CN115521902B - 一种提高病毒生产能力的细胞系及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高病毒生产能力的细胞系及其应用。本发明通过使细胞凋亡功能受损构建了一种可以提高病毒生产能力的细胞系仓鼠肾细胞BHK‑21‑TSD，保藏编号为CCTCC NO：C2022241；所述细胞系可用于多种病毒的培养，并且提高多种病毒产量；相比于野生型细胞病毒产量约提高900‑8000倍，在经过多次传代后依然可以生产高滴度的病毒；有利于病毒的规模化生产。

Description

一种提高病毒生产能力的细胞系及其应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种提高病毒生产能力的细胞系及其应用。
背景技术
病毒是一种非细胞型的微生物，个体微小，结构简单，由蛋白质与核酸组成，缺乏完整的酶系统，又无核糖体等细胞器，所以不能在无生命的培养基上生长，只能在敏感的活细胞内以复制的方式进行增殖，为严格细胞内寄生。而病毒的体外培养特别是细胞培养因其不受机体免疫力的影响，易于观察病毒的生产特性，便于病毒收集等优点，使其成为病毒研究、疫苗生产和病毒诊断的良好方法。
细胞培养病毒常规步骤为：宿主细胞培养→病毒感染宿主细胞→病毒培养→病毒收集。病毒在感染细胞后，细胞会启动自身的防御功能，如细胞凋亡，阻止病毒的复制与繁殖。而病毒为了复制与繁殖，会抑制细胞的凋亡。越来越多的实验表明，病毒感染与细胞凋亡有密切关系。但并不是所用的病毒都会在感染早期抑制细胞的凋亡，而是在感染后期为释放病毒粒子，促进细胞凋亡，或因细胞自身的蛋白质和核酸代谢障碍，无法维持正常的生命活动而死亡。
作为病毒培养的宿主细胞，一般对某种或某几种病毒较为敏感。如若只是对某一病毒进行研究，那么用其敏感的宿主细胞对其进行培养，足够实验室研究。如若做病毒诊断的研究，需要十几种甚至更多种的病毒进行研究，这样就需要多种宿主细胞。不同细胞培养基不同，生长特性不同、培养方法不同，病毒产出效率也不一样，这对实验操作人员来说，单单宿主细胞的培养就过于复杂、繁琐。因此急需培养一种对多种病毒均敏感，且繁殖病毒能力还较强的细胞系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高病毒产量的细胞系。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种提高病毒生产能力的细胞系，所述细胞系的分类命名为仓鼠肾细胞BHK-21-TSD；保藏编号为CCTCC NO：C2022241；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2022年7月21日，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。
本发明的第二方面，提供一种本发明第一方面所述的提高病毒生产能力的细胞系的构建方法，具体为使细胞凋亡功能受损。
在本发明的一些实施方式中，可通过诱导剂或基因编辑技术或射线照射使凋亡功能受损，但并不限于上述方法。
在本发明的一些实施方式中，所述诱导剂包括：4-硝基喹啉-1-氧化物、1-甲基-1-亚硝基脲、7,12-二甲基苯并[a]蒽、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍、2-乙酰氨基芴、马兜铃酸A中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述构建方法具体包括以下步骤：
(a)通过4NQO(4-硝基喹啉-1-氧化物)、NMU(1-甲基-1-亚硝基脲)、DMBA(7,12-二甲基苯并[a]蒽)、MNNG(1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)、2-AAF(2-乙酰氨基芴)、AAⅠ(马兜铃酸A)的至少一种分别诱导BHK-21细胞，筛选出细胞凋亡功能受损程度较高的细胞株；
(b)将步骤(a)得到的细胞株接种人呼吸道合胞病毒A型(RSV-A)、风疹病毒(RV)、人偏肺病毒A型(HMPV-A)的至少一种，筛选出病毒表达量较高的细胞株；
(c)将步骤(b)得到的细胞株接种副流感病毒2型(PIV2)、腮腺炎病毒(MUV)、麻疹病毒(MV)的至少一种，挑选病毒表达量较高的细胞株，即得。
