CN111440770B - 人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法 - Google Patents

人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及溶瘤病毒制备技术领域，尤其涉及人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法。本发明提供的培养基组合，包括EX‑Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基、DMEM培养基中至少两种。该培养基组合能够使悬浮培养的HeLa S3细胞能保持高密度高活率生长，并且支持搅拌式生物反应器大规模培养细胞扩增病毒。同时，悬浮培养HeLa S3细胞扩增痘苗病毒，病毒滴度也稳定在较高水平，实现了溶瘤痘苗病毒的大规模生产。

Description

人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法
技术领域
本发明涉及溶瘤病毒制备技术领域，尤其涉及人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法。
背景技术
溶瘤病毒（Oncolytic Virus）能靶向性杀伤肿瘤细胞，而不会对正常组织细胞产生杀伤作用。同时，溶瘤病毒可以杀伤那些抗凋亡的肿瘤细胞，并且不会对现有的抗肿瘤治疗方案产生拮抗作用，适合联合用药。
痘苗病毒(Vaccinia Virus，VACV)曾在全球杀灭天花的行动中得到广泛应用，人类对痘苗病毒的生物学性状和致病机理有着较为深入的了解。同时，痘苗病毒复制快，副作用明确，自身基因组大，可插入大片段外源基因，适合经过改造后用于肿瘤的治疗。曾用于天花预防接种的痘苗病毒包括NYCBH株、Lister株、哥本哈根株、天坛株、Ankara株等。
近年来，国内外一些学者致力于将重组痘苗病毒(rVACV)应用于肿瘤的生物治疗，其中一些研究已取得较大突破，特别是法国Transgene公司关于溶瘤痘苗病毒的研究走在前列，虽然溶瘤痘苗病毒项目JX594（Pexa-Vec）肝癌III期临床失败，但其同类产品TG6002，正在英国开展针对结直肠癌的I/IIa临床实验。该产品使用了新的基因编辑技术并移除了两个基因，预期会有更好的疗效。同时，天士力创世杰(天津)生物制药公司获得了该产品的国内全部开发权，代号为T601，并于2019年4月18日收到国家药监局核准签发的重组溶瘤痘苗病毒注射液T601药物临床试验通知书，适应症为晚期恶性消化道实体肿瘤。另外，Genelux公司的主要候选产品GL-ONC1，一种改良的溶瘤痘苗病毒，可通过腹腔注射和静脉注射给药，已经完成治疗头颈癌Ⅰ期临床试验，显示出良好的安全性和疗效。
目前，用于培养溶瘤痘苗病毒的宿主细胞有BSC-1、Vero、HeLa S3、MRC-5、BHK-21等，但人源细胞并不多，且多为贴壁生长，培养基几乎全都需要添加血清。血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒的生产工艺和质量，给溶瘤病毒的使用带来了不容忽视的安全隐患。
随着无血清培养技术的不断进步，很多细胞（如CHO细胞、HEK293细胞、BHK-21细胞等）可以实现无血清悬浮培养，但是仍然有很多细胞（如VERO细胞）的贴壁特性难以改变，培养方式仍以方瓶和滚瓶的内表面为介质贴附生长。这些培养体系所能提供的细胞生长面积有限，细胞培养规模的放大只能依赖培养单元的增加，由此给病毒生产带来诸如污染风险大、生产效率低、产品质量可控性差及人力资源需求大等弊端。微载体培养是融合悬浮培养优点的一种特化的细胞贴壁培养模式，不仅大大增加了单位培养体积中细胞赖以生长的表面积，同时也加大了细胞培养过程监测和控制及细胞培养规模放大的可实施程度。但与悬浮培养相比，微载体的使用也加大了细胞培养的成本，引入了诸多不可控的风险，也给培养规模的放大带来了不便。
