JPH02500166A - ストレプトコッカス感染診断のためのファージ関連リシンの製造 - Google Patents
ストレプトコッカス感染診断のためのファージ関連リシンの製造Info
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- JPH02500166A JPH02500166A JP63506448A JP50644888A JPH02500166A JP H02500166 A JPH02500166 A JP H02500166A JP 63506448 A JP63506448 A JP 63506448A JP 50644888 A JP50644888 A JP 50644888A JP H02500166 A JPH02500166 A JP H02500166A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ストレプトコッカス種細胞を高宙度に生育させ、そして該ストレプト
コッカス培養物をリシンを含有しないファージ懸濁液の適当量で感染させること
による、ファージ関連リシンの高タイターの生産方法に関する。このプロセスに
おいて、ファージは細胞断片および活性リシンから分離され、そして濃縮される
。濃縮したファージ溶液は高細胞密度で生育しているストレプトコッカス細胞を
感染させるために使用される。ファージの接種後、感染したストレプトコッカス
は精密な時間に収穫され、そしてファージ関連リシンの最大量を放出させるよう
に緩衝液中に再懸濁される。
2 背景技術
C1バタテリオフアージで感染させたグループCストレプトコッカスの溶解物は
、グループA、CおよびEストレプトコッカスおよびそれらの単離された細胞壁
を溶解する能力を有する酵素であるリシン(N−アセチルムラモイル−L−アラ
ニンアミダーゼ、E、 C。
3.5.1.28)を含んでいる。Maxed、 W、 R,(1957) J
、Gen。
Microbiol、韮584. この酵素はグループAストレプトコッカス細
胞壁成分、MタンパクおよびC炭水化物の単離のために理想的であることが判明
した。
ストレプトコッカスの感染症の検出のためこの酵素の新規用途がVincent
A、 FischettiおよびDavid Bernsteinによって開
発された。
二の新しい用途を商業的に魅力あるものとするためには、ファージ関連リシンを
効率的に生産することが必須である。
研究室においてリシンの少量を製造するための操作は文献に見られる。しかしな
がら記載されているプロセスは、ファージの調製のための接種物として大量のフ
ァージ溶解物を必要とすること、そして上滑中に存在する遊離リシンを不活性化
するため長期間(4週間)を必要とすることにおいて、商業的見地からいくつか
の本来的欠点を持っている。加えて、得られるタイターはかなり低く、そして不
安定である。
リシンとファージ接種物の両方の調製のためにはりシン不含ファージ接種物が必
須である。エージングによる不活性化のほかに、物理的分離はファージ接種物か
ら望ましくない成分を除去するための非破壊的手段を提供する。物理的分離方法
のうち、限外口過は分子サイズに従って成分を分離する商業的に利用し得るシス
テムである。
リシンの分子はファージ粒子より小さい。適切な膜を選択することにより、ファ
ージを残しそして濃縮する一方で、リシンを通過させることができる。:a縮し
たファージは次に遊離リシンを除去するための緩衝液で洗い、ファージ濃縮物は
使用可能となるか、または使用のため貯蔵される。
先行技術によれば、不活性化したりシンを含むエージングしたファージ溶液が6
50nmにおいて0.16光学密度へ生育させたストレプトコッカス培養物へ接
種するために使用される。混合物は37°Cにおいて20分間保持され、その時
感染した細胞が収穫され、緩衝液中に再懸濁される。細胞は溶解することを許容
され、ファージと溶解酵素を放出する。
一般に細胞内酵素の総収量は細胞質量の関数である。リシンのタイターは感染し
たストレプトコッカスの濃度の増加につれて増加すべきである。先行技術におい
ては、ファージ濃度は一定であり、そのためストレプトコッカス細胞密度の増加
は感染したストレプトコッカスの数または酵素タイターを増加させることができ
なかった。
本発明によれば、ストレプトコッカスはより高い密度へ生育することができ、そ
して濃縮したファージで感染されることができる。その結果、リシンのタイター
を増加させることができる。
本主更皇皿玉
従って、本発明の一般的目的は、遊離リシンを含まないファージ懸濁液を調製す
るための改良方法と、そしてグループCストレプトコッカスを感染した組織から
同定するための診断テストに使用し得るリシンの高タイターを製造するための改
良方法を提供することである。
ファージ製造のためのこの新しい方法の利点は三重である。ファージ接種物の新
しいバッチを発生させるのに要するファージの量が大きく減少する。当初のファ
ージあたり生産されるファージの数は104倍改良される。加えてファージ生産
のための接種物として使用されるファージ溶解質は、高い希釈係数のため外から
の溶解が発生しないため活性リシンを含むことができる。
本発明のファージ溶解質は実質上りシンを含まない、すなわちストレプトコッカ
ス細胞での1:4希釈は37°Cで15分間インキュベートする時該細胞を溶解