本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述的细胞系在生产病毒中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒包括：人呼吸道合胞病毒A型、风疹病毒、人偏肺病毒A型、人副流感病毒2型、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、人偏肺病毒B型、登革热病毒、寨卡病毒、人冠状病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒中的至少一种。但并不局限于上述病毒。
本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述细胞系在制备生产病毒的产品中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒包括：人呼吸道合胞病毒A型、风疹病毒、人偏肺病毒A型、人副流感病毒2型、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、人偏肺病毒B型、登革热病毒、寨卡病毒、人冠状病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒中的至少一种。但并不局限于上述病毒。
本发明的第五方面，提供一种产品，所述产品中包含本发明第一方面所述的细胞系。所述产品用于病毒的培养和/或增殖。所述细胞系用作病毒的待感染宿主细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述产品中还包含用于病毒培养和/或增殖的常规试剂。
在本发明的一些实施方式中，所述病毒包括：人呼吸道合胞病毒A型、风疹病毒、人偏肺病毒A型、人副流感病毒2型、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、人偏肺病毒B型、登革热病毒、寨卡病毒、人冠状病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒中的至少一种。但并不局限于上述病毒。
本发明的第六方面，提供一种生产病毒的方法，该方法包括：
(a)用靶病毒感染本发明第一方面所述的细胞系；
(b)培养被靶病毒感染的细胞系。
在本发明的一些实施方式中，用0.05-0.5的MOI的靶病毒感染所述细胞系。
在本发明的一些实施方式中，所感染时间为2～4h。
在本发明的一些实施方式中，所述培养的时间为24-120h。
在本发明的一些优选实施方式中，所述培养的时间为64～80h。
本发明的第七方面，提供本发明第一方面所述的细胞系在构建细胞库中的应用。
本发明的第八方面，提供本发明第一方面所述的细胞系在制备疫苗中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明通过使细胞凋亡功能受损构建了一种可以提高病毒生产能力的细胞系仓鼠肾细胞BHK-21-TSD，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022241；可用于多种病毒的培养，并且提高病毒产量；相比于BHK-21细胞病毒产量约提高900-8000倍，在经过多次传代后依然可以生产高滴度的病毒，具有较高的应用价值，有利于病毒的规模化生产。
附图说明
图1为Bcl-2、bax、P53、Fas、NF-kB1基因的相对表达量。
图2为人呼吸道合胞病毒A型(RSV-A)、风疹病毒(RV)、人偏肺病毒A型(HMPV-A)滴度检测。
图3为人副流感病毒2型(PIV2)、腮腺炎病毒(MUV)、麻疹病毒(MV)滴度检测。
图4为Bcl-2、bax、P53、Fas、NF-kB1基因表达检测。
图5为呼吸道合胞病毒B型(RSV-B)、副流感病毒1型(PIV1)、人偏肺病毒B型(HMPV-B)、登革热病毒(DV)、寨卡病毒(ZV)、人冠状病毒(OC43)滴度检测。
图6为BHK-21-STD细胞不同传代次数的扩增病毒的能力。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
一、BHK-21-STD细胞系的建立。
1、BHK-21工作细胞库建立
BHK-21细胞来源于ATCC(ATCC CCL-10)。申请人购买后继续培养3代，建立主细胞库，冻存于液氮中。从主细胞库取一支细胞，复苏并继续培养3代，建立工作细胞库，冻存于液氮中。培养用的培养基为含10％胎牛血清的MEM完全培养基。
