CN102443565A - 一种适于培养cho细胞的培养基及其培养工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适于培养CHO细胞的培养基及其培养工艺，涉及一种含有C6614的基础培养基和含有EX-Cell 302的流加培养基，整个培养工艺采用流加浓缩培养基流加和降温培养，结合灌流基础培养基的方法。该工艺具有十分良好的效果，工艺具有稳定性好、可操作性强、批次间结果差异小等特点，可以极大的提高重组蛋白的产量。

Description

一种适于培养CHO细胞的培养基及其培养工艺

技术领域

本发明公开了一种中国仓鼠卵巢细胞的培养基的配制及其培养工艺，更具体地说涉及一种采无血清新培养基用悬浮培养生产重组蛋白治疗药物的培养工艺，属于生物制品领域。

背景技术

诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。其中，基因重组治疗性抗体(包括受体-Fc融合蛋白等抗体样分子)是生物制药领域发展最迅猛、销售额最高、产品种类最多的一类产品，是拉动生物制药产业快速增长的主要力量。例如，罗氏公司阿瓦斯汀是一种阻碍血管生成的基因重组治疗性抗体，被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗肺癌、结肠癌和直肠癌，并在欧洲获准用于治疗乳腺癌，2009年的销售额达59亿美元。

基因重组治疗性抗体(包括受体-Fc融合蛋白等抗体样分子)的研发和产业化，是其发展的关键。由于基因重组治疗性抗体上游构建技术和大量生产抗体的动物细胞大规模培养技术的落后，我国现在最高生产水平非常低，产量低导致生产成本高居不下，项目难以产业化。适宜的培养基和大规模培养工艺是目前制约重组抗体类药物表达水平的两大瓶颈。而其中找到适合生产的工作细胞的培养工艺对整个生产的作用尤为重要，是提高细胞产量的重要途径之一。差的培养工艺将导致高额的生产成本。

20世纪80年代初期，在世界卫生组织(WHO)明确了哺乳动物传代细胞可用于生物制品生产以后，哺乳动物细胞在生物技术药物的研发中获得了长足发展。目前，用于生物制药的真核表达系统中，中华仓鼠卵巢细胞系(Chinese hamster ovary cell line，CHO)是应用最为广泛的，在美国和欧盟已批准的以哺乳动物细胞生产的生物药品中，利用CHO系统的占60％以上，且比例不断上升。常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO(DHFR-)，与其他表达系统相比，CHO细胞具有如下优点：a.外源蛋白容易在CHO细胞中合成并分泌到培养基中；b.表达蛋白的折叠及二硫键的形成几乎与天然蛋白质相同；c.在正常的氨基酸位置上发生糖基化；d.能完成其他翻译后加工与修饰；e.能正确组装多亚基蛋白；f.外源基因的整合稳定；g.能以无血清培养基进行悬浮培养并达到高密度，且培养体积能达到1000L以上。因此，CHO细胞在生物制药业中受到广泛重视，而其中CHO-DHFR-细胞系(二氢叶酸还原酶缺陷型)又因为其良好的DHFR筛选系统得到了研发者的一致青睐。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达，其中部分药物已投放市场，倒如EPO、GCSF等。

但是，CHO细胞培养成本高，条件难掌握，在一定程度上影响了它对基因重组治疗性抗体(包括受体-Fc融合蛋白等抗体样分子)的表达水平。本发明人研究发现，不同来源，不同生长状态(贴壁，悬浮)和用于表达不同基因重组治疗性抗体(包括受体-Fc融合蛋白等抗体样分子)的CHO细胞株对营养物质的需求都不一样。因此，依据不同的细胞株设计和优化出适合其高密度生长或高水平目的产物表达的培养基，已经是迫在眉睫且亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一提供了一种适于CHO细胞悬浮无血清培养的培养基，其包含下列组分：

(1)21.4g/L C6614培养基

(2)0.05～6.0mM/L谷氨酰胺

(3)0.1～100mg/L胰岛素

(4)0.1～100mM/L柠檬酸铁

调节pH为6.9-7.4。

所述适于CHO细胞悬浮无血清培养的培养基优选为

(1)21.4g/L C6614培养基

(2)4～6mM/L谷氨酰胺

(3)5.0mg/L胰岛素

(4)1.5mM/L柠檬酸铁

调节pH为7.0。

上述培养基中还可以含有脂类，其中所述脂类优选为CD lipids。

上述培养基的制备方法如下：将C6614干粉与超纯水混合搅拌后，加入谷氨酰胺、柠檬酸铁水溶液，再加入碳酸氢钠调节pH值为6.9-7.4，60分钟后再加入胰岛素，补充超纯水，10分钟后取样测定生化参数，过滤除菌。

