CN107974432A - 高效分泌表达猪瘟e2蛋白的cho细胞株的培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株的培养方法及其应用，所述的培养方法包括以下步骤：1)将高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株在1号培养基中逐级放大培养；2)将放大培养后的细胞转入生物反应器中进行发酵培养，在2号培养基中进行搅拌培养，发酵培养初期培养温度为36.5～37.5℃，pH为7.05～7.25，从发酵培养的120±2h开始，将培养温度下调至31.5～32.5℃，并将pH下调至6.90～7.10；在整个发酵培养的过程中，控制溶氧为20％～60％；在生物反应器中发酵的第12天后，收获细胞发酵液。本发明的培养方法获得的猪瘟E2蛋白产高、且具有更好的可操作性和实用性，因此，本发明更有利于扩大培养规模。
Description
技术领域
本发明涉及CHO细胞的发酵培养方法和应用，属于细胞工程领域。
背景技术
猪瘟在欧洲称为古典猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种急性、热性、致死性疾病。猪瘟具有高度接触传染性、发病急、高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变特征。家养和野生猪是其唯一的天然宿主。世界动物卫生组织(OIE)将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。猪瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。
猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员，为单链线状RNA病毒。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。CSFV基因组长约12.5kb，仅含有1个大的开放性阅读框(ORF)，此ORF编码约3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白。此多聚蛋白在翻译的同时和在翻译后经病毒与宿主细胞蛋白酶加工成12种成熟蛋白，依次为Npro,C,Erns,E1,E2,p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A,NS5B，其中C,Erns,E1和E2为结构蛋白,其余为非结构蛋白。E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。
本发明人在申请号为201710409930.6的发明专利申请构建了一株高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株，该细胞株在摇瓶培养时产量能够达到1g/L。为了进一步提高该细胞株的表达产量以降低疫苗生产成本，以及进一步适应规模化的工业化生产以方便后续工业化大规模生产，本发明人在摇瓶发酵的基础上，进一步研究了该细胞株的大规模的细胞培养方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株的大规模培养方法。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株的培养方法，所述的培养方法包括以下步骤：1)将高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株在无血清培养基中逐级放大培养；2)将放大培养后的细胞转入生物反应器中在无血清培养基中进行发酵培养，所述发酵培养的初期培养温度为36.5～37.5℃，pH为7.05～7.25；从发酵培养的120±2h开始，将培养温度下调至31.5～32.5℃，并将pH下调至6.90～7.10，其中，需在96±2h和216±2h时添加无血清培养基；在整个发酵培养的过程中，控制溶氧为20％～60％；在生物反应器中发酵的第12天后，收获细胞发酵液。
本发明的技术方案中，优先地，步骤1)中的所述无血清培养基为Dynamis和EX-CELL302且含有25μM MSX，所述Dynamis和所述EX-CELL 302体积比为6:4。
本发明的技术方案中，优先地，步骤2)中的所述无血清培养基为Dynamis和EX-CELL302且不含有25μM MSX，所述Dynamis和所述EX-CELL 302体积比为6:4。
本发明的技术方案中，优先地，步骤2)中，在96±2h和216±2h时添加的无血清培养基为CD Efficent Feed C，所述CD Efficent Feed C浓度为79.6g/L。更优选地，每次添加的所述CD Efficent Feed C的体积为步骤1)中的所述无血清培养基和步骤2)中的所述无血清培养基的总体积的10％。