有些细胞虽然被成功悬浮驯化，可以完全无血清悬浮培养，但其改变生长特性后，扩增病毒能力显著下降。Transgene公司公布的专利曾报道，HeLa S3细胞悬浮驯化后，扩增JX594（Wyeth株）病毒的能力明显下降，单细胞产毒从72 pfu/cell（贴壁附着培养）降至0.4pfu/cell（悬浮培养），失去了商业应用价值。另外，HeLa S3细胞对剪切力敏感，在悬浮培养时，使用摇瓶培养可以生长良好，一旦放大至反应器中搅拌培养时，细胞则不能正常生长，且细胞活率会急剧下降。综上，人源细胞的悬浮培养的效果对溶瘤痘苗病毒的生产存在重大影响。但目前，人源细胞的悬浮培养仍存在密度不足、活率较低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法。利用该培养基能够驯化贴壁生长的HeLa 细胞，使之适应无血清悬浮培养，保持高密度高活率生长，并且支持搅拌式生物反应器大规模培养细胞扩增病毒。
本发明提供了培养基组合在HeLa细胞悬浮培养中的应用，所述培养基组合由EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基中至少两种组成。
本发明提供的培养基组合，包括EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基、DMEM培养基中至少两种。本发明中，所述培养基组合为EX-Cell® 293培养基和DMEM培养基的组合；或EX-Cell® 293培养基和VirusPro®CD HeLa培养基的组合；或VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的组合；或EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的组合。
本发明中EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基、DMEM培养基均为无血清培养基。在HeLa细胞培养过程中也不添加血清及类似成分。本发明中，所述EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基或DMEM培养基中还可以添加有促进细胞生长的因子；所述因子选自胰岛素、生长激素、表皮生长因子（如rHuEGF）、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子(MSA)、类胰岛素生长因子（如rHuIGF）等，添加促进细胞生长的因子的浓度根据具体情况人为考虑，如生长情况、因子的产品要求等，如添加浓度为40ng/ml的rHuEGF，但不限于只能添加上述浓度。
本发明提供的培养基组合中各培养基的体积比不做限定，在实施例中以等比例的培养基组合进行验证。
一些实施例中，EX-Cell® 293培养基与DMEM培养基的组合中，EX-Cell® 293培养基与DMEM培养基的体积比为1:1。
一些实施例中，EX-Cell® 293培养基和VirusPro®CD HeLa培养基的组合中，EX-Cell® 293培养基和VirusPro®CD HeLa培养基的体积比为1:1。
一些实施例中，VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的组合中，VirusPro®CDHeLa培养基和DMEM培养基的体积比为1:1。
一些实施例中，EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的组合中，EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的体积比为1:1:1。
本发明所述的培养基组合在HeLa细胞悬浮培养中的应用。本发明所述的HeLa细胞为HeLa S3细胞。
本发明还提供了HeLa细胞悬浮培养的方法，将悬浮驯化的HeLa细胞接种于所述的培养基，振荡培养。
所述悬浮驯化的HeLa细胞的制备方法为：将HeLa细胞使用含有血清的DMEM复苏培养后，以EX-Cell® 293重悬细胞进行悬浮驯化。
本发明中，所述振荡培养的条件为34℃～38℃、3%～10% CO2条件下，100~130rpm振荡培养24～96小时。在本发明实施例中，所述振荡培养的条件为37℃，5%CO2，110rpm，培养3d（72小时）后传代。
本发明中，所述接毒MOI为0.001 pfu/cell ~0.5pfu/cell。
一些实施例中，所述接毒MOI为0.005 pfu/cell ~0.1pfu/cell。一些具体实施例中，所述接毒的MOI为0.02pfu/cell。
本发明所述的培养基在制备溶瘤痘苗病毒中的应用。