しないであろう、リシン含量が低(保たれているため、最初のファージ複製サイ
クル以前には細胞外で誘発された溶解は存在しないであろう、ファージ複製サイ
クルは、ストレプトコッカスの20〜30分毎の2個の細胞の複製に比較して2
0分毎にファージ粒子を放出するので、この多サイクルプロセスはIQ+<1〜
10”PFU/dのファージ濃度を容易に生成することができる。
ファージによる最初の細胞感染は、好ましくは650 nmにおいて約0.2の
光学密度のストレプトコッカス培養物へ加えたio”pFU/dストックからな
され、約10’PFU/dの当初接種物を表す。いくらかのりシンが多サイクル
培養プロセスの途中で形成され、そしてすべてのファージ粒子が新しい細胞を感
染しないであろうが、すべての細胞が溶解されるであろう最高ファージ濃度が存
在する。それにもかかわらず、このプロセスはたった4時間内でたった10’P
FU/J!l!の接種物からIQIOファージ粒子を発生させることができる。
明細書および請求の範囲を検討するとき、本発明のそれ以上の目的、特徴および
利益は、本発明が関係する分野に熟練した当業者に対して完全に明らかになるで
あろう。
Hるための の)能
概略的に、本発明の上記および他の目的、特徴および利益は、その−面において
a)生育しているストレプトコッカス培養物にファージを接種し、b)溶解物が
得られるように細胞が完全に溶解するまで培養物をファージの複数の溶解サイク
ルの間インキュベートし、C)接種物として使用するのに適したりシン不含ファ
ージを形成するように溶解物から細胞断片および遊離リシンを除去することより
なるリシン不含ファージ接種物を製造する方法を提供することによって達成され
る。
主生更生肛豊l腹皿
一面において、本発明は遊離リシンを含まないファージ懸濁液を製造し、そして
グループAストレプトコッカスを感染した組織から同定するための診断テストに
使用できるリシンの高タイターを製造する方法を提供する。
リシンを含まないファージ接種物は、適当量のファージ溶液を加える前に、65
0nmにおいて0.10ないし1.00D(好ましくは0.1ないし0.40D
)の細胞密度へストレプトコッカス細胞をTodd−Hewitt培地中で生育
させることによって調製された。ファージ感染後、培養物は、細胞が完全に溶解
する前にファージの数溶解サイクルが生起することを許容するようにインキュベ
ートされた。細胞断片が0.2ミクロン膜を通って口過することによって除去さ
れた。この活性遊離リシンを含有するファージ調製物は、100.000および
300、000の間の分子量カットオフを持った膜を備えた第2の限外口過シス
テムを通された。ファージは遊離リシンから分離され、そして濃縮された。最後
の濃縮ファージは緩衝液で洗浄され、そしてリジン製造のためのまたはファージ
の次のバッチの調製のための接種物として使用された。
リシンの製造のため、いくらかの修飾をもって前記プロセスが追従された。ファ
ージ感染ストレプトコッカスは濃縮したファージが650nmにおいて0.10
D以上の細胞密度へ生育したストレプトコッカス培養物へ接種された後15〜
20分で収穫された。収穫した細胞は5X10−’Mジチオスレイトール(DT
T)およびウシすい臓デオキシリボヌクレアーゼ5■を含んでいる0、 05
Mリン酸緩衝液p H6,1中に再懸濁された。懸濁液を次に37℃において3
0〜60分インキュベートし、その間細胞は溶解し、溶解酵素(リジン)を放出
する。エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を最終濃度0.005Mへ加え
た。細胞断片およびファージは5orvall A6410−タ(Ivan 5
orvall+ Inc、、 Norwich CT )中4℃において30.
00Orpmで4時間超遠心することによって除去された。リシン溶液を集め、
ストレプトコッカス感染検出のための診断試薬として使用できた。
これ以上考究することなく、当業者は以上の説明を利用して本発明のその全範囲
にわたって利用することができるものと信じられる。
それ故以下の好ましい具体例は例証であり、開示の残部の限定と解すべきではな
い。以下の実施例において、温度は未補正の摂氏で述べられ、すべての部および
パーセントは特記しない限り重量による。
実施例1
ファージ接種物が新しい多サイクルプロセスによって調製された。
ストレプトコッカス細胞の6.5リツトル培養物がTodd−Hewi tt培
地中650nmにおいて光学密度0.20まで生育され、そしてファージ(30
d、1.Ox 10’ p f u/dl)を接種され、そして溶解が発生する
まで(90分)インキュベートされた。接種直後の当初のファージタイターは4
.6X10’pfu/−であった、完全細胞溶解後(90分)ファージタイター
は4.5 X 10” p f u/dであり、10’の増加であった。
対照として、ファージ接種物が発表された操作に従って調製された。ストレプト
コッカスの12リツトル培養物がTodd−Hewi tt培地中650 nm
において光学8度0.15まで生育され、そしてファージ(3z、 2.8 X
10’ p f u/adりを接種され、そして溶解が発生するまで(45分
)インキュベートされた。接種直後のファージタイターは5.6X10”pfu
/dであった。完全細胞溶解後(90分)ファージタイターは8.6X10”
pfu/dであり、出発タイターの15倍であった。
