CN111849863B - 支持cho细胞高效生产单克隆抗体的培养基添加剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基添加剂，其由以下组分组成：苦瓜多肽、核桃油、大豆卵磷脂、脂溶性维生素、微量元素、氨基酸和水。本发明还提供了所述培养基添加剂的制备方法和用途。本发明的培养基添加剂原料来源简单，无动物来源成分，成本低，能够支持CHO细胞高密度生长，单克隆抗体高效表达，延长培养平台期，提高单克隆抗体产量。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基添加剂，以及该培养基添加剂的制备方法和应用。
背景技术
单克隆抗体药物特异性强、临床研究成功率高于小分子药物，临床需求量大，市场前景广阔，社会经济价值巨大，己经成为现代生物制药产业中发展最快的领域。由于抗体类药物用药量大、对生产工艺、设备、和产品质量要求高，需要很高生产技术平台，而抗体生产技术成为限制我国单克隆抗体产业发展的主要的瓶颈之一。已有单克隆抗体药物原研药被纳入国家医保，如西妥昔单抗，其价格已大幅降低，因此国内单抗仿制药更需要进一步控制成本。在CHO细胞悬浮培养生产单克隆抗体过程中，也存在诸多问题和瓶颈，最主要的是单抗产量的问题。如何提高CHO细胞生产单克隆抗体的产量，是亟待解决的问题。
CHO细胞作为表达抗体药物等外源蛋白的理想宿主，在生物制药产业中获得广泛应用。CHO细胞生长和抗体表达过程中需多达上百种的营养物质和成分，这些物质的物理化学性质如溶解性、稳定性等差异巨大，细胞的需求以及其对细胞生长和抗体表达的影响也各有差异。培养基成分中大部分为水溶性成分，但仍需部分脂溶性成分，两者不能互溶。即便是根据细胞代谢特征定制的培养基，也需要综合考虑溶解性、稳定性、保质期、制备工艺等问题，而不能完全包含所需成分。化学成分明确的培养基虽然具有多种优点，但也具有原料成本高，制备工艺复杂等限制，并且随着培养过程中细胞密度不断增大，也会逐渐表现出营养不均衡，导致细胞凋亡。
一些植物来源的多肽、油脂等，营养丰富，来源简单，成本低。苦瓜多肽是从苦瓜中提炼出来的多肽类生物活性成分，与胰岛素有相似的结构和理化指标，不仅具有胰岛素样作用，同时含有多种氨基酸、小分子化合物、维生素C、胰蛋白酶抑制剂等。核桃油含富含棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)等脂类成分，同时还含有脂溶性维生素、叶酸、硒元素、黄酮多酚等抗氧化物质。纳米乳液是油、水、乳化剂混合经高压均质所形成的均一乳液，粒径一般在200nm以下，具有动力学稳定性，保持活性、增加稳定性、改善溶解性、提高分散性和生物利用度等特点。纳米乳液能提高油溶活性物的水溶性。
发明内容
本发明的目的在于针对以上要解决的技术问题，提供一种能够实现CHO细胞的高密度生长、长时间高效表达单抗、支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基添加剂。
本发明的另一个目的是提供该培养基添加剂的制备方法。
本发明的又一个目的是提供该培养基添加剂的应用。
为实现上述目的，本发明提供了一种支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基添加剂，该培养基添加剂由以下组分组成：苦瓜多肽、核桃油、大豆卵磷脂、脂溶性维生素、微量元素、氨基酸和水。
优选地，每1千克该培养基添加剂由以下组分组成：15-40g苦瓜多肽、10-30g核桃油、30-50g大豆卵磷脂、160-420μg脂溶性维生素、50.1-150.36mg微量元素、3.25-7.75g氨基酸和余量的水。
优选地，所述脂溶性维生素为维生素E、维生素K或二者的混合物。更优选地，维生素E的含量为每1千克培养基添加剂含有100-300μg维生素E。维生素K的含量为每1千克培养基添加剂含有60-120μg维生素K。更优选地，
优选地，所述微量元素包括柠檬酸铁、五水硫酸铜、一水合硫酸锰或其混合物。更优选地，所述微量元素为柠檬酸铁、五水硫酸铜、一水合硫酸锰的混合物，每1千克培养基添加剂含有的微量元素为50-150mg柠檬酸铁、60-200μg五水硫酸铜和40-160μg一水合硫酸锰。
优选地，所述氨基酸包括L-精氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-缬氨酸或其混合物。更优选地，所述氨基酸为L-精氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-缬氨酸的混合物，每1千克培养基添加剂含有的氨基酸为0.8-1.5g L-精氨酸、200-600mg L-赖氨酸、150-400mg L-亮氨酸、2-5g L-谷氨酰胺和100-250mg L-缬氨酸的混合物。
