CN105238764A - 一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron株及构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron株及构建方法和应用，步骤是：A、Intron上下游同源臂的PCR扩增；B、转染载体的构建。将Intron基因上下游同源臂片段通过分子克隆技术克隆至pcDNA3.1(+)载体上；C、PRV-ΔIntron重组病毒的构建与鉴定；D、PRV-ΔIntron重组病毒体外培养生物学特性。将制备的伪狂犬病毒ΔIntron基因缺失毒株接种PK-15细胞；E、动物实验。将制备的伪狂犬病毒ΔIntron基因缺失毒株感染Balb/c小鼠，Intron的缺失导致其毒力大大降低。该毒株表达miRNA的区域缺失，丧失了对宿主和自身蛋白质编码基因的调控作用，导致毒力下降，具有开发成为新型疫苗的潜在价值。方法易行，操作简便，缺失区域遗传稳定，不会返强。用于制备新型伪狂犬病疫苗，预防和控制猪伪狂犬病。

Description

一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron株及构建方法和应用

技术领域

本发明涉及动物病菌基因工程技术领域。具体涉及一个伪狂犬病毒鄂A株PRVIntron缺失突变活毒株，同时还涉及一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron突变株的构建方法，还涉及一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron突变株的用途。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)，又名奇痒症、奥叶基氏病(Aujeszky'sdisease,AD),是由伪狂犬病毒引起的以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎为主要特征的一种烈性传染病(殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:700-713.McCrackenRM,McFerranJBandDowC.Theneuralspreadofpseudorabiesvirusincalves.JGenVirol,1973,)。伪狂犬病病原为疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科的伪狂犬病毒(PRV)。

伪狂犬病毒感染宿主谱非常广泛，包括啮齿类动物、家畜、犬类和猫科动物，然而其感染自然宿主——猪和非自然宿主所引起的临床症状和结局是不同的：成年猪感染野生型PRV后主要表现为呼吸系统和繁殖系统疾病症状，很少发生死亡；非自然宿主感染PRV后表现奇痒及神经症状，大多以死亡告终(Pomeranzetal,2005)。

本病广泛分布于世界各地，已有50多个国家和地区报道该病的流行(李春华,王英,蒋凤英,胡建华.猪伪狂犬病研究进展.动物医学进展,2008,29:68-72.)。我国于上世纪40年代末在猫中首次分离到伪狂犬病毒，60年代初随着养猪业的发展，伪狂犬病开始在猪群中流行(童武等，2013)。该病对养猪业的危害主要表现在以下几个方面：a.妊娠母猪感染后表现流产，产死胎或木乃伊胎。b.15日龄内哺乳仔猪出现神经症状后一般24～36h内死亡，死亡率可达100％。c.断奶仔猪发病表现为拉稀、运动失调、颤抖、口吐白沫等，比哺乳仔猪死亡率低。d.感染公猪发生睾丸肿胀、萎缩，丧失种用价值；母猪表现屡配不孕、不发情或返情。e.感染育肥猪表现为呼吸道症状，极少病例出现神经症状，死亡率极低，但增重迟缓、饲料报酬降低，影响经济效益(刘正飞,陈焕春,吴斌,何启盖,秦永辉.伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究.畜牧兽医学报,2004,35:70-73.)，且感染后耐过的猪成为PRV最主要的储存宿主和传播者。

PRV除了能感染猪以外，还能感染牛、绵羊、狗、猫、山羊、鸡、浣熊、臭鼬及一些实验用动物如兔、小鼠、大鼠、豚鼠等，兔尤为敏感；偶尔也会感染马；人、黑猩猩等高等灵长类不感染PRV或感染但不发病，但恒河猴和狨猴对PRV是易感的。此外PRV在野猪中大量存在，熊和野生猫科动物在食用带有PRV的肉后也可被感染(EnquistLW.Lifebeyonderadication:veterinaryvirusesinbasicscience.ArchVirolSup,1999,15:87–109.；McCrackenRM,McFerranJBandDowC.Theneuralspreadofpseudorabiesvirusincalves.JGenVirol,1973,20:17–28；WittmannG,JakubikJandAhlR.MultiplicationanddistributionofAujeszky’sdisease(pseudorabies)virusinvaccinatedandnon-vaccinatedpigsafterintranasalinfection.ArchVirol,1980,66:227–240；KimmanTG,BinkhorstGJ,PolJM,GielkensAL,andRoelvinkME.Aujeszky’sdiseaseinhorsesfulfilsKoch’spostulates.VetRec,1991,128:103–106.),这给PRV的根除带来巨大困难，并时刻威胁着养猪业的健康发展(MüllerT,HahnEC,TottewitzF,KramerM,KluppBG,MettenleiterTC,FreulingC.Pseudorabiesvirusinwildswine:aglobalperspective.ArchVirol,2011,156:1691-1705.)。