本发明另一目的还提供了在上述培养基的基础上，后期培养中所用的流加培养基为含有EX-cell 302的培养基；所述的流加培养基优选为浓缩的EX-cell 302培养基，其含有63.6g/LEX-cell 302培养基、2-100g/L大豆水解蛋白、5-10mg/L胰岛素；所述的浓缩的EX-cell 302培养基更有选为含有63.6g/L EX-cell 302培养基、20g/L大豆水解蛋白、5mg/L胰岛素。

本发明还提供了一种生产重组蛋白类药物的CHO细胞培养工艺，其具体步骤如下：

(1)控制生物反应器的参数溶氧控制为40，温度控制为37℃，搅拌速度为40rpm，气体流量为100mL/min；

(2)采用权利要求1-3中任一培养基为基础培养基，浓缩EX-cell 302培养基为流加培养基；

(3)在培养后期采用流加和降温培养工艺并降低pH，将温度控制在34.0～36.5℃，控制pH在6.0～7.1；

(4)流加培养过程中，保持葡萄糖浓度为2～3g/L，谷氨酰胺浓度为2～3mM/L。

所述的CHO细胞培养工艺，其步骤更优选为：

(1)控制生物反应器的参数溶氧控制为40，温度控制为37℃，搅拌速度为40rpm，气体流量为100mL/min；

(2)采用权利要求2中的培养基为基础培养基，权利要求6中的浓缩EX-cell 302培养基为流加培养基；

(3)在培养后期采用流加和降温培养工艺并降低pH，将温度控制在34-36.5℃，控制pH在6.9-7.0；

(4)流加培养过程中，保持葡萄糖浓度为2～3g/L，谷氨酰胺浓度为2～3mM/L。

本发明的培养工艺采用流加浓缩培养基流加和降温培养，结合灌流基础培养基的方法。该工艺具有十分良好的效果，工艺具有稳定性好、可操作性强、批次间结果差异小等特点，可以极大的提高重组蛋白的产量。

在本发明中，所述的融合蛋白是中国专利“VEGF受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用”(专利号ZL200610066257.2)和“抑制血管新生的融合蛋白及其用途”(专利号ZL200510073595.4)，具体而言是稳定表达FP3细胞系的CHO细胞(本发明中的细胞)以及FP3融合蛋白，因此ZL200610066257.2和ZL200510073595.4的内容可用来解释本发明。

具体实施方式

实验材料：

C6614培养基(SAFC公司，批号：8E0326)；EX-cell 302培养基(SAFC公司，批号：027K0075)；CHO-S-SFM II(Invitrogen公司)；SAF-CHO-G-001(清大天一公司)；谷氨酰胺(SIGMA公司，批号：027K0075)；胰岛素(诺和诺德公司，批号：WG0074)；柠檬酸铁(华东师范大学试剂厂，批号：20070506)；大豆水解蛋白(KERRY公司，批号：1320001283)；葡萄糖(SIGMA公司，批号：1282291)；谷氨酰胺(SIGMA公司，批号：027K0075)；浓缩混合脂100×CD lipidS(Gibco USA)

实施例1基础培养基的筛选

发明人系统对比研究了五种培养基：CHO DHFR^-(C6614)，EX-cell 302，CHO-S-SFM II，SAF-CHO-G-001，混合培养(C6614∶SFM-II∶EX-cell 302＝4∶1∶1)，都添加1.5mM柠檬酸铁和5mg/L的胰岛素，结合细胞密度和活率，以蛋白产量为考察指标，确定最佳的基础培养基。

将细胞从种子库中取出，37℃快速解冻，用移液管将冷冻管中的细胞全部转移至40mL离心管中，加入9mL培养基，900r/min离心3分钟，弃上清，用10mL培养基重悬沉淀，接种于T75方瓶中，37℃培养，2天后计数，按照3×10⁵/mL接种于摇瓶中，以后每3天记数一次，并按照3×10⁵/mL的接种密度进行扩大。再按照5×10⁵cell/mL接种密度分别接种于5个500mL摇瓶中，每瓶接种80mL，置入CO₂培养箱中，37℃培养。从培养第2天起，每天取样1.5mL，用于细胞计数和生化分析检测，时刻关注各项参数的变化，每当糖浓度低于3g/L时，添加一定量相应流加培养基。取样3mL，留样1.5mL用于后期蛋白含量测定。