本发明还提供了一种溶瘤痘苗病毒的制备方法，其包括：将悬浮驯化的HeLa细胞接种于本发明所述的培养基，振荡培养至细胞密度不低于5×106cells/ml，然后稀释细胞至密度为2×106cells/ml ~5×106cells/ml接种病毒，继续培养2~3 d后收毒。
本发明提供的HeLa细胞的培养方法，将高密度HeLa细胞稀释至合适密度后扩增病毒，大幅减少了细胞种子培养体积，简化操作，降低了劳动强度。制备方法如下：
培养细胞：悬浮培养HeLa S3细胞至密度不低于5×106cells/ml，如 6×106cells/ml ~7×106cells/ml，稀释至密度为2×106cells/ml ~5×106cells/ml接毒；
一些实施例中，所述稀释采用培养使用的培养基组合。一些实施例中，接毒时HeLaS3细胞的密度为2×106cells/ml ~5×106cells/ml、3×106cells/ml ~4×106cells/ml或4×106cells/ml ~5×106cells/ml。优选的，接毒时细胞的密度为3×106cells/ml ~4×106cells/ml时接毒，更优选的，接毒时细胞的密度为3×106cells/ml或约4×106cells/ml。
接种病毒：病毒扩增方法为：MOI为：0.001 pfu/cell ~0.5pfu/cell，温度为：32℃~38℃，CO2:3%~10%，培养时间为：1~3天。优选MOI为0.01 pfu/cell ~0.1 pfu/cell，温度：37℃，CO2：5%，培养2天。
收获病毒：离心，去上清，收获细胞，破碎细胞，离心或过滤去除细胞碎片，收获病毒液。
此外，本发明提供的方法还适用于大规模培养，从而能够大规模生产痘苗病毒，单细胞产毒能力与摇瓶扩毒相当，保持了较高水平。生产方法如下：
（1）培养细胞：悬浮培养HeLa S3细胞，密度达到5×106cells/ml ~7×106cells/ml时，然后稀释细胞至密度为3×106cells/ml ~4×106cells/ml方可接种病毒。
（2）接种病毒：病毒扩增方法为：MOI为：0.001 pfu/cell ~0.5pfu/cell，温度为：32~38℃，DO：30%~80%，pH 6.8~7.6，培养时间为：1-3天。优选MOI为0.01 pfu/cell ~0.1pfu/cell，温度：37℃，DO：50%，pH 7.4，培养2天。
（3）收获病毒：离心，去上清，收获细胞，破碎细胞，离心或过滤去除细胞碎片，收获病毒液。
接种病毒为痘苗病毒，经过改造或者未经改造的病毒株均可，本发明中，所述病毒为痘苗病毒Lister株。另一些实施例中，所述病毒为改造过的重组痘苗病毒株，具体为重组痘苗病毒Lister株。
本发明提供的培养基组合，包括EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基、DMEM培养基中至少两种。该培养基组合能够使悬浮培养的HeLa S3细胞保持高密度高活率生长，并且支持搅拌式生物反应器大规模培养细胞扩增病毒。同时，悬浮培养HeLa S3细胞扩增痘苗病毒，病毒滴度也稳定在较高水平，实现了溶瘤痘苗病毒的大规模生产。
附图说明
图1 HeLa S3细胞生长曲线。
具体实施方式
本发明提供了人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。其中，EX-Cell® 293培养基购自sigma、DMEM培养基购自sigma、VirusPro® CD HeLa购自源培生物科技有限公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1.病毒宿主细胞HeLa S3的无血清悬浮培养
1.1HeLa S3细胞贴壁传代培养
（1）细胞来源：子宫颈癌细胞，购买于美国菌种保藏中心，HeLa S3 (ATCC®CCL2.2™)，获得后进行扩增，分装冻存。
（2）培养基：DMEM（5%FBS），指含5%胎牛血清的DMEM培养基。
（3）复苏：从液氮中复苏1支HeLa S3细胞，转入T25方瓶中，使用DMEM（5%FBS）进行培养。
（4）培养2-4天后，HeLa S3细胞在T25方瓶中生长汇合度为80%~100%时，用D-PBS溶液漂洗细胞，加入胰酶消化后，用培养基重悬，轻轻吹打细胞至分散，1:3~1:5传代至T75方瓶中继续培养。2~4天后，按同样的方法传代至T175方瓶中继续培养。