近年来该病毒给养猪业造成巨大的经济损失，并且在免疫压力下开始发生变异，先前预防用的疫苗Batha-K61已经不能产生很好的保护力来抵抗新的PRV毒株。从2011年起，我国多省发生了新生仔猪疑似伪狂犬病症状的病例，脑组织分离病料经PCR鉴定、细胞病变观察及间接免疫荧光等实验验证为PRV，对gE毒力基因进行序列比对分析，表明该毒株与经典PRV(S株)和疫苗株有明显差异，为新变异毒株童武,张青占,郑浩,刘飞,姜一峰,单同领,周艳君,童光志.免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.中国动物传染病学报,2013,21:1-7.)。因此尽快研发新型疫苗，控制该病的传播迫在眉睫。

近几年研究表明病毒与宿主细胞间复杂的相互作用过程也涉及miRNA介导的RNA沉默途径(GottweinE,CullenBR.ViralandcellularmicroRNAsasdeterminantsofviralpathogenesisandimmunity.CellHostMicrobe,2008,3:375-387.)。本实验室前期研究发现PRV感染PK15细胞后，LLT基因中约4.6kb的Intron作为一个pri-miRNA(初级miRNA)，可以编码11个不同的miRNA(WuYi-Quan,ChenDi-Jun,HeHua-Bin,ChenDong-Sheng,ChenLing-Ling,ChenHuan-Chun,LiuZheng-Fei.Pseudorabiesvirusinfectedporcineepithelialcelllinegeneratesadiversesetofhostmicrornasandaspecialclusterofviralmicrornas.PlosOne,2012,7(1):e30988.)，其中7个是先前未报道的。通过stem-loopRT-PCR和northernblot的方法对它们进行了进一步鉴定。靶基因预测分析显示PRV编码的miRNAs能够调控众多自身与宿主的靶基因，这些靶基因涉及多种生物学过程，包括免疫系统加工、细胞凋亡、细胞死亡和病毒复制等(Wuetal,2012)。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种伪狂犬病毒缺失株(PRV-ΔIntron)，该毒株表达miRNA的区域缺失，丧失了对宿主和自身蛋白质编码基因的调控作用，导致毒力下降，具有开发成为新型疫苗的潜在价值。

本发明的另一个目的是在于提供了一种伪狂犬病毒缺失株(PRV-ΔIntron)的制备方法，方法易行，操作简便，缺失区域遗传稳定，不会返强。

本发明的再一个目的是在于提供了一种伪狂犬病毒缺失株PRV-ΔIntron在制备伪狂犬病基因工程疫苗中的应用，可以用于制备新型伪狂犬病疫苗，预防和控制猪伪狂犬病。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种伪狂犬病毒缺失株PRV-ΔIntron的制备方法，其步骤是：

A、Intron上下游同源臂的PCR扩增。以伪狂犬病毒鄂A株DNA为模板，用表1中的引物和表2所示的扩增条件，分别扩增LLTintron的上下游同源臂。其中上游同源臂551bp，包含编码EP0蛋白的序列SEQIDNO.1；下游同源臂536bp，包含IE180的序列SEQIDNO:3。

B、转染载体的构建。将Intron基因上下游同源臂片段通过分子克隆技术克隆至pcDNA3.1(+)载体上，通过酶切位点HindIII、EcoRI和XhoI拼接在一起，构成同源重组所必需的上下游同源臂，构建的该中间转移载体被命名为pZF11-84(缺失Intron基因)，在pZF11-84中插入带有完整启动子的EGFP报告基因,将构建成的重组转移质粒命名为pZF14-6(ΔIntron/EGFP+)。

