CN109628413A - 一种人偏肺病毒的培养方法及其产物和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人偏肺病毒HMPV培养方法及其产物和应用。本发明的人偏肺病毒的培养方法是使用幼仓鼠肾细胞系BHK作为人偏肺病毒的宿主，按照BHK细胞准备——HMPV接种——HMPV培养——HMPV收获进行。本发明还提供了通过上述培养方法获得的人偏肺病毒和BHK细胞系培养物。本发明的培养方法优化了HMPV的培养操作方法、缩短培养时间、提高标本分离成功率和产出病毒液浓度，为人偏肺病毒体外诊断试剂、药物、抗体、疫苗的研发生产提供了较好的基础，为人偏肺病毒生物检定参考品研发与生产提供了充足的原料，同时也为建立鉴定人偏肺病毒感染金标准方法奠定了较好的基础。

Description

一种人偏肺病毒的培养方法及其产物和应用

技术领域

本发明涉及病毒培养技术领域，具体涉及一种人偏肺病毒的培养方法及其产物和应用。

背景技术

人偏肺病毒(HMPV，Human Metapneumovirus)是2001年一位荷兰学者通过使用第三代猴肾细胞系(LLC-MK2、Vero)从呼吸道标本中培养分离出来的，并在之后的时间里被分离出不同亚型。经众多学者研究，LLC-MK2细胞被认为是培养分离HMPV的最佳宿主，其次是Vero细胞。培养分离的操作方法是将LLC-MK2细胞或Vero细胞传代到96孔细胞培养板中，培养成单层细胞，用PBS清洗细胞2遍；再接种病毒液50μL/孔，室温3000r/min离心60min，弃上清，加入150μL/孔维持培养基(含1.25μg/mLTPCK胰酶处理的维持液MEM)，放到37℃，5％CO₂培养箱中培养；每隔3天观察一次有无细胞病变，取50μL上清，实时荧光PCR动态监测病毒的复制，同时补充等量新鲜维持培养基，培养18天后鉴定，若为阴性则盲传2代。

现有培养分离方法存在多方面的缺点和困难：①HMPV生长复制缓慢；②培养时间较长，需要连续培养长达18天；③必要时每隔2-3天更换新鲜维持培养液，以保持细胞的活力；④还需要每隔3天取样检测1次，观察病毒复制情况；⑤需要使用96孔细胞培养板离心培养。这些操作要求给HMPV培养带来极大的困难和麻烦。而且，⑥HMPV标本分离成功率低；培养HMPV产出低。

正是因为HMPV培养非常困难，才导致对HMPV的研究进展相当缓慢。至今未见任何一家保藏中心有出售HMPV毒株，即便是世界上最大的保藏中心美国典型培养保藏中心(ATCC)也仅有一份HMPV核酸参考品出售(VR-3250SD)，数量少且价格昂贵。至今基因数据库(NCBI)网站上收录的不同来源的HMPV基因组全序列约60条，数据缺乏。《临床微生物学手册》第11版记载HMPV的分型研究尚不完善，相关流行病学资料缺乏。造成这些现象的根本原因是HMPV的培养困难，难以获得足够的研究材料。

病毒的接种方法、检测方法都已经相当成熟，众多学者已经优化过。不同病毒培养时的操作方法大同小异，因此在操作方法上优化的可能性很小，即便做出优化也不会与传统方法产生本质区别。

决定一种病毒能否在体外培养的原因有两个关键因素，第一个因素是寻找一种对该病毒敏感的宿主，第二个因素是在培养基中添加辅助病毒感染、复制的营养物质。

BHK细胞系作为一种鼠肾细胞，与现有技术使用的猴肾细胞系存在本质区别，未曾见用于HMPV的培养。BHK细胞系创系于1960年代，从幼儿叙利亚仓鼠肾脏分离创建，随后克隆并创建大量子代细胞系，例如BHK-21[C13](ATCC CCL-10)。目前，大多数保藏中心保存的是子代细胞系，只有少量保藏中心或病毒学实验室保存有原系，如中科院昆明细胞库保存的BHK编号为KCB 90020YJ。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种人偏肺病毒的培养方法及其产物和应用。本发明的培养方法优化了HMPV的培养操作方法、缩短培养时间、提高标本分离成功率和产出病毒液浓度。