2、BHK-21诱导
从工作细胞库中复苏一支BHK-21细胞，去除冻存培养液后，加入完全培养基等分至6孔板中。第二天换液，并于每孔分别加入诱导剂4NQO(4-硝基喹啉-1-氧化物)、NMU(1-甲基-1-亚硝基脲)、DMBA(7,12-二甲基苯并[a]蒽)、MNNG(1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍)、2-AAF(2-乙酰氨基芴)、AAⅠ(马兜铃酸A)，使终浓度分别为0.5μM、5μM、50μM、0.5μM、0.5μM、10μM，继续培养3天。
以下细胞克隆及细胞培养过程中，相对应的诱导剂持续存在。
3、第一次克隆
培养第4天，每孔细胞用计数稀释法，将细胞接种至96孔培养板中进行单克隆培养。培养6天后观察细胞，挑选出生长速度较好、细胞状态正常的单克隆细胞孔，传至24孔板中。连续观察挑选4天。传至24孔板的细胞注意观察细胞生长状态，避免细胞密集生长，及时分散细胞。剔除质量差的孔，选择生长速度较好、细胞形态正常、无明显杂质的孔进行标记。最终4NQO诱导的细胞挑选出12株细胞，分别标记为4NQO-1～4NQO-12。NMU诱导的细胞挑选出14株细胞，分别标记为NMU-1～NMU-14。DMBA诱导的细胞挑选出14株细胞，分别标记为DMBA-1～DMBA-14。MNNG诱导的细胞挑选出11株细胞，分别标记为MNNG-1～MNNG-11。2-AAF诱导的细胞挑选出12株细胞，分别标记为2-AAF-1～2-AAF-12。AAⅠ诱导的细胞挑选出10株细胞，分别标记为AAⅠ-1～AAⅠ-10。以上共73株细胞，在细胞密度生长至80％时，取3/4细胞进行核酸提取，分别检测Bcl-2、bax、P53、Fas、NF-kB1基因的相对表达量，结果见图1。剩余1/4细胞继续培养。
从图1A1～图1A5结果来看，4NQO-6、4NQO-7、4NQO-10细胞株Bcl-2基因相对表达量较高；4NQO-2、4NQO-6、4NQO-7、4NQO-11细胞株bax基因相对表达量较低；4NQO-1、4NQO-7、4NQO-12细胞株P53基因相对表达量较低；4NQO-3、4NQO-7、4NQO-10细胞株Fas基因相对表达量较低；4NQO-3、4NQO-4、4NQO-7细胞株NF-kB1基因相对表达量较高。综合判断4NQO-7细胞株细胞凋亡功能受损程度较高。故4NQO-7细胞株进行第二轮细胞单克隆筛选。
从图1B1～图1B5结果来看，NMU-3、NMU-11细胞株Bcl-2基因相对表达量较高；NMU-2、NMU-3、NMU-4、NMU-11细胞株bax基因相对表达量较低；NMU-3、NMU-4、NMU-13细胞株P53基因相对表达量较低；NMU-3、NMU-7、NMU-12细胞株Fas基因相对表达量较低；NMU-3、NMU-9、NMU-14细胞株NF-kB1基因相对表达量较高。综合判断NMU-3细胞株细胞凋亡功能受损程度较高。故NMU-3细胞株进行第二轮细胞单克隆筛选。
从图1C1～图1C5结果来看，DMBA-5、DMBA-9、DMBA-14细胞株Bcl-2基因相对表达量较高；DMBA-5、DMBA-6、DMBA-9细胞株bax基因相对表达量较低；DMBA-4、DMBA-5、DMBA-9细胞株P53基因相对表达量较低；DMBA-4、DMBA-5、DMBA-7细胞株Fas基因相对表达量较低；DMBA-5、DMBA-14细胞株NF-kB1基因相对表达量较高。综合判断DMBA-5细胞株细胞凋亡功能受损程度较高。故DMBA-5细胞株进行第二轮细胞单克隆筛选。
从图1D1～图1D5结果来看，MNNG-7、MNNG-11细胞株Bcl-2基因相对表达量较高；MNNG-1、MNNG-2、MNNG-7细胞株bax基因相对表达量较低；MNNG-1、MNNG-7、MNNG-10细胞株P53基因相对表达量较低；MNNG-4、MNNG-7、MNNG-11细胞株Fas基因相对表达量较低；MNNG-2、MNNG-7细胞株NF-kB1基因相对表达量较高。综合判断MNNG-7细胞株细胞凋亡功能受损程度较高。故MNNG-7细胞株进行第二轮细胞单克隆筛选。
从图1E1～图1E5结果来看，2-AAF-2、2-AAF-8、2-AAF-12细胞株Bcl-2基因相对表达量较高；2-AAF-1、2-AAF-6、2-AAF-8细胞株bax基因相对表达量较低；2-AAF-2、2-AAF-4、2-AAF-8细胞株P53基因相对表达量较低；2-AAF-1、2-AAF-8、2-AAF-9细胞株Fas基因相对表达量较低；2-AAF-3、2-AAF-4、2-AAF-8细胞株NF-kB1基因相对表达量较高。综合判断2-AAF-8细胞株细胞凋亡功能受损程度较高。故2-AAF-8细胞株进行第二轮细胞单克隆筛选。
