JP2007525178A - メタニューモウイルス株、そのワクチン製剤における用途、抗原性配列の発現のためのベクターとしての用途、並びにウイルス増殖方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルス、すなわちパラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科のニューモウイルス(Pneumoviridae)亜科に属するメタニューモウイルス(MPV)に関する。また本発明は、メタニューモウイルス属及びその構成要素に系統学的に一致し又は関連するものとして同定可能な、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルスにも関する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株、特にヒトメタニューモウイルスの分離株のゲノムヌクレオチド配列に関する。本発明は、診断及び治療方法を目的とした、哺乳動物メタニューモウイルスの種々の分離株の配列情報の使用に関する。本発明は、哺乳動物メタニューモウイルス及びトリニューモウイルスの両方を含むメタニューモウイルスのゲノム又はその一部をコードするヌクレオチド配列に関する。本発明はさらに、該ヌクレオチド配列によりコードされるキメラウイルス又は組換えウイルスを包含する。本発明はまた、1以上の非天然又は異種配列を含むキメラ及び組換え哺乳動物MPVに関する。本発明はさらに、哺乳動物又はトリニューモウイルス(該ウイルスの組換え及びキメラ形態を含む)を含むワクチン製剤に関する。本発明のワクチン製剤は、多価ワクチン、例えば二価及び三価ワクチン製剤を包含する。
本出願は、米国特許仮出願第60/465,811号(2003年4月25日出願)、米国特許仮出願第60/466,776号(2003年4月30日出願)、米国特許仮出願第60/480,658号(2003年6月20日出願)、米国特許仮出願第60/498,640号(2003年8月28日出願)、米国特許仮出願第60/550,911号(2004年3月5日出願)(これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる)の優先権を主張する。
古典的には、破壊的な疾患媒体としてパラミクソウイルスは、毎年世界中の多数の動物やヒトの死亡の原因となっている。パラミクソウイルスは、モノネガウイルス目(Mononegavirales)(マイナス−センス1本鎖RNAウイルス)内の科であり、パラミクソウイルス亜科(Paramyxovirinae)とニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)からなる。後者の亜科は現在分類学的に、ニューモウイルス属(Pneumovirus)とメタニューモウイルス属(Metapneumovirus)とに分けられる(Pringle, 1999, Arch. Virol. 144/2,2065-2070)。ニューモウイルス属(Pneumovirus)の1つの種であるヒト呼吸器合胞体ウイルス(hRSV)は、世界中で幼児及び小児の間の下気道感染症の単一の最も重要な原因である(Domachowske & Rosenberg, 1999, Clin. Microbio. Rev. 12(2):298-309)。ニューモウイルス属の他のメンバーには、ウシ及びヒツジの呼吸器合胞体ウイルスとマウスのニューモウイルス(PVM)がある。
トリニューモウイルス(APV)が引き起こす呼吸系疾患は、南アフリカで1970年代後半に最初に記載され(Buysら、1980, Turkey 28:36-46)、そこでは七面鳥産業にとって壊滅的な影響があった。七面鳥の疾患は副鼻腔炎と鼻炎を特徴とし、七面鳥鼻気管炎(TRT)と呼ばれた。APVのヨーロッパ分離株はまた、ニワトリの頬腫れ症候群(swollen head syndrome)の要因であることが強く示唆されている(O'Brien, 1985, Vet. Rec. 117:619-620)。元々この疾患は、ニューカッスル病ウイルス(NDV)に感染したブロイラーニワトリの群に出現し、ニューカッスル病(ND)に関連する二次的問題であると考えられた。ヨーロッパAPVに対する抗体が、SHSの発症後罹患したニワトリで検出され(Cookら、1998, Avian Pathol. 17:403-410)、APVが原因であることを示唆している。
パラインフルエンザウイルス感染は、幼児と小児で重症の呼吸器疾患を引き起こす(Taoら、1999, Vaccine 17:1100-08)。感染性パラインフルエンザウイルス感染症は、世界中で呼吸器感染症にかかった小児患者のすべての入院数の約20%を占める。同上。
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、幼児と小児の重症の下気道疾患の主原因である(Feigenら(編)、1987、Textbook of Pediatric Infectious Diseases中、ダブリュー・ビー・ソンダース(WB Saunders)、フィラデルフィア、1653〜1675頁;New Vaccine Development, Establishing Priorities、第1巻、1985、ナショナルアカデミープレス(National Academy Press)、ワシントンDC、397〜409頁;及びRuuskanenら、1993, Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79)。RSV感染の毎年の流行性は世界的に明らかであるが、ある季節のRSV疾患の発症率と重症度は地域により変動する(Hall, 1993, Contemp. Pediatr. 10:92-110)。北半球の温帯地域では、これは通常晩秋に始まり晩春に終わる。1次RSV感染はほとんど6週齢〜2才の小児で起き、まれに院内流行中に生後4週間以内に起きる(Hallら、1979, New Engl. J. Med. 300:393-396)。RSV感染のリスクの高い小児には、特に限定されないが、早産児(Hallら、1979, New Engl. J. Med. 300:393-396)、気管支肺異形成の小児(Groothuisら、1988, Pediatrics 82:199-203)、先天性心疾患(MacDonaldら、New Engl. J. Med. 307:397-400)、先天性又は後天性免疫不全症(Ograら、1988, Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249;及びPohlら、1992, J. Infect. Dis. 165:166-169)、及び嚢胞性繊維症(Abmanら、1988, J. Pediatr. 113:826-830)がある。RSV感染で入院した心疾患又は肺疾患の幼児の死亡率は、3%〜4%である(Navasら、1992, J. Pediatr. 121:348-354)。
エンベロープを有するウイルスのいくつか、例えばレトロウイルス、オルトミクソウイルス、フィロウイルス及びパラミクソウイルスは、宿主細胞への侵入を獲得する融合機構を利用している可能性が出てきている(Eckertら、2001, Annu. Rev. Biochem. 70:777-810;Weissenhornら、1999, Mol. Membr. Biol. 16:3-9;Lambら、1999, Mol. Membr. Biol. 16:11-19;Skehelら、2000, Annu. Rev. Biochem. 69:531-569;Bentz, J., 2000, Biophys J. 78:886-900;Peisajovichら、2002, Trends Biochem. Sci. 27:183-190)。このモデルにおいて、融合タンパク質はコンフォメーション変化を受け、パラミクソウイルスのFタンパク質のN末端に存在する融合ペプチドが露出して、例えば細胞膜へ挿入される(Wangら、2003, Biochem. Biophys. Res. Comm. 302:469-475)。この高度に保存された7回反復(HR)領域は、融合過程の促進に関与している(Wangら、2003, Biochem. Biophys. Res. Comm. 302:469-475)。従って、この7回反復配列は、宿主細胞との融合を阻害することによりウイルス感染及び/又は増殖の予防のための魅力的な標的である。
本発明は、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルス、すなわちパラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科のニューモウイルス(Pneumoviridae)亜科に属するメタニューモウイルス(MPV)に関する。また本発明は、メタニューモウイルス属及びその構成要素に系統学的に一致し又は関連するものとして同定可能な、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルスにも関する。特に本発明は、C型APVに関連するものよりも、I−2614としてCNCM(パリ)に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より近縁の哺乳動物MPVに関する。より具体的な実施形態で、哺乳動物MPVは、変種A1、A2、B1、又はB2哺乳動物MPVでありうる。しかし本発明の哺乳動物MPVは、まだ同定されていない追加の変種を包含することができ、変種A1、A2、B1、又はB2に限定されない。
cDNA 相補的DNA
L 大タンパク質
M マトリックスタンパク質(エンベロープの内側の線)
F 融合糖タンパク質
HN 血球凝集素−ノイラミニダーゼ糖タンパク質
N、NP又はNC 核タンパク質(RNAに関係しポリメラーゼ活性に必要)
P リンタンパク質
MOI 感染多重度
NA ノイラミニダーゼ(エンベロープ糖タンパク質)
PIV パラインフルエンザウイルス
hPIV ヒトパラインフルエンザウイルス
hPIV3 ヒトパラインフルエンザウイルス3型
APV/hMPV hMPV配列を有する組換えAPV
hMPV/APV APV配列を有する組換えhMPV
哺乳動物MPV 哺乳動物メタニューモウイルス
nt ヌクレオチド
RNP リボ核タンパク質
rRNP 組換えRNP
vRNA ゲノムウイルスRNA
cRNA 抗ゲノムウイルスRNA
hMPV ヒトメタニューモウイルス
APV トリニューモウイルス
MVA 改変ワクシニアウイルスアンカラ
FACS 蛍光活性化細胞分取器
CPE 細胞変性効果
1位 転写されるウイルスゲノムの第1遺伝子の位置
2位 天然のウイルスゲノムの第1オープンリーディングフレームと第2オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第2遺伝子の位置
3位 天然のウイルスゲノムの第2オープンリーディングフレームと第3オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第3遺伝子の位置
4位 天然のウイルスゲノムの第3オープンリーディングフレームと第4オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第4遺伝子の位置
5位 天然のウイルスゲノムの第4オープンリーディングフレームと第5オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第5遺伝子の位置
6位 天然のウイルスゲノムの第5オープンリーディングフレームと第6オープンリーディングフレームの間の位置、あるいは転写されるウイルスゲノムの第6遺伝子の位置
dpi(感染後の日数)
F(融合)
HAI(血球凝集抑制)
HN(血球凝集素−ノイラミニダーゼ)
hpi(感染後の時間)
MOI(感染多重度)
POI(感染時)
bPIV−3(ウシパラインフルエンザウイルス3型)
hPIV−3(ヒトパラインフルエンザウイルス3型)
RSV(呼吸器合胞体ウイルス)
SFM(血清不含培地)
TCID50(50%組織培養感染用量)
図1:分離株00−1とニューモウイルス科の他のメンバーのアミノ酸配列間で見出される相同性%。百分率(×100)は、N、P、M、F、及びLの2つのRAP−PCR断片(8及び9/10)のアミノ酸配列について示す。
APV−A、B又はC:トリニューモウイルスA型、B型又はC型;
hRSV:ウシ又はヒト呼吸器合胞体ウイルス;
PVM:マウス肺炎ウイルス;
L8:Lに位置するRAP−PCRで得られる断片8;
L9/10:Lに位置するRAP−PCRで得られる断片9及び10のコンセンサス
Lのアライメントについては、bRSV、hRSV及びAPV−A配列のみが利用可能であった。
hPIV−3:ヒトパラインフルエンザウイルス3型;
SV:センダイウイルス;
hPIV−2:ヒトパラインフルエンザウイルス2型;
NDV:ニューカッスル病ウイルス;
MV:麻疹ウイルス;
nipah:ニパウイルス。
本発明は、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルス、すなわちパラミクソウイルス科ニューモウイルス亜科内の、メタニューモウイルス(MPV)及びその変種に関する。また本発明は、メタニューモウイルス属及びその構成要素(component)に系統学的に一致し又は関連するものとして同定可能な、単離された哺乳動物マイナス鎖RNAウイルスにも関する。本発明の哺乳動物MPVは、変種A1、A2、B1、又はB2哺乳動物MPVでありうる。しかし本発明の哺乳動物MPVは、まだ同定されていないMPVの追加の変種を包含することができ、変種A1、A2、B1、又はB2に限定されない。
哺乳動物メタニューモウイルスの構造的特徴
本発明は哺乳動物MPVを提供する。哺乳動物MPVは、パラミクソウイルス科(paramyxoviridae)のニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)に属するマイナスセンス1本鎖RNAである。さらに哺乳動物MPVは系統発生的にメタニューモウイルス属に属するものとして同定され、ここで哺乳動物メタニューモウイルスは、系統発生的に、トリ鼻気管炎の原因物質である七面鳥鼻気管炎ウイルスより、CNCM(パリ)にI−2614として寄託されているウイルス分離株(配列番号19)に、より近縁である。ウイルスは、例えばウイルスの核酸配列情報を得て、これを系統発生分析で試験することにより、系統発生的にメタニューモウイルス属に対応するとして同定される。当業者に公知の任意の方法を使用して、ウイルス株の間の系統発生的関係を決定することができる。方法の例はセクション5.9を参照のこと。WO02/057302号として公開された国際特許出願PCT/NL02/00040号(これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる)に、他の方法が開示されている。特にPCT/NL02/00040号は、12頁27行〜19頁29行(これは参照することにより本明細書に組み込まれる)で系統発生解析に適した核酸配列を開示している。ウイルスは、下記でさらに詳述されるような配列類似性の基づいて哺乳動物MPVとしてさらに同定することができる。
Tm=81.5℃−16.6(log10[Na+])+(%G+C)−0.63(%ホルムアミド)−(600/l)
ここで、(Tm)は融解温度であり、[Na+]はナトリウム濃度であり、G+Cはグアニンとシトシン含量であり、lは塩基対中のハイブリッドの長さである。配列間のミスマッチの影響は、Bonnerらの式を使用して計算することができる(Bonnerら、1973, J. Mol. Biol. 81:123-135):ハイブリッド中の塩基のミスマッチの各1%について、融解温度は1〜1.5℃低下する。
PV変種B2のSHタンパク質と少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、又は少なくとも99%、又は少なくとも99.5%同一なら;及び/又は、もしそのLタンパク質のアミノ酸配列が、プロトタイプNL/1/94(配列番号333)により示される哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質と少なくとも99%、又は少なくとも99.5%同一なら、哺乳動物MPVはMPV変種B2として分類することができる。