本发明的技术方案中，优先地，步骤1)中逐级放大培养时每48～72小时进行传代摇瓶培养，经过300ml、1.8L摇瓶培养扩增后，转入生物反应器中进行发酵培养，所述摇瓶培养时摇床设置的条件为37℃，100rpm，5％CO2。
本发明的技术方案中，优先地，步骤1)中逐级放大培养过程中，每次传代时细胞密度为1～3×106VC/ml，接种时细胞密度为0.2～0.4×106VC/ml。
本发明的技术方案中，优先地，步骤2)中发酵培养的整个过程中，控制溶氧为40％。
本发明的技术方案中，优先地，步骤2)中发酵培养的整个过程中，控制葡萄糖的浓度为2.5～4g/L。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种将高效分泌表达猪瘟E2蛋白的培养方法在高效分泌表达其他目的蛋白的CHO细胞株发酵培养中的应用。
本发明通过这些培养条件的综合调控取得了很好的培养效果：与摇瓶发酵相比，调整发酵条件后，最高活细胞密度(1.28×107VC/ml)比摇瓶发酵的(8.1×106VC/ml)高；猪瘟E2蛋白表达量(2.18g/L)远高于摇瓶发酵(1.54)；而且本发明还具有更好的可操作性和实用性。因此，本发明更有利于扩大培养规模。
另外，本发明的培养方法相对于其他灌流式培养方法或流加式培养方法都有比较明显的优势，其优势在于：1)本发明的培养方法发酵时间相对较短，只用发酵12天即可收获目的蛋白，而灌流式培养和流加式培养一般都需要近20天或更长时间的发酵培养才收获目的蛋白；2)本发明中仅在第4天和第9天添加补料培养基，比灌流式培养和流加式培养需要持续添加培养基或放出培养基相比，外源的污染概率较小，能适当降低设备要求和人员要求以及提高发酵的成功率；3)本发明针对的表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株表达产量本身就很高(大于1g/L，接近2g/L)，采用灌流式培养和流加式培养(本实验室条件有限，未能进行比较实验，只能进行理论推算)虽然表达产量可能相对要高，但是能够提高的幅度非常有限(因为本发明的表达产量相对很高)，远不如本发明缩短培养时间和节约培养基(培养时间越长，所耗的培养基越多)所带来的成本低。
附图说明
图1发酵过程活细胞密度变化曲线。
图2发酵过程中细胞活力曲线。
图3Werstern Blotting鉴定第12日细胞发酵上清中CSFV-E2的表达：M表示Marker；N(Negative control)表示阴性对照；P(Positive control)表示阳性对照；1表示发酵上清样品133D，2表示发酵上清样品133D-B，稀释10倍，上样量为4μl。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
MSX(甲硫氨酸亚砜亚铵，L-methioninesulfoximine)、EX-CELL 302培养基为Sigma公司产品；
Dynamis培养基、CD FortiCHO培养基、CD CHO培养基、CD Efficent Feed C、葡萄糖为Gibco公司产品；
Max P CHO 100培养基为MabPlex公司产品；
其他试剂均为国产市售产品。
实施例1种子细胞的扩增
从液氮罐中取出高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株(细胞株编号为133株，具体参见本发明人提交的申请号为201710409930.6的发明专利申请)，置37℃水浴中迅速融化，用50ml 1号培养基(1号培养基为60％Dynamis+40％EX-CELL 302混合培养基，均为无血清培养基，含25μM MSX)重悬细胞，细胞接种密度为0.2-0.4×106VC/ml，接种细胞于250ml的细胞摇瓶，并置于37℃，100rpm，5％CO2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，传代时细胞密度为1-3×106VC/ml。将250ml摇瓶中的细胞转移至1L的摇瓶中，补充培养基至300ml，并将摇瓶置于37℃，100rpm，5％CO2摇床中进行摇瓶培养48～72小时，再进行传代，传代细胞密度和过程与上述传代基本一致，此次传代后培养基总体积为1.8L，继续培养48～72小时，待用。
实施例2 15L生物反应器发酵培养
(1)将2号培养基(2号培养基为60％Dynamis+40％EX-CELL 302混合培养基，不含MSX)泵进生物反应器。设置参数：pH设置为7.15，工作范围7.05～7.25；溶氧40％，工作范围20％～60％；温度37.0℃，工作范围36.5～37.5℃；搅拌速度130rpm。溶氧电极过夜饱和。