从表1可以看出，细胞在C6614培养基中培养，最高活细胞数最大，约为41.97×10⁵，而在SFM-II、EX-cell 302、SAF-CHO-G-001和混合培养基中，最高活细胞数都较低。但是，细胞在C6614中培养，活细胞数下降非常快，从第5天开始陡然下降，对浓缩培养基的流加也毫无反应，生长周期为8天，而在SFM-II和302培养基中，活细胞数的下降呈现一个平缓的趋势，尤其是302培养基，可以使细胞生长维持12天。由表2细胞活率结果中也可以看出，采用C6614作为基础培养基，细胞在培养初期具有较高的存活率，但是从第5天开始，存活率下降非常快，培养第8天，存活率低于30％；SFM-2初期存活率不高，整个培养过程中呈现较C6614平缓的下降趋势；EX-cell 302培养基从培养第3天开始，存活率低于90％，但是细胞活性下降非常平缓，直到第8天才开始下降，第11天细胞活性低于40％。三种基础培养基中从蛋白表达效果上来看(表3)，EX-cell 302比较好。

因此，细胞在EX-cell 302培养基中能够维持较长时间，而在C6614培养基中虽然不能维持较长的时间，但是可以提高活细胞密度，所以我们选择C6614培养基作为基础培养基，EX-cell 302培养基作为流加培养基。

表1.活细胞密度变化趋势(10⁵/ml)

-表示未测定

表2细胞活性变化趋势(％)

表3蛋白产量(mg/L)

实施例2培养基中谷氨酰胺对细胞活性和蛋白产量的影响

谷氨酰胺在细胞培养时是大部分细胞培养基的基本成分。细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在脱掉氨基后，谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。在缺少谷氨酰胺时细胞生长不良。但是，谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。而谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mM。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。因此，本发明人初步研究添加对细胞生长及蛋白表达的谷氨酰胺浓度。

利用摇瓶进行种子扩大培养及制备。接种反应器时，细胞液与培养基的比例维持1∶3～1∶5，接种密度维持在5×10⁵cells/mL左右，设置溶氧为40％，温度设定为37℃，转速设定为55转/分钟，采用CO₂与1mol/L的Na₂CO₃溶液调节pH，溶氧控制：采用3-gas控制模式。在培养过程中根据营养消耗情况补充浓缩的谷氨酰胺，并根据活细胞数和活率补充一定量的含有20g/L大豆水解蛋白302浓缩培养基。采用细胞计数仪检测活细胞数及细胞活率。采用NOVA自动生化分析仪测Glucose，L-glutamine，Lactate及NH4+浓度，HPLC进行蛋白含量测定。

结果如表4，5，6所示，在CHO细胞培养过程中添加适量的谷氨酰胺可以明显促进蛋白表达。过高浓度的谷氨酰胺对细胞的生长有明显的抑制作用。添加谷氨酰胺的浓度越高，活细胞数的下降速率越快。添加的谷氨酰胺浓度越高，对细胞产生的损伤可能越大，因此细胞的存活率也下降的越明显。因此，当谷氨酰胺添加浓度在0.05mM/L～6.0mM/L的范围时，均可以有效的促进蛋白表达，最佳的谷氨酰胺添加浓度为：2.0mM。

表4添加不同浓度谷氨酰胺(mM)细胞密度(10⁵/ml)

表5添加不同浓度谷氨酰胺(mM)对细胞活率的影响(％)

表6添加不同浓度谷氨酰胺(mM)对蛋白产量的影响(mg/ml)

实施例3其他组分对蛋白产量的影响

有研究表明，细胞在无血清培养液中培养时须加入一些生长因子，以取代血清支持细胞生长，如各种激素、生长因子和转运蛋白等。而其中起主要作用的一般为3～4种。普遍认为胰岛素、柠檬酸铁、乙醇胺和亚硒酸钠是无血清培养基中的主要成份。胰岛素是大多数合成培养基的必须成份，它可刺激细胞对尿苷和葡萄糖的吸收以合成RNA、蛋白质和脂质。胰岛素还能与细胞膜上的胰岛素受体结合而调控细胞内的多种代谢途径，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，对细胞生长起重要作用。有研究表明，各种生物膜对维持细胞正常的结构和功能是非常重要的，而脂类，尤其是浓缩的lipid，也是构成细胞各种生物膜的重要组成部分。另外，脂类中的活性脂质如：类固醇激素、萜类化合物等等都对细胞的正常生长有着非常重要的作用。因此，本发明人进一步研究添加组分对细胞生长及蛋白表达的影响。