哺乳動物MPVの構造的定義以外に、哺乳動物MPVはその機能的特徴により規定することができる。ある実施形態において本発明の哺乳動物MPVは、哺乳動物宿主に感染することができる。哺乳動物宿主は、哺乳動物細胞、組織、臓器又は哺乳動物でもよい。具体的な実施形態において哺乳動物宿主は、ヒト又はヒト細胞若しくは臓器である。当業者に公知の任意の方法を使用して、哺乳動物宿主が哺乳動物MPVに感染しているかどうかを試験することができる。ある実施形態においてウイルスは、哺乳動物細胞に結合する能力について試験される。他のある実施形態においてウイルスは、哺乳動物細胞中にゲノムを輸送する能力について試験される。具体的な実施形態においてウイルスのゲノムは、検出可能なように例えば放射能標識される。次にウイルスを、哺乳動物細胞と少なくとも1分、少なくとも5分、少なくとも15分、少なくとも30分、少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも5時間、少なくとも12時間、又は少なくとも1日インキュベートする。次に細胞を洗浄し、細胞からウイルス粒子を除去し、次に細胞を検出可能な標識物によりウイルスゲノムの存在について試験する。別の実施形態において細胞中のウイルスゲノムの存在は、RT−PCRを使用して哺乳動物MPV特異的プライマーを使用して検出される(PCT WO02/057302号、37〜44頁を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる)。
本発明は、哺乳動物変種及びトリ変種を含む、メタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされる組換え又はキメラウイルスを包含する。本発明によれば、組換えウイルスは、内在性の又は天然のゲノム配列あるいは非天然のゲノム配列によってコードされる哺乳動物MPV及びAPVから得られたものである。本発明によれば、非天然配列は、天然の又は内在性のゲノム配列とは異なるものであるが、それは表現型の変化をもたらしてももたらさなくてもよいゲノム配列に対する点変異、再配列、挿入、欠失などを含むがこれらに限定されない1つ又は複数の変異があることに起因する。本発明の組換えウイルスは、哺乳動物変種及びトリ変種を含む、メタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターによってコードされたウイルスを包含し、ウイルスゲノムに対して非天然の核酸を含んでも含まなくてもよい。本発明によれば、メタニューモウイルスのゲノムから得られたウイルスベクターは、哺乳動物メタニューモウイルスの1つのORFの少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するものであり、ORFによってコードされるポリペプチドは、前掲のセクション5.1及び表1で述べたアミノ酸配列同一性を有している。
ある実施形態では、ウイルスベクターが、本発明のヒト又は哺乳動物メタニューモウイルスのゲノムから得られる。その他の実施形態では、ウイルスベクターはトリニューモウイルスのゲノムから得られる。ある実施形態では、ウイルスベクターは哺乳動物MPV及びAPVから得られた配列を含有し、したがってキメラヒトMPV/APVウイルスはこのウイルスベクターによってコードされるようになる。例示的な実施形態では、キメラhMPV/APVウイルスが構成されるように、ヒトメタニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子をトリニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子に置き換えている。その他の実施形態では、ウイルスベクターが、APV及び哺乳動物MPVから得られた配列を含有し、その結果、キメラAPV/hMPVウイルスがウイルスベクターによってコードされるようになる。さらに例示的な実施形態では、キメラAPV/hMPVウイルスが構築されるように、トリニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子がヒトメタニューモウイルスのF遺伝子及び/又はG遺伝子に置き換えられている。
鋳型を調製することができる。
本発明によれば、本発明のウイルスベクターはさらに、異種配列を発現するよう設計製作することができる。本発明の実施形態において、異種配列は、ウイルスベクター以外の供給源から得られる。限定するのではなく一例として、異種配列は、ウイルスベクターが得られる種、サブグループ、又は変種よりも、メタニューモウイルスの様々な種、サブグループ、又は変種に属するウイルスの抗原タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする。限定するのではなく一例として、異種配列は、メタニューモウイルス以外のウイルスの抗原タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする。限定するのではなく一例として、異種配列は、その出所源がウイルスではない。この実施形態によれば、異種配列は、所望の生物学的性質又は活性を有する部分、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質をコードすることができる。そのような異種配列は、タグ又はマーカーをコードすることができる。そのような異種配列は、生体応答調節物質、すなわちその例にはリンホカイン、インターロイキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及び顆粒球コロニー刺激因子が含まれる生体応答調節物質をコードすることができる。
本発明のウイルスベクターへの外来遺伝子配列の挿入は、ウイルスコード領域を異種配列で完全置換することによって、又は部分置換することによって、又はウイルスゲノムに異種ヌクレオチド配列を付加することによって行うことができる。完全置換は、PCR誘導型の変異誘発性を使用することにより、おそらく最良に行われると考えられる。簡単に説明すると、PCRプライマーAは、5’末端から3’末端まで、クラスIIS制限酵素部位などの固有の制限酵素部位(すなわち「シフター」酵素;特定の配列を認識するがその配列の上流又は下流でDNAを切断する);置換される遺伝子の領域に相補的なヌクレオチドの伸長部;及び異種配列のカルボキシ末端コード部分に相補的なヌクレオチドの伸長部を含有すると考えられる。PCRプライマーBは、5’末端から3’末端まで、固有の制限酵素部位;置換される遺伝子に相補的なヌクレオチドの伸長部;及び異種又は非天然遺伝子の5’コード部分に対応するヌクレオチドの伸長部を含有すると考えられる。これらのプライマーを使用して、クローニングした異種又は非天然遺伝子のコピーについてPCR反応させた後、固有の制限部位を使用して生成物を切り出しクローニングすることができる。クラスIIS酵素による消化、及び精製したファージポリメラーゼによる転写によって、結果的に異種又は非天然遺伝子の挿入を持つようになったウイルス遺伝子の正確な非翻訳末端を含有するRNA分子が生成されると考えられる。代替の実施形態においては、PCRによる刺激を受けた反応を使用して、バクテリオファージプロモーター配列及びハイブリッド遺伝子配列を含有する2本鎖DNAを調製することができ、その結果、RNA鋳型をクローニングすることなく直接転写できるようになる。
Gタンパク質は、メタニューモウイルスの膜貫通タンパク質である。特定の実施形態においては、ウイルスエンベロープの表面に発現するように、外部ドメインをコードするG−ORFの領域に異種配列を挿入する。1つの手法では、いかなるウイルス配列も欠失させることなく、異種配列を抗原部位に挿入することができる。別の手法では、異種配列がG−ORFの配列に取って代わる。そのような構築物の発現産物は、外来抗原に対するワクチンに役立てることができ、ワクチン接種した宿主での組換えウイルスの増殖に伴う問題を確かに回避することができる。抗原部位のみが置換されている無傷のG分子によって、G機能が可能になり、したがって生存可能なウイルスの構築物が可能になる。したがってこのウイルスは、さらなるヘルパー機能を必要とせずに、増殖することができる。ウイルスは、あらゆる偶発的な逸脱の危険性が回避されるように、その他の方法で弱毒化してもよい。
2シストロン性mRNAは、ウイルス配列の翻訳の内部開始が可能になるように、また規則的な末端開始部位から外来タンパク質コード配列の発現が可能になるように、構築することができる。あるいは2シストロン性mRNA配列は、ウイルス配列が規則的な末端オープンリーディングフレームから翻訳されるがその一方で外来配列が内部部位から開始するものを構成することができる。ある特定の内部リボソーム進入部位(IRES)配列を利用することができる。選択されるIRES配列は、MPVパッケージングの限界に影響を与えないように、十分短いものであるべきである。したがって、そのような2シストロン的手法を目的として選択されるIRESは、その長さが500ヌクレオチド以下であることが好ましい。特定の実施形態において、IRESは、1つのピコルナウイルスから得られ、いかなる追加のピコルナウイルス配列も含まない。特定のIRES要素には、哺乳動物BiP IRESとC型肝炎ウイルスIRESが含まれるが、これらに限定されない。
上述のように調製されたウイルスベクター及び組換え鋳型は、適切な宿主細胞に異種遺伝子産物が発現するように、又は異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスが生成されるように、様々な方法で使用することができる。一実施形態においては、組換えcDNAを使用して適切な宿主細胞にトランスフェクトすることができ、得られたRNAを用いて異種遺伝子産物の発現を高いレベルで実施することができる。高レベルの発現をもたらす宿主細胞系は、それぞれAPV又はMPVに重感染した細胞系、APV又はMPV機能を補完するよう設計製作された細胞系など、ウイルス機能を提供する連続した細胞系を含む。
本発明のキメラ及び組換えウイルスを調製するために、プラス又はマイナスセンスで本発明の組換え又はキメラウイルスのゲノムをコードするcDNAを使用して、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質及び機能をもたらす細胞にトランスフェクトすることができる。あるいは、本発明の組換えウイルスをコードするDNA又はRNA分子によるトランスフェクションの前、間、又は後に、細胞にヘルパーウイルスをトランスフェクトすることができる。本発明の合成組換えプラスミドDNA及びRNAは、例えば1992年11月24日発行の米国特許第5,166,057号;1998年12月29日発行の米国特許第5,854,037号;1996年2月20日公開の欧州特許公開EP0702085A1;米国特許出願第09/152,845号;1997年4月3日公開の国際特許公開PCT WO97/12032号;1996年11月7日公開のWO96/34625;欧州特許公開EP−A780475;1999年1月21日公開のWO 99/02657;1998年11月26日公開のWO98/53078号;1998年1月22日公開WO98/02530号;1999年4月1日公開のWO99/15672号;1998年4月2日公開のWO98/13501号;1997年2月20日公開のWO97/06270号;及び1997年6月25日公開のEPO78047SA1であって、その全体が参照により本明細書に援用されているものに記載されているような、当技術分野で知られている数多くの技法によって、感染性ウイルス粒子に複製し又はレスキューすることができる。
本発明のある実施形態では、ヘルパーウイルスなしでウイルスを回収することができる。より詳細には、ウイルスゲノムをコードするプラスミドと、複製及びレスキューに必要なウイルスタンパク質をコードするプラスミドとを細胞内に導入することによってウイルスを回収することができる。ある実施形態では、細胞を無血清培地で成長させ、維持する。ある実施形態では、エレクトロポレーションによってプラスミドを細胞内に導入する。特定の実施形態では、ウイルスのアンチゲノムcDNAをT7プロモーターの制御下にコードするプラスミドと、T7 RNAポリメラーゼをコードするプラスミドと、Nタンパク質、Pタンパク質、及びLタンパク質をそれぞれT7プロモーターの制御下にコードするプラスミドとを、エレクトロポレーションでSF Vero細胞の中に導入する。Vero細胞は、ATCCから入手して、以下のステップ(Mike Berryの研究室で開発された)に従って、無血清培地中で成長するように適合させた。
2.DMEM+5%v/vFBS中で5代継代培養する、P126;
3.FBS生育細胞をT−225フラスコ中のOptiPRO(Invitrogen Corporation)に直接移す;
4.OptiPRO中で7代継代培養する;
5.継代数133〜7でプレマスター細胞バンク株を凍結させる;
6.OptiPRO中で4代継代培養する;
7.継代数137でマスター細胞バンク株を凍結させる;
8.OptiPRO中で4代継代培養する;
9.継代数141で作業細胞バンク株(Working Cell Bank Stock)を凍結させる;
10. 解凍させて、エレクトロポレーション及びウイルス増幅用に増殖させる。
本発明の組換えウイルスはさらに、弱毒化表現型を示すよう遺伝子組換えを行うことができる。特に本発明の組換えウイルスは、ウイルスがワクチンとして投与される被験体において、弱毒化表現型を示す。弱毒化は、当業者に知られている任意の方法によって実現することができる。理論に拘泥するものではないが、組換えウイルスの弱毒化表現型は、例えば意図される宿主において自然な状態では十分に複製されないウイルスを使用する(例えばヒトにおけるAPVを使用する)ことによって、また、野生型のウイルス株に比べ、ウイルスゲノムの複製を減少させることによって、ウイルスが宿主細胞に感染する能力を低下させることによって、又はウイルスタンパク質が感染性ウイルス粒子に構成する能力を低下させることによって、引き起こすことができる。リーダー配列やトレーラー配列など、ウイルスのある配列の生存能力は、ミニゲノムアッセイを使用して試験することができる(セクション5.8参照)。
本発明の特定の実施形態において、弱毒化は、ウイルスの1以上の遺伝子を、異なるウイルス、異なる株又は異なる分離体の類似遺伝子と置換することにより達成する。特定の実施形態において、メタニューモウイルス、例えばhMPV又はAPVなどの哺乳動物メタニューモウイルスの1以上の遺伝子を、別のパラミクソウイルスの類似遺伝子と置換する。より具体的な実施形態において、哺乳動物メタニューモウイルス(例えばhMPV)のN遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2−1 ORF、M2−2 ORF、SH遺伝子、G遺伝子若しくはL遺伝子、又はこれらの2つ以上の遺伝子の任意の組合せを、他のウイルス種、株又は分離体の類似遺伝子と交換し、ここで別のウイルス種は、例えば限定されるものではないが、別の哺乳動物メタニューモウイルス、APV又はRSVでありうる。
細胞培養系、動物モデル系、又は被験体におけるキメラ又は組換えウイルスの増殖速度を決定するために、本発明においていくつかのアッセイを用いることができる。キメラ及び組換えウイルスがウイルス粒子の感染、複製、又はパッケージングを行う要件を決定するために、本発明によるいくつかのアッセイを用いることもできる。
cDNAからの生ウイルスの作製は、hMPVを特性決定する手段と、弱毒化ワクチン及び免疫原性化合物の作製のための手段を提供する。この目的を達成するため、レポーター遺伝子を含有するvRNAをコードするcDNA及びミニレプリコンは、ウイルスをレスキューするため、そしてまたRNAの増幅、発現及びビリオンへの組込みに関与するヌクレオチド配列及びタンパク質を同定するために用いることができる。当業者に知られている任意のレポーター遺伝子を本発明で使用することができる(セクション5.8.2参照)。例えば、使用しうるレポーター遺伝子としては、限定されるものではないが、GFP、HRP、LUC及びAPをコードする遺伝子が挙げられる(レポーターの例のさらなるリストについてはセクション5.8.2も参照のこと)。一つの特定の実施形態において、使用するレポーター遺伝子はCATをコードする。本発明の別の特定の実施形態において、レポーター遺伝子はリーダー配列とトレーラー配列に挟まれている。レポーター遺伝子と隣接して配置するために使用しうるリーダー及びトレーラー配列は、任意のマイナスセンスイルス、例えば限定されるものではないが、MPV、RSV、及びAPVのものである。例えば、レポーター遺伝子は、肝炎デルタリボザイム(Hep−d Ribo)及びT7ポリメラーゼ終結(T−T7)シグナルに結合しているマイナスセンスhMPV又はAPVリーダーと、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの後に続くhMPV又はAPVトレーラー配列によって挟むことができる。
