CN104849463B - 一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法，同时提供了尤其适用于该方法的两株单克隆抗体细胞株。本发明在检测前先对二价疫苗中的抗原进行中和，得到仅含有一种抗原的待测样品再进行检测，从而避免了多抗原存在对检验结果所产生的交叉影响。与此同时，选择更加客观的定量分析方法并优化了相关工艺条件。本发明所提供的两株杂交瘤细胞性能优异，均具有与自身特异反应强、与另一抗原无交叉反应的特性，可以较好的将两株病毒区分开，尤其适用于本发明所述检测方法。

Description

一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的急性、高度接触性传染病。其多表现为鸡精神倦怠、被毛松乱及呼吸道症状，如气喘、呼吸困难，剖检后气管有大量分泌物。鸡支气管炎病毒按临床症状主要分为呼吸型、肾型、生殖道型及变异型。严重的鸡传染性支气管炎病可致鸡死亡，其病死率为40％-90％，即使不发生死亡也会对鸡的生产性能产生较大影响，因此对我国养禽业有极为重要的影响。对于本病的防治仍然是预防为主。
随着对该病认识的深入和重视，针对不同临床型的疫苗也陆续被研究出来，市场上对不同临床型的多价多联疫苗的需求量也日益增加。对鸡传染性支气管炎多价疫苗效力检验一是用攻毒保护的实验方法，二是用高免血清中和的方法。攻毒保护的方法使用实验动物数量较多且用强毒操作存在散毒等生物安全风险。而用高免血清中和后接种鸡胚的方法，虽不直接接触强毒但由于血清中成分较为混杂，常出现交叉保护的问题，因此这种方法检测多价疫苗结果不准确。
此外，传统的鸡胚检测法检测周期长达144小时，且判定阳性时使用观察鸡胚病变和称重的办法。该方法主观性较大，在称重过程中由于鸡胚在液体环境中本身附着液体量不一致，导致在判定临界值时误差较大。
单克隆抗体制备技术今年来越来越多的应用与疾病检测、治疗的相关领域，其最大的优点在于制备出的抗体可针对某一抗原表位从而产生不同于其他病毒株的特异性抗体。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种鸡传染性支气管炎二价疫苗效力检验方法，以克服现有技术中多价疫苗效力检验方法所存在的耗时长、不准确等技术问题。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种鸡传染性支气管炎K136株、H120株二价疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
1)利用第一杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或利用第二杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体；
2)取待检验活疫苗与所述抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体混合，完全中和得到唯一抗原溶液；
3)利用步骤2)所述唯一抗原溶液接种鸡胚，弃去接种后24h内死亡胚，至48h取出全部鸡胚；
4)分别测定上述全部鸡胚尿囊液中病毒含量。
优选的，步骤2)具体为：先将待检验活疫苗稀释至2羽剂量/mL再混合；在此基础上还可以进一步优选的，步骤2)具体为：混合比例为1:(0.5～2)(v/v)，混合后于22～28℃中和反应25～35min。
优选的，步骤3)所述的接种方法为：将步骤2)得到的唯一抗原溶液依照其中抗原浓度分别稀释至10-2羽剂量/0.1ml、10-3羽剂量/0.1ml、10-4羽剂量/0.1ml，分别吸出0.1ml接种10日龄SPF鸡胚。
优选的，步骤4)对病毒含量的测定是利用RT-PCR法实现的。
优选的，步骤4)完毕后还包括步骤5)，所述步骤5)具体为：将步骤4)测定的结果确定出病毒感染阳性例，进而计算半数感染量。上述结果可以依据《中国兽药典》附录七规定的阳性例来确定。
同时本发明还提供了一种权利要求1所述的第一杂交瘤细胞，其保藏编号为CCTCCC2014171。
同时本发明还提供了一种权利要求1所述的第二杂交瘤细胞，其保藏编号为CCTCCC2014170。
在以上技术方案中，保藏编号为CCTCC C2014171和CCTCC C2014170两种生物材料的保藏单位均为“中国典型培养物保藏中心”，其地址为“湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内”，二者保藏日期均为2014年9月4日。
在以上技术方案中：
所述第一杂交瘤细胞是具备分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体的杂交瘤细胞；所述第二杂交瘤细胞是具备分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明在检测前先对二价疫苗中的抗原进行中和，得到仅含有一种抗原的待测样品再进行检测，从而避免了多抗原存在对检验结果所产生的交叉影响，进而保证检测结果的客观性。与此同时，本发明选择对感染后鸡胚尿囊液中的病毒含量进行定量分析而非粗放的称重对比，能够更加准确的反应实验结果，同时使得检测时间显著降低。此外，本发明在公知方法的基础上对抗原抗体反应的混合条件、接种工艺做了相应的优选，使得优选工艺更加适合该检测方法。