C、PRVΔIntron-EGFP+重组病毒的构建与鉴定。将中间转移质粒pZF14-6(ΔIntron/EGFP+)和PRVEa基因组用脂质体法共转染于PK15细胞系进行同源重组，空斑纯化筛选得到PRV-ΔIntron-EGFP+重组病毒。

D、PRVΔIntron-EGFP⁺重组病毒体外培养生物学特性。将制备的伪狂犬病毒ΔIntron基因缺失毒株接种PK-15细胞，一步法增值曲线试验和空斑试验表明缺失株增殖能力下降。

E、动物实验。将制备的伪狂犬病毒ΔIntron基因缺失毒株感染Balb/c小鼠，Intron的缺失导致其毒力大大降低。

本发明构建的PRVLLT区Intron缺失株所用的上游同源臂序列,序列长度为551bp。一种分离的蛋白质，其编码基因为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。该序列在第一步中获得，含有EP0基因。

本发明构建的PRVLLT区Intron缺失株缺失的Intron序列,序列长度为4368bp。一种分离的蛋白质，其编码基因为SEQUENCENO.2所示的核苷酸序列。该序列在第一步中获得，其中intron序列被删除。

本发明构建的PRVLLT区Intron缺失株所用的下游同源臂序列,序列长度为536bp。一种分离的蛋白质，其编码基因为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。该序列在第一步中获得，含有IE180基因。

本发明构建的PRVLLT区Intron缺失株所用的EGFP表达盒序列,序列长度为1941bp。一种分离的蛋白质，其编码基因为SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。该序列在第二步获得，含有EGFP表达盒。

本发明通过同源重组技术获得一株伪狂犬病毒ΔIntron基因缺失突变活毒株PRV-ΔIntron-EGFP⁺，该活毒株于2014年6月19日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCCNO：V201422，该毒株缺失了如序列表SEQIDNO：2所示的1-4368bp；插入了如序列表SEQIDNO：4所示的1-1941bp的EGFP表达盒。PRV-ΔIntron系通过基因工程技术将伪狂犬病毒强毒株Ea中LLT基因的intron序列删除，并插入标记基因EGFP而获得。该基因缺失突变株能够在PK-15等细胞上增殖并引起细胞病变，不再产生非编码基因miR-1、miR-2、miR-3、miR-4、miR-5、miR-6、miR-7、miR-8和miR-9，接种实验动物后毒力显著下降。

一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron株在制备伪狂犬病基因工程疫苗中的应用，其步骤是：

A、在该突变株的基础上进一步缺失毒力基因gE和TK基因，或在gE和TK基因缺失的基础上进一步缺失LLTintron；

B、在PK-15或其它细胞上增殖；

C、加入明胶或脱脂奶粉，冷冻干燥作为冻干活疫苗；

D、用生理盐水稀释后接种猪。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明所用的材料是猪疱疹病毒1型PRVEa临床分离野生型毒株，具有全部的毒力因子和其他免疫原性很好的抗原。因此，PRVΔIntron基因缺失毒株具有应用于新基因工程疫苗研发的潜在价值。

2.选用EGFP作为报告基因，使得重组病毒的筛选更快速，准确，可靠。

3.PRVΔIntron缺失株在细胞上形成的空斑变小，其增殖能力下降10倍；

4.PRVΔIntron缺失株对Balb/c小鼠的LD₅₀为2.3×10⁴PFU/mL，而亲本株为1.6×10³PFU/mL，毒力下降16倍。

附图说明

图1A为一种质粒pZF11-84构建的示意图。

为含有intron上下游同源臂的重组质粒，其中上游同源臂长551bp，下游同源臂长536bp。

图1B为一种插入EGFP基因的重组质粒pZF14-6示意图。

为含有EGFP基因的上下游同源臂转移质粒，其中EGFP表达盒位于上下游同源臂同源臂之间。

图2为一种PRV-ΔIntron缺失株及Intron回复突变株的构建方法示意图。

其中：图2A为一种PRV-ΔIntron缺失株构建方法示意图，图2B为一种Intron回复突变株的构建方法示意图。

图3为一种扩增Intron基因上下游同源臂的PCR产物检测示意图。

图中泳道1:扩增的Intron上游同源臂，大约550bp；泳道2:扩增的Intron下游同源臂，大约540bp；M:DL2000DNAmolecularmarker(购至宝生物工程(大连)有限公司公司)。