ある実施形態においては、組織培養物又は動物モデルでのレポーター遺伝子発現を測定するアッセイを、本発明の方法で使用することができる。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列を、APVやhMPV、hMPV/APV、APV/hMPVなどのウイルスにクローニングするが、この場合、(i)レポーター遺伝子の位置が変化しており、(ii)レポーター遺伝子を挟む遺伝子間領域の長さは様々なものである。種々の組合せについて試験をして、レポーター遺伝子の最適な発現速度、及びレポーター遺伝子を含むウイルスの最適な複製速度を決定する。
感染率は、例えば臨床サンプル(例えば鼻腔ぬぐい分泌液)について本発明のウイルスが存在するかどうか、抗APV抗原抗体、抗hMPV抗原抗体、抗APV抗原抗体、及び/又は抗体であって異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に特異的なものを使用する免疫蛍光アッセイ(IFA)によってそれぞれ試験をすることであるがこれに限定することのない、当技術分野で周知の任意の方法によって決定することができる。
抗体血清力価は、当技術分野で周知の任意の方法によって決定することができ、例えば、血清サンプル中の抗体又は抗体断片の量をサンドイッチELISAで定量することができるが、これに限定するものではない。簡単に説明すると、ELISAは、血清中の抗体又は抗体断片を認識する抗体で、4℃で一晩マイクロタイタープレートを被覆することからなる。次いでこのプレートを、室温で約30分間、PBS−Tween−0.5%BSAで遮断する。PBS−TWEEN−BSA中に希釈した精製済みの抗体又は抗体断片を使用して標準曲線を構成し、サンプルをPBS−BSA中に希釈する。サンプル及び標準液を、アッセイプレートの2つ組のウェルに加え、室温で約1時間インキュベートする。次に非結合抗体をPBS−TWEENで洗い落とし、結合抗体については、室温で約1時間、標識二次抗体(例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG)で処理する。標識に特異的な色素生成基質を添加し、例えば分光光度計によって基質の代謝回転速度を測定することにより、標識抗体の結合を検出する。血清中の抗体又は抗体断片レベルの濃度は、サンプルに関する基質の代謝回転速度と標準曲線での基質の代謝回転速度とを、ある希釈率で比較することによって決定する。
本発明のある実施形態においては、哺乳動物MPVの構成要素に結合する抗体が存在するかどうか検出する。特に、哺乳動物MPVのタンパク質に対する抗体の存在は被験体内で検出することができ、それによって、被験体内の哺乳動物MPVの存在を診断する。哺乳動物MPVの構成要素に対する抗体の存在を検出するには、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。
抗体結合の動態パラメータの決定は、例えば、0.05%Tween−20を含有するHBS緩衝液にモノクローナル抗体(「mAb」)を様々な濃度で溶かしたもの250μLを、抗原が固定されているセンサチップ表面に注入することによって、決定することができる。抗原は、哺乳動物MPVの任意の構成要素でよい。特定の実施形態において、抗原は哺乳動物MPVのFタンパク質又はGタンパク質でよいが、これらに限定されない。流量は、75uL/分で一定に維持する。解離データを15分間、又は必要に応じてそれ以上収集する。各注入/解離サイクルの後、希釈酸、典型的な場合には10〜100mM HClの短い1分間のパルスを使用して、抗原表面から結合mAbを除去するが、状況が許すならその他の再生剤を使用する。
抗体又はその抗原結合フラグメントがウイルス感染力を中和する能力を、微量中和アッセイにより決定する。この微量中和アッセイは、Anderson他(1985、J.Clin.Microbiol. 22:1050〜1052、その開示全体を参照により本明細書に援用する)により記述された手順に変更を加えたものである。この手順は、その開示全体を参照により本明細書に援用するJohnson他、1999、J.Infectious Diseases 180:35〜40にも記載されている。
このアッセイは、抗体を添加する前に細胞をそれぞれのウイルスに4時間感染させ、読取りが細胞の融合の存否に関するものであること以外、基本的に微量中和アッセイと同一である(Taylor他、1992、J.Gen.Virol. 73:2217〜2223)。
熱力学的結合親和性及びエンタルピーを、抗体とそれに対するそれぞれの抗原との相互作用に関して等温滴定熱量測定(ITC)から決定する。
抗体の結合熱力学を、Microcal,Inc. VP滴定熱量計を使用したITC測定により決定する。VP滴定熱量計は、断熱性エンクロージャ内に封入されたサンプル用と参照用容器(1.409ml)の一対の組合せと、このサンプル容器に対してリガンド溶液を滴定するための回転スターラ−シリンジとからなる。ITC測定は、25℃及び35℃で行う。サンプル容器には、抗体を加えたリン酸緩衝液が入っていたが、参照容器には緩衝溶液のみ入っている。リン酸緩衝溶液は、HyClone,Inc.製の生理食塩水67mM PO4(pH7.4)である。5〜10μlという一定量の0.05〜0.1mM RSV−抗原、PIV−抗原、及び/又はhMPV−抗原溶液を、3〜4分間あけて、熱交換シグナルが失われることからわかるように結合が飽和するまで抗体サンプル溶液中に滴定する。
Qt=nCtΔHb ○V{1+Xt/nCt+1/nKbCt-[(1+Xt/nCt+1/nKbCt)2-4Xt/nCt]1/2}/2 (1a)
ΔQ(i)=Q(i)+dVi/2V{Q(i)+Q(i-1)}-Q(i-1) (1b)
上式でCtは、サンプル容器中の初期抗体濃度であり、Vはサンプル容器の容積であり、nは結合反応の化学量論的な量であり、これによってKb、ΔHb ○、及びnの値を得る。Kbを決定するのに最適なサンプル濃度の範囲はKbの値に応じて異なり、以下の関係式によって定義される。
したがって1μMで決定することのできる最大Kbは2.5×108M−1未満である。最初の滴定液添加が結合等温式に適合しない場合、シリンジ開口と溶液との界面での気泡の放出を示す可能性があるので、それは最終分析で無視される。
免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼ及び/又はプロテアーゼ阻害剤(例えばEDTA、PMSF、159手法ニン、バナジン酸ナトリウム)を添加したRIPA緩衝液(1%NP−40又はTritonX−100、1%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、0.15M NaCl、0.01Mリン酸ナトリウム(pH7.2)、1%Trasylol)などの溶解緩衝液に細胞集団を溶解し、対象の抗体を細胞溶解産物に添加し、4℃である時間(例えば4時間)インキュベートし、タンパク質A及び/又はタンパク質Gセファロースビーズを細胞溶解産物に添加し、4℃で約1時間以上インキュベートし、ビーズを溶解緩衝液中で洗浄し、ビーズをSDS/サンプル緩衝液中に再懸濁することを含む。対象の抗体が特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウェスタンブロット分析によって評価することができる。当業者なら、抗体と抗原との結合が増加しまたバックグラウンドが低下するように(例えばセファロースビーズで細胞溶解産物をプレクリアする)修正可能なパラメータが理解されよう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察に関しては、例えばAusubel他編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、John Wiley&Sons,Inc.、New York、第10、16、1頁を参照されたい。
異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれるかどうかという問題は、当業者に知られている任意の生化学的アッセイを使用することによってさらに調べることができる。特定の実施形態においては、異種タンパク質がウイルス粒子に組み込まれるかどうかを決定するのに、ショ糖勾配アッセイを使用する。
本発明は、哺乳動物MPV、特にhMPVに関する。本発明は、MPVの2つの血清学的サブグループA及びBの特性決定と、MPV A1、A2、B1、及びB2の4つの変種の特性決定を行うが、本発明はこれらのサブグループ及び変種に限定されない。本発明は、本明細書に記載されるサブグループ及び変種に属すると特性決定し、あるいはまだ特徴付けられていないサブグループ又は変種に属すると特性決定されたものも含めた、任意のまだ同定されていないMPV分離株を包含する。
ャンブルを使用して最尤樹を生成する系統樹分析で試験した後で、トリ鼻気管炎の病因物質であるシチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)とも呼ばれるトリニューモウイルス(APV)のウイルス分離株に関係するよりも、CNCM(パリ)にI−2614として寄託されたウイルス分離株のほうに対して系統学上より密接に相当することが見出されることを特徴とするウイルスを提供する。特に前記系統樹分析では、本質的に非哺乳動物ウイルスではあるが最も近い類縁にあるAPV−Cウイルス分離株を、外集団として使用することが有用である。
2つ以上のアミノ酸配列をBLAST(Altschul,S.F.他、1990、J.Mol.Biol. 215:403〜410)によって比較して、それらの互いの配列相同性及び配列同一性を決定することができる。2つ以上のヌクレオチド配列は、これらをBLAST(Altschul,S.F.他、1990、J.Mol.Biol. 215:403〜410)によって比較して、互いの配列相同性及び配列同一性を決定することができる。BLAST比較は、Clustal W法(Mac Vector(tm))を使用して実施することができる。ある特定の実施形態においては、コンピュータプログラムによる2つ以上の配列のアライメントの後に、マニュアルで再調整することができる。
本発明の方法では、哺乳動物MPVの核酸と、又はその逆相補鎖と、又はその相補鎖とのハイブリダイゼーションが可能な核酸を使用して、それらの配列の互いの相同性及び同一性を決定することができる。ある実施形態においては、ストリンジェンシーの高い条件下で核酸をハイブリダイズする。限定ではなく一例としての、そのような高ストリンジェンシー条件を使用する手順は、以下の通りである。DNAを含むフィルタのプレハイブリダイゼーションを、6×SSC、50mM Tris−HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.02%BSA、及び500μg/ml変性サケ精子DNAからなる緩衝液中、65Cで8時間から一晩にわたり実施する。フィルタは、100μg/ml変性サケ精子DNA及び5〜20×106cpmの32P標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、65Cで48時間ハイブリダイズする。フィルタの洗浄は、2×SSC、0.01%PVP、0.01%Ficoll、及び0.01%BSAを含有する溶液中、37Cで1時間行う。この後、0.1×SSC中、50Cで45分間洗浄してから、オートラジオグラフィにかける。使用することができるその他の高ストリンジェンシー条件は、当技術分野で周知である。本発明のその他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、穏かな低ストリンジェンシー条件下で実施するが、そのような条件は問う業者に周知である(例えば、Sambrook他、1989、Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York参照; またAusubel他編、the Current Protocols in Molecular Biology series of laboratory technique manuals、1987〜1997 Current Protocols、(著作権) 1994〜1997 John Wiley and Sons,Inc.も参照)。
本発明は、哺乳動物MPV分離株間の系統学上の関係の推論に関する。系統学上の関係の分析では、多くの方法又は手法を利用することができ、そのような方法には、距離法、最尤法、及び最大節約法が含まれる(Swofford,DL.他、Phylogenetic Inference. Molecular Systematics. Hillis,DM、Mortiz,C、及びMable,BK編、1996. Sinauer Associates: Massachusetts、USA. 第407〜514頁; Felsenstein,J.、1981、J.Mol.Evol. 17:368〜376)。この他ブートストラップ技法は、得られる系統樹の信頼区間を準備し調べるのに有効な手段である(Felsenstein,J.、1985、Evolution. 29:783〜791)。系統学上の関係を確立するには、哺乳動物MPV分離株を比較するためにヌクレオチド又はペプチド配列情報を使用する任意の方法又は手法を使用することができ、距離法、最尤法、及び最大節約法又は手法が含まれるが、これらに限定されない。系統学的データの質を分析するには、ブートストラップを含むがこれに限定することのない当技術分野で知られている任意の方法を使用することができる。系統学的手法に使用されるヌクレオチド又はペプチド配列データのアライメントには、マニュアルアライメント、コンピュータペアワイズアライメント、及びコンピュータマルチプルアライメントが含まれるが、これらに限定されない。当業者なら、必要とされる情報及び許される時間に基づいて使用される好ましいアライメント法又は系統学的手法に精通しているであろう。
本発明は、哺乳動物MPVによりコードされたタンパク質に対する抗体の作製にも関する。詳細には本発明は、哺乳動物MPVのFタンパク質、Nタンパク質、M2−1タンパク質、M2−2タンパク質、Gタンパク質、又はPタンパク質を含めた、全てのMPV抗原に対する抗体の作製に関する。本発明によれば、哺乳動物MPV、その誘導体、類似体、又は断片によりコードされた任意のタンパク質を免疫原として使用して、そのような免疫原と免疫特異的に結合する抗体を産生することができる。本発明の抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)フラグメント、Fab発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、及びエピトープ結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち免疫学的に抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)又はサブクラスでよい。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、抗体をペプシンやパパインなどの酵素で処理することによって産生することができるF(ab)及びF(ab’)2フラグメントが含まれる。特定の実施形態では、ヒトMPVによりコードされたタンパク質に対する抗体が産生される。別の実施形態では、ヒトMPVによりコードされたタンパク質のドメインに対する抗体が産生される。
本発明は、哺乳動物MPVが宿主又は宿主細胞に感染する能力を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。ある実施形態では、本発明は、哺乳動物MPVが宿主又は宿主細胞内で複製する能力を低下させる化合物を同定するための方法を提供する。哺乳動物MPVが宿主に感染しかつ/あるいは宿主又は宿主細胞内に複製する能力を消失させ又は低下させる化合物をスクリーニングするには、当業者に周知の任意の技法を使用することができる。特定の実施形態では、哺乳動物MPVがヒトMPVである。
好ましい実施形態で、本発明は、本発明による核酸によってコードされたタンパク様分子又はメタニューモウイルス特異的ウイルスタンパク質又はその機能的断片を提供する。有用なタンパク様分子は、例えば、本発明によるウイルスから得ることが可能な遺伝子又はゲノム断片のいずれかから得られる。本明細書で提供されるような分子又はその抗原性断片は、例えば、診断方法又はキットに有用であり、またサブユニットワクチンなどの医薬品組成物に有用である。特に有用なものは、抗原又はサブユニット免疫原として含まれるF、SH及び/又はGタンパク質あるいはその抗原性断片であるが、不活性化した全ワクチンを使用することもできる。系統学的分析で同定された、組換え核酸断片によってコードされたタンパク様物質も特に有用であるが、当然ながら、生体内であろうと(例えば保護する目的で、又は診断用抗体を提供するために)生体外であろうと(例えばファージディスプレイ技術によって、又は合成抗体を産生するのに有用な別の技法によって)、特にMPV特異的抗体又はT細胞応答を誘発するために、系統学的分析に有用なORFの好ましい境界内にあるものが好ましい。