作为一种优选的实施方案，所述单克隆抗体包括但不限于西妥昔单抗(Cetuximab)、地舒单抗(Denosumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿柏西普(Aflibercept)、雷珠单抗(Ranibizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、乌司奴单抗(Ustekinumab)、戈利木单抗(Golimumab)、依达赛珠单抗(Idarucizumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、依库珠单抗(Eculizumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、莫罗单抗(Muromomab)、达利珠单抗(daclizumab)、康柏西普(Conbercept)、抗人白介素-8单抗等。
另一方面，本发明还提供了所述培养基添加剂的制备方法，其包括以下步骤：将各组分混合，搅拌，均质处理得纳米乳液，即为所述培养基添加剂。
另一方面，本发明还提供了一种支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基，其含有根据本发明所述的培养基添加剂。
另一方面，本发明还提供了所述培养基添加剂用于促进CHO细胞生产单克隆抗体的用途。
另一方面，本发明还提供了一种促进CHO细胞生产单克隆抗体的方法，其中，在生产过程中，向CHO细胞培养基中添加稀释20倍的所述培养基添加剂。
优选地，所述培养基添加剂的添加量为基于细胞培养体积10-15g/L。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明的添加剂配方包括苦瓜多肽、核桃油、大豆卵磷脂、脂溶性维生素、微量元素类、氨基酸等，能够提供细胞培养后期细胞生长和抗体表达的多种营养物质和成分。原料来源简单，无动物来源成分，成本低，根据细胞培养中后期细胞代谢和抗体表达需求设计配方，成分配置合理，能支持CHO细胞高密度生长，单克隆抗体高效表达。在使用商品化的或定制培养基的同时添加该培养基添加剂，能支持CHO细胞在悬浮培养条件下快速生长并达到较高的培养密度，能够延长培养平台期，提高单克隆抗体产量。
2.通过将添加剂制备成纳米乳液，具有纳米乳液的性质，有效的解决了脂溶性物质的水溶性，将脂溶性成分和水溶性成分混合于稳定的体系中，各成分溶解性好，并且在流加过程中保持稳定，不易变质，可用于培养过程中长时间流加。
3.在CHO细胞培养生产单克隆抗体的过程中，在培养的后期，细胞密度高，抗体表达随之增加，培养基中的某些特定成分逐渐不足以维持细胞的活力和抗体的高效表达，特别是由于抗体的翻译后修饰增加，使得参与修饰的细胞器如内质网，高尔基体等压力增大，细胞需要合成大量膜结构扩大内质网和高尔基体膜面积来确保抗体的有效翻译后修饰，因此需要从培养基中摄取更多所需成分，否则，内质网压力会导致细胞快速凋亡。在原有单克隆抗体生产工艺的基础上，在培养后期通过流加方式补充本发明制备的添加剂，可使CHO细胞的培养密度得到大幅度提高，培养周期延长，抗体产量增加；
4.应用方法简便，可通过过滤除菌，可直接配合多种商业培养基和定制培养基使用，仅需单独补料即可，无需对原有工艺和设备进行改动，效果明显，成本低。
具体实施方式
下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
值得注意的是，出于简要清楚的目的，以下实施例中对一些常规的技术操作步骤、试剂、仪器并未进行细致的描述，但应理解，如未特别说明，这些常规技术操作步骤、试剂、仪器对本领域普通技术人员而言是显而易见的。
本发明实施例中的培养工艺依序由细胞复苏、摇瓶扩培和罐生产步骤组成，其中罐生产步骤在applikon 2L生物反应器中进行。所用高压均质机为IKA超高压均质机(HPH2000/4-SH5)。
以下实施例中，以西妥昔单抗、地舒单抗、利妥昔单抗为例，说明本发明的培养基添加剂的技术效果，但本发明的培养基添加剂的实际应用不限于此，也可应用于CHO细胞培养进行其他单克隆抗体的生产。所用西妥昔单抗生产细胞株和地舒单抗生产细胞株为本公司自主构建和筛选的CHO细胞株。其中西妥昔单抗中编码重链(γ1)和轻链(κ)的DNA序列来源于爱必妥(Erbitux)的蛋白序列，地舒单抗中编码重链(γ1)和轻链(κ)的DNA序列来源于商业地舒单抗的蛋白序列，利妥昔单抗中编码重链(γ1)和轻链(κ)的DNA序列来源于美罗华(Mabthera)的蛋白序列通过DNA合成得到基因序列，将基因序列克隆到表达载体上，通过共转染技术对CHO DHFR-细胞进行转染，得到的转染体经过含Hygromycin B和Geneticin的培养基的双重筛选，得到含有稳定重链和轻链基因的转染体。转染体用含不同MTX(甲氨蝶呤)浓度的MTX扩增培养基筛选高产细胞株。尽管具体的操作细节未详细描述，但该构建、筛选工艺为本领域技术人员所知晓并且可重现的。也可以使用通过商业渠道购买获得的生产单克隆抗体的CHO细胞株。