本发明的人偏肺病毒的培养方法是使用幼仓鼠肾细胞系(BHK，Baby HamsterKidney Cell)作为人偏肺病毒的宿主。

优选的，所述培养方法包括如下步骤：BHK细胞准备——HMPV接种——HMPV培养——HMPV收获。

优选的，本发明的人偏肺病毒的培养方法包括如下步骤：

(1)准备幼仓鼠肾细胞：将所述幼仓鼠肾细胞传代到96孔板或T75培养瓶中；

(2)人偏肺病毒接种：用PBS清洗所述步骤(1)中处理后的幼仓鼠肾细胞，稀释所述人偏肺病毒的病毒液并接种到清洗后的所述幼仓鼠肾细胞上，再放入培养箱中静置2小时或者在室温条件下使用离心机以1500g离心力离心90分钟；所述培养箱的条件为35℃，5％CO2；

(3)人偏肺病毒培养：去除步骤(2)中所述人偏肺病毒的病毒液后，更换含0.3μg/mL TPCK胰酶的DMEM培养基，再放入培养箱培养；所述培养条件为35℃-37℃，5％CO₂，培养5-9天；

(4)人偏肺病毒收获：培养到第5天后，每天观察BHK细胞系培养物的病变效果，当病变达到70％以上，进行人偏肺病毒的收获。

本发明的第二个目的是还提供了通过上述培养方法获得的人偏肺病毒。

本发明的第三个目的是还提供了通过上述培养方法获得的人偏肺病毒在人偏肺病毒体外诊断试剂研发与生产、抗人偏肺病毒药物研发与生产、人偏肺病毒抗体研发与生产、人偏肺病毒疫苗研发与生产、人偏肺病毒生物检定参考品研发与生产、人偏肺病毒动物感染实验及其产物方面的应用。

本发明的第四个目的是还提供了通过上述培养方法获得的BHK细胞系培养物。

本发明的第五个目的是还提供了通过上述培养方法获得的BHK细胞系培养物在HMPV感染诊断方面的应用。

本发明选定幼仓鼠肾细胞系(BHK，Baby Hamster Kidney Cell)作为HMPV的新宿主，使HMPV培养在操作方法、培养时间、标本分离成功率、产出病毒液浓度这几项获得优化。①培养时间由现有的18天缩短到9天以内；②中途无需换液和取样检测；③不受96孔板培养方法的限制，可使用更大的容器，如T75培养瓶培养。④标本分离成功率提升到60％以上，获得大量毒株并测序分型，使得分离培养法应用于HMPV感染的诊断得以实现；⑤获得更高产出，病毒液浓度可达10⁶TCID₅₀/mL以上。

本发明方法为人偏肺病毒体外诊断试剂、药物、抗体、疫苗的研发生产提供了较好的基础，为人偏肺病毒生物检定参考品研发与生产提供了充足的原料，同时也为建立鉴定人偏肺病毒感染金标准方法奠定了较好的基础。

附图说明

图1为本发明的HMPV在BHK细胞中培养6天的CPE(100×)图，其中，A为阴性BHK细胞图，B为细胞变圆脱落种CPE形态，C为扁平融合种CPE形态，D为聚团融合种CPE形态；

图2为文献《临床常见呼吸道病毒分离培养手册》(周荣、杨子锋编著)记载的HMPV在LLC-MK2细胞中培养18天的CPE图，其中A为阴性对照(50×)，B为阴性对照(200×)，C为hMPV(50×)，D为hMPV(200×)。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照本领域中常规实验方法进行。

实施例1：将LLC-MK2细胞与BHK细胞对比，进行HMPV培养实验对照

参考现有方法选择LLC-MK2细胞作为对照组，BHK细胞作为实验组。按如下方法进行对照实验。

标本来源：广州医科大学附属第一医院检验科，咽拭子，样本号1803-107，起始浓度为CT＝24.96。CT是荧光定量PCR仪的检测单位，CT＝24.96相当于10⁴copies/mL。

培养基：A、DMEM+2％NCS+1％P/S

B、DMEM+0.3μg/mL TPCK-Try+1％P/S

其中，DMEM是细胞基础培养基，NCS是新生牛血清，P/S是青霉素和链霉素的简称，TPCK-Try是经过“甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮”处理的胰酶简称。