本発明は、弱毒化形態のウイルス、組換え形態のMPV及びAPV、1つ又は複数の異種又は非天然の抗原性配列を発現するキメラMPV及びAPVを含めたMPV及びAPVを含む、ワクチン及び免疫原性調製物を提供する。本発明のワクチン又は免疫原性調製物は、1価、あるいは2価又は3価のワクチンを含めた多価ワクチンを包含する。本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、様々なウイルス感染からの保護を行うのに有用である。特に本発明のワクチン又は免疫原性製剤は、宿主を呼吸器感染症から保護する。
このアッセイを使用して、本発明の組換えウイルス及び本発明のワクチンが、コットンラットやハムスターなどを含むがこれらに限定されない動物モデル系の下気道ウイルス感染を予防できるかどうか決定する。組換えウイルス及び/又はワクチンは、静脈内(IV)経路によって、筋肉内(IM)経路によって、又は鼻内経路(IN)によって投与することができる。組換えウイルス及び/又はワクチンは、当業者に周知の任意の技法によって投与することができる。このアッセイは、抗体が結合する肺のウイルス力価の減少に、抗体の血清濃度を相関させるのにも使用する。
本発明のある実施形態においては、本発明の治療及び診断法を目的とした標的集団を、年齢によって定義する。ある実施形態においては、本発明の治療及び/又は診断法を目的とした標的集団は、呼吸器感染の他に疾患又は障害を特徴とする。
in vitroアッセイ及び動物モデルで試験をする本発明のワクチン又はその断片は、さらに、健常な成人志願者群において、安全性、耐性、及び薬物動態について調べることができる。志願者に、筋肉内、静脈内、又は肺送達系によって、単回用量の本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンを投与する。単回用量の本発明の組換えウイルス及び/又は本発明のワクチンを受ける前に少なくとも24時間、各志願者をモニターし、その投与を受けた後少なくとも48時間は、各志願者の臨床部位をモニターする。次いで志願者を、外来患者として投与後3日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、及び56日目にモニターする。
本発明は、MPVを診断及び/又は検出する手段及び方法を提供し、前記手段及び方法は、MPV及びその構成要素と、その転写、翻訳、発現、増殖、及び代謝プロセスの産物の検出に用いられるものである。より詳細には、本発明は、動物及びヒトのMPV感染を診断する手段及び方法を提供し、前記手段及び方法には、MPVの構成要素、MPVのライフサイクルによる産物、及びMPV曝露又は感染に対する宿主の応答による産物の検出が含まれるが、これらに限定するものではない。
本発明は、哺乳動物MPVの核酸配列、哺乳動物MPVのタンパク質、及び哺乳動物MPVのタンパク質に対する抗体に関する。本発明はさらに、哺乳動物MPVの核酸配列の相同体、及び哺乳動物MPVのタンパク質の相同体に関する。本発明はさらに、融合タンパク質をコードする核酸配列に関し、この融合タンパク質は、哺乳動物MPVのタンパク質又はその断片と、哺乳動物MPV由来ではない1つ又は複数のペプチド又はタンパク質を含有するものである。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、哺乳動物MPVのタンパク質又はその断片と、ポリヒスチジンタグなどであるがこれに限定することのないペプチドタグを含有する。本発明はさらに、哺乳動物MPVのタンパク質又はその断片と、哺乳動物MPV由来ではない1つ又は複数のペプチド又はタンパク質を含有する融合タンパク質に関する。また本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質をコードする核酸の誘導体にも関する。また本発明は、哺乳動物MPVのタンパク質の誘導体にも関する。誘導体は、付加、欠失、切断、置換、及び逆位などであるがこれらに限定されないタンパク質の変異形態でよいが、これらに限定するものではない。誘導体は、さらに、哺乳動物MPVのタンパク質のキメラ形態でよく、そのタンパク質の少なくとも1つのドメインが異なるタンパク質から得られたものである。誘導体は、例えば薬物などの別の分子に共有結合し又は非共有結合している哺乳動物MPVのタンパク質の形態でもよい。
ウイルスと宿主細胞の融合は、MPVを含めたいくつかのエンベロープウイルスの感染性生活環における必須ステップである。したがって、ウイルス細胞融合の阻害は、これらのウイルスを制御するための新規手法の一典型となるものである。この阻害方法は、宿主におけるMPVの増殖と、MPVによる宿主の感染とを予防する代替的方法の一典型である。ウイルス細胞融合の阻害は、必要とされる付着タンパク質のタイプに依存している。Wang他、Biochem Biophys Res Comm 302(2003)469〜475。したがって、本発明の一実施形態においては、アッセイを用いて、様々な付着タンパク質に対するウイルス細胞融合の依存性の同定を行う。
6.1 実施例1: 検体の採取、ウイルスの単離、ウイルスの特性解析
ウイルスの存在についてアッセイするため、また同定されたウイルスを特性解析するために宿主から鼻咽頭吸引液の試料を得た。鼻咽頭吸引液は、気道感染症(RTI)を罹患している子供から採取した。病気の原因が何であるかを決定するために、A型及びB型インフルエンザウイルス、hRSV、並びに1、2及び3型ヒトパラインフルエンザウイルス(hPIV)に対する蛍光標識抗体を用いた直接免疫蛍光アッセイ(DIF)ですべての鼻咽頭吸引液を試験した(実施例9の方法を参照)。ウイルスはまた、VERO細胞、第3カニクイザル腎臓(tMK)細胞、ヒト内皮肺(HEL)細胞及びマービンドック(marbin dock)腎臓(MDCK)細胞を含めた様々な細胞系で、高速シェルバイアル技法(Rothbarth他、1999、J of Virol. Methods、78:163-169)を用いて鼻咽頭吸引液から単離した。DIFアッセイで陰性であった2又は3回の継代後に細胞変性効果(CPE)を示す試料を、A、B及びC型インフルエンザウイルス、A及びB型hRSV、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、1〜4型ヒトパラインフルエンザウイルス(hPIV)、センダイウイルス、5型サルウイルス、並びにニューカッスル病ウイルスに対するウイルス特異的抗体を用いた間接免疫蛍光アッセイ(IFA)(実施例11の方法を参照)によって試験した。多くの場合に病原体を同定することができたが、一部の検体は試験したすべてのウイルスに対して陰性であった。
ヒト集団におけるこのウイルスの血清陽性率を調査するために、様々な年齢区分のヒト由来の血清を、未同定のウイルス分離株のうち1種に感染させたtMK細胞を用いた間接IFAによって分析した。調査により、このウイルスに対する抗体が6カ月齢〜12カ月齢の子供の25%で検出されることが明らかとなった。さらに、5歳までには、子供のほぼ100%が血清陽性であった。全体で56個の血清試料を間接IFA及びVNアッセイで観察した。試料の51個又は91%で、VNアッセイの結果、すなわち8を超える力価が、間接IFAの結果、すなわち32を超える力価と一致した。IFAで陽性であることが判明した4個の試料試料がVNアッセイで陰性であった、すなわち力価が8未満であった。1個の血清試料がIFAで陰性であった、すなわち、力価が32未満であり、VN試験で陽性であった、すなわち、力価が16であった(図2)。
未知のウイルス分離株の配列情報を得るために、RAP−PCR(Welsh他、1992、NAR、20:4965-4970)として知られるランダムPCR増幅戦略(実施例21参照)。簡単に説明すると、tMK細胞をウイルス分離株のうち1種(分離株00−1)並びに陽性対照として役割を果たすhPIV−1に感染させた。両方の培養物が同等のレベルのCPEを示した後、培養物上清中のウイルスを連続的な20〜60%スクロース勾配で精製した。EMによって勾配画分をウイルス様粒子について検査し、約50%のスクロースを含む分画からRNAを単離し、これ中にヌクレオカプシドが観察された。両方のウイルス分画から単離したRNA分離株を等量ずつRAP−PCRで使用し、その後、試料を隣り合わせで3% NuSieveアガロースゲルに流した。次いで、未同定のウイルスに特異的な20個の示差的に現れたバンドをゲルから精製し、プラスミドpCR2.1(Invitrogen)にクローニングし、ベクター特異的プライマーを用いて配列決定した(実施例22参照)。National Library of Medicineから入手可能なBLASTプログラムを用いて、Genbankデータベースで配列に対する相同性を検索することによって、20個の断片のうち10個がAPV/TRTV配列との類似性を示していることが判明した。
MPVの核タンパク質(N)、リンタンパク質(P)、マトリックスタンパク質(M)及び融合タンパク質(F)遺伝子の配列分析により、米国において主としてトリで見つかるAPV血清型Cとの最も高い度合の配列相同性が明らかとなった。また、これらの分析により、ウイルスゲノムの3’末端に非構造タンパク質NS1及びNS2が存在しないこと、並びに融合タンパク質がマトリックスタンパク質のすぐ隣に位置することも明らかになった。22K(M2)遺伝子、小さな疎水性(SH)遺伝子、結合(G)遺伝子、ポリメラーゼ(L)遺伝子、遺伝子間領域、及びトレーラー配列の配列を決定した。既に記載した配列と組み合わせると、ここで提示する配列により、ゲノム末端の最末端の12〜15個のヌクレオチドを除いてMPVのゲノム配列が完成し、MPVのゲノム機構が確立した。MPVゲノムの配列をAPVサブタイプA、B及びC、RSVサブタイプA及びB、PVM並びに他のパラミクソウイルスの配列と並べて比較することにより、メタニューモウイルス属におけるMPVの分類の強力な証拠が提供される。
hMPVの別の分離株(1−99)も同定かつ配列決定した。これを行うために、hMPV分離株1−99を第3サル腎臓細胞で、既に記載された方法と全く同じように増殖させた(van den Hoogen他、2001、Nature Medicine、7(6):719-724)。MagnaPure LC単離システム(Roche Applied Science)及び全核酸キットのプロトコルを用いてウイルスRNAを単離した。標準のプロトコルを用い、ランダム6量体(Progema Inc. Leiden)をプライマーとして使用して、RNAをcDNAへと変換した。このcDNAは、配列分析で使用するまで−20℃又はそれより低い温度に維持した。このプロジェクトの全体で使用したプライマーは、プロトタイプhMPV 1−00株から入手可能な配列に基づいているか、又はhMPV株1−99を用いて配列分析の後に得られた。
ウイルス群の間、すなわちMPVと他のウイルス間の関係を同定するために系統的な手法を用いることができる。さらに、同型のウイルスの様々な分離株について系統的関係を決定することができる。MPVと他のウイルスとの間の関係性を決定するために、またhMPVの様々な分離株間の関係性を決定するために、系統樹を決定した。たとえば、MPVと様々なウイルスとの間の関係性を例示するために、ヌクレオチド又はタンパク質の配列データを使用して系統樹を作製することができる。あるいは、hMPVの様々な分離株間の関係性を例示するために、ヌクレオチド又はタンパク質の配列データを使用して系統樹を作製することができる。
ゲノム組成の大部分が決定したが、最末端にある真の(authentic)の末端配列が欠けていた。ウイルスRNAのライゲーション、次いでライゲートした接合点のPCR増幅並びにポリアデニル化及び3’RACE法を組み合わせて用いて、真のヌクレオチド配列を決定した(図54)。ウイルスRNA末端のライゲーションによって作製したPCR断片の配列分析により、図26に示すリーダー配列及びトレーラー配列が明らかとなった(配列番号18〜21参照)。このようにして得たトレーラー配列は、APVを含めた他のパラミクソウイルスのトレーラー配列から予測された配列と矛盾がなかった。しかし、配列分析した71個のクローンのうち2個のリーダー配列しか、現在までにすべてのパラミクソウイルスで見つかっている末端ヌクレオチド残基としてのACを含んでいなかった。したがって、次いでポリアデニル化及び3’RACE法を組み合わせて用いてhMPV/NL/1/00リーダーの末端ヌクレオチド配列を確認した。さらに、hMPV NL/1/00の3’リーダー末端に2つの追加のヌクレオチドが同定された。
hMPVのウイルス分離株を血清型又は遺伝型によって区別できるかどうかを決定するために、ウイルス中和アッセイを使用した(たとえば実施例16参照)。ウイルス特異的抗血清を産生させるために、ウイルス分離株00−1及び99−1をフェレットに接種した。00−1分離株では、個別の加圧したグローブボックス内で飼育した2匹の特定病原体除去フェレット及び2匹のモルモットを実験的に鼻腔内感染させることによって、ウイルスに対するフェレット及びモルモット特異的抗血清を産生させた。2〜3週間後、すべての動物を心室穿刺によって出血させ、その血清を対照血清として用いた。血清は、以下に記載のように間接IFAで、既に記載したすべてのウイルスについて試験した。これらの抗血清と99−1分離株を用いて調製した抗血清とを、両方のウイルスでのウイルス中和アッセイで使用した(表10)。
7.1 実施例9: 直接免疫蛍光アッセイ(DIF)法
RTIを罹患している患者由来の鼻咽頭吸引液を、記載のようにDIFによって分析した(Rothbarth他、1999、J. of Virol. Methods、78:163-169)。試料は−70℃で保存した。簡単に説明すると、鼻咽頭吸引液を5mlのダルベッコMEM(BioWhittaker、Walkersville, MD)で希釈し、ボルテックスミキサーで1分間、よく攪拌した。懸濁液を10分間、840×gで遠心した。沈降物をマルチスポットスライド(Nutacon、Leimuiden, The Netherlands)上に広げ、上清をウイルス単離に使用した。乾燥させた後、細胞をアセトン中で1分間、室温で固定した。スライドを洗浄した後、これをインフルエンザA及びB、hRSV及びhPIV1〜3などのウイルスに特異的な市販のFITC標識抗血清(Dako、Glostrup, Denmark)と共に15分間37℃でインキュベートした。PBSで3回、水道水で1回洗浄した後、スライドをグリセロール/PBS溶液(Citifluor、UKO、Canterbury, UK)に浸して覆った。その後、Axioscop蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析した。
宿主由来の培養試料中におけるウイルスの検出は、宿主が現在かつ/又は過去にウイルスに曝された又は感染していたことの直接の指標である。
感染細胞又は組織中のウイルスタンパク質を可視化するために抗体を使用することができる。間接免疫蛍光アッセイ(IFA)とは、蛍光指標にカップリングさせた第2の抗体がウイルスに特異的な抗体上の共通のエピトープを認識する感受性のある手法である。IFAは、その感度のレベルが高いのでDIFよりも有利である。
ウイルスの検出には、ウイルスの様々な特徴を利用することができる。たとえば、多くのウイルスが赤血球に結合することができるタンパク質を含み、これにより格子が生じる。この特性は赤血球凝集と呼ばれ、ウイルスを検出するための赤血球凝集アッセイで使用することができる。電子顕微鏡(EM)の下でウイルスを可視化することもでき、またPCR技法によって検出することもできる。
感染/病気中には、ウイルスに対する特異的抗体が産生される。したがって、宿主におけるウイルスに特異的な抗体の検出は、宿主が現在かつ/又は過去にそのウイルスに感染していたことの指標となる。
ウイルスに特異的な抗体の検出には、MPVを感染させたtMK細胞を(上述のように)アセトンでカバーガラス上に固定し、PBSで洗浄し、1〜16の希釈率の血清試料と共に30分間37℃でインキュベートした。PBSで2回、水道水で1回洗浄した後、スライドを37℃で30分間、FITC標識の使用した種に対する二次抗体(Dako)と共にインキュベートした。上述のようにスライドを処理した。
パラミクソウイルス科ではNタンパク質が最も豊富なタンパク質であり、このタンパク質に対する免疫応答が感染の初期に起こる。そのため、MPVに対する抗体を検出するためのELISAアッセイを開発するためにNタンパク質の組換え源を使用することが好ましい。抗体の検出に適した抗原には、MPVウイルスに曝された又はそれに感染した患者の任意のMPV特異的抗体と結合する、任意のMPVタンパク質が含まれる。本発明の好ましい抗原には、MPVに曝された患者において免疫応答を優先的に引き起こし、したがって典型的には患者の抗体によって最も容易に認識されるものが含まれる。特に好ましい抗原には、MPVのN、F、M及びGタンパク質が含まれる。免疫学的技法に用いられる抗原は、未改変抗原であっても、それを改変した形であってもよい。分子生物学における周知の技術を用いてMPV抗原のアミノ酸配列を変化させ、免疫学的技法で使用し得る改変した形の抗原を生成することができる。