图4为一种所构建重组转移质粒pZF11-83、pZF14-6和pZF12-30限制性酶切鉴定示意图。

其中：图4-A泳道M：DL15000DNAmolecularmarker；M’:DL5000DNAmolecularmarker(购自宝生物工程(大连)有限公司公司)；1：空载体对照：用HindⅢ和XhoI酶切pcDNA3.1(+)得到约5.4kb的片段；2：用HindⅢ和XhoI酶切质粒pZF11-84得到5.4kb和1.1kb片段；3：用EcoRI酶切pZF11-83得到约6.0kb的片段；4:pZF11-84质粒经EcoRI酶切得到约6.5kb的片段；5:pZF11-84质粒经SmaI酶切得到5kb和1.5kb的片段；图4-B泳道M：DL15000DNAmolecularmarker；1：对照pZF11-84质粒经EcoRI酶切得到约6.5kb的片段；2：pZF14-6质粒经EcoRI酶切得到6.5kb和1.9kb的片段；3：用NheI酶切pZF14-6质粒得到约6.8kb和1.6kb的片段，说明EGFP片段顺向插入到Intron上下游同源臂之间；图4-C泳道1：质粒pZF12-30经XhoI酶切鉴定结果，得到5.6kb和5.2kb的片段，其中5.6kb的片段为含有完整Intron及其上下游同源臂；M：DL15000DNAmolecularmarker。

图5为一种构建的重组转移质粒pZF14-6转染PK15细胞可发出较强的绿色荧光示意图。

转染效率也能达到转染要求。

图6为一种构建的pZF14-6重组转移质粒与PRVEa基因组共转染于PK15细胞系示意图。

其中图6-A：箭头所指细胞群在自然光和蓝色激发光下的典型病变；6-B：箭头所指的细胞群在蓝色激发光下发出绿色荧光的典型病变。

图7为一种构建的重组病毒PRV-ΔIntron-EGFP⁺的筛选纯化示意图。

其中图7-A：箭头所指细胞群在自然光和蓝色激发光下的照片；图7-B：箭头所指的细胞群在蓝色激发光下发出绿色荧光的照片；图7-C：空斑扩大结果。

图8为一种构建的重组病毒PRV-ΔIntron-EGFP⁺进行的PCR验证示意图。

图中泳道P+：用pZF14-6质粒做阳性对照检测Intron上游同源臂与EGFP的接头；泳道1-4：检测PRV-ΔIntron-EGFP⁺4个空斑Intron上游同源臂与EGFP的接头，扩增出706bp的条带；Wt(+)：用PRVEa基因组做阳性对照检测Intron与下游同源臂接头，扩增出613bp的条带；5-8：检验PRV-ΔIntron-EGFP⁺4个空斑中是否有野毒残留，未扩增出条带；M2000：DL2000DNAmolecularmarker。

图9为一种构建的PRV-ΔIntron-EGFP⁺中Intron缺失的示意图。

虚线部分为缺失的碱基。

图10为一种构建的Intron回复突变株PRV-ΔIntron-R的空斑筛选示意图。

其中：图10-A：自然光下的空斑照；图10-B：蓝色激发光下空斑照。

图11为一种构建的回复突变株PRV-ΔIntron-R进行的PCR验证示意图。

图中泳道Wt+：PRVEa阳性对照，扩增Intron与下游接头613bp片段；泳道1-4：4个PRV-ΔIntron-R空斑样品，均扩增出613bp大小的条带；Cell&H₂O：阴性对照；Δ+：PRV-ΔIntron-EGFP⁺对照；1’-4’：4个PRV-ΔIntron-R空斑样品PCR检测是否存在PRV-ΔIntron-EGFP⁺的残留；M：DL2000DNAmolecularmarker。