本发明所提供的两株杂交瘤细胞由发明人制备得到，其性能优异，均具有与自身特异反应强、与另一抗原无交叉反应的特性，可以较好的将两株病毒区分开，尤其适用于本发明所述检测方法。
本发明利用相对简单的技术手段实现了良好的技术效果，从根本上解决了现有技术中用动物检验不安全和用血清检验不准确的问题，同时显著降低了检测时间和实施成本，具有突出的推广前景。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的术语“第一”、“第二”等并不表示任何顺序、数量或重要性，而仅用于区别一种物质和另一种物质。
实施例1(两株杂交瘤细胞的制备)
一、抗原的制备
1、单克隆抗体6G8株抗原的制备
将鸡传染性支气管炎病毒K136株接种于10日龄SPF鸡胚，6天后无菌收获鸡胚尿囊液。将尿囊液差速离心具体方法如下：取-20℃冻存的病毒液融化后，5000g，4℃离心30min，弃沉淀取上清液，再14000g，4℃离心20min，弃杂蛋白，取上清液。然后进行超速离心：将上一步得到的上清液以66100g(TYPE60Ti，BeckmanL8-M)4℃离心1.5h，弃上清，沉淀加入2mLTEN缓冲液(50mM Tris-HCL、50mM NaCl、5mM Na2EDTA、PH7.4)，并在无菌条件下降沉淀吹打使其分散、溶解。放入-70℃冰箱备用。
取少量浓缩后的病毒蛋白进行不同程度稀释，用紫外分光光度计测定病毒的OD260和OD280值，使OD值在0.3-0.7间，再用公式“蛋白浓度＝1.45OD280-0.74OD260”计算出稀释后的浓度，最后乘以稀释倍数，获得纯化病毒含量。
2、单克隆抗体5D5株抗原的制备
将鸡传染性支气管炎病毒H120株接种于10日龄SPF鸡胚，6天后无菌收获鸡胚尿囊液。其他步骤同上。
二、杂交瘤细胞制备
取适量的相应的病毒液与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射6周龄BALB/c小鼠，每只0.2ml；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；3天后融合。
将加强免疫后3天的小鼠，眼眶采血作为阳性血清，颈脱臼将小鼠致死，无菌打开腹腔取出脾脏，用研磨棒挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。选择生长状态良好的骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)和制备好的脾淋巴细胞按1:5混合在一支融合管中，1000rpm离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37℃水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL 37℃预热的无抗不完全DMEM培养基，使PEG稀释而失去作用，37℃静止10min，1000rpm离心10min；弃上清，用60mL HAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞；分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃5％CO2培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT培养基换出一半培养基；10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清进行抗体检测。
通过间接ELISA检测的方法，对融合细胞上清液中的抗体进行检测。取经纯化并灭活后的相应的抗原与碳酸盐缓冲液(pH9.0)按1:1000稀释。将此稀释液加入酶标反应板中，每孔100μL，置于4℃冰箱过夜或37℃温箱2小时。弃去液体用PBST洗液洗涤3次。拍干后每孔加入200ul封闭液，37℃温箱封闭2小时，弃去液体，用PBST洗液洗涤3次后拍干作为抗原包被板。
将融合细胞上清液加入相应的抗原包被板中，37℃孵育1小时，同上用PBST洗液洗涤3遍；加入终浓度1:10000稀释的羊抗鼠HRP-IgG 50μl/孔，37℃孵育1h，同上洗涤3遍；加入TMB显色液50μl/孔，37℃反应10-15min；加入2M H2SO450μl/孔终止反应。测定孔内的OD450。用免疫小鼠血清作为阳性对照，用非免疫小鼠血清作为阴性对照，同时设立空白对照孔。
用有限稀释法将间接ELISA方法检测出的阳性杂交瘤细胞吹下，按1个细胞/孔、3个细胞/孔、10个细胞/孔加入到装有饲养细胞的96孔板中；37℃5％CO2培养箱培养7-10天，对出现单个细胞克隆孔的上清再用间接ELISA方法进行检测；连续进行3-4次亚克隆，至每个细胞孔上清均为阳性时可以定株。两株K136病毒株获得杂交瘤细胞株为6G8，后经保藏得到其保藏编号为CCTCC C2014171，H120病毒株获得杂交瘤细胞株为5D5，后经保藏得到其保藏编号为CCTCC C2014170。
实施例2(对实施例1制备的两株杂交瘤细胞所产生抗体的特异性鉴定)
分别将K136株病毒和H120株病毒包被在96孔酶标板中，用两株杂交瘤细胞株上清液分别与之反应结果如表1所示：
