CN101935637A - 鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株及其应用。本发明克隆了流行超强毒株HLJ-0504的主要保护性抗原基因VP2，将其核苷酸进行突变修饰，然后将其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段，构建IBDV重组基因组的感染性克隆，利用IBDV反向遗传操作系统，拯救并鉴定了重组弱毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3749；本发明重组弱毒疫苗株具有良好的复制性、遗传稳定性和安全性。在免疫效果上，本发明弱毒疫苗株和中等毒力疫苗相当，优于弱毒疫苗株。在生物安全性上，优于中等毒力疫苗。本发明重组弱毒疫苗株具备作为疫苗株的高效、低毒的特点，是良好的疫苗候选毒株，可用于鸡传染性法氏囊病的防控。

Description

鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明涉及一株重组弱毒疫苗株，尤其涉及一株表达流行毒株主要保护性抗原蛋白VP2的鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株，本发明还涉及该重组弱毒疫苗株在制备防制鸡传染性法氏囊病生物制品中的应用，属于鸡传染性法氏囊病的防制领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种主要危害雏鸡的急性、高度接触性、免疫抑制性、致死性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为“影响社会经济的重要疾病”。该病于1957年首次爆发于美国，现已大面积流行于欧州、东南亚、非州、南美洲等地。中国的流行情况也比较严重，一直威胁着中国养禽业的发展。IBDV有两个血清型，仅血清I型对鸡致病。血清I型毒株由于不断变异又分为经典毒株、变异毒株、超强毒株(very virulent IBDV，vvIBDV)，其中vvIBDV的致死率高达60％以上，而且耐过鸡群会呈现对禽流感、新城疫等免疫失败(Müller H，Islam M R，Raue R.Research on infectious bursal disease-the past，the presentand the future.Vet.Microbiol.2003，97：153-165.)。最近研究发现，野生鸟类也能感染vvIBDV。免疫抑制、抗原变异，特别是vvIBDV的出现，使得该病的防控形势更加严峻。

IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属，其基因组由两个双股RNA节段组成。B节段长2827bp，编码具有RNA聚合酶活性的VP1蛋白。A节段长3260bp，包括两个开放阅读框(ORF)：小ORF在前，编码非结构蛋白VP5；大ORF在后，编码VP2、VP3和VP4蛋白。VP2是IBDV唯一的衣壳蛋白，是IBDV主要的毒力蛋白和宿主保护性抗原(Garriga D，Querol-Audi J，Abaitua F，et al.The 2.6-Angstrom structure of infectious bursal disease virus-derived T-1particles reveals new stabilizing elements of the virus capsid.J.Virol.，2006，80：6895-6905.)。

最近，IBDV新的变异趋向已被监测到。本发明人实验室对分离鉴定的vvIBDV进行全基因组序列分析还发现，HLJ-0504代表了一群具有基因组新特征的vvIBDV，这类病毒具有超强毒的A节段和介于强弱毒之间的B节段，VP2基因存在抗原漂变，其对SPF鸡致死率高达86.7％，该类病毒在东北地区、广西以及法国均有存在。依据主要保护性抗原基因VP2绘制的遗传进化树分析发现，HLJ-0504株在国内流行毒株中具有代表性。

疫苗免疫是防控vvIBDV的主要手段，但vvIBDV致病性很强且不适应细胞培养，活疫苗株的获得只能通过将野生vvIBDV在鸡胚或CEF细胞上传代致弱(Wang X M，Fu C Y，Gao H L，et al.Pathogenicantigenic and molecular characterization of very virulent strain(Gx)of infectious bursal disease virus isolated in China.Agri.Sci.China，2003，2：566-572.Wang X M，Zeng X W，Gao H L，et al.Changes inVP2 gene during the attenuation of very virulent infectious bursaldisease Virus strain Gx isolated in China.Avian Dis.，2004，48：77-83.Wang，X.，Zhang H.，Gao H.，et al.Changes in VP3 and VP5 genesduring the attenuation of very virulent infectious bursal disease virusstrain Gx isolated in China.Virus Genes，2007，34：67-73.Yamaguchi T，Ogawa M，Inoshima Y，et al.Identification of sequence changesresponsible for the attenuation of highly virulent infectious bursaldisease virus.Virology，1996，223：219-223.)。这种传统的疫苗株驯化方法费时费力，往往需要数年时间，而且结果带有随机性。对于高致病力的、易变异的vvIBDV的防控，特别是突发疫情的防控，开展疫苗株的快速构建研究迫在眉睫。

反向遗传技术是研究基因功能和进行分子修饰的有力工具。国外研究者对建立快速的疫苗株筛选方法做了一些探索工作。Mundt等曾以疫苗株D78为亲本毒，拯救获得嵌合病毒D78-Chim，该病毒对经典毒和变异株的攻击均能产生保护。此外，有研究者曾以缺失VP5的策略试图构建疫苗株，VP5缺失虽然导致复制延迟但并不影响宿主对IBDV的体液免疫反应强度。Lim等曾通过点突变使vvIBDV HK46株适应非允许细胞CEF，但没有进一步评估其致病性和免疫原性。