利用摇瓶进行种子扩大培养及制备。接种反应器时，细胞液与培养基的比例维持1∶3～1∶5，接种密度维持在5×10⁵cells/mL左右，设置溶氧为40％，细胞培养前期设定为37℃，转速初始设定为55转/分钟，采用CO₂与1mol/L的Na₂CO₃溶液调节pH，溶氧控制：采用3-gas控制模式。考察添加对细胞生长及重组蛋白表达的影响，在培养第三天和第五天加入浓缩储备液，在培养过程中根据营养消耗情况补充浓缩的葡萄糖及谷氨酰胺，并根据活细胞数和活率补充一定量的302浓缩培养基。采用细胞计数仪检测活细胞数及细胞活率。采用NOVA自动生化分析仪测Glucose，L-glutamine，Lactate及NH4+浓度，HPLC进行蛋白含量测定。

从表7，8，9中可以看出，加入胰岛素和柠檬酸铁或脂类的细胞生长和维持的趋势均好于对照，可见添加组分对蛋白表达有一定促进作用，适量添加可提高细胞数和蛋白的表达量。利用所述方法可快速优化培养基成分可显著提高生物反应器中细胞的蛋白表达量。

表7不同浓度组分对细胞生长的影响(10⁵/ml)

表8不同浓度组分对细胞存活率的影响(％)

表9不同浓度组分对蛋白表达的影响(mg/ml)

实施例4

在流加补料培养基筛选实验中，采用C6614作为基础培养基，302浓缩培养基作为流加培养基。在此基础上进行优化，将补料培养基进一步调整，并采用对细胞生长较好的几种水解蛋白，观察细胞在该流加策略中的生长状况和蛋白产量。流加培养基采用以下配方：

A.302浓缩培养基+20g/L大米水解蛋白；

B.302浓缩培养基+20g/L麸皮水解蛋白；

C.302浓缩培养基+2g/L大豆水解蛋白；

D.302浓缩培养基+100g/L大豆水解蛋白；

E.302浓缩培养基+20g/L大豆水解蛋白

五种流加培养基进行流加，细胞密度的变化基本一致，细胞存活率的变化也基本一致。由表10、11、12可知，最后两天蛋白产量的可以看出，E号流加方式的结果最好，最终蛋白产量达229mg/L，D号次之，工艺中采取添加适当浓度的大豆水解蛋白能增加CHO细胞FP3融合蛋白表达。

表10活细胞密度变化趋势(10⁵/ml)

表11细胞活性变化趋势(％)

表12蛋白产量(mg/L)

实施例5后期培养过程中反应器温度对细胞活率和蛋白产量的影响

利用摇瓶进行种子扩大培养及制备。接种反应器时，细胞液与培养基的比例维持1∶3～1∶5，接种密度维持在5×10⁵cells/mL左右，设置溶氧为40％，细胞培养前期设定为37℃，后期将考察低温环境对蛋白表达的影响，转速初始设定为55转/分钟，采用CO₂与1mol/L的Na₂CO₃溶液调节pH，溶氧控制：采用3-gas控制模式。采用细胞计数仪检测活细胞数及细胞活率，HPLC进行蛋白含量测定。

由表13、表14、表15可知，34℃-36.5℃的培养温度能使细胞在培养后期维持较高的蛋白含量。

表13温度对细胞生长的影响(10⁵/ml)

表14温度对细胞存活率的影响(％)

表15温度对蛋白表达的影响蛋白产量(mg/L)

实施例6培养后期反应器的pH对蛋白产量的影响

利用摇瓶进行种子扩大培养及制备。接种反应器时，细胞液与培养基的比例维持1∶3～1∶5，接种密度维持在5×10⁵cells/mL左右，设置溶氧为40％，细胞培养前期设定为37℃，后期将考察pH对蛋白表达的影响，转速初始设定为55转/分钟，采用CO₂与1mol/L的Na₂CO₃溶液调节pH，溶氧控制：采用3-gas控制模式。采用细胞计数仪检测活细胞数及细胞活率，HPLC进行蛋白含量测定。