表1抗原抗体反应结果
K136株 H120株 NDV 空白对照
6G8 1.964* 0.106 0.089 0.043
5D5 0.096 1.725 0.091 0.052
*ELISA实验OD值
以上结果表明实施例1制备的杂交瘤细胞6G8、5D5分别对鸡传染性支气管炎K136株、H120株具有良好的特异性。
实施例3(利用实施例1制备的两株杂交瘤细胞分别制备抗体并纯化)
一、两株单抗腹水的制备与纯化
取8周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mL/只；1周后腹腔分别注射用PBS稀释的处于对数生长期的两株细胞，1×106CFU/只；待小鼠腹部明显隆起时，用16号针头从腹腔采集腹水，2500rpm离心10min，去除脂肪组织，将上清取出，-70℃保存备用。
采用间接ELISA的方法，将所制得腹水先按1:1000稀释，再按2倍倍比稀释，依次加入包被抗原的酶标孔内，其他步骤同前。结果6G8株单抗效价为1：6.4*104；5D5株单抗效价为3.2*104。
对其进行单抗亚类鉴定，操作步骤如下：按单克隆抗体亚类试剂盒说明书介绍的方法进行。酶标板内分别加入四种单抗腹水1:5000稀释100uL/孔，37℃孵育1小时，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入工作浓度羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA亚类血清100μL/孔，每株单抗加每种亚类两孔，37℃孵育30min，PBST洗涤3次，每次5min；加入1:1000稀释的兔抗羊辣根过氧化物酶结合物100uL/孔，37℃孵育15min，PBST洗涤3次，每次5min；加TMB显色液100μL/孔，37℃避光显色5-10min；用2M H2S04100uL/孔终止反应；在450nm波长下测定OD值。以OD值明显高于其他孔者所加亚类血清为单抗亚类。结果两株单抗均为IgG3。
将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化，取20ml经预处理的腹水置于小烧杯中，在搅拌下滴加饱和硫酸铵溶液10ml，连续缓慢搅拌30min，然后以10000g离心15min.
二、抗体稀释倍数的确定
分别将两株纯化后的单抗进行1:50、1:100、1:200稀释，然后与相应病毒1:1混合接入5枚10日龄SPF鸡胚，选择5枚鸡胚全部没有死亡或病变的组作为抗体最佳稀释倍数。本批纯化后的抗体6G8株其最佳稀释倍数为1:100，5D5株最佳稀释倍数为1:50。
实施例4(利用实施例3制备的两种抗体执行鸡传染性支气管炎K136株、H120株二价活疫苗效力检验)
将二价活疫苗稀释至2羽/1ml，分别与稀释好的6G8株单抗和5D5株单抗进行1:1混合25℃中和30min。中和后用将混合液10倍稀释至10-4羽/0.1ml。将10-2羽/0.1ml，10-3羽/0.1ml和10-4羽/0.1ml分别吸出0.1ml接种10日龄SPF鸡胚。接种后24小时照胚，弃去死亡的鸡胚，连续观察取出死胚，至45小时全部取出，放入2-8℃冰箱冷蛋。设计检测引物为P1：5’-CCTAAGAACGGTTGGAA-3’，P2:5’-TACTCTCTACACACACAC-3’。无菌取尿囊液各500μL，用RNAisol裂解法提取病毒RNA，进行转录反应体系为20μL，含随机引物2μL、RNA 8μL、DEPC水2μL，混合均匀70℃保温10min后，冰上急冷2min；瞬离反应管；上述反应管中配制下列反应体系：RNA/引物变性溶液12μL、10mmol/L dNTP1μL、5×M-MLV Buffer 4μL、RNase Inhibitor0.5μL、RNase H-0.5μL、DEPC水2μL，30℃反应30min，42℃水浴作用1h，-70℃15min后，-20℃保存。PCR产物预测大小为740bp。PCR反应体系:ddH2O 17.25μL、10×Buffer 2.5μL、2.5mmol/L dNTP 2μL、P1(10pmol/L)0.5μL、P2(10pmol/L)0.5μL,ExTaq酶(5U/uL)0.25μL,cDNA 2μL。反应条件:95℃预变性3min；95℃30s,53℃30s,72℃1min,30个循环；72℃延伸10min。PCR反应产物于2％的琼脂糖凝胶中电泳观察。根据RT-PCR阳性判定该鸡胚为阳性，从而计算EID50。结果为鸡传染性支气管炎(K136株、H120株)二价活疫苗，K136株部分效价为104.5EID50/羽份；H120株部分效价为104.375EID50/羽份。符合质量标准。
实施例5(一种鸡传染性支气管炎K136株、H120株二价疫苗效力检验方法)
包括以下步骤：
1)利用第一杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或利用第二杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体；
2)取待检验活疫苗与所述抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体混合，完全中和得到唯一抗原溶液；
