CN103484426B

CN103484426B - 一种无动物源的低蛋白培养基

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Publication number: CN103484426B
Application number: CN201310481858.XA
Authority: CN
Inventors: 刘吉; 孙丽霞; 李剑凤; 王桂江; 刘传磊; 张建军; 朱蕾
Original assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Qilu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2013-10-15
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2033-10-15
Also published as: CN103484426A

Abstract

本发明属于生物材料领域，具体提供一种新的支持CHO细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无动物源低蛋白培养基，充分利用现有技术中的成分代替动物来源的组分，最终获得的培养基无动物来源成分，能去除血清对生产过程的干扰，降低成本，实现CHO细胞高密度贴壁培养和单细胞悬浮培养，为生物制品的规模化生产提供方便。

Description

一种无动物源的低蛋白培养基

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种适于CHO细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无动物源的低蛋白培养基。

背景技术

以中国仓鼠卵巢(chinese hamster ovary，CHO)细胞为代表的真核表达系统是现代制药工业的重要组成部分，与其他表达系统相比，它具有许多优点:第一，具有高效的重组基因扩增和表达能力；第二，有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；第三，很少分泌自身的内源蛋白，具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；第四，CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长，也可以悬浮生长。即CHO细胞既可以贴壁生长在微载体介质表面，也可以悬浮生长在发酵罐中。微载体作为一种新兴的利用CHO细胞贴壁附着在微载体上进行细胞培养的技术，广泛地应用于组织工程中种子细胞的扩增（王常勇.采用微载体技术大规模培养组织工程种子细胞[J].生物医学工程与临床，2002，6(1)：51254.）；发酵罐或生物反应器等大规模悬浮培养CHO细胞的技术，以其易于扩大化等优势，也在工程细胞培养中得到了广泛应用。（陈志南，杨向民.基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术[J].中国医药生物技术，2009，4（5）：325－328.）两种培养方式均在重组药物的研究中占据重要的位置。从这个角度来讲，研发一种既满足CHO细胞不同生长方式，同时又适合其大规模高密度扩增的培养基具有重要的应用价值。

此外，传统的CHO细胞贴壁培养是在含8%～10%牛血清的培养基中扩增培养，血清虽然营养成分丰富，但是有很多不足的地方：第一，血清各批次间差异很大，其成分不能保持一致；第二，血清或血清来源的物质，如血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素或其他外源性物质中可能存在支原体或病毒等污染物，会对细胞产生毒害作用；第三，血清组分复杂，给产品纯化带来了巨大困扰，不利于产品质量的提升；第四，由于组分不明确，很难根据不同细胞株设计和优化能够支持其高密度培养和高水平表达的培养基。

综上可知，在CHO无血清培养基中摒弃动物来源成分，同时尽可能降低培养基中的蛋白质含量，无论从产品产量还是质量角度来讲都是开发CHO无血清培养基的主流方向。

关于无血清培养基的开发，已经有过许多尝试：

Gyun Min Lee等人（Gyun M L，Eun J K，No S K，et al.Development of aserum-free medium for the production of erythropoietin by suspension culture ofrecombinant Chinese hamster ovary cells using a statistical design[J].Journal ofBiotechnology，1999（69）：85-93.）开发了无血清培养基，以IMDM培养基为基础培养基，添加了2mg/LFe(NO₃)₃·9H₂O、0.0025mg/L CuCl₂、和1mg/LZnSO₄·7H₂O作为微量元素，同时添加了2.5-5mg/L胰岛素，10-20mg/L转铁蛋白等营养物质，用于表达EPO的CHO工程细胞的悬浮培养。

Chi Hsien Liu等人（Chi H L，I-Ming C，Shiaw M H，et al.Factorial designscombined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHOcells[J].Enzyme and Microbial Technology，2001，28：314-321.）开发了无血清培养基，以IMDM培养基为基础培养基，添加了1%SITE（硒，胰岛素，转铁蛋白，乙醇胺），0.3g/L酵母抽提物，0.09%亚麻油脂-牛血清白蛋白，用于CHO细胞的无血清悬浮培养，这些添加物能够很好的促进CHO细胞生长。