1.2 HeLa S3细胞悬浮驯化培养
（1）更换培养基：HeLa S3细胞在T175方瓶中贴壁生长2-4天后，汇合度为80%~100%，用D-PBS溶液漂洗细胞，加入胰酶消化，待细胞脱落后，收集全部细胞，900rpm，离心5分钟，弃上清，用EX-Cell® 293重悬细胞，轻轻吹打，使细胞分散，转入125ml摇瓶中，培养体积30ml，初始细胞密度约为：5×105cells/ml，培养条件为：37℃，5%CO2，110rpm振荡培养。
（2）悬浮培养传代：HeLa S3细胞在125ml摇瓶中悬浮培养3天，细胞密度约为4×106cells/ml。按接种细胞密度5×105cells/ml计算所需细胞悬液，1000rpm，离心5分钟收集细胞，用EX-Cell® 293培养基重悬后，转入摇瓶继续培养，培养条件为：37℃，5%CO2，110rpm。
（3）传代10~15次后，细胞不聚团，且活率保持在90%以上时，细胞已适应悬浮培养。
实施例2 培养基组合
市场上可用于HeLa S3细胞培养的无血清培养基并不多，且大部分只可支持HeLaS3细胞贴壁附着生长，支持HeLa S3细胞悬浮生长的极少，即使是支持HeLa S3细胞悬浮生长的细胞培养基，细胞生长状况也不佳。
在此实施例中，以EX-Cell® 293、DMEM、VirusPro® CD HeLa中的两种或三种等比例组合成新的无血清培养基，125ml摇瓶中悬浮培养HeLa S3细胞，初始细胞接种密度:7.5×105 cells/ml，37℃，5%CO2，110rpm振荡培养。培养3天后，按细胞接种密度约0.8×106cells/ml进行传代，继续培养3天后，检测细胞密度和活率，结果如表1：
表1培养后细胞密度和活率
Figure DEST_PATH_IMAGE001
结果表明，各组都取得了良好的培养效果，在细胞密度和存活率方面，三种培养基混合的实验组取得了更好的效果。以EX-Cell® 293、DMEM、VirusPro® CD HeLa中的两种或三种按照不同比例组合成新的无血清培养基，如按照1:2、2:1、1:2:1、2:1:1、1:1:2等不同比例进行细胞培养3天后，检测的细胞密度均能达到且高于1×106cells/ml的数量级，活度也均能达到95%以上。基于对实验强度的考量，扩毒实验仅以等比例的培养基组合进行验证。
另外，以VirusPro® CD HeLa +EX-Cell® 293（1:1）组合培养基为例，重新培养一瓶HeLa S3细胞，绘制细胞生长曲线，如图1，数据如表2：
表2 培养的细胞密度和活率随时间变化
Figure 377148DEST_PATH_IMAGE002
实施例3不同培养基组合扩毒
3.1实验方法
细胞株：HeLa S3（无血清悬浮培养）
痘苗病毒：Lister株，经基因改造的重组痘苗病毒株
培养基：
①EX-Cell® 293+ DMEM（1:1）
②VirusPro® CD HeLa + DMEM（1:1）
③VirusPro® CD HeLa + EX-Cell® 293（1:1）
④EX-Cell® 293+ VirusPro® CD HeLa +DMEM（1:1:1）
细胞培养：使用上述4种培养基组合，分别培养HeLa S3细胞，25ml/瓶，生长至第3天时，分别取样，检测细胞密度。再用相应培养基稀释至约4×106cells/ml，准备接毒。
病毒扩增：按MOI 为0.02 pfu/cell计算毒种接入量，向4组培养基培养的细胞中接入Lister病毒。继续培养2天后，分别收集并裂解4瓶中的细胞，收获病毒。
3. 2实验结果
表3不同培养基组合培养的效果
Figure 497551DEST_PATH_IMAGE003
结果表明，四种培养基组合扩增病毒的水平相当，单细胞产毒为20.4 pfu/cell ~24.6pfu/cell。其中，VirusPro® CD HeLa + EX-Cell® 293（1:1）组合扩增病毒优于其它组合，单细胞产毒可达24.6pfu/cell。
实施例4 HeLa S3细胞不同MOI扩增病毒
4.1实验方法
细胞株：HeLa S3（无血清悬浮培养）
痘苗病毒：Lister株，经基因改造的重组痘苗病毒株。
培养基：VirusPro® CD HeLa + EX-Cell® 293 1:1组合