被験体がウイルスに感染すると、そのウイルスに対する抗体のアレイが産生させる。これらの抗体の一部はウイルス粒子に結合してその感染力を中和することができる。ウイルス中和アッセイ(VN)は通常、血清又はモノクローナル抗体の希釈液をウイルスと混合し、これをインキュベートし、培養細胞、孵化卵、又は動物を用いて残存感染力をアッセイすることによって実施する。中和抗体はウイルス粒子上の型特異的な抗原ウイルス粒子を定義するために使用することができる。たとえば、ウイルスの血清型を定義するために中和抗体を使用することができる。さらに、幅広く中和する抗体も存在し得る。
宿主におけるウイルスの存在は、宿主から採取した試料中でウイルス核酸を検出することによっても診断することができる(たとえば実施例18のRT−PCR及び実施例21のRAP−PCR参照)。
生物学的サンプル中のウイルスの検出は、ウイルスのゲノム物質を複製又は増幅する方法を用いて行うことができる。既知のパラミクソウイルスにおけるRT−PCRアッセイのためのウイルスに特異的なオリゴヌクレオチド配列を本実施例中で以下に記載する。50mMのTris.HCl pH8.5、50mMのNaCl、4mMのMgCl2、2mMのジチオトレイトール、200μMずつの各dNTP、10単位の組換えRNAsin(Promega、Leiden, the Netherlands)、10単位のAMV RT(Promega、Leiden, the Netherlands)、5単位のAmplitaq Gold DNAポリメラーゼ(PE Biosystems、Nieuwerkerk aan de Ijssel, The Netherlands)、及び5μlのRNAを含む50μlの反応液中で、1ステップのRT−PCRを行った。サイクル条件は、42℃で45分間及び95℃で7分間を1回、95℃で1分間、42℃で2分間、及び72℃で3分間を40回繰り返し、72℃で10分間を1回である。プライマーの配列は配列表で提供する。より具体的には、核タンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号28及び29に対応するヌクレオチド配列を有するN3及びN4であり、これらを用いて151個のヌクレオチドの断片を増幅した。マトリックスタンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号30及び31に対応するヌクレオチド配列を有するM3及びM4であり、これらを用いて252個のヌクレオチドの断片を増幅した。ポリメラーゼタンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号34及び35に対応するヌクレオチド配列を有するL6及びL7であり、これらを用いて173個のヌクレオチドの断片を増幅した。Fタンパク質の遺伝子に使用したプライマーはそれぞれ配列番号32及び33に対応するヌクレオチド配列を有するF7及びF8であり、これらを用いて221個のヌクレオチドの断片を増幅した。
サンプル中のhMPVの存在を検出するために、迅速かつ単純なPCRベースのアッセイを開発した。hMPVのL配列及びN配列を標的とした標準通りのRT−PCR分析を、以下のプライマーセット、すなわち、L−フォワード(5’-CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3’)及びL−リバース(5’-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3’)、並びに、プライマー、N−フォワード(5’-CATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3’)及びN−リバース(5’-TCTGCAGCATATTTGTAATCA-3’)を用いて実施した。反応混合物(全容積50μl)は、RNA 5μl、各プライマー200nM、AmpliTaq Gold緩衝液(Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d IJssel, The Netherlands)、dNTP 600μM、DTT 2μM、MgCl2 2mM、RNAsin 20U、Taqポリメラーゼ5U、及びAMV逆転写酵素10U(全ての酵素はPromega社から購入した)。RT−PCRのパラメータは、42℃で60分、そして95℃で7分、続いて、95℃で1分と、45℃で2分と、72℃で3分とを40サイクルであった。全ての新規DNA鎖の伸長が確実に完了するように、72℃で10分の最終インキュベーションを含めた。
全てのhMPVサブタイプ、すなわちA1、A2、B1、及びB2の検出を可能にするため、感度のよい単一アッセイを開発した。このアッセイは、様々なサブタイプのhMPV株の検出を、一定のセットの診断用設備と試薬とを使用して行うことを可能にしたので有利であった。この新規でかつ感度のよいTaqmanアッセイは、4つのサブタイプ全てに対して等しく感度がよいと判定された。
MPV又は他のウイルスの遺伝物質は、ゲノム内の領域にハイブリダイズし、遺伝物質が増幅されるように特定の方向に伸張するプライマーを用いて検出又は増幅することができる。この種の技法は、特定の配列情報が入手不可であるか、また遺伝物質の最初の増幅を試料中で行う場合に有用である。このような技法の1つはRAP−PCRと呼ばれている。
RAP−PCRを用いてセグメントを増幅した後、増幅したセグメントについて配列情報を得ることができる。これを行うためには、配列決定の前に作製した断片をベクター内にクローニングすることが有利である。
RAP−PCR法は配列中に、増幅又は複製されていないギャップを残す場合がある。完全な配列を得るために、RT−PCRを用いてギャップの配列情報を得ることができる。
hMPVウイルスを検出するために、様々な宿主内で抗体の存在を検出する免疫学的アッセイ。最も豊富に産生されるタンパク質であるので、一例では、Nタンパク質に対する抗体を使用する。この特徴は、ウイルスのゲノムに渡って起こる転写の勾配によるものである。
8.1 実施例25:様々な細胞系におけるhMPVの増殖
各ウイルスの特徴を検査するためにウイルス分離株を様々な細胞系で培養することができる。たとえば、培養物中で測定される力価レベルに基づいて様々なウイルス分離株の感染力を特徴とし、かつ区別することができる。あるいは、さらに分析するために、細胞を使用して培養物中のウイルス株を増殖又は増幅させることができる。
ミニレプリコン構築体を、アンチセンスレポーター遺伝子を含むように作製することができる。ミニレプリコンの例であるCAT−hMPVを図24に示す。ミニレプリコン構築体の作製に使用したリーダー配列及びトレーラー配列を図26に示す。比較のために、APV、RSV及びPIV3のリーダー配列及びトレーラー配列のアラインメントも図26に示す。
hMPVをレスキューするために、ミニレプリコン構築物は、レポーター遺伝子を含有するように作製しうる。ミニレプリコンの一例、すなわちCAT−hMPVを図24に示す。レポータータンパク質クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)をコードするcDNAを、5’と3’の非コードウイルス配列の間にマイナス鎖配向でクローニングしうる。T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列及び制限酵素の認識配列は、構築物を挟むように配置しうる。in vitro転写により、精製されたポリメラーゼタンパク質と混合した場合に再構成されたRNP複合体を形成しうるウイルス様RNAが生じる。RNPを、例えばヘルパーウイルスを用いて、真核細胞にトランスフェクトしうる。あるいは、レスキューは、完全にプラスミドが駆動するものであってもよい、すなわちミニレプリコンは、T7ポリメラーゼプラスミドと共トランスフェクトしてもよく、N、P、L及びM2−1遺伝子はpCITE−2a/3aから発現された。hMPVをレスキューするために使用されるポリメラーゼ構成要素は、RSV、APV、PIV、MPV又はその任意の組合せのものでありうる(セクション5.8.1参照)。ウイルスは、CAT活性を検出することができるいくつかのアッセイの任意のものを用いて検出しうる(実施例24参照)。別の代替法において、ミニレプリコン系を用いたhMPVのレスキューはまた、ミニレプリコンをトランスフェクトした細胞に、MPV、APV、RSV、PIV、又はその任意の組合せからの1又は複数のhMPVポリメラーゼ構成要素(NL/1/00及びNL/l/99)を重複感染させることにより実施し得る。
hMPVウイルスの遺伝子を発現する完全長cDNAを構築して、感染性のウイルスを生成することができる。たとえば、hMPVのすべての遺伝子又はすべての必須の遺伝子をコードしているcDNAを構築することができる。その後、ゲノムを発現させて感染性ウイルスを生成することができる。
非セグメント化RNAウイルスの逆遺伝学系は、ゲノムRNA発現用のT7プロモーターを備えたプラスミドに基づいているが、これとは異なり、細胞の転写機構を利用する系は、より効率的である可能性があり、さらに、バクテリオファージT7由来のRNAポリメラーゼを共発現する必要がない。ウイルスRNA分子を細胞内で発現させるのに、一方向性又は双方向性のpolI−polII転写システムを使用することができる。このシステムは、クローニングされたcDNAからのインフルエンザウイルスの生成に非常に効率的であることが立証された(Hoffmann他、PNAS、97 6108〜6113(2000))。RNAポリメラーゼII転写産物とは異なり、RNAポリメラーゼI転写産物は、それらの5’末端にキャップ構造を含有せず、そして、3’末端にポリAテールを有しない。したがって、細胞の転写機構を利用するシステムは、polIIプロモーターからはタンパク質を発現し、そして、polIプロモーターからはキャップ構造もポリAテールも有しないウイルス(−)vRNA又は(+)cRNAを発現するように設計される。ウイルスの複製及び転写には末端構造が重要であるので、余分な非ウイルス配列を含有しないウイルス様一次転写物を提供することは極めて重要である。
T7 RNAポリメラーゼを発現する細胞系を、組換えMPVゲノムの複製及びパッケージングに使用することができる。例えば、CMVプロモーターの制御下にT7 RNAポリメラーゼを発現するように、Vero細胞を設計製作することができる。この手法は、T7 RNAポリメラーゼを発現するポックスウイルスなどのヘルパーウイルスで共感染させる必要性を排除するので、有用である。この方法の別の利点は、ヘルパーウイルスを除去するのに必要な選択系の必要性を排除することである。
CMV又はSV40プロモーターの制御下でT7 RNAポリメラーゼを発現するプラスミドを設計製作して、それが細胞内で組換えMPVゲノムの複製及びパッケージングに使用される細胞の中に一時的にトランスフェクトすることができる。例えば、Vero細胞及び293T細胞を、CMVプロモーターの制御下でT7 RNAポリメラーゼを発現するように設計製作することができる。特定の一実施形態においては、T7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子を、CMV MIEプロモーターの制御下に保持するプラスミドを、T7プロモーターによって駆動される選択マーカー(例えばネオマイシン)と組み合わせて用いることができる。これによって、T7 RNAポリメラーゼを発現する細胞系の効率的な選択が可能となるであろう。T7 RNAポリメラーゼを発現する細胞系を用いた手法は、T7ポリメラーゼを発現するポックスウイルスなどのヘルパーウイルスで共感染させる必要性を排除するので有用である。この方法の別の利点は、ヘルパーウイルスの混入を除去するための選択系の必要性が排除されることである。さらに、この手法は、293T細胞やCOS7細胞など、トランスフェクション効率が高い細胞系の使用を可能にする。したがって、トランスフェクトされた細胞は、複数コピーのT7ポリメラーゼ発現プラスミドを有し、この結果、1コピーしか有しない安定細胞系と比較して、一時的にトランスフェクトされた細胞より、1細胞あたりのT7ポリメラーゼタンパク質の量が多くなっている。
組換えhMPVをレスキューするための、成功した系が開発された。簡単に説明すると、様々なポリメラーゼタンパク質をコードする発現プラスミドを、レスキューするべきクローニングされたhMPVと共に適切な宿主細胞内に共トランスフェクトした。収集及び処理を行い、細胞及び上清を使用してVero細胞に接種した。レスキューされた感染性のウイルスが、免疫染色法を用いて検出された。
MPV株の病原性を特性解析すために動物宿主を感染させることができる。たとえば、それぞれの株が生物内でどれほど感染性があるかを決定するために、様々な宿主を用いることができる。
APVは、ヒトMPVによる感染を予防するため、又はヒト宿主におけるヒトMPVの感染力を低減させるためのワクチンとして使用することができる。ワクチンはAPV全体あるいはAPVの配列及び加えて別のメタニューモウイルスの異種配列からなるそのキメラ若しくは組換え型又は誘導体であることができる。組換えウイルスワクチンを作製するバックボーンとしてAPVのゲノムを使用することができる。たとえば、APVのF遺伝子及び/又はG遺伝子をヒトMPVのF遺伝子又はG遺伝子で置換したワクチンを作製することができる。あるいは、APVバックボーンの配列をPIV由来の配列をAPVバックボーンに置換した又は付加した配列を含むワクチンを作製することができる。組換え/キメラワクチンのさらなる情報については、たとえばConstruction of the Recombinant cDNA and RNAを参照されたい。ワクチンは、それだけには限定されないが、皮下注射、鼻腔内投与、又は吸引を含めた、当業者に周知の様々な方法によって候補に投与することができる(上記セクション5.13参照)。本発明のウイルス及び/又は少なくとも103TCID50〜106TCID50の開始用量で投与する。ウイルス及び/又はワクチンは、単一用量又は複数用量で投与する。たとえば、初回用量は、宿主生命の間中ずっと定期的な間隔で投与する1回又は複数回の後続又はブースター用量と共に投与することができる。臨床治験では、有効な用量レジメンが決定できるように、ウイルスの複製速度をワクチンの用量を調節する指標として使用することができる。研究集団内のウイルスの複製速度と有効であることが知られている所定の速度とを比較することができる。
ヒトMPVは、APVによる感染を予防するため、又はトリ宿主におけるAPVの感染力を低減させるためのトリ用ワクチンとして使用することができる。ワクチンはMPV全体あるいはMPVの配列及び加えて別のメタニューモウイルスの異種配列からなるそのキメラ若しくは組換え型又は誘導体であることができる。組換えウイルスワクチンを作製するバックボーンとしてMPVのゲノムを使用することができる。たとえば、ヒトMPVのF遺伝子及び/又はG遺伝子をAPVのF遺伝子又はG遺伝子で置換したワクチンを作製することができる。組換え/キメラワクチンのさらなる情報については、たとえばConstruction of the Recombinant cDNA and RNAを参照されたい。
ウイルス細胞融合の阻害は、エンベロープウイルスを制御するための新規手法の一典型となるものである。この手法は、hMPVウイルスの感染及び/又は増殖を阻止するのに有利であろう。融合過程中、Fタンパク質の7回反復配列(HR)セグメントが露出する。融合過程中に可溶性のHRペプチドを添加して、競合させれば、ウイルス融合が阻止されるであろう。Fタンパク質のHRペプチドによるhMPV細胞融合の阻害は、強いウイルス細胞融合阻害活性を示すと予測される。
7回反復配列がウイルス融合を阻害する能力を検査するために、それらがウイルス融合を阻害する能力を試験できるように、7回反復ペプチドを発現させ、精製することができる。組換え発現ベクターで適当な細菌宿主、例えば大腸菌BL21(DE3)を形質転換して、光学濃度が600nmで0.8〜1.0の時に発現を誘導する。IPTG 1.0mMを使用した25℃で5時間の誘導に続いて、細菌細胞を収集して、リン酸緩衝食塩水中で超音波処理によって溶解させる。その後、Triton X−100を最終濃度3%となるように添加して、溶解物を氷上で30分間インキュベートし、その後、4℃、12000×gで15分間遠心することによって清澄化する。発現されたHRタンパク質は、その後精製する。