在过去近60年里，IBDV曾经出现过两次大的变异，每次变异都因为新毒株突破了原有疫苗免疫保护而造成了严重损失(Müller H，Islam M R，RaueR.Research on infectious bursal disease-the past，the present and the future.Vet.Microbiol.2003，97：153-165.)。近20年来，鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株(vvIBDV)在危害养禽业的同时，也在发生和累计着微小的变异，是否会出现抗原性大的变异或者出现毒力更强的毒株可能只是个时间问题。传统的传代致弱的疫苗株驯化方法费时费力，不能满足突发疫情应急防控的需要。所以，应用先进的反向遗传操作技术，依据流行病学监控信息，针对流行毒株，有目的的快速构建IBDV新型疫苗毒株具有重大的现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一株表达vvIBDV流行毒株主要保护性抗原蛋白VP2的重组弱毒疫苗株，该毒株有较高的复制滴度，对鸡无致病性，遗传稳定性良好，有较好的免疫原性。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株表达vvIBDV流行毒株主要保护性抗原蛋白VP2的重组弱毒疫苗株(rGtHLJVP2)，其微生物保藏号是：CGMCC No.3749；分类命名是：鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)；保藏时间是：2010年4月20日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心：保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明克隆了流行超强毒株HLJ-0504的主要保护性抗原基因VP2，将其核苷酸进行突变修饰(A889T/G980A)，然后将其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段，构建IBDV重组基因组的感染性克隆，利用IBDV反向遗传操作系统，拯救并鉴定了重组弱毒疫苗株rGtHLJVP2。在感染性克隆里，IBDV基因组的两端均克隆有核酶的cDNA序列。核酶的本质是一种具有剪切酶活性的RNA。锤头状核酶结构(hammerhead ribozyme，HamRz)核心序列共有58个核糖核酸，自我剪切位点在其3′末端C处；丁肝病毒核酶结构(hepatitis delta ribozyme，HdvRz)共有88个核糖核酸，自我剪切位点在其5′末端G处。核酶序列的引入实现了从转录水平上控制重组IBDV基因组的完整性，这是实现高效病毒拯救的关键之一。vvIBDV不能够适应CEF细胞，这是由VP2的253和284位氨基酸位点决定的(Qi X L，Gao H L，Gao Y L，et al.Naturally occurring mutations atresidues 253 and 284 in VP2 contribute to the cell tropism andvirulence of very virulent infectious bursal disease.Antiviral Res.，2009，84：225-233.)。vvIBDV HLJ-0504核苷酸突变A889T/G980A导致了VP2的氨基酸突变Q253H和A284T，这是感染性克隆有感染性并在DF1和CEF细胞上能够拯救出重组病毒的前提。

感染性克隆pCAGGGtAHLJVP2HRT与pCAGGGtBHRT共转染细胞后，经IFA和电镜观察证明，拯救出了重组弱毒疫苗株rGtHLJVP2。测序证明，本发明重组弱毒疫苗株rGtHLJVP2是一株以弱毒株Gt为骨架，其主要保护性抗原基因VP2被vvIBDV HLJ-0504相应区域替换了的重组病毒。

本发明重组弱毒疫苗株(rGtHLJVP2)主要具有以下几方面的特点：

(1)复制特性良好。rGtHLJVP2在CEF细胞上与Gt具有相似的复制动力学曲线，接毒后48h-60h，病毒滴度可达到10⁷TCID₅₀/ml以上。在SPF鸡的法氏囊内，rGtHLJVP2与Gt也具有相当的病毒载量。

(2)安全性好，对SPF鸡无致病性。rGtHLJVP2尽管具有vvIBDV的VP2基因，但由于做了分子修饰，与Gt对照组一样，对SPF鸡不呈现致病性。在接种SPF鸡后的14天内，试验鸡的精神状态良好，未出现任何发病症状；法氏囊正常，没有萎缩，没有明显的显微病变。rGtHLJVP2和弱毒疫苗株Gt一样对SPF鸡无致病性，但中等毒力疫苗B87对法氏囊造成了严重萎缩和不可逆病理损伤。

(3)遗传稳定性良好。rGtHLJVP2在CEF细胞和SPF鸡上分别盲传15代和5代，病毒滴度保持稳定，基因组没有发生意外突变，毒力也没有返强。

(4)免疫原性良好。rGtHLJVP2免疫SPF鸡后，7d 80％血清抗体阳转，10d 100％阳转，而且能够100％保护强毒攻击。rGtHLJVP2和中等毒力疫苗B87相当，优于弱毒疫苗株Gt。