细胞培养：从细胞库中复苏一管HeLa S3细胞，转入125ml摇瓶中，37℃，5%CO2，110rpm振荡培养。培养3天后，按细胞接种密度约0.8×106cells/ml进行传代，继续培养3天后，取样检测细胞密度为6.82×106cells/ml，活率97.01%，用培养基稀释后，取样测细胞密度为4.07×106cells/ml，准备接种病毒。
病毒扩增：分别按接毒MOI为0.005、0.02、0.1pfu/cell计算所需的病毒量，接入病毒，2天后收毒，蚀斑法检测病毒滴度。
4.2实验结果
表4 不同MOI接毒对制备病毒效果的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE004
实验结果表明：悬浮培养的HeLa S3细胞，能有效支持痘苗病毒的扩增，在MOI为0.02pfu/cell~0.1pfu/cell时，病毒扩增效率较高，单细胞产毒为22.4pfu/cell~31.9pfu/cell。其中，当MOI为0.02pfu/cell时，扩增效果最优。
实施例5 HeLa S3细胞稀释至不同密度扩增病毒
5.1实验方法
细胞株：HeLa S3（无血清悬浮培养）
痘苗病毒：Lister株，经基因改造的重组痘苗病毒株。
培养基：VirusPro® CD HeLa + EX-Cell® 293 1:1组合
细胞培养：从细胞库中复苏一管HeLa S3细胞，转入125ml摇瓶中，37℃，5%CO2，110rpm振荡培养。培养3天后，按细胞接种密度约0.8×106cells/ml进行传代，继续培养3天后，检测细胞密度为6.56×106cells/ml，活率96.6%，用培养基稀释细胞至不同密度，取样测细胞密度（数据见表5），准备接种病毒。
病毒扩增：按MOI 为0.02 pfu/cell计算毒种接入量，向3瓶细胞中接入Lister病毒。继续培养2天后，分别收集并裂解4瓶中的细胞，收获病毒。
5.2实验结果
表5 不同细胞密度接毒对病毒扩增效果的影响
Figure 667501DEST_PATH_IMAGE005
实验结果表明：悬浮培养的HeLa S3扩增病毒，接毒时，不是细胞密度越高，病毒滴度就高，需要稀释至合适密度接毒，才能获得较高病毒产量。表格中，细胞密度为3.88×106cells/ml时接毒，单细胞产毒最高，达27.1pfu/cell。因此，实验同时也表明，提高HeLaS3细胞峰值密度，有利于大规模扩增病毒时，能获得更多的病毒收获液，减少了细胞扩增种子的体积，简化了操作，降低了劳动强度。细胞密度优选在3-4×106cells/ml时接毒，单细胞产毒最高。
实施例6用50L一次性生物反应器搅拌培养HeLa S3细胞扩增病毒
6.1实验方法
细胞株：HeLa S3（无血清悬浮培养）
痘苗病毒：Lister株，经基因改造的重组痘苗病毒株。
培养基：VirusPro® CD HeLa + EX-Cell® 293 1:1组合
细胞培养：从细胞库中复苏一管HeLa S3细胞，转入125ml摇瓶中，37℃，5%CO2，110rpm振荡培养。培养3天后，按细胞接种密度约0.8×106cells/ml进行传代，继续培养3天后，继续传代，扩增种子细胞，准备上罐。
反应器培养细胞：提前安装好50L培养袋，注入合适体积的培养基，准备接入细胞。按细胞接种密度约1.0×106cells/ml计算，接入种子细胞。设定温度为37℃，搅拌速度为50rpm，溶氧DO为50%，pH为7.2，当天培养时间计为D0，每天监测，取样检测细胞密度、葡萄糖含量、产乳酸量等指标。
反应器扩增病毒：细胞在反应器中生长至第3天（D3）时，检测细胞密度，再用相应培养基稀释至约4×106cells/ml。按MOI 为0.02 pfu/cell计算所需接入的病毒量，接入病毒，继续培养2天（D5）后，收集并裂解细胞，收获病毒。
表6 50L反应器细胞培养生长情况
Figure DEST_PATH_IMAGE006
6.2 实验结果
6.2.1 大规模50L搅拌培养条件下，HeLa S3依然能高密度高活率生长，在接入病毒后D3时，细胞活率依然保持93%；D5收毒时，细胞密度能达到6.42×106cells/ml。