LLC-MK2和BHK细胞的准备：将LLC-MK2和BHK细胞分别传代到96孔板培养板中。

人偏肺病毒接种方法：用PBS清洗准备好的LLC-MK2和BHK细胞，稀释人偏肺病毒的病毒液并接种到清洗后的BHK和LLC-MK2细胞上，再放入到离心机中离心接种；所述的接种条件为室温、1500g离心力离心90分钟。

培养方法：去除病毒液，BHK与LLC-MK2均分为2组，分别更换A培养基和B培养基，培养环境35℃5％CO₂，培养时间7天。

检测方法：使用荧光定量PCR检测，获得CT值，检测误差±1，值越小表示浓度越高，每降低3.3，表示浓度提高10倍。在第3天、第4天或第5天、第7天取样检测，并观察是否有病变。实验结果见表1，表1为用LLC-MK2细胞与BHK细胞进行HMPV培养对照实验的结果数据，其中A表示A培养基检测结果，B表示B培养基检测结果。

表1

结果分析：

(1)第1代LLC-MK2与BHK无显著差异，A培养基与B培养基无显著差异，而且浓度均低于标本浓度(CT＞24.96)。这个现象符合临床病毒学规律，大多数病毒接种第一代需要适应细胞，产出一般不高。因此第1代的数据不能说明两者优劣，但说明了LLC-MK2与BHK均能培养HMPV。

(2)第2代LLC-MK2与BHK有显著差异，A培养基与B培养基有显著差异。在使用B培养基时，第3天采样结果显示BHK培养的HMPV浓度(CT＝20.89)已经超过标本浓度(CT＝24.96)10倍以上，第5天采样时BHK培养的HMPV浓度(CT＝17.71)超原始标本浓度(CT＝24.96)100倍以上，而LLC-MK2培养的HMPV浓度仅能达到标本浓度水平。

(3)观察BHK组实验结果，使用B培养基培养的浓度远远超过A培养基，这符合文献描述的HMPV培养需要使用含胰酶的培养基。

(4)根据第2代培养的结果，我们认为数据已经足够充分，使用B培养基时，从第二代开始BHK远远强于LLC-MK2。因此不需要进行更多对比实验。

实施例2：选择BHK细胞作为宿主，使用实施例1中的B类培养基进行扩增实验及TCID₅₀滴度测定

根据对比实验的结果，我们选择BHK细胞作为宿主，使用实施例1中的B类培养基，使用96孔板从标本中分离毒株，然后使用T75培养瓶扩大培养，以此方法共获取4株毒株，编号为HMPV-01、HMPV-02、HMPV-03、HMPV-04。扩大培养后，使用96孔板进行TCID₅₀测定，同时进行PCR检测对比。结果如表2所示，表2为用BHK细胞作为宿主，使用B类培养基对四株毒株进行扩增实验及TCID₅₀滴度测定的结果数据。

表2

毒株编号	标本号	培养时间	TCID<sub>50</sub>/mL	PCR检测(CT值)	标本浓度(CT值)
						HMPV-01	1803-107	7天	1.0×10<sup>5</sup>，6天，CPE	18.52	24.96
HMPV-02	1712-70	6天	5.6×10<sup>6</sup>，6天，CPE	14.64	23.71
						HMPV-03	1802-38	7天	1.3×10<sup>6</sup>，6天，CPE	17.39	32.18
HMPV-04	1804-212	7天	1.8×10<sup>6</sup>，6天，CPE	16.83	31.27

图1为本发明的HMPV在BHK细胞中培养6天的CPE(100×)图，其中，A为阴性BHK细胞图，B为细胞变圆脱落种CPE形态，C为扁平融合种CPE形态，D为聚团融合种CPE形态；图2为文献《临床常见呼吸道病毒分离培养手册》(周荣、杨子锋编著)记载的HMPV在LLC-MK2细胞中培养18天的CPE图，其中A为阴性对照(50×)，B为阴性对照(200×)，C为hMPV(50×)，D为hMPV(200×)。

由图1和图2可见，图2展示的效果如同其文献描述的现象一致，因为维持长达18天，阴性细胞状态很差，与阳性细胞区别不明显，很难区分开来；而本发明收集的图鉴展示的BHK阴性细胞形态非常规则，与阳性细胞存在明显区别。