実施例2
ファージ接種物は新しいプロセスによって濃縮し、遊離リシンを除去することが
できる。先行技術においては、このファージ調製物は残存リシンが不活性になる
ことを許容するため4°Cで4週間貯蔵し、ファージ溶解物が酵素調製のためグ
ループC細胞へ加えられた時該酵素による溶解を防止していた。 (Fishc
hetti、 V、 CIGotschicb+ E、 c、l Berhei
淋e7. A、 W、 (1971) J、 Exp、 Med1匪本発明によ
れば、溶解物は溶解が起った直後処理することができる。溶解物は、未感染細胞
および細胞断片を除去するためミリボアC; V L P 0.2ミクロン膜力
セットを通過させた0口液を次にミリボアPTMK3000に膜力セットを通過
させ、ファージを濃縮し、遊離リシンを除去した。生成するファージリテネート
を塩化ナトリウム2 g/l、二塩基性リン酸ナトリウム0.4g/j!および
炭酸ナトリウム2.5g#!を含む緩衝液P H7,5で洗った。300に膜を
通すファージ濃縮およびリシン除去の結果を表1および表2にそれぞれ示す。
(以下余白)
表 1
濃m 物1.8X10′0940 1.7X10”洗ツタ濃縮物 2.0X10
” 800 1.6X10”口 液 9.5X10’ 14.380 1.4X
10”濃縮物 22 940 20.680
洗った濃縮物 1.9 800 1.520口 液 1 9 14.380 2
73.220実施例3
リシンを製造する改良方法を以下に記載する。グループCストレプトコッカス株
26 RP 66 (ATCC# 21.597)をTodd−)1eini
tt培地12f中37°Cで650nmにおける光学密度0.41へ生育さセタ
。2.4 x 10”p f u/Iiを含有するグループCバクテリオファー
ジ(CI) (ATCC# 21.597−Bl)の3j!をストレプトコッカ
ス培養物へ加えた。混合物を37℃で16分間保持し、その時感染した培養物を
培地の温度を15℃以下に下げるため氷塊上へ注いだ。感染した細胞を冷蔵遠心
機中3700Xgにおいて収穫し、ジチオスレイトール5X10−’Mおよびウ
シすい臓デオキシヌクレア−ゼI(ベーリンガー、グレードII)5mgを含有
する0、 05 Mリン酸緩衝液、pH6,1中に再懸濁した。細胞は溶解し、
溶解酵素を放出シタ、細胞断片オヨヒファーシを5orvall A6410
9−中30.00Orpmにおいて4時間遠心することにより除去した。酵素溶
液を部分抽出し、グループAストレプトコッカスを溶解するその能力についてテ
ストし、−70°Cで貯蔵した。
実施例4
酵素のバッチ中の単位/dの数はグループAストレプトコッカスのOD8.。を
37°Cにおいて15分で0.3から0.15へ減少させるのに要する最高酵素
希釈度の逆数であることが決定される。ストレプトコッカスの種々の細胞密度を
増加するファージ接種物で感染させることによって得られる12!バツチ中のり
シンの収量を表3に示す。
0.10(先行技術) % 10” 4.0−7.lX10’0.21 2.9
X10′3 4.0X10’0.40 2.6xlO” 7.0xlO5O,6
04,3X10′3 9.8X10’以上の実施例は、本発明の一般的にまたは
特定的に記載した反応剤および/または作業条件を実施例において特定的に使用
したそれらに置き換えることによって同様な成功度をもってくり返すことができ
る。以上の説明から、本発明が関係する分野の当業者はその本質的特徴を容易に
確かめることができ、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そ
れを種々の用途および条件に適応させるため、種々の改変および修飾をなすこと
ができる。
皮来上皇且里ユ
以上の議論から見られるように、本発明は例えばストレプトコッカスの感染の検
出に有用な、ファージ関連リジンのための商業的に魅力ある生産方法の提供にお
いて産業上有用である。
国際調査報告
Claims (9)
- 1.a)生育しているストレプトコッカス培養物へファージを接種し、 b)該培養物を溶解物が得られるように細胞が完全に溶解するまで複数のファー ジ溶解サイクルの間インキュベートし、c)接種物として使用するのに適したリ シン不含ファージを形成するように溶解物から細胞断片および遊離リシンを除去 することよりなるリシン不含ファージ接種物を生産する方法。
- 2.遊離リシンは溶解物を約100,000〜300,000の分子量カットオ フを有する膜を通して限外口過することによって除去される第1項の方法。
- 3.細胞はグループCストレプトコッカス細胞である第1項の方法。
- 4.細胞外リシンを実質上含まないストレプトコッカスファージ接種物。
- 5.ファージがC1である第4項の接種物。
- 6.a)生育しているストレプトコッカス細胞へストレプトコッカスリシン不含 ファージ接種物を接種し、b)該細胞をリシンの生産に適した条件下で培養し、 c)リシンを放出させるように細胞を溶解し、d)溶解物からリシンを回収する ことよりなるリシンの生産方法。
- 7.ファージがC1である第6項の方法。
- 8.細胞がグループCストレプトコッカスである第6項の方法。
- 9.溶解物は醸酵培地リットル当りリシンの少なくとも70,000単位を含ん でいる第6項の方法。
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