结果如表16所示，高pH条件下(7.1)的细胞生长速率稍快，达到的最高活细胞密度也稍高。但在低pH条件(6.9)更有利于后期蛋白的表达及细胞的维持生长。第10天的蛋白产量分别达到320mg/L。

表16低pH条件下反应器中活细胞，活率随时间变化

实施例13工艺的验证

培养基及溶液的配制方法：

1、含有C6614的基础培养基

称取C6614干粉963g，盛入50L配液桶，同时盛入42L超纯水，搅拌5分钟，加入谷氨酰胺19.71g。称取柠檬酸铁225mg，溶于1L超纯水中，水浴50℃，30分钟后，加入配液桶中，同时加入NaHCO₃67.5g，60分钟后加入胰岛素225mg，补充超纯水至45L，10分钟后取样测定生化参数，过滤除菌。

制得的培养基中含有21.4g/L C6614培养基；43.8mg/L谷氨酰胺；5.0mg/L胰岛素；1.5mM/L柠檬酸铁。

2、浓缩302培养基

称取302培养基干粉636g，大豆水解蛋白200g，溶于9L水中，搅拌，30分钟后，用1mol/LNaOH和HCL调pH到7.0，配液体积补充到10L，60分钟后加入50mg胰岛素，10分钟后过滤除菌。

制得的培养基中含有63.6g/L EX-cell 302培养基、20g/L大豆水解蛋白、5mg/L胰岛素。

3、葡萄糖溶液

称取1000g葡萄糖，溶于4L超纯水中，搅拌20分钟后定容为5L，10分钟后过滤除菌。

4、L-谷氨酰氨溶液

称取146g L-谷氨酰氨，溶于4L超纯水中，搅拌20分钟后定容为5L，10分钟后过滤除菌。

工艺验证一：

从工作细胞库复苏一支种子细胞，接种到T75方瓶中，培养体积10mL，5％C02，37℃培养两天后取样，细胞计数，然后移种到250mL摇瓶中，培养温度37℃，培养体积20mL，摇床转速为120rpm。3天后取样细胞计数，转入500mL摇瓶中，培养体积50mL。3天后取样细胞计数，培养体积扩大到200mL，分别转入2个500mL摇瓶。3天后取样计数，细胞分别转入2个1L摇瓶中，培养体积每瓶300mL，3天后，细胞密度达到2×10⁶cells/mL，作为种子细胞。然后接种到5L NBS生物反应器中，培养基为含C6614的基础培养基，接种密度5×10⁵cells/mL，接种体积2L，溶氧控制为40，温度控制为37℃，搅拌速度为40rpm，pH控制为7，气体流量为100mL/min。流加试剂为大豆水解蛋白，和GIBCO公司生产的混合脂(100×CD lipids)，恒温37℃培养，溶氧控制为40，转速为40rpm，pH前期控制为7.0，后期控制为6.9，每3天进行流加，细胞培养周期为8天，收获时细胞活率为50％左右，产量80-90mg/L。

工艺验证二：

将摇瓶制备的种子细胞接种到NBS 30L生物反应器中，接种密度为3～5×10⁵cells/mL，接种体积为8-10L，溶氧控制为40％，温度控制为37℃，第3天开始控制pH为7，搅拌转速40rpm，气体流量为500mL/min，培养3天后，补加含C6614的基础培养基，使培养体积扩大到20升。三天后细胞密度达到1.5-2×10⁶cells/mL，接种150L反应器，接种密度2～5×10⁵cells/mL，接种体积为80L，流加2％培养体积的浓缩302培养基(63.6g/L EX-cell 302培养基、20g/L大豆水解蛋白、5mg/L胰岛素)溶氧控制为40％饱和度，温度控制为36.5℃，pH控制为7，搅拌转速40rpm，气体流量为2000mL/min。细胞密度大于1.5×10⁶cells/mL，温度降到34℃，pH控制为6.9，以后每天流加2％培养体积浓缩302培养基(63.6g/L EX-cell 302培养基、20g/L大豆水解蛋白、5mg/L胰岛素)；根据每天生化分析仪测定结果，当葡萄糖浓度低于2g/L，补加到3g/L，当谷氨酰胺浓度低于2mmol/L，补加到3mmol/L；培养11天后结束培养，蛋白产量为320mg/L。