Chisa Hayashi等人（Chisa H，Kentaro S，Hideki Y，et al.Comparative Studyon Delivery of Phosphatidic Acid to Serum-Free Culture of Chinese HamsterOvary Cells[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2003,96（2）：196-198.）在CHO无血清悬浮培养中，以MEM作为基础培养基，添加2.2g/L碳酸氢盐，15mM羟乙基哌嗪乙磺酸，0.1g/L卡那霉素硫酸盐，10mg/L纤连蛋白，1mg/L吐温80，10mg/L磷脂酸（或10mg/L环糊精），发现吐温80和磷脂酸在该培养基促进CHO细胞的生长的作用较为显著，提示脂类是CHO细胞无血清生长的重要营养物质。

J.L.Moreira等人（J.L.Moreira，P.M.Alves，A.S.Feliciano，et al.Serum-free and serum-containing media for growth of suspended BHKaggregates in stirred vessels[J].Enzyme and Microbial Technology，1995，17：437-444.）以DMEM/F12（v/v，1:1）为基础培养基，并添加了10mg/L人胰岛素，5pg/L巯基乙醇，4mM谷氨酰胺，4g/L葡萄糖，1mg/L胆固醇，1mg/L谷胱甘肽，1g/L血清白蛋白等成分，开发出的无血清培养基，能很好的适用于BHK细胞（叙利亚仓鼠肾细胞）的培养，同时有效缓解了细胞结团现象。

Kiyoshi Ohnuma等人（Kiyoshi O，Yohei H，Miho F，et al.Serum-free cultureconditions for serial subculture of undifferentiated PC12cells[J].Journal ofNeuroscience Methods，2006，151：250-261.）用无血清培养基培养PC12细胞（大鼠嗜铬瘤细胞），以RPMI1640：DMEM(v/v，1：1)为基础培养基，同时添加30ug/ml胰岛素，3-30ug/ml转铁蛋白，2g/L碳酸氢盐，15mM羟乙基哌嗪乙磺酸，5mM L-谷氨酰胺，10nM亚硒酸钠，110mg/L丙酮酸钠，3.25g/L葡萄糖和100mg/L卡那霉素硫酸盐，发现该无血清培养基能够较含血清培养基更好的支持PC12细胞贴壁生长，且贴壁形态良好。

虽然以上列举的无血清培养基能够为动物细胞生长提供良好的营养条件，但是其中含有较多的动物来源蛋白质，使得产品质量和安全面临考验，同时也为纯化带来了困难。而商品化的Hyclone、Invitrogen无血清培养基虽然不含蛋白质，但是其价格昂贵，成分秘而不宣，为CHO细胞的大规模培养增加了巨大的成本。

申请号为200910053506.8的中国专利“适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基”公开了一种无动物来源低蛋白培养基，其可用于CHO细胞悬浮培养，最大活细胞密度达到3.75×10⁶cells/ml，但是未证明其能否适合CHO细胞贴壁培养，使该培养基在微载体培养技术方面的应用受到了限制。

因此，目前市场急需开发一种无动物来源成份、蛋白含量较低、适合CHO细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养并能高效扩增的培养基。

发明内容

针对现有技术存在的不足和空白，本发明的发明人提供一种新的支持CHO细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无动物源低蛋白培养基，其无动物来源成分，能去除血清对生产过程的干扰，降低成本，实现CHO细胞高密度贴壁培养和单细胞悬浮培养，为生物制品的规模化生产提供方便。。

本发明的具体技术方案是：

采用RPMI1640/F12（v/v，1:1）作为基础培养基，采用酵母抽提物和大豆水解物替代动物来源成分，特别是血清成分，采用金精三羧酸和硫酸锌代替胰岛素，采用柠檬酸铁代替转铁蛋白，并添加化学组分明确的脂类物质、微量元素、抗氧化剂、保护细胞免受流体剪切力损伤和抑制细胞结团的化合物、以及其他物质；

其中所述的脂类物质包括：磷脂酰胆碱、乙醇胺、吐温80；

所述的微量元素包括：硝酸铁、氯化铜、硫酸锌、亚硒酸钠；

所述的抗氧化剂为：β-巯基乙醇；

所述的保护细胞免受流体剪切力损伤和抑制细胞结团的化合物包括：嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-68)、硫酸葡聚糖；

所述的其他添加物为：L-谷氨酰胺；

其具体配比如下：

每升RPMI1640/F12（v/v，1:1）培养基中，各组分具体用量如下：

其中所述的RPMI1640/F12（v/v，1:1）培养基为将购买的液体RPMI1640培养基与液体F12培养基按体积比1:1混合，然后将各组分溶解于RPMI1640/F12（v/v，1:1）培养基中，定容至终体积1L，用0.22μm微孔膜滤器过滤除菌获得。