图12为一种病毒体外培养空斑大小比较结果示意图。

PRV-ΔIntron-EGFP⁺空斑显著变小。

图13为一种病毒体外培养一步生长曲线示意图。

PRV-ΔIntron-EGFP⁺增殖速度显著减慢。

图14为一种小鼠攻毒后临床症状示意图。

图14-A：PRVEa株组攻毒小鼠96hpi，背部有咬痕；图14-B：PRV-ΔIntron-R组攻毒小鼠96hpi，背部有严重咬伤；图14-C：PRV-ΔIntron-EGFP⁺组攻毒小鼠132hpi，背部无咬痕。

图15为一种不同毒株对小鼠致病力的分析。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明做详细说明，但不是限制本发明。

实施例1：

本研究中所用实验材料及试剂：

18-T购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)，货号为D101A；pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司，货号V79020。

GIBCO胎牛血清及新生牛血清购自Invitrogen公司，货号10099-141。

DMEM培养基购自美国Invitrogen公司。货号：12800-017。

Opti-MEM(1×)培养基购自美国Invitrogen公司。货号：11058-021。

0.25％Trypsin-EDTA(1×)购自美国Invitrogen公司。货号：25200-072。

无酚红DMEM培养基购自美国HyClone公司。货号：SH30211.15。

AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物有限公司。货号：AP-GX-50。

脂质体转染试剂盒Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。货号：11668-500。

限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)和北京纽英伦生物技术有限公司(NEB)。

猪肾传代细胞(PK15)、牛肾传代细胞(Madin-Darbybovinekidney,MDBK)购自中国典型培养物保藏中心(武汉)。

实验动物：5-7周龄BALB/c小鼠购自武汉生物制品研究所。

试剂配制：

DMEM培养基：1L装DMEM粉剂溶于800mL灭菌的三蒸水中，加入3.7gNaHCO₃，用浓HCl调pH值于6.8左右，定容至1000mL后，用0.22μm直径的滤器过滤除菌，4℃保存。

无酚红DMEM培养液(2×)：称取13.4g无酚红DMEM粉剂溶于400mL三蒸水中，加入3.7gNaHCO₃，用HCl调pH值于6.8左右，定容至500mL后，用0.22μm直径的滤器过滤除菌，4℃保存。

细胞生长液：在DMEM培养液中按10％加入胎牛血清或新生牛血清，1％青链霉素，4℃保存。

细胞维持液：在DMEM培养液中按2％或5％加入胎牛血清或新生牛血清，1％青链霉素，4℃保存。

4％羧甲基纤维素钠：称取40g羧甲基纤维素钠，溶于500.0mL三蒸水中，搅拌均匀后高温高压灭菌。再加入500.0mL无酚红DMEM培养液(2×)，摇匀，置4℃冰箱保存备用，用前按3％血清，1％双抗加入其中摇匀。

1.6％低熔点琼脂糖：称取低熔点琼脂糖1.6g，加入到100mL三蒸水中搅拌均匀后高温高压灭菌。

实施例2：

Intron上下游同源臂的PCR扩增：

根据GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上发表的PRV基因组的全长核苷酸序列(Genbank登录号为BK001744.1)，设计2对引物(引物对序列见表1，所有引物由上海生工生物技术有限公司合成)，以PRV基因组文库中的质粒为模板，分别扩增Intron的上下游同源臂。上下游同源臂详细序列见序列表SEQIDNO:1和序列表SEQIDNO:3，其中Intron缺失后的详细序列见序列表SEQIDNO:2。