6.2.2 病毒收获后，取样检测病毒滴度，结果为8.5×107pfu/ml，单细胞产毒为21.7pfu/cell，与摇瓶扩增病毒的滴度相当，已经能完全满足商业化痘苗病毒生产的需求，成功开发了悬浮搅拌培养HeLa S3细胞扩增痘苗病毒的技术工艺。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.培养基组合在HeLa细胞悬浮培养中的应用，所述培养基组合为：
EX-Cell® 293培养基和DMEM培养基的组合；其中EX-Cell® 293培养基和DMEM培养基的体积比为1:2、1:1或2:1；
或EX-Cell® 293培养基和VirusPro®CD HeLa培养基的组合；其中EX-Cell® 293培养基和VirusPro®CD HeLa培养基的体积比为1:2、1:1或2:1；
或VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的组合；其中VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的体积比为1:2、1:1或2:1；
或EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的组合；其中EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的体积比为1:1:1、1:2:1、2:1:1或1:1:2。
2.用于HeLa细胞悬浮培养的培养基组合，其为：
EX-Cell® 293培养基和DMEM培养基的组合；其中EX-Cell® 293培养基和DMEM培养基的体积比为1:2、1:1或2:1；
或EX-Cell® 293培养基和VirusPro®CD HeLa培养基的组合；其中EX-Cell® 293培养基和VirusPro®CD HeLa培养基的体积比为1:2、1:1或2:1；
或VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的组合；其中VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的体积比为1:2、1:1或2:1；
或EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的组合；其中EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基和DMEM培养基的体积比为1:1:1、1:2:1、2:1:1或1:1:2。
3.根据权利要求2所述的培养基组合，所述EX-Cell® 293培养基、VirusPro®CD HeLa培养基或DMEM培养基中还添加有促进细胞生长的因子；
所述因子选自胰岛素、生长激素、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、增殖刺激因子、类胰岛素生长因子。
4.权利要求2或3所述的培养基组合在制备溶瘤痘苗病毒中的应用。
5.HeLa细胞悬浮培养的方法，其特征在于，将悬浮驯化的HeLa细胞接种于权利要求2或3所述的培养基组合，振荡培养。
6.一种溶瘤痘苗病毒的制备方法，其特征在于，包括：将悬浮驯化的HeLa 细胞接种于权利要求2或3所述的培养基组合，振荡培养至细胞密度不低于5×106cells/ml，然后稀释细胞至密度为2×106cells/ml ~5×106cells/ml接种病毒，继续培养2~3 d后收毒。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述稀释细胞至密度为3×106cells/ml ~4×106cells/ml接种病毒。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述振荡培养的条件为34~38℃，3%~10% CO2，100~130rpm，培养24～96小时后传代或接种病毒。
9.根据权利要求6~8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述接种病毒MOI为0.001pfu/cell ~0.5pfu/cell。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述病毒为痘苗病毒Lister株，或为经基因改造的重组痘苗病毒Lister株。
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