其中，金精三羧酸是一种是核酸酶和拓扑异构酶的抑制剂，具有抑制细胞凋亡的作用，同时它还可以通过增加酪氨酸和丝氨酸的磷酸化进而诱导细胞信号转导通路；硫酸锌能调节胰岛素和受体的水平，在维持受体磷酸化和去磷酸化水平及胰岛素信号转导过程中发挥重要的作用，同时硫酸锌作为一种微量元素，在葡萄糖转运方面也发挥重要作用；柠檬酸铁可作为替代的铁转运蛋白，与细胞膜上的铁转运蛋白受体结合，促进铁的穿膜传递、稳定培养基的活性、对细胞起机械保护作用。更重要的是，胰岛素和转铁蛋白中含有大量动物来源成份，为下游纯化带来了困扰，而金精三羧酸、硫酸锌和柠檬酸铁不含动物来源成份，可以作为胰岛素和转铁蛋白的良好替代品。

酵母抽提物和大豆水解物均含丰富的蛋白水解物，能够为细胞生长提供重要的氨基酸、短肽等营养物，促进细胞生长；乙醇胺和磷脂酰胆碱与磷脂的合成有关，后者在生物膜的构建与重塑过程中发挥作用；吐温80为非离子型表面活性剂，一方面促进培养基的溶解，一方面减小细胞受到的剪切力损伤；硝酸铁，氯化铜，亚硒酸钠等微量元素通过与蛋白质和其他有机基团结合，形成了酶、激素、维生素等生物大分子，发挥着重要的生理生化功能；β-巯基乙醇是一种抗氧化剂，为细胞提供还原环境，使细胞免受自由基和活性氧的损伤，同时也是部分酶的抑制剂和激素的激活剂；嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-68)是细胞生长中重要的脂类物质，也是良好的剪切力保护剂；硫酸葡聚糖既是一种剪切力保护剂，又可以减少细胞的聚集；L-谷氨酰胺可以为细胞提供必需的氮源，促进细胞内蛋白质合成以及细胞生长和分化。

其中在培养基的选择上，本发明选用了RPMI1640/F12（v/v，1:1）培养基，发明人发现该培养基与现在常用的DMEM/F12（v/v，1:1）培养基相比，与本发明的其他添加物的组合效果要好，故而首次采用了这种混合培养基。

而且本发明的发明人结合实验结果，最终在众多的添加物中选取了上述的物质，其组合效果最好，可以实现CHO细胞高密度贴壁培养和单细胞悬浮培养，为生物制品的规模化生产提供方便，较之现有的培养基有了长足的进步。

在上述配比的基础上，本发明的发明人进一步确定了较为优选的技术方案，其具体配比如下：

每升RPMI1640/F12培养基中，含有下述用量的组分：

在上述两个配比的基础上，本发明的发明人进一步确定了两个最优选的技术方案，其具体配比如下：

A：每升RPMI1640/F12（v/v，1:1）培养基中，各组分具体用量如下：

B：每升RPMI1640/F12（v/v，1:1）培养基中，各组分具体用量如下：

上述两个配比的技术方案能够更好地支持CHO细胞的生长，特别是当金精三羧酸浓度在8-60毫克/升范围内、柠檬酸铁浓度在40-70毫克/升范围内、硫酸锌浓度在0.9-1.2毫克/升范围内时，CHO细胞的营养消耗和供给可以得到更好的平衡，细胞可以获得较高的生长密度。

上述培养基的制备方法较为普通，将购买的液体RPMI1640培养基与液体F12培养基按体积比1:1混合，将各组分溶解于RPMI1640/F12（v/v，1:1）培养基中，定容至终体积1L，用0.22μm微孔膜滤器过滤除菌后即可获得；应用时，可直接按照普通含血清培养基的使用方法直接使用。

综上所述，本发明提供一种新的支持CHO细胞大规模贴壁培养和单细胞悬浮培养的无动物源低蛋白培养基，充分利用现有技术中的成分代替动物来源的组分，最终获得的培养基无动物来源成分，能去除血清对生产过程的干扰，降低成本，实现CHO细胞高密度贴壁培养和单细胞悬浮培养，为生物制品的规模化生产提供方便。