3)利用步骤2)所述唯一抗原溶液接种鸡胚，弃去接种后24h内死亡胚，至48h取出全部鸡胚；
4)分别测定上述全部鸡胚尿囊液中病毒含量。
实施例6(一种鸡传染性支气管炎K136株、H120株二价疫苗效力检验方法)
包括以下步骤：
1)利用第一杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或利用第二杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体；
2)取待检验活疫苗与所述抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体混合，完全中和得到唯一抗原溶液；
3)利用步骤2)所述唯一抗原溶液接种鸡胚，弃去接种后24h内死亡胚，至48h取出全部鸡胚；
4)分别测定上述全部鸡胚尿囊液中病毒含量。
在此基础上，步骤2)具体为：先将待检验活疫苗稀释至2羽剂量/mL再混合。混合比例为1:0.5(v/v)，混合后于22℃中和反应25min。
步骤3)所述的接种方法为：将步骤2)得到的唯一抗原溶液依照其中抗原浓度分别稀释至10-2羽剂量/0.1ml、10-3羽剂量/0.1ml、10-4羽剂量/0.1ml，分别吸出0.1ml接种10日龄SPF鸡胚。
步骤4)完毕后还包括步骤5)，所述步骤5)具体为：将步骤4)测定的结果依据《中国兽药典》附录七规定的阳性例标准确定出病毒感染阳性例，进而计算半数感染量。
上述第一杂交瘤细胞，是保藏编号为CCTCC C2014171的杂交瘤细胞
上述第二杂交瘤细胞，其保藏编号为CCTCC C2014170的杂交瘤细胞。
实施例7(一种鸡传染性支气管炎K136株、H120株二价疫苗效力检验方法)
包括以下步骤：
1)利用第一杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或利用第二杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体；
2)取待检验活疫苗与所述抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体混合，完全中和得到唯一抗原溶液；
3)利用步骤2)所述唯一抗原溶液接种鸡胚，弃去接种后24h内死亡胚，至48h取出全部鸡胚；
4)分别测定上述全部鸡胚尿囊液中病毒含量。
在此基础上，步骤2)具体为：先将待检验活疫苗稀释至2羽剂量/mL再混合。混合比例为1:2(v/v)，混合后于28℃中和反应35min。
上述第一杂交瘤细胞，是任意一种能产生抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体的杂交瘤细胞。
上述第二杂交瘤细胞，是任意一种能产生抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体的杂交瘤细胞。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种鸡传染性支气管炎K136株、H120株二价疫苗效力检验方法，其特征在于包括以下步骤：
1)利用第一杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或利用第二杂交瘤细胞分泌抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体；
2)取待检验活疫苗与所述抗鸡传染性支气管炎病毒K136株单克隆抗体或抗鸡传染性支气管炎病毒H120株单克隆抗体混合，完全中和得到唯一抗原溶液；
3)利用步骤2)所述唯一抗原溶液接种鸡胚，弃去接种后24h内死亡胚，至48h取出全部鸡胚；
4)分别测定上述全部鸡胚尿囊液中病毒含量；
其中，所述第一杂交瘤细胞是保藏编号为CCTCC C2014171的杂交瘤细胞；所述第二杂交瘤细胞是保藏编号为CCTCC C2014170的杂交瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)具体为：先将待检验活疫苗稀释至2羽剂量/mL再混合。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)具体为：混合比例为1:(0.5～2)(v/v)，混合后于22～28℃中和反应25～35min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)所述的接种方法为：将步骤2)得到的唯一抗原溶液依照其中抗原浓度分别稀释至10-2羽剂量/0.1ml、10-3羽剂量/0.1ml、10-4羽剂量/0.1ml，分别吸出0.1ml接种10日龄SPF鸡胚。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)对病毒含量的测定是利用RT-PCR法实现的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4)完毕后还包括步骤5)，所述步骤5)具体为：将步骤4)测定的结果确定出病毒感染阳性例，进而计算半数感染量。
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