总之，本发明重组弱毒疫苗株rGtHLJVP2具有良好的复制性、遗传稳定性和安全性。在免疫效果上，本发明弱毒疫苗株和中等毒力疫苗相当，优于弱毒疫苗株。本发明重组弱毒疫苗株具备了作为疫苗株的高效、低毒的特点，是一株良好的疫苗候选毒株，可以用于鸡传染性法氏囊病(IBD)的防控。

附图说明

图1HLJ-0504株VP2基因的突变修饰及替换Gt株相应区段流程图。

图2感染性克隆示意图。

图3用HLJ-0504株VP2基因替换Gt株基因组相应区段过程中的各步PCR产物；M.1kb DNA Ladder Marker；1.PCR产物GtHLJ0504VP2I；2.PCR产物GtHLJ0504VP2II；3.GtHLJ0504VP2III；4.PCR产物GtAHLJVP2HRT。

图4重组病毒在CEF上的CPE(100X)；左.rGtHLJVP2；右.正常细胞对照。

图5间接免疫荧光检测重组病毒(×100)；左.rGtHLJVP2；右.正常细胞对照。

图6电镜下的重组病毒rGtHLJVP2(40000×)。

图7重组病毒rGtHLJVP2在CEF细胞上的复制动力学曲线。

图8重组病毒rGtHLJVP2体内(法氏囊)复制动力学曲线。

图9重组病毒接毒后鸡囊重指数变化曲线。

图10重组病毒接种SPF鸡的法氏囊的病理变化(20X)。

图11重组病毒诱导试验鸡的抗体滴度。

图12不同疫苗免疫试验鸡抗体消长曲线。

图13试验鸡二免及攻毒后各组鸡囊重指数变化曲线；d p.i.：dayspost-infection(接种后天数)；d p.c.：days post challenge(攻毒后天数)。

图14试验鸡二免及攻毒后法氏囊的病理变化(20X)；d p.i.：dayspost-infection(接种后天数)；d p.c.：days post challenge(攻毒后天数)。

图15试验鸡二免后法氏囊中的病毒载量。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1重组弱毒疫苗株rGtHLJVP2的设计、拯救、鉴定及免疫效力初步评价

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒

HLJ-0504，vvIBDV[购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所菌毒种室(对外)]；Gt，IBDV弱毒疫苗株，由哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病课题组(本发明人课题组)将vvIBDV Gx株连续传代致弱并保存，具体方法可参考有关文献(Wang X M，Zeng X W，Gao H L，et al.Changes in VP2 geneduring the attenuation of very virulent infectious bursal disease Virus strain Gxisolated in China.Avian Dis.，2004，48：77-83；Wang，X.，Zhang H.，Gao H.，et al.Changes in VP3 and VP5 genes during the attenuation of very virulent infectiousbursal disease virus strain Gx isolated in China.Virus Genes，2007，34：67-73.)。

1.1.2质粒

pT-HLJ0504AHRT：将HLJ-0504基因组A节段克隆入pMD18T载体，A节段5’端和3’端已分别加入核酶结构的cDNA序列，分别为HamRz(58bp)：5′TGTTAAGCGTCTGATG

AGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTC3′和HdvRz(88bp)：5′GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGG

TCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG3′。pCAGGGtAHRT和pCAGGGtBHRT：分别将IBDV弱毒株Gt的基因组的A、B节段克隆入真核表达载体pCAGGS，基因组两端已分别引入了核酶结构HamRz和HdvRz(Qi X L，Gao Y L，Gao H L，et al.An improved method forInfectious bursal disease virus rescue using RNA polymerase II system.J.Virol.Methods，2007，142：81-88.)。上述质粒均由本发明人课题组构建和保存。

1.1.3细胞和单克隆抗体

DFI细胞购自美国模式培养集存库(American type culture collection，ATCC)；原代鸡胚成纤维细胞(CEF)按常规方法用SPF鸡胚制备；抗IBDVVP2蛋白单克隆抗体6H7D由本发明人课题组制备；Top10F′菌种由本发明人实验室保存(Top10F′菌种也可从生物试剂公司购买得到)。

1.1.4实验动物

SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，饲养于超滤负压隔离器中。

1.1.5主要试剂

各种限制性内切酶、PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase、DNA Marker、dNTP等购于大连宝生物公司；胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自Omega公司；Plasmid Midi Kit为QIAGEN产品；Lipofectamine^TM-2000，Superscript^TM RT-PCR Systems试剂盒购于英俊生物技术有限公司(Invitrogen)；Opti-MEM I Medium为GIBCO产品；荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG为Sigma产品。