(2)从CO2恒温摇床取出实施例1中的细胞并计数，用2号培养基稀释细胞至0.2～0.4×106VC/ml，接种到生物反应器。
(3)每隔24h计数细胞密度及活力，用nova生化分析仪测葡萄糖/谷氨酸/谷氨酰胺等，当葡萄糖低于2.5g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L。
(4)在96±2h时补料(约第四天)：补充CD Efficent Feed C(浓度为79.6g/L)(3号培养基)，添加的量为1号和2号培养基总体积的10％。
(5)120±2h(约第五天)开始，pH调至7.00(此处一般通过CO2和NaOH来调节，一般仪器设置好后会自动调节)，工作范围6.90～7.10；温度调整至32℃，工作范围31.5～32.5℃。
(6)216±2h时补料(约第九天)，补充CD Efficent Feed C(浓度为79.6g/L)(3号培养基)，添加的量为1号培养基和2号培养基总体积的10％。
(7)第十二天，收获细胞发酵液。具体细胞发酵液的纯化见本发明人提交的申请号为201710343544.1的发明专利申请。
实施例3 15L生物反应器与摇瓶平行发酵比较实验
为了比较15L生物反应器与摇瓶发酵的差异，我们利用15L生物反应器与摇瓶平行发酵，并比较上述两种发酵过程的细胞密度、活力及蛋白的产量。133D-B表示15L生物反应器发酵，发酵体积为10L，搅拌速度150r/min；133D表示1L摇瓶发酵，发酵体积为250ml。
活细胞密度分析如图1所示，133D-B与133D生长趋势相近。133D-B最高活细胞密度(1.28×107VC/ml)比133D(8.1×106VC/ml)高。
细胞活力分析如图2所示，两组细胞活力无明显差别，均在80％以上。
蛋白鉴定通过Werstern Blotting检测第12日E2蛋白的表达(图3)。结果显示，细胞株表达的蛋白与阳性对照一致，证明表达的蛋白为猪瘟E2蛋白。
蛋白表达量检测(参见表1)：HPLC检测发酵上清E2蛋白表达量，均不低于1g/L，生物反应器发酵的蛋白表达量远高于摇瓶发酵。
表1
实施例4不同培养基发酵比较实验
为了比较不同培养基对发酵培养的影响，我们利用15L生物反应器进行了四次发酵，具体发酵参见实施例1和实施例2(除了培养基不同以外，其他条件一致)，具体培养基信息和猪瘟E2蛋白表达产量参见表2所示：
表2
其中，60％CD：60％CD CHO+40％EX-CELL 302；100％M：100％Max P CHO 100；60％D：60％Dynamis+40％EX-CELL 302；60％F：60％CD FortiCHO+40％EX-CELL 302；CD：CDEfficient Feed C。
通过比较133B，133M，133C，133F，在其它条件相同的情况下，133C表达量最高，即60％Dynamis+40％EX-CELL 302作为基础培养基(2号培养基)，CD Efficient Feed C作为补料培养基(3号培养基)时，猪瘟E2蛋白表达产量相对最高。
实施例5不同补料(时间和体积)发酵比较实验
为了比较不同补料对发酵培养的影响，我们利用15L生物反应器进行了三次发酵，具体发酵参见实施例1和实施例2(除了补料不同以外，其他条件一致)，具体培养基信息和猪瘟E2蛋白表达产量参见表3所示：
表3
此处基础培养基体积为1号培养基和2号培养基的总体积；第4天具体时间为96±2h，第9天具体时间为216±2h；第3天具体时间为72±2h，第6天具体时间为144±2h，第9天具体时间为216±2h；第5天具体时间为120±2h，第8天具体时间为192±2h，第11天具体时间为264±2h。
通过比较133#4，133#6，133#8，在其它条件相同的情况下，133#4表达量最高，即在第4天和第9天补料，每次补料体积为基础培养基体积的10％，猪瘟E2蛋白表达产量相对最高。
实施例6基础培养基中是否含MSX发酵比较实验
为了比较MSX对发酵培养的影响，我们利用15L生物反应器进行了两次发酵，具体发酵参见实施例1和实施例2(除了基础培养基中是否含有MSX不同以外，其他条件一致)，具体培养基信息和猪瘟E2蛋白表达产量参见表4所示：
表4
通过比较133P，133N，在其它条件相同的情况下，133N表达量最高，即基础培养基中不含有MSX(25μM)，猪瘟E2蛋白表达产量相对最高。
实施例7不同时间降温和降pH发酵比较实验
为了比较不同时间降温和降pH对发酵培养的影响，我们利用15L生物反应器进行了三次发酵，具体发酵参见实施例1和实施例2(除了降温和降pH时间不同以外，其他条件一致)，具体培养基信息和猪瘟E2蛋白表达产量参见表5所示：
表5
通过比较133#1，133#2，133#3，在其它条件相同的情况下，133#2表达量最高，即在第5天降温和降pH，猪瘟E2蛋白表达产量相对最高。
实施例8使用实施例1和2的方法发酵培养高效分泌表达其他目的蛋白的CHO细胞株