表1Intron基因上下游同源臂扩增及重组病毒的鉴定所用引物

表注：引物序列的下划线部分表示酶切位点。

表2Intron基因上下游同源臂PCR扩增条件

表3PCR鉴定PRV-ΔIntron-EGFP⁺及PRV-ΔIntron-R的扩增条件

实施例3：

转染载体的构建：

PCR扩增Intron上下游同源臂，用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(购自Axygen)回收后分别连pMD18-T载体中，分别命名为pZF11-81和pZF11-82。用HindⅢ和EcoRI双酶切质粒pZF11-81及pcDNA3.1(+)载体，回收上游同源臂片段及载体，将上游同源臂连入酶切后的pcDNA3.1(+)中，质粒命名为pZF11-83。用EcoRI和XhoI双酶切pZF11-82，回收下游同源臂定向插入到用相同酶切后的pZF11-83中，即构建成了含有Intron上下游同源臂的质粒pZF11-84(见图1-A)，经多种限制性内切酶鉴定构建正确(图2-A)。为了便于重组病毒的筛选，在质粒pZF11-84的基础上插入了EGFP表达盒(图1-B)，限制性酶切鉴定质粒构建正确且EGFP为顺向插入(图2-B)，其中EGFP的详细序列见序列表SEQIDNO:4。用脂质体法(脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司。货号：11668-500)将质粒pZF14-6转染PK15细胞后，作为标记基因的EGFP表达盒表达正常(图5)，表明所构建的转移质粒pZF14-6正确，可用于共转染。

实施例4：

PRV-ΔIntron-EGFP⁺重组病毒的构建与鉴定：

1.同源重组和筛选纯化

病毒滴度(PFU)的测定：将病毒原液做连续10倍梯度稀释，取适当稀释度的病毒液200μL/孔接于长满单层MDBK细胞24孔板，每个稀释度做3个重复，吸附2h，不弃培养液，覆盖4％羧甲基纤维素钠(含3％新生牛血清，1％双抗)，每孔约1mL，48h后，待细胞出现病变后，每孔用10％甲醛(1×PBS，10％甲醛)补满，固定4h以上，弃孔中液体，倾斜培养板用流水冲洗至无覆盖物，各孔加结晶紫(0.35％、w/v)至覆盖底层，水平摇床室温孵育10～15min，弃结晶紫染液，侧板冲洗数次，温箱敞口烘干，取密度适中的孔显微镜下计数，计算病毒效价。

病毒的增殖：根据所测定的PFU，按0.01MOI接种PRV接种于长满PK15的细胞瓶中，48～72h后，待80％以上细胞出现裂解时，收获病毒液，标记分装后储存于-80℃。

病毒基因组的提取：

(1)培养8个T150瓶PK15细胞，待长至80％时接种PRVEa毒株，待细胞病变完全后，收集病毒培养液，转入50mL无菌的离心管中，6000r/min离心10min；

(2)将上清转入超高速离心管中，于管底缓慢加5mL30％的蔗糖溶液，避免产生气泡，称重配平；

(3)4℃，25000r/min超高速离心2h；

(4)将离心后的离心管上层30％的蔗糖及上清倒掉，在吸水纸上倒置晾干1min；

(5)沉淀用100μL1×TE重悬，收集于7mL离心管中，补加500μLTE；

(6)用200μL10％的SDS，15μL1mg/mLRnase，轻弹混匀，置于60℃水浴30min；

(7)再加入100μL蛋白酶K(10mg/mL)，混匀，置于60℃水浴中30min；

(8)用1×TE补加至3mL，再加3mL苯酚-氯仿-异戊醇混合液颠倒混匀；

(9)8000r/min，4℃，30min(或者12000r/min4℃10min)，抽提2～3次；

(10)用2.5mL～3mL乙醚抽提1次(将苯酚抽提除去)；

(11)8000r/min，10min，弃去上清，用移液器吹液体表面，使乙醚挥发完全；

(12)加入1/10体积4℃预冷的NaAc和2.2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，轻轻颠倒，可见白色絮状物析出，用枪头轻轻挑出，放于干净的EP管中，用75％乙醇漂洗，离心(8000～18000r/min，10min)，烘干，用200μL1×TE溶解，琼脂糖电泳检测。