1.2引物设计与合成

用于RT-PCR、融合PCR以及点突变的引物见表1，由英俊生物技术有限公司(invitrogen)合成。

注：斜体部分为限制性酶切位点序列；有下划线的序列为核酶序列；小写字母表示引入的突变核苷酸；引物依据IBDV HLJ-0504毒株的序列(GenBank登录号为GQ451330和GQ451331)设计。

1.3HLJ-0504株VP2基因突变位点的引入

为了在HLJ-0504株VP2上引入氨基酸突变Q253H和A284T，以pT-HLJ0504AHRT为模板，运用PCR介导的定点突变方法，在HLJ-0504株VP2基因上先后引入核苷酸突变A889T、G980A。所用的聚合酶是高保真的PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase。

首先，以pT-HLJ0504AHRT为模板，用引物GxA889TU/GxA889TL(表1)在HLJ-0504株VP2基因上引入核苷酸突变A889T。PCR程序是：95℃ 5min；95℃ 30s，55℃ 1min，68℃ 6min，18个循环；72℃ 10min。用DpnI降解PCR产物中被甲基化的模板pT-HLJ0504AHRT(37℃ 1h)，将处理过的PCR产物转化感受态细胞Top10F’，提取并鉴定阳性质粒，命名为pT-HLJ0504A889HRT。

然后，以pT-HLJ0504A889HRT为模板，用引物GxG980AU/GxG980AL(表1)在HLJ-0504株VP2基因上引入第二个核苷酸突变G980A。具体过程同上。最终获得VP2上带有两个核苷酸突变A889T、G980A的重组质粒pT-HLJ0504A889/980HRT。将pT-HLJ0504A889/980HRT送英俊生物技术有限公司(Invitrogen)测序，分别测三个克隆。

1.4HLJ-0504株VP2基因替换Gt株基因组相应区段

用融合PCR技术完成VP2基因的替换，具体步骤如下：

①第一步PCR：以pCAGGGtAHRT为模板，AU03/F9VP2Q173L为引物，扩增Gt株基因组A节段VP2基因之前的区段。反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30s，59.3℃ 30s，72℃ 30s，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物命名为GtHLJ0504VP2I(预期长度200bp)。

②第二步PCR：以pT-HLJ0504A889/980HRT为模板，以F9VP2Q173U/F9VP2Q1512L为引物，扩增经突变修饰的HLJ-0504株的VP2基因。反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30s，53.3℃ 30s，72℃ 1min 10s，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物命名为GtHLJ0504VP2II(预期长度1327bp)。

③第三步PCR：以pCAGGGtAHRT为模板，F9VP2Q1512U/AL03为引物，扩增Gt株基因组A节段VP2基因之后的区段。反应程序为：95℃ 5min；94℃ 30s，62.5℃ 30s，72℃ 2min 10s，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物命名为GtHLJ0504VP2III(预期长度1950bp)。

④第四步PCR(融合PCR)：以GtHLJ0504VP2I、GtHLJ0504VP2II、GtHLJ0504VP2III为模板，AU03/AL03为引物进行融合PCR反应，PCR为两个反应串联。第1个反应不加引物，条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，65℃2min，72℃ 3min 40s，循环8次；72℃延伸10min。反应完毕后在第1个反应的体系内加入引物AU03/AL03，继续进行第2个PCR反应，反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，68.6℃ 30s，72℃ 3min 40s，循环30次；72℃延伸10min。PCR产物命名为GtHLJVP2HRT(预期长度3406bp)(见图1)。

1.5感染性分子克隆的构建

将融合PCR产物GtAHLJVP2HRT经限制性内切酶Cla I/Kpn I酶切，与经同样酶切处理的体pCAGGS连接，筛选阳性克隆，经酶切、测序鉴定后，命名为pCAGGGtAHLJVP2HRT(见图2)。

1.6重组病毒拯救

用Plasmid Midi Kits(QIAGEN)制备纯化序列正确的重组质粒pCAGGGtAHLJVP2HRT和pCAGGGtBHRT，然后用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)介导共转染DFI细胞。具体操作如下：

①将DFI细胞饲养于六孔板内，待细胞生长至60-80％时(最好在细胞处于对数生长期内)进行转染；

②将重组质粒pCAGGGtAHLJVP2HRT和pCAGGGtBHRT(质粒浓度均为1μg/μl，每种质粒2μl)稀释于246μl Opti-MEM中，混匀静置；

③将10μl Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)稀释于240μl Opti-MEM中，轻微混匀，室温孵育5min；

④将稀释的质粒和Lipofectamine^TM 2000在一个EP管中轻微混匀，室温孵育20min；

⑤在此孵育时间内，将六孔板内培养液吸出，用无双抗的Hank’s液将细胞洗三次，再用少量的Opti-MEM I reduced serum medium(Opti-MEM)(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将待转染孔细胞洗一次，然后每孔加入0.5ml Opti-MEM，于37℃ CO₂培养箱孵育；