将实施例1和实施例2的方法应用到表达PEDV-S蛋白的3C5株CHO细胞(具体构建方法详见本发明人提交的申请号为201710242260.3的发明专利申请)的发酵培养中，经过发酵培养，发现使用本方法能够大大提高PEDV-S蛋白的表达产量，即原来的摇瓶发酵产量约为1g/L，使用该方法后表达产量提高到约1.3g/L。
将实施例1和实施例2的方法应用到表达BVDV-E2蛋白的GS-4A2株CHO细胞(具体构建方法详见本发明人提交的申请号为201611208261.8的发明专利申请)的发酵培养中，经过发酵培养，发现使用本方法能够大大提高BVDV-E2蛋白的表达产量，即原来的摇瓶发酵产量约为0.5g/L，使用该方法后表达产量提高到约1.1g/L。
将实施例1和实施例2的方法应用到表达IBRV-gD蛋白的2A2株CHO细胞(具体构建方法详见本发明人提交的申请号为201710023620.0的发明专利申请)的发酵培养中，经过发酵培养，发现使用该方法对IBRV-gD蛋白的表达产量提高的不明显，即原来的摇瓶发酵产量约为2-3g/L，使用本方法后表达产量提高到约2.2-3.2g/L。可能原因是摇瓶发酵本身的表达产量就很高，想在此基础上面再大大提高表达产量很难或不显著。
通过将实施例1和实施例2的培养条件在表达其他目的蛋白的CHO细胞株的发酵培养中的实践，发现该培养方法也很适合表达其他目的蛋白的CHO细胞株的发酵培养。因此其他的CHO细胞株可以在此培养条件的基础上进一步优化适合本细胞株的发酵培养条件，有利于加快其他CHO细胞株的工业化生产进程。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。
Claims (10)
1.一种高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：
1)将高效分泌表达猪瘟E2蛋白的CHO细胞株在无血清培养基中逐级放大培养；
2)将放大培养后的细胞转入生物反应器中在无血清培养基中进行发酵培养，所述发酵培养的初期培养温度为36.5～37.5℃，pH为7.05～7.25；从发酵培养的120±2h开始，将培养温度下调至31.5～32.5℃，并将pH下调至6.90～7.10，其中，需在96±2h和216±2h时添加无血清培养基；在整个发酵培养的过程中，控制溶氧为20％～60％；在生物反应器中发酵的第12天后，收获细胞发酵液。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1)中的所述无血清培养基为Dynamis和EX-CELL 302且含有25μM MSX，所述Dynamis和所述EX-CELL 302体积比为6:4。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2)中的所述无血清培养基为Dynamis和EX-CELL 302且不含有25μM MSX，所述Dynamis和所述EX-CELL 302体积比为6:4。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2)中，在96±2h和216±2h时添加的无血清培养基为CD Efficent Feed C，所述CD Efficent Feed C浓度为79.6g/L。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，每次添加的所述CD Efficent Feed C的体积为步骤1)中的所述无血清培养基和步骤2)中的所述无血清培养基的总体积的10％。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1)中，逐级放大培养时每48～72小时进行传代摇瓶培养，经过300ml、1.8L摇瓶培养扩增后，转入生物反应器中进行发酵培养，所述传代摇瓶培养时摇床设置的条件为37℃，100rpm，5％CO2。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，步骤1)中，逐级放大培养过程中，每次传代时细胞密度为1～3×106VC/ml，接种时细胞密度为0.2～0.4×106VC/ml。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2)中，发酵培养的整个过程中，控制溶氧为40％。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2)中，发酵培养的整个过程中，控制葡萄糖的浓度为2.5～4g/L。
10.一种使用如权利要求1至9任一权利要求所述的培养方法在高效分泌表达其他目的蛋白的CHO细胞株发酵培养中的应用。
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