在图1中展示了本发明的3种CPE形态，分别是细胞变圆脱落、扁平融合、聚团融合。产生这3种形态差异的原因之一是HMPV有A、B两种不同亚型。原因之二是BHK受TPCK胰酶影响，胰酶是消化细胞使用的试剂(浓度2500μg/mL)，病毒培养虽然使用很低的浓度(0.3μg/mL)但依旧对细胞有刺激作用，不同批次细胞受影响程度不同，受影响程度低倾向于出现细胞变圆脱落形态，受影响程度中等则倾向于出现扁平融合形态，受影响程度高则倾向于出现聚团融合形态。

由表2和图1、图2的结果得到如下分析：

(1)此处所述的培养时间仅指建立库存的主代批次的培养时间。由表2结果可见，与现有方法需要培养18天相比，以上4株毒株的培养方法均在7天以内，时间大为缩短。同样的，TCID₅₀测定均耗时6天，也同样说明BHK培养HMPV相较于传统方法培养时间得到极大优化。

(2)以上4株毒株的分离方法使用96孔板离心法，扩大培养使用常规的T75培养瓶培养，TCID₅₀测定使用常规的96孔板测定法。这表明与现有方法不同，使用BHK培养HMPV时不受容器限制，可随意根据实验需求变换培养容器。

(3)TCID₅₀的检测均通过CPE(细胞病变效应)判定结果，能观察CPE表示细胞对病毒敏感性高。而文献描述HMPV的CPE是很难判定的，从侧面反映BHK细胞系优于其他细胞系。

(4)HMPV诊断试剂尚无指导原则，参考《流行性感冒病毒核酸检测试剂注册申报资料指导原则》，指出病毒类参考品原料要求达到10⁵TCID₅₀/mL以上浓度，以上4株均达到指导原则要求。这是毒株滴度提高的具体体现，这一成果提供的标准毒株将使得国家出台HMPV诊断试剂指导原则得以实现。

(5)PCR检测结果显示4株病毒均处于很高浓度，而且与TCID₅₀检测结果相对应，说明通过CPE判定TCID₅₀结果与实际值非常接近。这个现象提示可将传统的细胞培养法进行HMPV感染诊断应用于临床实验，从而建立起HMPV临床实验的金标准方法。

经过实验研究，本发明选定幼仓鼠肾细胞系(BHK，Baby Hamster Kidney Cell)作为HMPV的新宿主，使HMPV培养在操作方法、培养时间、产出病毒液浓度、病毒感染临床诊断方法这几项获得优化。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种人偏肺病毒的培养方法，其特征在于，使用幼仓鼠肾细胞系作为人偏肺病毒的宿主。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

准备幼仓鼠肾细胞系——人偏肺病毒接种——人偏肺病毒培养——人偏肺病毒收获。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)准备幼仓鼠肾细胞系：将所述幼仓鼠肾细胞传代到96孔板或T75培养瓶中；

(2)人偏肺病毒接种：用PBS清洗所述步骤(1)中处理后的幼仓鼠肾细胞，稀释所述人偏肺病毒的病毒液并接种到清洗后的所述幼仓鼠肾细胞上，再放入培养箱中静置2小时；所述培养箱的条件为35℃，5％CO₂；

(3)人偏肺病毒培养：去除步骤(2)中所述人偏肺病毒的病毒液后，更换含0.3μg/mLTPCK胰酶的DMEM培养基，再放入培养箱培养；所述培养条件为35℃-37℃，5％CO₂，培养5-9天；

(4)人偏肺病毒收获：培养到第5天后，每天观察幼仓鼠肾细胞系培养物的病变效果，当病变达到70％以上，进行人偏肺病毒的收获。

4.通过权利要求1-3之一所述的培养方法获得的人偏肺病毒。

5.权利要求4所述的人偏肺病毒在人偏肺病毒体外诊断试剂研发与生产、抗人偏肺病毒药物研发与生产、人偏肺病毒抗体研发与生产、人偏肺病毒疫苗研发与生产、人偏肺病毒生物检定参考品研发与生产、人偏肺病毒动物感染实验及其产物方面的应用。

6.通过权利要求1-3之一所述的培养方法获得的幼仓鼠肾细胞系培养物。

7.权利要求6所述的培养物在HMPV感染诊断方面的应用。