附图说明

图1倒置显微镜下观察的CHO细胞在实施例2制备的培养基中贴壁生长48小时后的细胞图；

图2CHO细胞在实施例2制备的培养基中贴壁生长的活细胞密度变化图；

图3CHO细胞在实施例3制备的培养基中贴壁生长的活细胞密度变化图；

图4倒置显微镜下观察的CHO细胞在实施例4制备的培养基中悬浮生长72小时后的细胞图；

图5CHO细胞在实施例4制备的培养基中悬浮生长的活细胞密度变化图；

图6CHO细胞在实施例5制备的培养基中悬浮生长的活细胞密度变化图。

具体实施方式

下面通过具体的制备实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例中所使用的培养基成分和CHO细胞均可市购获得：

CHO-K1细胞：购自美国ATCC；

RPMI1640培养基、F12培养基、嵌段式聚醚F68（Pluronic F-68）、L-谷氨酰胺：购自Gibco公司；

酵母抽提物、大豆水解物：购自BD公司；

金精三羧酸、硫酸锌、柠檬酸铁、乙醇胺、磷脂酰胆碱、吐温80、硝酸铁、氯化铜、亚硒酸钠、β-巯基乙醇、硫酸葡聚糖：购自sigma公司；

其余培养基成分均可市购获得。

Plackett-Burman试验的定义：

Plackett-Burman试验就是筛选试验设计，主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于响应变量的显著影响，采用的试验设计方法。方法主要通过对每个因子取两水平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性。筛选试验设计不能区分主效应与交互作用的影响，但对显著影响的因子可以确定出来，从而达到筛选的目的，避免在后期的优化试验中由于因子数太多或部分因子不显著而浪费试验资源。

响应面设计试验的定义：

是利用合理的试验设计方法并通过试验得到一定的数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。

实施例1

用Plackett-Burman试验法筛选影响CHO无血清培养基的主要因素及其使用浓度，实验方法如下：

将CHO细胞（CHO-K1）置于本发明所述的无血清培养基中进行单细胞悬浮培养：接种于美国Corning公司的125毫升摇瓶中，培养液体积为20毫升，接种密度为6×10⁵细胞/毫升，置二氧化碳培养箱中摇动培养，温度36.5℃，二氧化碳5vt%，转速150rpm。

CHO细胞悬浮培养无血清培养基的设计以RPMI1640/F12（v/v，1:1）为基础培养基，选用实验次数N=12的实验设计，对酵母提取物(X1)、金精三羧酸(X2)、柠檬酸铁(X3)、大豆提取物(X4)、磷脂酰胆碱(X5)、乙醇胺(X6)、吐温80(X7)、微量元素(X8)、β-巯基乙醇(X9)、嵌段式聚醚F-68(X10)、硫酸葡聚糖(X11)、L-谷氨酰胺（X12）共12个因子进行考察，每个因子分别取低和高2个水平，响应值为活细胞密度(Y)，平行实验3次，试验情况参见下述各表：

表1微量元素的成分及含量

表2Plackett-Burman设计实验

表3Plackett Burman设计实验结果

表4响应面设计实验

表5响应面设计实验结果

综上表1～5，通过多因素优化实验，可以得出各替代物及添加物的最佳浓度范围，根据实验结果进一步选取三个对细胞生长影响最显著的因素——酵母提取物、金精三羧酸和柠檬酸铁进行响应面设计实验，最终得到各替代物及添加物的浓度范围如下表6：

表6无血清培养基各组分及浓度

酵母提取物	500-5000毫克/升
		大豆提取物	500-10000毫克/升
金精三羧酸	5-100毫克/升
		柠檬酸铁	2-500毫克/升
磷脂酰胆碱	1-20毫克/升
		乙醇胺	1-30毫克/升
吐温80	0.5-10毫克/升
		硝酸铁	0.5-2毫克/升
氯化铜	0.001-0.02毫克/升
		硫酸锌	0.1-2毫克/升
亚硒酸钠	15-300毫克/升
		β-巯基乙醇	10-50uM
嵌段式聚醚F-68	100-3000毫克/升
		硫酸葡聚糖	30-100毫克/升
L-谷氨酰胺	292-1460毫克/升

实施例2

1.培养基配制：

一种适于CHO细胞大规模贴壁和单细胞悬浮培养的无血清培养基，以RPMI1640/F12（v/v，1:1）为基础的培养基中添加以下物质：

将购买的液体RPMI1640培养基与液体F12培养基按体积比1:1混合，将上述各组分溶解于RPMI1640/F12（v/v，1:1）培养基中，定容至终体积1L，用0.22μm微孔膜滤器过滤除菌。