⑥待时间截止后，将500ul质粒和Lipofectamine^TM 2000混合液滴加于刚处理过的DFI细胞单层上，置37℃ CO₂培养箱孵育；

⑦8-10h后，吸去培养液，用含双抗的Hank’s液将细胞洗三次，每孔细胞加入2ml DMEM(含10％PAA胎牛血清和100U/ml双抗)置37℃ CO₂培养箱继续培养。

⑧72h后收获细胞悬液，反复冻溶3次，取细胞悬液连续在CEF上传代，拯救出的重组病毒被命名为rGtHLJVP2。同时设立空载体pCAGGS对照和正常细胞对照。

1.7拯救的重组病毒鉴定

1.7.1间接免疫荧光(IFA)检测

将重组病毒感染CEF，16h后，无水乙醇室温固定细胞20min，常规方法做IFA检测。所用一抗为抗IBDV-VP2单克隆抗体6H7D，二抗为荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG。同时设非感染CEF细胞对照。

1.7.2电镜观察

将收获的重组病毒细胞悬液反复冻融3次，3000rpm于4℃离心10min，取其上清12000rpm于4℃离心10min，适量PBS重悬沉淀，然后做负染电镜观察。同时设非感染CEF细胞对照。

1.7.3RT-PCR鉴定

用PureLink^TM Viral RNA/DNA Kits(Invitrogen)试剂盒按说明书从细胞毒中提取RNA，并进行反转录。以AU/F6VP2Q1512L、BU/B1344L引物分别扩增A、B节段的部分片段，将PCR产物克隆入pMD18T载体并测序鉴定。

1.8重组病毒在CEF细胞上的复制特性

重组病毒rGtHLJVP2以10⁴ TCID₅₀接种铺满单层的CEF，于感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h分别取细胞上清，常法滴定其TCID₅₀效价；重复测定3次，取其平均值，绘制病毒复制动力学曲线。同时设Gt株对照。

1.9动物实验

将14日龄SPF鸡随机分为三个组，每组45只。第1组，接种10^4.4TCID₅₀重组病毒rGtHLJVP2，接种途径为点眼滴鼻。第2组，接种10^4.4TCID₅₀Gt株病毒，接种途径为点眼滴鼻。第3组，接种200ul DMEM。接毒后每天观察鸡的精神状态。于接毒后3、5、7、10、14d，各组分别随机剖杀5只鸡。对剖杀鸡只分离血清，置于-70℃待检测其抗体水平。观察各脏器尤其是法氏囊的病变；采取法氏囊，计算囊重比和囊指数；每个法氏囊分两部分，一部分用10％中性福尔马林固定，进行病理组织学分析；另一部分则用于病毒基因组提取。

1.9.1囊重比

分别称取鸡的体重和法氏囊重量，统计分析后，计算囊重比(Bursalof fabricius weight/Body weight ratio，F/B)和囊指数(BBIX)。F/B＝(法氏囊重/体重)X1000；BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡囊肿比；当BBIX＜0.7时，判为法氏囊萎缩。

1.9.2重组病毒体内复制动力学研究

将接毒后3、5、7、10、14d的部分法氏囊用适量PBS研磨，将悬液反复冻溶三次，常法提取IBDV全基因组RNA，利用本实验室建立的real-timeRT-PCR方法检测法氏囊中的病毒载量。每个时间点重复三次，计算其平均数和标准差，绘制病毒复制动力学曲线。

1.9.3试验鸡血清抗体的检测

用IDEXX IBDV Antibody Test Kit检测接毒后3、5、7、10、14d分离的血清中的抗体效价，具体步骤见说明书。

1.9.4试验鸡法氏囊中IBDV基因组部分片段扩增及测序

取各试验组部分法氏囊用适量PBS研磨，将悬液反复冻溶三次，按照1.7.3方法，以AU/F6VP2Q1512L、BU/B1344L引物分别扩增IBDV A、B节段的部分片段，将PCR产物克隆入pMD18T载体并测序鉴定。

1.9.5攻毒保护试验

上述试验结束后，对每组中的剩余鸡只进行攻毒保护实验。用地方流行分离超强毒株HLJ-0504[购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所菌毒种室(对外)]，对每只鸡进行攻毒，途径为滴鼻点眼，攻毒剂量为10⁴ELD₅₀，统计各试验组的死亡数，计算其攻毒保护率。

1.10拯救病毒遗传稳定性试验

1.10.1在CEF细胞上的稳定性

将重组病毒在CEF细胞上连续传代至15代，按1.7.3方法进行IBDV基因组片段扩增和和测序分析。

1.10.2在SPF鸡上的遗传稳定性

将重组病毒在2周龄SPF鸡上连续传代至5代。每代接种后连续观察5天；然后将其剖杀采集法氏囊，按1.7.3方法进行IBDV基因组片段扩增和和测序分析。并将每代部分法氏囊经10％中性福尔马林固定后进行病理组织学观察。