PRVEa基因组与中间转移质粒pZF14-6共转染PK15细胞(脂质体法)：于6孔细胞培养板中培养PK15细胞，待细胞长至70％～80％换成无血清Opti-MEM培养基饥饿2h，2mL/孔，于转染前1h左右，取两只1.5mL无菌Eppendorf管。管A加入244μLOpti-MEM和6uLLipofectin-amine2000，管B中依次加入无血清培养基Opti-MEM、适量线性化的重组转移质粒、1.5μg病毒基因组DNA共250μL，轻轻混匀。A、B液配好后室温静置5min。将管A中的溶液逐滴加至管B中，边加边轻轻弹匀，室温静置20～30min，加入500μLOpti-MEM混匀后静置5min。吸弃6孔板中的培养基，用不含血清的DMEM或Opti-MEM洗涤细胞一次。然后将B管中的混合物加至单层细胞上，于37℃，5％CO2培养箱中培养4～6h，吸弃细胞培养液，加入含5％新生牛血清的DMEM继续培养。24h后观察结果，约至48h出现较多病变时，将病毒液冻存于-80℃。

空斑筛选纯化：将PK15细胞接于细胞培养皿中，待细胞长至80％时接种适量病毒液，吸附2h，覆盖低熔点琼脂糖和2×无酚红DMEM培养液等体积混合液，4℃凝固后(约30min)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，直至出现病变，荧光显微镜下观察，然后在自然光下用10μL或100μL的移液器吸取荧光亮度较强的单个空斑(图7-A、图7-B)转移至预先加入500μl维持液的冻存管中，做好标记。经过4轮的空斑纯化筛选，直至所有的空斑都发出绿色荧光为止(图7-C)。

2.PRV-ΔIntron-EGFP⁺重组病毒的PCR鉴定

以PRV-ΔIntron-EGFP⁺DNA为模板，设计引物P7、P8(见表1)扩增Intron上游同源臂和EGFP的接头处，另设pZF14-6质粒模板为阳性对照，扩增出706bp的特异性片段，与预期大小相符；同时设计引物P5、P6扩增Intron与下游同源臂接头处，检测PRVEa残留情况，若有野毒残留可扩增出613bp的条带。4个样品均未检测出野毒条带(图8)，表明重组病毒构建正确并已纯化完全。

实施例5：

PRV-ΔIntron-R回复突变株的构建与鉴定：

1.同源重组和筛选纯化

以PRV-ΔIntron-EGFP⁺为亲本，与中间转移质粒pZF12-30共转染于PK15细胞系，具体实施方法同实施例4。

空斑筛选纯化：将PK15细胞接于细胞培养皿中，待细胞长至80％时接种适量病毒液，吸附2h，覆盖低熔点琼脂糖和2×无酚红DMEM培养液等体积混合液，4℃凝固后(约30min)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，直至出现病变，在显微镜下观察空斑形成情况，荧光显微镜下观察空斑是否发绿色荧光，用10μL或100μL的移液器吸取不发荧光的单个空斑(图10-A、图10-B)转移至预先加入500μl维持液的冻存管中，做好标记。经过3轮的空斑纯化筛选，纯化完全。

2.PRV-ΔIntron-R回复突变株的PCR鉴定

以PRV-ΔIntron-R病毒DNA为模板，用引物P5、P6进行扩增Intron与下游同源臂接头处，同时设PRVEa基因组做阳性对照，均可检测到613bp的条带，说明回复突变株构建正确。同时用引物P7、P8检测PRV-ΔIntron-EGFP⁺，设PRV-ΔIntron-EGFP⁺基因组对照，样品组未扩增出706bp的条带(图11)，说明回复突变株已纯化完全，无PRV-ΔIntron-EGFP⁺残留。

实施例6：

PRV-ΔIntron-EGFP⁺重组病毒体外培养生物学特性

空斑大小比较：

将MDBK细胞接至24孔细胞培养板中，12～24h后待细胞长至90％进行接毒：取PRVEa、PRV-ΔIntron-EGFP⁺、PRV-ΔIntron-R分别连续10倍倍比稀释，取10^-5和10^-6两个稀释度的病毒液200μL接种于培养板中，吸附2h，每孔加入lmL4％羧甲基纤维素钠(含3％新生牛血清)，48h后补满10％中性甲醛，固定过夜，次日侧板冲洗直至没有残留，每孔分别加入1mL结晶紫(0.35％、w/v)，染色10～15min，侧板冲洗，置温箱烘干，显微镜下照相。在显微镜分别选取4×、10×和20×物镜下拍照数张，选取照片进行空斑大小测量。使用AdobeAcrobat7.0Professional等软件的测量工具，随机选取100个单个的空斑进行测量，每个空斑测量3次，以最大值为准。测量数据通过Excel等软件分析，按KolmogorovSmirnov法通过与亲本毒株的大小比较，并通过t-检验对数据进行了分析。