2.细胞培养：

将CHO细胞（CHO-K1）置于本发明所述的无血清培养基中进行贴壁培养：接种于75平方厘米的方瓶中，培养液体积为8毫升，接种密度为2.5×10⁵cells/ml，置二氧化碳培养箱中静置培养，温度36.5℃，二氧化碳5vt%，在显微镜下观察，细胞贴壁和伸展状态良好（如图1所示）；细胞最高生长密度达到1.22×10⁶cells/ml（如图2所示）。

实施例3

1.培养基配制：

一种适于CHO细胞大规模贴壁和单细胞悬浮培养的无血清培养基，在以RPMI1640/F12（v/v，1:1）为基础培养基中添加以下物质：

将购买的液体RPMI1640培养基与液体F12培养基按体积比1:1混合，将上述各组分溶解于RPMI1640/F12（v/v，1:1）培养基中，定容至终体积1L，用0.22μm微孔膜滤器过滤除菌后即可。

2.细胞培养：

将CHO细胞（CHO-K1）置于本发明所述的无血清培养基中进行贴壁培养：接种于75平方厘米的方瓶中，培养液体积为8毫升，接种密度为2.5×10⁵cells/ml，置二氧化碳培养箱中静置培养，温度36.5℃，二氧化碳5vt%。细胞最高生长密度达到1.03×10⁶cells/ml（如图3所示）。

实施例4

1.培养基配制：

2.细胞培养：

将CHO细胞（CHO-K1）置于本发明所述的无血清培养基中进行单细胞悬浮培养：接种于美国Corning公司的125毫升摇瓶中，培养液体积为20毫升，接种密度为6×10⁵细胞/毫升，置二氧化碳培养箱中摇动培养，温度36.5℃，二氧化碳5vt%，转速150rpm，在显微镜下观察，细胞边缘清晰，形态饱满，大小均一，无结团现象，适应良好（如图4所示）。整个培养过程持续9天。培养第5天，CHO细胞在本发明无动物源低蛋白培养基中的活细胞密度达到5.4×10⁶cells/ml（如图5所示）。

实施例5

1.培养基配制：

2.细胞培养：

将CHO细胞（CHO-K1）置于本发明所述的无血清培养基中进行单细胞悬浮培养：接种于美国Corning公司的125毫升摇瓶中，培养液体积为20毫升，接种密度为6×10⁵细胞/毫升，置二氧化碳培养箱中摇动培养，温度36.5℃，二氧化碳5vt%，转速150rpm。整个培养过程持续9天。培养第5天，CHO细胞在本发明无动物源低蛋白培养基中的活细胞密度达到6.78×10⁶cells/ml（如图6所示）。该密度远高于专利申请号为200910053506.8的发明中CHO细胞所达到最高密度，是其最高密度3.75×10⁶cells/ml的1.8倍。

综合上述实施例2-5的内容可知，本发明所提供的培养基充分利用现有技术中的成分代替动物来源的组分，最终获得的培养基无动物来源成分，能去除血清对生产过程的干扰，降低成本，实现CHO细胞高密度贴壁培养和单细胞悬浮培养，为生物制品的规模化生产提供方便。

Claims

1.一种无动物源的培养基，以RPMI1640/F12，v/v为1:1作为基础培养基，其特征在于：培养基中含有如下物质：

酵母抽提物、大豆水解物、金精三羧酸、柠檬酸铁、脂类物质、微量元素、抗氧化剂、保护细胞免受流体剪切力损伤和抑制细胞结团的化合物、以及其他物质；其中，

所述的脂类物质包括：磷脂酰胆碱、乙醇胺和吐温80；

所述的微量元素包括：硝酸铁、氯化铜、硫酸锌和亚硒酸钠；

所述的抗氧化剂为：β-巯基乙醇；

所述的保护细胞免受流体剪切力损伤和抑制细胞结团的化合物包括：嵌段式聚醚F-68(Pluronic F-68)和硫酸葡聚糖；

所述的其他物质为：L-谷氨酰胺。

2.根据权利要求1所述的无动物源的培养基，其特征在于：每升RPMI1640/F12培养基中，含有下述用量的组分：

3.根据权利要求1所述的无动物源的培养基，其特征在于：每升RPMI1640/F12培养基中，含有下述用量的组分：

4.根据权利要求1或2或3所述的无动物源的培养基，其特征在于：每升RPMI1640/F12培养基中，含有下述用量的组分：

5.根据权利要求1或2或3所述的无动物源的培养基，其特征在于：每升RPMI1640/F12培养基中，含有下述用量的组分：