発現された7回反復ペプチドがウイルス融合を阻害する潜在的有効性を決定するために、アッセイを用いて、HRペプチド相互の複合体形成を確認することができる。それを行うために、等モル量のHRA及びHRBを混合して、室温で1時間インキュベートする。融合タンパク質の形態にあるHRA及びHRBの両方によるHRA/B複合体の形成を評価する。ゲル濾過には、Akta Explorer FPLCシステム(Amersham−Pharmacia)上で機能するHiload Superdex G75カラム(Pharmacia)にサンプルを添加する。ピーク画分を収集して、トリス−トリシンSDS−PAGEにかける。ピークの分子量を、同じカラム上を移動するタンパク質標準物質(Pharmacia)と比較して推定した。
これらのペプチドの7回反復配列セグメントは、自然において螺旋状であることが知られている。この理由から、ウイルス融合の阻害に使用するのに適当な候補を同定するために、いくつかの方法を用いて、発現されたHRペプチドがアルファへリックスを形成しているかどうか決定することができる。CDスペクトルは、PBS(10mMリン酸ナトリウム、pH7.3;150mM NaCl)中のタンパク質を用いて分光光度計で行う。波長スペクトルを、37℃で0.1cm経路長のキュベットを用いて記録する。この分析には約20μg/mlのタンパク質濃度を用いる。
HRペプチドがウイルス融合を阻害する有効性を決定するのに、細胞ベースのアッセイを用いることができる。HRAペプチド及びHRBペプチドによるウイルス細胞融合の阻害を試験するために、阻害試験を行う。Vero細胞の単層培養を10〜100 TCID50でhMPVに感染させる。感染の2時間後に、上清を吸引して、ウイルス種菌を除去するために細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄する。新たな培地(L−グルタミン(2mM)、ペニシリン(100U/ml)、ストレプトマイシン(100μg/ml)、及び0.3%ウシ血清アルブミンを含有するIscoveの改変ダルベッコ培地(IMDM))を添加して、細胞を37℃でインキュベートする。HRAペプチド及びHRBペプチドは、個別にhMPV感染細胞とインキュベートされる。あるいは、様々な量のHRAペプチド及びHRBペプチドを、hMPV感染細胞とインキュベートする。APV、RSV、又はPIV由来の対応するHRペプチドも、hMPV感染細胞とのインキュベーションによってhMPVウイルス融合を阻害するのに用いることができる。インキュベーションの24〜72時間後に、免疫蛍光分析(IFA)を用いて細胞の記録を行う。IFAにおける染色は、感染細胞をモルモット抗hMPV血清と共にPBS中で1時間インキュベートして、それに続いて、FITC標識されたウサギ抗モルモットポリクロナール抗体調製物と、PBS中で1時間インキュベートすることによって行う。最後に、免疫蛍光顕微鏡で分析する前に、エリオクロムブラックでバックグランド染色を行う。高倍率(320×)下の5つのフィールド中で感染細胞の計数を行った。
9.1 実施例36:ウイルス遺伝子の置換によって起こる弱毒化
様々なウイルス遺伝子のオープンリーディングフレームの置換を、クローニングされたウイルスゲノムのcDNAで標準的な組換えDNA技法を使用して行う。様々なウイルス構築体におけるCAT活性に関しては、図60を参照されたい。
hMPV株hMPV/NL/1/00のM2遺伝子マップを図61に示す。M2遺伝子の欠失を生成するために、Bsp E1部位をヌクレオチド位置4741に構築し、さらに第2のBsp E1部位をヌクレオチド位置5444に構築する。制限部位は部位特異的変異誘発によって構築する。制限エンドヌクレアーゼBsp E1を使用して、2箇所のBsp E1部位で組換えゲノムの制限消化を行い、続いて連結させると、その結果、ヌクレオチド位置4741とヌクレオチド位置5444との間の配列の欠失が得られる。
制限酵素部位を導入するのに使用したプライマー:
4741から5444までのM2欠失を作製するために、hMPV/NL/1/00にBspEIを導入するため:
プライマーセット
緒言
この方法は、ヘルパーウイルスの非存在下における、プラスミドのみを使用した組換えhMPVの回収を可能にする。hMPVの回収は、SF Vero細胞を使用して実施し、これらは、動物及びヒトに由来する産物の非存在下に増殖される。この方法は、ヘルパーウイルス(T7ポリメラーゼを発現する組換えワクチニアウイルス又は鶏痘ウイルス)を使用した以前の方法と同様の効率で組換えhMPVを回収するのを可能にする。この回収方法はヘルパーウイルスを必要としないので、ワクチンウイルスは混入物質を含まず、下流のワクチン生産を単純化する。ワクチンウイルス回収に使用される細胞は、動物又はヒトに由来する産物を含有しない培地で生育される。これは伝染性海綿状脳症(例えばBSE)に関する製品エンドユーザーの心配を取り除く。
無血清培地中でエレクトロポレーションを使用してSF Vero細胞内に、hMPV Nプラスミド(4μg;マーカー:カナマイシン抵抗性)、hMPV Pプラスミド(4μg;マーカー:カナマイシン抵抗性)、hMPV Lプラスミド(2μg;マーカー:カナマイシン抵抗性)、hMPVアンチゲノムcDNAをコードするcDNA(5μg;マーカー:カナマイシン抵抗性)、及びT7 RNAポリメラーゼをコードするpADT7(N)DpT7(5μg;マーカー:ブラストサイジン)を導入する。
hMPV N pCITEプラスミド4μg、
hMPV P pCITEプラスミド4μg、
hMPV M2 pCITEプラスミド3μg、
hMPV L pCITEプラスミド2μg、
T7 RNAポリメラーゼプラスミド5μg、
及び、レスキューするべきウイルスゲノムをコードするウイルスcDNA 5μgである。
最近になって記載されたパラミクソウイルスであるヒトメタニューモウイルス(hMPV)は、呼吸器疾患を引き起こし、それには、重度の咳、細気管支炎、及び肺炎が含まれることがある。ニューモウイルス(Pneumovirus)亜科の他のメンバー、トリメタニューモウイルス(APV)、及び呼吸器合胞体ウイルス(RSV)と同様に、hMPVは、2つの表面糖タンパク質、すなわち1つの付着糖タンパク質(G)と、1つの融合タンパク質(F)とを発現する。hMPVの結合及び進入の研究は、いまだ報告されていないが、他のパラミクソウイルスのFタンパク質との配列アラインメントは、保存されている機能ドメインの存在を明らかにした(例えば図9参照)。理論に拘泥するものではないが、完全長融合タンパク質F0がF1及びF2に切断されることによって、F1断片のN末端にある融合ペプチドが露出し、これはウイルス膜が宿主細胞膜と融合するための前提条件である。
実施例28で記述したように、いくつかの組換えhMPVが構築された。実施例32で記述したように、様々な組換えhMPVがレスキューされた。トリプシンの存在下及び非存在下における組換えhMPV/NL/1/00の増殖曲線を図65に示す。細胞(Vero細胞)はMOI 0.1で感染させた。
ウイルスを動物に接種したときに、ウイルスに対する一群の抗体が産生される。これらの抗体の一部は、ウイルス粒子に結合して、ウイルスの感染性を中和することができる。この実施例では、微量中和試験を用いて、抗体を含有する血清の希釈液でウイルスをインキュベートした後におけるウイルスの残留感染力を分析した。連続希釈のために、96ウェルプレートを、(i)行A(希釈率1:32);B(1:64);C(1:128);D(1:256);E(1:512);F(1:1024);G(1:2048);及びH(抗体なし)に、そして、(ii)様々な試料用に列1〜12(第1の試料:列1〜3;第2の試料:列4〜6;第3の試料:列7〜9;第4の試料:列10〜12)に分割した。230μlの試料希釈液を行Aに添加する。115μlのOpti−MEMを行B〜Hに添加する。次に、1B、2B、及び3Bのウェルに第1の試料、4B、5B、及び6Bのウェルに第2の試料、7B、8B、及び9Bのウェルに第3の試料、そして、10B、11B、及び12Bのウェルに第4の試料の1:32希釈液115μlを添加する。血清及び培地は、3回、上下にピペッティングすることよって穏やかに混合する。これらのステップを、行BからCに、行CからDに、行DからEに、行EからGに繰り返す。希釈された試料を行Gに添加して、混合した後に、行Gから115μlを取り除き、廃棄する。
MPV/RSV2価ワクチン候補株、例えば、ヒトRSVの可溶性型Fタンパク質など、RSVの抗原性タンパク質を発現するhMPV(「hMPV/RSV FSOL」)を、アフリカミドリザルなどの非ヒト霊長類モデルにおける有効性及び免疫原性に関して評価する。この可溶性型RSV Fタンパク質は、膜貫通ドメイン及び管腔ドメインを欠失している。
Claims (76)
- メタニューモウイルス(MPV)を生成する方法であって、
a)異種RNAポリメラーゼを発現する宿主細胞に、
MPVのcDNAを含むDNA分子であって、異種RNAポリメラーゼによって転写されるDNA分子を
導入すること、及び、
b)前記宿主細胞によって生成されるウイルスを単離すること
を含む方法。 - メタニューモウイルスを生成する方法であって、
a)T7 RNAポリメラーゼを発現する宿主細胞に、
MPVのcDNAを含むDNA分子であって、T7 RNAポリメラーゼによって転写されるDNA分子
を導入すること、及び、
b)前記宿主細胞によって生成されるウイルスを単離すること
を含む方法。 - メタニューモウイルスを生成する方法であって、
(a)polI及びpolIIポリメラーゼを発現する宿主細胞に、MPVのcDNAを正方向に含むDNA分子であって、前記polIポリメラーゼによって転写されるDNA分子を導入すること、及び
(b)前記宿主細胞によって生成されるウイルスを単離すること
を含む方法。 - 転写調節配列に機能的に連結した、ウイルスのN、P、及びLタンパク質をコードする1つ又は複数のDNA分子を、polI及びpolIIポリメラーゼを発現する宿主細胞に導入することをさらに含む、請求項1、2、又は3に記載の方法。
- 前記メタニューモウイルスが哺乳動物メタニューモウイルスである、請求項1、2、又は3に記載の方法。
- 前記メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項1、2、又は3に記載の方法。
- 前記宿主細胞がM2−1をコードするDNA分子をさらに含む、請求項1、2、又は3に記載の方法。
- 前記宿主細胞がBHK細胞系である、請求項1、2、又は3に記載の方法。
- 前記宿主細胞が293T細胞である、請求項1、2、又は3に記載の方法。
- 前記宿主細胞がVero細胞である、請求項1、2、又は3に記載の方法。
- ウイルスを生成する方法であって、転写調節配列に機能的に連結したウイルスのN、P、及びLタンパク質をコードする1つ又は複数のDNA分子を宿主細胞に導入することを含み、前記N、P、及びLタンパク質が、レスキューしようとするウイルス種以外のウイルス種に由来する、上記方法。
- 単離された哺乳動物メタニューモウイルスであって、前記哺乳動物メタニューモウイルスがパラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)のニューモウイルス亜科(Pneumovirinae)に属するマイナスセンス1本鎖RNAウイルスであり、かつ、前記哺乳動物メタニューモウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)に関連するよりも、I−2614としてCNCM(パリ)に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関係しているものであり、(i)前記ウイルスの少なくとも1つの領域が、哺乳動物メタニューモウイルスの異なる分離株からの類似の領域に置き換えられており、又は、(ii)前記ウイルスの少なくとも1つの領域が除去されており、又は、(iii)前記ウイルスの少なくとも1つの領域が、哺乳動物メタニューモウイルスの異なる分離株からの類似の領域に置き換えられおり、かつ、前記ウイルスの少なくとも1つの領域が除去されている、哺乳動物メタニューモウイルス。
- 前記領域の長さが、少なくとも3ヌクレオチド、少なくとも5ヌクレオチド(nt)、少なくとも10nt、少なくとも25nt、少なくとも50nt、少なくとも75nt、少なくとも100nt、少なくとも250nt、少なくとも500nt、少なくとも750nt、少なくとも1kb、少なくとも1.5kb、少なくとも2kb、少なくとも2.5kb、少なくとも3kb、少なくとも4kb、又は少なくとも5kbである、請求項12に記載のウイルス。
- 前記領域が、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2−1 ORF、M2−2 ORF、SH遺伝子、G遺伝子、L遺伝子、リーダー領域、トレーラー領域、又は非コード領域の断片である、請求項12に記載のウイルス。
- 前記領域が、N遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2−1 ORF、M2−2 ORF、SH遺伝子、G遺伝子、L遺伝子、リーダー領域、トレーラー領域、又は非コード領域である、請求項12に記載のウイルス。
- 前記ウイルスが弱毒化されている、請求項12、13、又は14に記載のウイルス。
- 以下のアミノ酸位置、すなわち、Fタンパク質のアミノ酸99位から102位までのRQSR、Lタンパク質のアミノ酸456位のPhe、Lタンパク質のアミノ酸749位のGlu、Lタンパク質のアミノ酸1246位のTyr、Lタンパク質のアミノ酸1094位のMet、及び、Lタンパク質のアミノ酸746位のLysの1つ又は複数に、少なくとも1つの改変をもたらす少なくとも1つの遺伝子組換えを含む弱毒化hMPV。
- 前記遺伝子組換えが欠失、置換、又は付加である、請求項17に記載の弱毒化ウイルス。
- 少なくとも1つの遺伝的改変が、1コドンあたり2又は3ヌクレオチドの置換又は欠失からなる、請求項17に記載の弱毒化ウイルス。
- 弱毒化哺乳動物メタニューモウイルスであって、前記哺乳動物メタニューモウイルスのゲノム中の少なくとも1つのオープンリーディングフレームの位置が変化している、弱毒化哺乳動物メタニューモウイルス。
- 前記オープンリーディングフレームが、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2タンパク質、SHタンパク質、Gタンパク質、又はLタンパク質をコードする、請求項20に記載の弱毒化哺乳動物メタニューモウイルス。
- ウイルスを増殖する方法であって、ウイルスに感染している細胞を、前記細胞の成長に最適な温度より低い温度で培養することを含む方法。
- ウイルスを増殖する方法であって、(i)ウイルスに感染させる前に、第1の温度で細胞を培養すること、(ii)細胞をウイルスに感染させること、及び、(iii)細胞をウイルスに感染させた後に、第2の温度で細胞を培養することを含み、第2の温度が第1の温度より低いものである、上記方法。
- ウイルスを増殖する方法であって、血清の非存在下でウイルスに感染している細胞を培養することを含む方法。
- ウイルスを増殖する方法であって、(i)ウイルスに感染させる前に、血清の存在下で細胞を培養すること、(ii)細胞をウイルスに感染させること、及び、(iii)細胞をウイルスに感染させた後に、血清の非存在下で細胞を培養すること含む方法。
- ウイルスを増殖する方法であって、ウイルスに感染している細胞を、前記細胞の成長に最適である温度より低い温度で、無血清で培養することを含む方法。
- 前記ウイルスがマイナス鎖RNAウイルスである、請求項22、23、24、25、又は26に記載の方法。
- 前記ウイルスがメタニューモウイルスである、請求項22、23、24、25、又は26に記載の方法。
- 前記ウイルスが哺乳動物メタニューモウイルスである、請求項22、23、24、25、又は26に記載の方法。
- 前記ウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項22、23、24、25、又は26に記載の方法。
- 細胞が哺乳動物メタニューモウイルスに感染するのを阻害する方法であって、細胞を7回反復配列に接触させることを含み、前記7回反復配列が、哺乳動物メタニューモウイルスのHRに対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、又は少なくとも99.5%同一である、上記方法。
- 哺乳動物が哺乳動物メタニューモウイルスに感染するのを予防、治療、又は管理する方法であって、治療上有効な量の7回反復配列を前記哺乳動物に投与することを含み、前記7回反復配列が、前記哺乳動物メタニューモウイルスのHRに対して少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、又は少なくとも99.5%同一である、上記方法。
- 前記7回反復配列が、HRA、HRB、又はこれらの組合せである、請求項31又は32に記載の方法。