2、试验结果

2.1VP2修饰、替换与感染性分子克隆构建

通过融合PCR将HLJ-0504株带有两个点突变的VP2基因替换了Gt株A节段的相应区段，融合PCR各步的PCR产物分别是GtHLJ0504VP2I(203bp)、GtHLJ0504VP2II(1327bp)、GtHLJ0504VP2III(1938bp)、GtHLJVP2HRT(3406bp)，与预期相符(图3)。GtHLJVP2HRT经ClaI和KpnI双酶切后被克隆入pCAGGS，得到的重组真核表达载体命名为pCAGGGtAHLJVP2HRT。测序结果证明，HLJ0504株VP2基因被成功引入两个点突变A889T/G980A；修饰后的HLJ-0504株VP2基因正确替换Gt株基因组相应区段；重组A节段5’端和3’端分别存在核酶结构序列HamRz和HdvRz；重组感染性克隆pCAGGGtAHLJVP2HRT构建正确。

2.2病毒拯救

pCAGGGtAHLJVP2HRT与pCAGGGtBHRT共转染组，在CEF上传第三代时，可见细胞病变(CPE)(图4)；第三代以后，CPE更加明显；接毒后72h，细胞碎裂但不悬浮，折光性增强，呈砂砾状。而空载体对照组和正常细胞未见CPE。将拯救获得的重组病毒命名为rGtHLJVP2。

2.3重组病毒的鉴定

2.3.1重组病毒IFA检测

抗VP2单克隆抗体介导的间接免疫荧光鉴定结果显示，rGtHLJVP2感染CEF后可检测到特异荧光信号(图5)。而未接毒对照组观察不到荧光信号。

2.3.2重组病毒电镜观察

电镜下可观察到rGtHLJVP2细胞培养物上清中有直径60nm左右、无囊膜的病毒粒子，这与IBDV特有的形态结构一致(图6)，而非感染CEF细胞电镜下观察不到病毒粒子。

2.3.3重组病毒RT-PCR鉴定

从rGtHLJVP2第四代毒中扩增A、B节段部分片段，获得了预期大小约为1400bp、1340bp的片段。测序结果显示，序列特征与预期一致，即重组病毒rGtHLJVP2是以Gt株病毒基因组为骨架，其VP2基因被修饰后的HLJ-0504相应区段所替换。

2.4重组病毒复制特性研究

2.4.1体外复制特性

依据感染CEF后不同时间段细胞培养液中病毒的TCID₅₀效价，绘制了重组病毒rGtHLJVP2和Gt对照毒的复制动力学曲线(图7)。重组病毒rGtHLJVP2与Gt具有相似的复制动力学曲线，接毒后12h可检测到病毒；接毒后48h-60h，病毒滴度可达到10⁷TCID₅₀/ml以上。

2.4.2体内复制特性

应用real-time RT-PCR测定了拯救病毒rGtHLJVP2和Gt对照毒在感染SPF鸡后不同时间点内靶器官法氏囊中的病毒载量，体内复制动力学曲线表明：拯救病毒rGtHLJVP2与Gt在体内复制能力相当(图8)。

2.5重组病毒的致病性

2.5.1症状及剖检变化

重组病毒rGtHLJVP2与Gt对照组和DMEM对照组一样，在接种SPF鸡后的14天内，试验鸡的精神状态良好，未出现任何发病症状；法氏囊及其它脏器未见到眼观病变。

2.5.2试验鸡的囊指数

各试验组囊指数(BBIX)见图9。重组病毒rGtHLJVP2与Gt对照组和DMEM对照组一样，在接种SPF鸡后的14天内，BBIX均大于0.7，即法氏囊没有出现萎缩症状。

2.5.3试验鸡法氏囊的组织病理变化

重组病毒rGtHLJVP2与Gt对照毒试验组，仅在感染后3天(3dp.i.)和5d p.i.个别淋巴滤泡内呈现淋巴细胞轻度减少，之后法氏囊均无发现明显病理变化。DMEM阴性对照组法氏囊无明显病变(图10)。

2.6重组病毒的免疫效果评价

2.6.1试验鸡血清抗体的检测结果

血清抗体检测结果见表2。7d p.i.，重组病毒rGtHLJVP2组有80％鸡阳转，对照毒Gt试验组有60％鸡阳转；10d p.i.后，rGtHLJVP2组和Gt组均发生100％阳转。抗体产生情况见图11，7d p.i.后，rGtHLJVP2组抗体效价显著高于Gt组。DMEM阴性对照组未检测到特异性抗体。