从图1F1～图1F5结果来看，AAⅠ-3、AAⅠ-9细胞株Bcl-2基因相对表达量较高；AAⅠ-2、AAⅠ-5、AAⅠ-9细胞株bax基因相对表达量较低；AAⅠ-3、AAⅠ-5、AAⅠ-9细胞株P53基因相对表达量较低；AAⅠ-3、AAⅠ-4、AAⅠ-9细胞株Fas基因相对表达量较低；AAⅠ-2、AAⅠ-3、AAⅠ-9细胞株NF-kB1基因相对表达量较高。综合判断AAⅠ-9细胞株细胞凋亡功能受损程度较高。故AAⅠ-9细胞株进行第二轮细胞单克隆筛选。
4、第二次克隆
用计数稀释法将本实施例第一次克隆筛选出的6株细胞4NQO-7、NMU-3、DMBA-5、MNNG-7、2-AAF-8、AAⅠ-9分别接种至96孔板中，按照相同的方法进行单克隆挑选与传代。最终4NQO-7细胞挑选出11株细胞，分别标记为4NQO-7-1～4NQO-7-11。NMU-3细胞挑选出10株细胞，分别标记为NMU-3-1～NMU-3-10。DMBA-5细胞挑选出13株细胞，分别标记为DMBA-5-1～DMBA-5-13。MNNG-7细胞挑选出11株细胞，分别标记为MNNG-7-1～MNNG-7-11。2-AAF-8细胞挑选出12株细胞，分别标记为2-AAF-8-1～2-AAF-8-12。AAⅠ-9细胞挑选出12株细胞，分别标记为AAⅠ-9-1～AAⅠ-9-12。以上共69株细胞，在细胞密度生长至80％时，按1:4进行传代接种至24孔板中。细胞密度生长至90％以上时，用人呼吸道合胞病毒A型(RSV-A)、风疹病毒(RV)、人偏肺病毒A型(HMPV-A)按照MOI＝0.5分别感染以上69株细胞，感染条件为使用二氧化碳恒温培养箱，二氧化碳浓度为5％，温度为37℃。感染前细胞用PBS洗涤一次，加入1ml无血清的培养基和相应的病毒，继续培养2小时。2小时后去除无血清的培养液，加入2ml新鲜的病毒培养液，继续培养72小时后收集病毒并检测病毒滴度，结果见图2。
根据图2结果显示，4NQO-7-7、DMBA-5-10、MNNG-7-11、AAⅠ-9-3、AAⅠ-9-7细胞株RSV-A病毒表达量较高；DMBA-5-1、DMBA-5-4、2-AAF-8-3、AAⅠ-9-3、AAⅠ-9-7细胞株RV病毒表达量较高；NMU-3-4、MNNG-7-3、2-AAF-8-10、AAⅠ-9-3、AAⅠ-9-7细胞株HMPV-A病毒表达量较高。AAⅠ-9-3、AAⅠ-9-7细胞株虽RSA、ADV25、HPMV病毒表达量均高，但AAⅠ-9-7细胞株表达量比AAⅠ-9-3细胞株稍高，故AAⅠ-9-7细胞株进行第三轮细胞单克隆筛选。
5、第三次克隆
用计数稀释法将本实施例第二次克隆筛选出的AAⅠ-9-7接种至96孔板中，按照相同的方法进行单克隆挑选与传代。最终挑选出10株细胞，分别标记为AAⅠ-9-7-1～AAⅠ-9-7-10。以上10株细胞在细胞密度生长至80％时，按1:4进行传代接种至24孔板中。细胞密度生长至90％以上时，用人副流感病毒2型(PIV2)、腮腺炎病毒(MUV)、麻疹病毒(MV)按照MOI＝0.5分别感染以上10株细胞，感染条件为使用二氧化碳恒温培养箱，二氧化碳浓度为5％，温度为37℃。感染前细胞用PBS洗涤一次，加入1ml无血清的培养基和相应的病毒，继续培养2小时。2小时后去除无血清的培养液，加入2ml新鲜的病毒培养液，继续培养72小时后收集病毒并检测病毒滴度，结果见图3。
根据图3结果显示，AAⅠ-9-7-1、AAⅠ-9-7-4细胞株PIV2病毒表达量较高；AAⅠ-9-7-3、AAⅠ-9-7-4细胞株MUV病毒表达量较高；AAⅠ-9-7-2、AAⅠ-9-7-4细胞株MV病毒表达量较高。故AAⅠ-9-7-4细胞株为最终筛选出的细胞株，命名为仓鼠肾细胞BHK-21-TSD，保藏编号为CCTCC NO：C2022241；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2022年7月21日，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。
6、BHK-21-STD细胞库建立
本实施例第三次克隆筛选出的AAⅠ-9-7-4细胞株(被命名为BHK-21-STD)从24孔板传至T25培养瓶中，经3次传代培养，建立主细胞库。从主细胞库复苏一支BHK-21-STD，传代3次，建立工作细胞库。