- 前記哺乳動物メタニューモウイルスがヒトメタニューモウイルスである、請求項31又は32に記載の方法。
- サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、選択される第2の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、サンプルとを接触させることを含み、第2の核酸の配列が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21である、上記方法。
- サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、タンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含み、前記タンパク質の配列が、配列番号322、配列番号366、配列番号374、配列番号358、配列番号314、配列番号338、配列番号346、配列番号382、配列番号330、配列番号325、配列番号369、配列番号377、配列番号361、配列番号317、配列番号341、配列番号349、配列番号385、配列番号333、配列番号323、配列番号367、配列番号375、配列番号359、配列番号315、配列番号339、配列番号347、配列番号383、配列番号331、配列番号324、配列番号368、配列番号376、配列番号360、配列番号316、配列番号340、配列番号348、配列番号384、又は配列番号332である、上記方法。
- サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、配列番号366に対して少なくとも90%同一である、配列番号374に対して少なくとも70%同一である、配列番号358に対して少なくとも90%同一である、配列番号314に対して少なくとも82%同一である、配列番号338に対して少なくとも85%同一である、配列番号346に対して少なくとも60%同一である、配列番号330に対して少なくとも85%同一である、配列番号322に対して少なくとも20%同一である、配列番号382に対して少なくとも30%同一であるタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
- 第1の核酸が、サブタイプA1、B1、A2、又はB2のhMPVのゲノムに対して特異的にハイブリダイズする、請求項36又は37に記載の方法。
- 第1の核酸の長さが、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、又は少なくとも25ヌクレオチドである、請求項36又は37に記載の方法。
- サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、タンパク質、又はタンパク質の断片を特異的に認識する抗体又はそのフラグメントと、前記サンプルとを接触させることを含み、前記タンパク質の配列が、配列番号374、配列番号358、配列番号314、配列番号338、配列番号346、配列番号330、配列番号322、配列番号382、配列番号366、配列番号324、配列番号368、配列番号376、配列番号360、配列番号316、配列番号340、配列番号348、配列番号384、配列番号332、配列番号325、配列番号369、配列番号377、配列番号361、配列番号317、配列番号341、配列番号349、配列番号385、配列番号333、配列番号323、配列番号367、配列番号375、配列番号359、配列番号315、配列番号339、配列番号347、配列番号383、又は配列番号331である、上記方法。
- サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、配列番号374に対して少なくとも70%同一である、配列番号358に対して少なくとも90%同一である、配列番号314に対して少なくとも82%同一である、配列番号338に対して少なくとも85%同一である、配列番号346に対して少なくとも60%同一である、配列番号330に対して少なくとも85%同一である、配列番号322に対して少なくとも20%同一である、配列番号382に対して少なくとも30%同一である、配列番号366に対して少なくとも90%同一であるタンパク質又はタンパク質の断片を特異的に認識する抗体又はそのフラグメントと、前記サンプルとを接触させることを含む方法。
- 哺乳動物のMPV感染を血清診断する方法であって、前記哺乳動物から得たサンプル中における、MPV又はその構成要素に対して特異的な抗体又はそのフラグメントの存在を、配列番号374に対して少なくとも70%同一である、配列番号358に対して少なくとも90%同一である、配列番号314に対して少なくとも82%同一である、配列番号338に対して少なくとも85%同一である、配列番号346に対して少なくとも60%同一である、配列番号330に対して少なくとも85%同一である、配列番号322に対して少なくとも20%同一である、配列番号382に対して少なくとも30%同一である、配列番号366に対して少なくとも90%同一であるタンパク質又はタンパク質の断片と、前記サンプルとを反応させることによって検出することを含み、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)に関連するよりも、I−2614としてCNCM(パリ)に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連している、上記方法。
- 哺乳動物のMPV感染を血清診断する方法であって、前記哺乳動物から得たサンプル中における、MPV又はその構成要素に対して特異的な抗体又はそのフラグメントの存在を、MPV又はその構成要素と前記サンプルとを反応させることによって検出することを含み、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)に関連するよりも、I−2614としてCNCM(パリ)に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連している、上記方法。
- サンプル中の変種B1哺乳動物MPVを検出する方法であって、
(i)哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質(配列番号324)に対して少なくとも66%同一であるアミノ酸配列、
(ii)哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質(配列番号368)に対して少なくとも98.5%同一であるアミノ酸配列、
(iii)哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質(配列番号376)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(iv)哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質(配列番号360)に同一であるアミノ酸配列、
(v)哺乳動物MPV変種B1のFタンパク質(配列番号316)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(vi)哺乳動物MPV変種B1のM2−1タンパク質(配列番号340)に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、
(vii)哺乳動物MPV変種B1のM2−2タンパク質(配列番号348)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(viii)哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質(配列番号384)に対して少なくとも83%同一であるアミノ酸配列、又は
(ix)哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質(配列番号332)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列
を含むタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。 - サンプル中の変種A1哺乳動物MPVを検出する方法であって、
(i)哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質(配列番号322)に対して少なくとも66%同一であるアミノ酸配列、
(ii)哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質(配列番号366)に対して少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列、
(iii)哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質(配列番号374)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(iv)哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質(配列番号358)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(v)哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質(配列番号314)に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、
(vi)哺乳動物MPV変種A1のM2−1タンパク質(配列番号338)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(vii)哺乳動物MPV変種A1のM2−2タンパク質(配列番号346)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(viii)哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質(配列番号382)に対して少なくとも84%同一であるアミノ酸配列、又は、
(ix)哺乳動物MPV変種A1のウイルスのLタンパク質(配列番号330)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列
を含むタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。 - サンプル中の変種B2哺乳動物MPVを検出する方法であって、
(i)哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質(配列番号325)に対して少なくとも66%同一であるアミノ酸配列、
(ii)哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質(配列番号369)に対して少なくとも97%同一であるアミノ酸配列、
(iii)哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質(配列番号377)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(iv)哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質(配列番号361)に同一であるアミノ酸配列、
(v)哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質(配列番号317)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(vi)哺乳動物MPV変種B2のM2−1タンパク質(配列番号341)に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列:
(vii)哺乳動物MPV変種B2のM2−2タンパク質(配列番号349)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(viii)哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質(配列番号385)に対して少なくとも84%同一であるアミノ酸配列、又は、
(ix)哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質(配列番号333)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列
を含むタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。 - サンプル中の変種A2哺乳動物MPVを検出する方法であって、
(i)哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質(配列番号323)に対して少なくとも66%同一であるアミノ酸配列、
(ii)哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質(配列番号367)に対して少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列、
(iii)哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質(配列番号375)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(iv)哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質(配列番号359)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(v)哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質(配列番号315)に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、
(vi)哺乳動物MPV変種A2のM2−1タンパク質(配列番号339)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(vii)哺乳動物MPV変種A2のM2−2タンパク質(配列番号347)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(viii)哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質(配列番号383)に対して少なくとも84%同一であるアミノ酸配列、又は、
(ix)哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質(配列番号331)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列
を含むタンパク質をコードする第2の核酸に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。 - 第1の核酸の長さが、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、又は少なくとも25ヌクレオチドである、請求項44、45、46、又は47のいずれか一項に記載の方法。
- サンプル中の変種B1哺乳動物MPVを検出する方法であって、
(i)哺乳動物MPV変種B1のGタンパク質(配列番号324)に対して少なくとも66%同一であるアミノ酸配列、
(ii)哺乳動物MPV変種B1のNタンパク質(配列番号368)に対して少なくとも98.5%同一であるアミノ酸配列、
(iii)哺乳動物MPV変種B1のPタンパク質(配列番号376)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(iv)哺乳動物MPV変種B1のMタンパク質(配列番号360)に同一であるアミノ酸配列、
(v)哺乳動物MPV変種B1のFpタンパク質(配列番号316)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(vi)哺乳動物MPV変種B1のM2−1タンパク質(配列番号340)に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、
(vii)哺乳動物MPV変種B1のM2−2タンパク質(配列番号348)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(viii)哺乳動物MPV変種B1のSHタンパク質(配列番号384)に対して少なくとも83%同一であるアミノ酸配列、又は、