表2各试验组鸡血清抗体效价检测

注：a表示血清抗体阳转鸡只数/检测的鸡只

2.6.2攻毒保护试验

攻毒结果显示，rGtHLJVP2组在攻毒后连续10天观察期内未出现鸡只死亡，保护率达到100％(20/20)；Gt组有1只鸡死亡，保护率为95％(19/20)；而DMEM组保护率仅为15％(3/20)。

2.7重组病毒rGtHLJVP2遗传稳定性

2.7.1重组病毒基因组序列的稳定性

通过RT-PCR，从rGtHLJVP2在CEF细胞上的第5、10、15代病毒，以及在SPF鸡上传代的第1、5代毒中扩增获得A、B节段部分片段，获得了预期大小约为1400bp、1340bp的片段。测序结果显示，序列特征与rGtHLJVP2一致，在CEF细胞和SPF鸡上传代均未发生额外突变。

2.7.2重组病毒复制滴度的稳定性

重组病毒rGtHLJVP2在CEF细胞上的第8代和第15代滴度分别为10⁷TCID₅₀/ml、10^7.2TCID₅₀/ml，差异不显著。

2.7.3重组病毒致病力的稳定性

重组病毒rGtHLJVP2在SPF鸡上盲传5代，接种鸡未出现任何临床症状；剖检和病理切片均显示，法氏囊及其它脏器未出现显著特征性病理变化。说明重组病毒rGtHLJVP2未出现致病力返强现象。

试验例1 rGtHLJVP2的免疫学评价试验

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒和实验动物

HLJ-0504和vvIBDV均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所菌毒种室(对外)；Gt，IBDV弱毒疫苗株，由本课题组将vvIBDV Gx株连续传代致弱并保存，具体方法可参考有关文献(Wang X M，Zeng X W，Gao H L，et al.Changes in VP2 gene during the attenuation of very virulent infectious bursaldisease Virus strain Gx isolated in China.Avian Dis.，2004，48：77-83；Wang，X.，Zhang H.，Gao H.，et al.Changes in VP3 and VP5 genes during the attenuation ofvery virulent infectious bursal disease virus strain Gx isolated in China.VirusGenes，2007，34：67-73.)。

B87疫苗，为IBDV中等毒力活疫苗(可通过生物制品公司购买得到)。

SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，饲养于超滤负压隔离器中。

1.2.2主要试剂

鸡淋巴细胞分离液(LTS-1090)购于天津灏洋生物制品科技有限责任公司；Mouse Anti-Chicken CD4-FITC、Mouse Anti-Chicken CD8b-RPE、Mouse Anti-Chicken CD3-SPRD、Mouse IgG1-FITC、Mouse IgG2a-RPE、Mouse IgG1-SRPD购于SouthernBiotech公司；肝素钠(GMS12059.5)购于Invitrogen公司；鸡γ-IFN ELISA KIT、鸡IL-2 ELISA KIT、鸡IL-4 ELISAKIT为SAN JOSE产品。

1.2试验分组与免疫

随机将14日龄的SPF鸡分为4组，每组50只，各组鸡均单独饲养在负压超滤隔离器中。所有鸡只均通过滴鼻点眼途径免疫，7日龄首免，间隔一周进行二免。第1组免疫10⁵ TCID₅₀的重组病毒rGtHLJVP2，第2组免疫10⁵TCID₅₀弱毒疫苗株Gt，第3组免疫10³ELD₅₀中等毒力疫苗B87，第4组为DMEM对照组。第二次免疫剂量和途径同一免。

1.3血清抗体检测

分别在第一次免疫后7天，第二次免疫后7、14、21天采血并分离血清，置于-70℃。用IDEXX IBDV Antibody Test Kit检测上述试验设计中所分离血清的抗体水平，滴度大于396判为阳性。

1.4疫苗株致病力评估

分别在第二次免疫后7、14、21天每组随机剖杀10只鸡，观察各脏器尤其是法氏囊的病变。同时称量实验鸡体重和法氏囊的重量，计算囊重比和囊指数；将其每个法氏囊分为两部分，一部分用10％中性福尔马林固定，进行病理组织学分析；另一部分则用于Real-time RT-PCR病毒载量的检测。

1.4.1囊重比与囊指数

分别称取鸡的体重和法氏囊重量，统计分析后，计算囊重比(Bursalof fabricius weight/Body weight ratio，F/B)和囊指数(BBIX)。F/B＝(法氏囊重/体重)X1000；BBIX＝试验组鸡囊重比/空白对照组鸡囊肿比；当BBIX＜0.7时，判为法氏囊萎缩。

1.4.2法氏囊组织病理学观察

观察和分析法氏囊病理切片，判断组织学病变分值(Thehistopathologic bursal lesion score，HBLS)。根据法氏囊病理组织学变化(淋巴细胞坏死、淋巴滤泡萎缩或减少等)的不同程度，将其分为5个分值：1，没有任何病变；2，散在的或部分滤泡病变；3，小于或等于50％的滤泡发生病变；4，50％-75％的滤泡发生病变；5，75％-100％的滤泡发生病变。每组各时间点的HBLS为3只鸡的平均数。