二、BHK-21-STD细胞培养及凋亡相关基因表达情况
从工作细胞库复苏一支BHK-21-STD细胞，分成2份。一份用含10％胎牛血清的MEM完全培养基培养，一份用含AAⅠ的完全培养基培养，AAⅠ的终浓度为10μM。同时复苏一支BHK-21细胞同步培养。分别于培养第2代、第5代、第8代进行Bcl-2、bax、P53、Fas、NF-kB1基因表达的检测。结果见图4。
从图4结果来看，2种培养基培养的细胞，Bcl-2、bax、P53、Fas、NF-kB1均稳定表达。说明建立的BHK-21-STD细胞库在有无AAⅠ刺激的条件下，其细胞的凋亡功能已发生不可逆损伤。
三、BHK-21-STD细胞与BHK-21细胞生产病毒能力的比较
从工作细胞库各复苏一支BHK-21-STD细胞与BHK-21细胞，第二天传至24孔板中。细胞密度生长至90％以上时，用呼吸道合胞病毒B型(RSV-B)、副流感病毒1型(PIV1)、人偏肺病毒B型(HMPV-B)、登革热病毒(DV)、寨卡病毒(ZV)、人冠状病毒(OC43)按照MOI＝0.5分别感染BHK-21-STD细胞与BHK-21细胞，感染条件均使用二氧化碳恒温培养箱，二氧化碳浓度为5％，温度为37℃。感染前细胞用PBS洗涤一次，加入1ml无血清的培养基和相应的病毒，继续培养2小时。2小时后去除无血清的培养液，加入2ml新鲜的病毒培养液，继续培养72小时后收集病毒，并检测病毒滴度。检测结果见图5。
从图5结果来看：BHK-21-STD细胞比BHK-21细胞具有更高的病毒产出能力。病毒产量约提高900-8000倍。
四、BHK-21-STD细胞不同传代次数的扩增病毒的能力
以扩增人偏肺病毒A型为例。
从工作细胞库复苏一支BHK-21-STD细胞，分别于扩增的第2代、第5代、第8代的细胞，按照MOI＝0.5接种人偏肺病毒A型，感染条件为使用二氧化碳恒温培养箱，二氧化碳浓度为5％，温度为37℃。感染前细胞用PBS洗涤一次，加入1ml无血清的培养基和人偏肺病毒A型，继续培养2小时。2小时后去除无血清的培养液，加入2ml新鲜的病毒培养液，继续培养72小时后收集病毒并检测病毒滴度。结果见图6。
从图6结果来看，BHK-21-STD细胞经传8代后，依旧可以产出高滴度的偏肺病毒A型。
综上，相比于野生型细胞系，使细胞凋亡功能受损的细胞系具有优异的病毒生产能力，可以提高病毒的产率。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系的分类命名为仓鼠肾细胞BHK-21-TSD；保藏编号为CCTCC NO：C2022241。
2.权利要求1所述的细胞系的构建方法，其特征在于，使细胞凋亡功能受损。
3.权利要求1所述的细胞系在生产病毒和/或制备生产病毒的产品中的应用。
4.一种用于病毒培养和/或增殖的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1所述的细胞系。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品还包含用于病毒培养和/或增殖的常规试剂。
6.一种生产病毒的方法，该方法包括：
(a)用靶病毒感染权利要求1所述的细胞系；
(b)培养被靶病毒感染的细胞系。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(a)中用0.05-0.5的MOI的靶病毒感染所述细胞系。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述感染的时间为2～4h。
9.权利要求1所述的细胞系在构建细胞库和/或制备疫苗中的应用。
10.根据权利要求3所述的应用或权利要求4～5任一项所述的产品或权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于，所述病毒包括：人呼吸道合胞病毒A型、风疹病毒、人偏肺病毒A型、人副流感病毒2型、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒B型、副流感病毒1型、人偏肺病毒B型、登革热病毒、寨卡病毒、人冠状病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、伪狂犬病毒、口蹄疫病毒中的至少一种。
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