(ix)哺乳動物MPV変種B1のLタンパク質(配列番号332)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列
からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。 - サンプル中に変種A1哺乳動物MPVを検出する方法であって、
(i)哺乳動物MPV変種A1のGタンパク質(配列番号322)に対して少なくとも66%同一であるアミノ酸配列、
(ii)哺乳動物MPV変種A1のNタンパク質(配列番号366)に対して少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列、
(iii)哺乳動物MPV変種A1のPタンパク質(配列番号374)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(iv)哺乳動物MPV変種A1のMタンパク質(配列番号358)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(v)哺乳動物MPV変種A1のFタンパク質(配列番号314)に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、
(vi)哺乳動物MPV変種A1のM2−1タンパク質(配列番号338)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(vii)哺乳動物MPV変種A1のM2−2タンパク質(配列番号346)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(viii)哺乳動物MPV変種A1のSHタンパク質(配列番号382)に対して少なくとも84%同一であるアミノ酸配列、又は、
(ix)哺乳動物MPV変種A1のウイルスのLタンパク質(配列番号330)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列
からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。 - サンプル中の変種B2哺乳動物MPVを検出する方法であって、
(i)哺乳動物MPV変種B2のGタンパク質(配列番号325)に対して少なくとも66%同一であるアミノ酸配列、
(ii)哺乳動物MPV変種B2のNタンパク質(配列番号369)に対して少なくとも97%同一であるアミノ酸配列、
(iii)哺乳動物MPV変種B2のPタンパク質(配列番号377)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(iv)哺乳動物MPV変種B2のMタンパク質(配列番号361)に同一であるアミノ酸配列、
(v)哺乳動物MPV変種B2のFタンパク質(配列番号317)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(vi)哺乳動物MPV変種B2のM2−1タンパク質(配列番号341)に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、
(vii)哺乳動物MPV変種B2のM2−2タンパク質(配列番号349)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(viii)哺乳動物MPV変種B2のSHタンパク質(配列番号385)に対して少なくとも84%同一であるアミノ酸配列、又は、
(ix)哺乳動物MPV変種B2のLタンパク質(配列番号333)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列
からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。 - サンプル中の変種A2哺乳動物MPVを検出する方法であって、
(i)哺乳動物MPV変種A2のGタンパク質(配列番号323)に対して少なくとも66%同一であるアミノ酸配列、
(ii)哺乳動物MPV変種A2のNタンパク質(配列番号367)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(iii)哺乳動物MPV変種A2のPタンパク質(配列番号375)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(iv)哺乳動物MPV変種A2のMタンパク質(配列番号359)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(v)哺乳動物MPV変種A2のFタンパク質(配列番号315)に対して少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、
(vi)哺乳動物MPV変種A2のM2−1タンパク質(配列番号339)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列、
(vii)哺乳動物MPV変種A2のM2−2タンパク質(配列番号347)に対して少なくとも96%同一であるアミノ酸配列、
(viii)哺乳動物MPV変種A2のSHタンパク質(配列番号383)に対して少なくとも84%同一であるアミノ酸配列、又は、
(ix)哺乳動物MPV変種A2のLタンパク質(配列番号331)に対して少なくとも99%同一であるアミノ酸配列
からなるタンパク質に特異的に結合する抗体と、前記サンプルとを接触させることを含む方法。 - サンプル中のMPVを検出する方法であって、核酸又はその断片と、前記サンプルとを接触させることを含み、前記核酸が、配列番号378、配列番号362、配列番号318、配列番号342、配列番号350、配列番号326、配列番号334、配列番号386、配列番号370、配列番号379、配列番号363、配列番号319、配列番号343、配列番号351、配列番号327、配列番号335、配列番号387、配列番号371、配列番号380、配列番号364、配列番号320、配列番号344、配列番号352、配列番号328、配列番号336、配列番号388、配列番号372、配列番号381、配列番号365、配列番号321、配列番号345、配列番号353、配列番号329、配列番号337、配列番号389、配列番号373、又は配列番号357である、上記方法。
- サンプル中のMPVを検出する方法であって、核酸又はその断片と、前記サンプルとを接触させることを含み、前記核酸が、配列番号84〜118、配列番号154〜233、配列番号318〜321、配列番号326〜329、配列番号334〜337、配列番号342〜345、配列番号350〜357、配列番号362〜365、配列番号370〜373、配列番号378〜381、及び配列番号386〜389からなる群より選択される、上記方法。
- 前記断片の長さが、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、又は少なくとも1000ヌクレオチドである、請求項53又は54に記載の方法。
- サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、
(i)レポーター遺伝子をコードするミニレプリコンを含む細胞と、前記サンプルとを接触させること、及び、
(ii)前記レポーター遺伝子の発現を測定すること
を含む方法。 - 前記ミニレプリコンが、前記細胞で増幅された哺乳動物メタニューモウイルスのウイルス粒子中にパッケージングされる、請求項56に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子の発現が、前記哺乳動物メタニューモウイルスの存在下で刺激される、請求項56に記載の方法。
- サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、第3の核酸に対しストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれぞれハイブリダイズする第1の核酸及び第2の核酸と、前記サンプルとを接触させることを含み、第3の核酸が、配列番号18、配列番号19、配列番号20、及び配列番号21、又はその断片である、上記方法。
- サンプル中の哺乳動物メタニューモウイルスを検出する方法であって、
a)配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21に特異的にハイブリダイズする第1の核酸と、前記サンプルとを接触させること、及び、
b)第1の核酸配列がハイブリダイズした位置からMPV核酸の断片を増幅すること
を含み、前記断片は、断片の全長にわたって、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21に対して少なくとも89%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%同一、配列番号366に対して少なくとも90%同一、配列番号374に対して少なくとも70%同一、配列番号358に対して少なくとも90%同一、配列番号314に対して少なくとも82%同一、配列番号338に対して少なくとも85%同一、配列番号346に対して少なくとも60%同一、配列番号330に対して少なくとも85%同一、配列番号322に対して少なくとも20%同一、あるいは配列番号382に対して少なくとも30%同一である、上記方法。 - 前記断片が、断片の全長にわたって、配列番号366、配列番号374、配列番号358、配列番号314、配列番号338、配列番号346、配列番号330、配列番号322、又は配列番号382に対して少なくとも90%、95%、98%、99%、99.5%、又は100%同一である、請求項60に記載の方法。
- 第1の核酸の長さが、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、又は少なくとも25ヌクレオチドである、請求項60に記載の方法。
- 前記断片の長さが、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも250、少なくとも500、又は少なくとも1000ヌクレオチドである、請求項60に記載の方法。
- 第1の核酸が、配列番号22〜83からなる群より選択される核酸配列の核酸配列を含む、請求項60に記載の方法。
- (i)配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21に特異的にハイブリダイズする第2の核酸を、前記サンプルと接触させ、かつ、(ii)第1及び第2の核酸がそれぞれ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それぞれの少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、又は少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも1000ヌクレオチド、少なくとも2000ヌクレオチド、少なくとも3000ヌクレオチド、又は少なくとも4000ヌクレオチド以内の範囲で、第3の核酸配列にハイブリダイズし、第3の核酸配列は、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号84〜118、配列番号154〜233、配列番号318〜321、配列番号326〜329、配列番号334〜337、配列番号342〜345、配列番号350〜357、配列番号362〜365、配列番号370〜373、配列番号378〜381、及び配列番号386〜389からなる群より選択される、請求項60に記載の方法。
- 前記増幅断片の検出をさらに含む、請求項60に記載の方法。
- 哺乳動物のMPV感染を診断する方法であって、前記哺乳動物のサンプル中で、MPV又はその構成要素の存在を、F、L、N、M、P、M2、G、及びSHからなる群より選択されるMPVタンパク質を特異的に認識する抗体と、前記サンプルとを接触させることによって決定することを含む方法。
- ヒトのMPV感染を診断する方法であって、ヒトのサンプル中で、MPV又はその構成要素の存在を、F、L、N、M、P、M2、G、及びSHからなる群より選択されるhMPVタンパク質を特異的に認識する抗体と、前記サンプルとを接触させることによって決定することを含む方法。
- MPVを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)に関連するよりも、I−2614としてCNCM(パリ)に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号366に対して少なくとも90%同一、配列番号374に対して少なくとも70%同一、配列番号358に対して少なくとも90%同一、配列番号314に対して少なくとも82%同一、配列番号338に対して少なくとも85%同一、配列番号346に対して少なくとも60%同一、配列番号330に対して少なくとも85%同一、配列番号322に対して少なくとも20%同一、配列番号382に対して少なくとも30%同一であるタンパク質を、1つ又は複数の容器の中に含むキット。
- タンパク質を検出する手段をさらに含む、請求項6971に記載のキット。
- MPVを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)に関連するよりも、I−2614としてCNCM(パリ)に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号366に対して少なくとも90%同一、配列番号374に対して少なくとも70%同一、配列番号358に対して少なくとも90%同一、配列番号314に対して少なくとも82%同一、配列番号338に対して少なくとも85%同一、配列番号346に対して少なくとも60%同一、配列番号330に対して少なくとも85%同一、配列番号322に対して少なくとも20%同一、配列番号382に対して少なくとも30%同一であるタンパク質に特異的に結合する抗体を1つ又は複数の容器の中に含むキット。
- 前記抗体を検出する手段をさらに含む、請求項71に記載のキット。
- MPVを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)に関連するよりも、I−2614としてCNCM(パリ)に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号366に対して少なくとも90%同一、配列番号374に対して少なくとも70%同一、配列番号358に対して少なくとも90%同一、配列番号314に対して少なくとも82%同一、配列番号338に対して少なくとも85%同一、配列番号346に対して少なくとも60%同一、配列番号330に対して少なくとも85%同一、配列番号322に対して少なくとも20%同一、配列番号382に対して少なくとも30%同一であるタンパク質をコードする核酸を1つ又は複数の容器の中に含むキット。
- MPVを検出するためのキットであって、前記ウイルスが、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス(TRTV)に関連するよりも、I−2614としてCNCM(パリ)に寄託されたウイルス分離株に、系統学上より密接に関連しており、配列番号378、配列番号362、配列番号318、配列番号342、配列番号350、配列番号326、配列番号334、配列番号386、配列番号370、配列番号379、配列番号363、配列番号319、配列番号343、配列番号351、配列番号327、配列番号335、配列番号387、配列番号371、配列番号380、配列番号364、配列番号320、配列番号344、配列番号352、配列番号328、配列番号336、配列番号388、配列番号372、配列番号381、配列番号365、配列番号321、配列番号345、配列番号353、配列番号329、配列番号337、配列番号389、配列番号373、配列番号357、配列番号314、及び配列番号22〜83からなる核酸の群から選択される核酸に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は少なくとも99.5%同一である1つ又は複数の核酸又はその断片を含むキット。
- 前記核酸又はその断片を検出する手段をさらに含む、請求項73又は74に記載のキット。
- 前記断片の長さが、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、又は少なくとも25ヌクレオチドである、請求項73に記載のキット。
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