1.5疫苗株在法氏囊中的载量检测

从二免后7、14、21天的法氏囊中常规方法提取RNA，用real-timeRT-PCR检测病毒载量。

1.6攻毒保护试验

第二次免疫后21天，rGtHLJVP2组、Gt组、B87组、DMEM组各剩余免疫鸡20只。用地方流行超强毒株HLJ-0504对每组鸡进行攻毒，以检测疫苗株的攻毒保护效果，途径为滴鼻点眼，攻毒剂量为10⁴ELD₅₀。攻毒后连续观察10天，统计各试验组的死亡数，计算其攻毒保护率。并在攻毒后3，7，10天采集血清。

2试验结果

2.1试验鸡血清抗体水平比较

各试验组的抗体消长曲线见图12。一免后和二免后，rGtHLJVP2、Gt及B87试验组的抗体水平逐步升高；rGtHLJVP2组和B87组抗体消长曲线基本一致；rGtHLJVP2组和B87组的抗体效价明显高于Gt组，其中二免后第3周，rGtHLJVP2组和B87组的抗体效价比Gt组高2倍。攻毒后，各组抗体效价短暂小幅下降后，快速回升。

2.2疫苗株的致病力比较

2.2.1试验鸡的囊指数

依据各试验组的囊指数(BBIX)绘制的法氏囊病理动态变化曲线见图13。1)rGtHLJVP2与Gt试验组，除二免后1周(7d p.i.)外，在免疫后各试验期内均没有出现法氏囊萎缩的症状，即BBIX均大于0.7；2)rGtHLJVP2组与Gt组法氏囊的变化趋势基本一致；3)疫苗组B87试验组各时期内法氏囊都处于严重的萎缩状态，免疫期内其BBIX值介于0.21-0.37之间，明显低于rGtHLJVP2与Gt试验组。

2.2.2试验鸡法氏囊的组织病理变化

各实验组的法氏囊组织病理变化见图14，组织学病变分值见表3。

1)rGtHLJVP2与Gt试验组相似，在整个免疫期内，法氏囊基本正常，仅个别淋巴滤泡出现轻度减少，组织学病变分值HBLS均小于2。2)B87疫苗对照组对法氏囊的病理损伤很严重，法氏囊滤泡体积萎缩，滤泡内淋巴细胞显著减少，间质内成纤维细胞增生，HBLS始终为5。

表3各试验组鸡法氏囊的HBLS

2.3试验鸡法氏囊病毒载量的检测

二免后，rGtHLJVP2组、B87组以及Gt组的法氏囊中均能检测到IBDV，病毒载量均在1000拷贝/g组织以上(图15)。

2.4疫苗株免疫保护效果比较

2.4.1对致死率的保护

攻毒保护实验结果显示，rGtHLJVP2和B87试验组在攻毒后连续10天观察期内未出现鸡只死亡，保护率达到100％(20/20)；Gt组有1只鸡死亡，保护率为95％(19/20)；而DMEM组攻毒后，只有3只鸡存活，其保护率仅为15％(3/20)。

2.4.2对法氏囊损伤的保护

rGtHLJVP2与Gt免疫组，即使在vvIBDV攻击后，其法氏囊仍然没有发生萎缩，而B87组和Gt组在vvIBDV攻击后BBIX分别降到了0.18和0.13的极低水平(图14和表3)。

rGtHLJVP2与G t试验组在vvIBDV攻击后法氏囊能保持基本正常状态，仅个别淋巴滤泡出现减少；而B87疫苗对照组和DMEM对照组一样，在vvIBDV攻击后法氏囊病理变化更加严重(图14)。

目前防控vvIBDV的活疫苗主要有2类：弱毒活疫苗、中等或中等偏强毒力活疫苗。本试验利用SPF鸡比较和评价了IBDV重组弱毒疫苗株rGtHLJVP2与弱毒疫苗Gt、中等毒力疫苗B87的免疫效力和安全性。在免疫效果上，rGtHLJVP2和中等毒力疫苗B87相当，优于弱毒疫苗株Gt；在安全性上，rGtHLJVP2和弱毒疫苗株Gt一样对SPF鸡无致病性，但中等毒力疫苗B87对法氏囊造成了严重萎缩和不可逆病理损伤。本发明重组病毒rGtHLJVP2具备了作为疫苗株的高效、低毒的特点，可以用于IBD的防控。

Claims (3)

1.一株鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus)重组弱毒疫苗株，其微生物保藏号是：CGMCC No.3749。

2.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株在制备预防或治疗鸡传染性法氏囊病生物制品中的用途。

3.权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒重组弱毒疫苗株在制备诊断鸡传染性法氏囊病生物制品中的用途。

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