工艺的验证3

重复3批次工艺验证，方法如下：从工作细胞库复苏一支细胞，接种到T75方瓶中，培养体积10mL，5％C02，37℃培养两天后取样，细胞计数，然后移种到250mL摇瓶中，培养温度37℃，培养体积20mL，摇床转速为120rpm。3天后取样细胞计数，转入500mL摇瓶中，培养体积50mL。3天后取样细胞计数，培养体积扩大到200mL，分别转入2个500mL摇瓶。3天后取样计数，细胞分别转入2个1L摇瓶中，培养体积每瓶300mL，3天后，细胞密度达到2×106cells/mL，作为种子细胞。然后接种到5L NBS生物反应器中，培养基为含C6614的基础培养基，接种密度5×10⁵cells/mL，接种体积2L，溶氧控制为40，温度控制为37℃，搅拌速度为40rpm，pH控制为7，气体流量为100mL/min。流加培养基是63.6g/LEX-cell 302培养基，20g/L大豆水解蛋白，10mg/L胰岛素，恒温37℃培养，溶氧控制为40，转速为40rpm，pH前期控制为7.0，后期控制为6.9，每3天进行流加，第5天和第6天每天流加1.5％培养体积的流加试剂，之后每天流加1％培养体积的流加试剂，直到细胞培养结束，第5天开始培养温度降至34℃，当细胞活率下降到60％左右，培养温度降至33℃，pH控制为7.0，搅拌转速为40rpm，溶氧控制为40，培养周期为15天，根据每天生化分析仪测定结果，当葡萄糖浓度低于2g/L，补加到3g/L，当谷氨酰胺浓度低于2mmol/L，补加到3mmol/L，收获时细胞活率为50％左右，产量大于200mg/L。按照蛋白的质量标准对3批收获FP3蛋白进行测定，结果如表18所以，从结果中可以看出，该工艺条件成熟稳定，能够用于FP3蛋白药物的生产。

表18三批稳定性实验蛋白的检验结果

Claims (9)

1.一种适于CHO细胞悬浮无血清培养的培养基，其特征在于包含下列组分：

(1)21.4g/L C6614培养基

(2)0.05～6.0mM/L谷氨酰胺

(3)0.1～100mg/L胰岛素

(4)0.1～100mM/L柠檬酸铁

调节pH为6.9-7.4。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于含有下列组分：

(1)21.4g/LC6614培养基

(2)4～6mM/L谷氨酰胺

(3)5.0mg/L胰岛素

(4)1.5mM/L柠檬酸铁

调节pH为7.0。

3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于还含有脂类，其中所述脂类优选为lipid。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的培养基，其特征在于后期培养中所用的流加培养基为含有EX-cell 302的培养基。

5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于所述的流加培养基为浓缩的EX-cell 302培养基，其中含有63.6g/L 302培养基、2-100g/L大豆水解蛋白、5-10mg/L胰岛素。

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于所述的浓缩的EX-cell 302培养基的成分为63.6g/L 302培养基、20g/L大豆水解蛋白、5mg/L胰岛素。

7.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于由以下方法制备：C6614干粉与超纯水混合搅拌后，加入谷氨酰胺、柠檬酸铁水溶液，再加入碳酸氢钠调节pH值为6.9-7.4，60分钟后再加入胰岛素，补充超纯水，10分钟后取样测定生化参数，过滤除菌。

8.一种生产重组蛋白类药物的CHO细胞培养工艺，其特征在于：

(1)控制生物反应器的参数溶氧控制为40，温度控制为37℃，搅拌速度为40rpm，气体流量为100mL/min；

(2)采用权利要求1-3中任一培养基为基础培养基，浓缩EX-cell 302培养基为流加培养基；

(3)在培养后期采用流加和降温培养工艺并降低pH，将温度控制在33.0～36.5℃，控制pH在6.0～7.1；

(4)流加培养过程中，保持葡萄糖浓度为2～3g/L，谷氨酰胺浓度为2～3mM/L。

9.根据权利要求8所述的CHO细胞培养工艺，其特征在于：

(1)控制生物反应器的参数溶氧控制为40，温度控制为37℃，搅拌速度为40rpm，气体流量为100mL/min；

(2)采用权利要求2中的培养基为基础培养基，权利要求6中的浓缩EX-cell 302培养基为流加培养基；

(3)在培养后期采用流加和降温培养工艺并降低pH，将温度控制在34-36.5℃，控制pH在6.9-7.0；

(4)流加培养过程中，保持葡萄糖浓度为2～3g/L，谷氨酰胺浓度为2～3mM/L。