结果显示：PRVEa形成的空斑大小大为0.43～0.59mm，PRV-ΔIntron-EGFP⁺空斑大小为0.28～0.44mm，PRV-ΔIntron-R的空斑大小为0.46～0.58mm，重组毒所形成的空斑大小明显小于野毒空斑，而回复突变株空斑大小与野毒空斑大小一致。t-检验显示PRV-ΔIntron-EGFP⁺形成的空斑与PRVEa相比差异极显著(P<0.01)，PRV-ΔIntron-R形成的空斑与PRVEa无差异(图12)。

一步法生长曲线

培养24瓶PK15细胞，次日将细胞瓶全部放入4℃冰箱冷却1h。将测定过毒价的PRVEa、PRV-ΔIntron-EGFP⁺、PRV-ΔIntron-R分别稀释至15mL5％血清的DMEM中，迅速放在冰上。按照5MOI进行接毒，共取8个时间点，分别是0h、3h、6h、9h、12h、l8h、24h、30h。按照一定顺序将病毒液接入细胞瓶中，置于4℃冰箱，直到最后一瓶加完。开始计时，吸附1.5h后，取出细胞瓶弃掉病毒液用预冷的PBS洗3次，弃掉PBS加入5％的DMEM4mL，放入37℃温箱中，按照上述时间点收毒。冻融1次后标记分装，进行毒价测定。

结果表明：PRV-ΔIntron-EGFP⁺重组毒在体外培养的PK15cells中增殖速度显著慢于野毒株,说明Intron缺失后影响病毒的增殖能力；PRV-ΔIntron-R回复突变株的增殖能力基本恢复至野毒水平(图13)。

实施例7：

小鼠攻毒试验：

表4攻毒试验分组及结果统计

以相同剂量进行攻毒试验，接种PRV-ΔIntron-EGFP⁺突变株的小鼠死亡率显著低于PRVEa组，且死亡时间明显延迟。空白对照组小鼠均没有出现任何伪狂犬症状。存活率为100％。

攻毒后48hPRVEa组小鼠被毛粗乱，部分小鼠精神沉郁，开始出现瘙痒症状。第72～96h，PRVEa5×10⁴组小鼠频繁啃咬后背部皮肤，很快出现死亡，且死亡时间较集中；PRV-ΔIntron-R组部分小鼠背部出现咬伤(图14-B)；PRV-ΔIntron-EGFP⁺5×10⁵组小鼠攻毒144h后出现严重的瘙痒症状，躁动不安，频繁啃咬后背部，症状出现12h后小鼠陆续出现死亡，个别小鼠死前有共济失调现象，但没有皮肤咬伤(图14-C)，且未出现死亡高峰。PRV-ΔIntron-R与PRVEa组死亡情况比较一致(表4)，说明回复突变株的毒力基本恢复至野毒水平。

PRVEa和PRV-ΔIntron-EGFP⁺对小鼠致病力比较发现：PRV-ΔIntron-EGFP⁺病毒的致病力显著降低，在体内的传播速度变慢，导致小鼠死亡时间延缓(图15)。

SEQUENCELISTING

<110>华中农业大学

<120>一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron突变株及构建方法和应用

<130>一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron突变株及构建方法和应用

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<170>PatentInversion3.1

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Claims (3)

1.一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron基因缺失标志活毒株，其特征在于：伪狂犬病毒株PRV-ΔIntron，CCTCCNO：V201422。

2.根据权利要求1所述的一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron基因缺失标志活毒株，其特征在于：所述的伪狂犬病毒株PRV-ΔIntron含有序列SEQUENCENO.2所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron基因缺失标志活毒株PRVΔIntron在制备伪狂犬病基因工程疫苗中的应用。