以下实施例中，苦瓜多肽购自西安超邦生物科技有限公司；核桃油购自菏泽中禾健元生物科技有限公司。细胞复苏和罐生产培养基为BalanCD CHO Growth A培养基，补料培养基为BalanCD CHO Feed 1培养基，均购至Irvine Scientific公司。
CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤
1、细胞复苏
取一支冻存细胞，37℃水浴解冻，加入到10ml BalanCD CHO growth A培养基混匀，1000rpm离心5分钟，移除上清，再加入10mL CHO growth A培养基混匀，移至250mL摇瓶，继续加培养基到工作体积40mL，放入37℃、5％CO2，130rpm转速下培养。
2、摇瓶扩培
培养2-3天后，取样计数，将细胞进行扩大培养，接种密度维持在4-6×105细胞/mL，扩培周期2-3天。
3、2L罐生产制备
罐生产在Applikon 2L生物反应器中进行，在摇瓶种子细胞体积达到200mL以后，转种到2L罐，工作体积设定在1.2L。控制条件如下：36±0.5℃、pH 6.95±0.05、250rpm、溶氧30％、顶部通气量(overlay)0.07vvm、底部通气量(sparge)0.01vvm。D3、D5、D7和D9分别补料5％、5％、5％和5％BalanCD CHO Feed 1培养基，同时添加葡萄糖(按罐工作体积计算，添加至8g/L)。培养至细胞密度降至60％以下。
细胞培养收获液中西妥昔单抗定量检测方法：参照《中华人民共和国药典》2015版三部0514分子色谱排阻色谱法。
实施例1
按表1中的配方配置水相和油相溶剂，水相占比96％，将水相和油相混合，1200rpm/min搅拌30min，进行高压均质处理，均质压力180mPa，均质时间，循环次数5次，得纳米乳液，平均粒径167nm，即为稳定的培养基添加剂，添加剂稀释20倍经过滤除菌后使用，按上述CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤生产西妥昔单抗，在细胞密度达到15×106细胞/mL后，每隔24h按15g/L进行流加，在80min内流加完毕。当细胞活率降至85％以下时停止流加。开始流加添加剂后，每天取样，进行细胞计数，细胞活率和西妥昔单抗含量。
实施例2
按表1中的配方配置水相和油相溶剂，水相占比94％，将水相和油相混合，1000rpm/min搅拌30min，进行高压均质处理，均质压力160mPa，均质时间，循环次数6次，得纳米乳液，平均粒径123nm，即为稳定的培养基添加剂，添加剂稀释20倍经过滤除菌后使用，按上述CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤生产西妥昔单抗，在细胞密度达到18×106细胞/mL后，每隔24h按12g/L进行流加，在100min内流加完毕。当细胞活率降至85％以下时停止流加。开始流加添加剂后，每天取样，进行细胞计数，细胞活率和西妥昔单抗含量。
实施例3
按表1中的配方配置水相和油相溶剂，水相占比92％，将水相和油相混合，800rpm/min搅拌30min，进行高压均质处理，均质压力140mPa，均质时间，循环次数8次，得纳米乳液，平均粒径141nm，即为稳定的培养基添加剂，添加剂稀释20倍经过滤除菌后使用，按上述CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤生产西妥昔单抗，在细胞密度达到18×106细胞/mL后，每隔24h按10g/L进行流加，在100min内流加完毕。当细胞活率降至85％以下时停止流加。开始流加添加剂后，每天取样，进行细胞计数，细胞活率和西妥昔单抗含量。
实施例4
按表1中的配方配置水相和油相溶剂，水相占比94％，将水相和油相混合，1000rpm/min搅拌30min，进行高压均质处理，均质压力160mPa，均质时间，循环次数6次，得纳米乳液，平均粒径123nm，即为稳定的培养基添加剂，添加剂稀释20倍经过滤除菌后使用，按上述CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤生产地舒单抗，在细胞密度达到18×106细胞/mL后，每隔24h按12g/L进行流加，在100min内流加完毕。当细胞活率降至85％以下时停止流加。开始流加添加剂后，每天取样，进行细胞计数，细胞活率和地舒单抗含量。
实施例5
按表1中的配方配置水相和油相溶剂，水相占比94％，将水相和油相混合，1000rpm/min搅拌30min，进行高压均质处理，均质压力160mPa，均质时间，循环次数6次，得纳米乳液，平均粒径123nm，即为稳定的培养基添加剂，添加剂稀释20倍经过滤除菌后使用，按上述CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤生产利妥昔单抗，在细胞密度达到18×106细胞/mL后，每隔24h按12g/L进行流加，在100min内流加完毕。当细胞活率降至85％以下时停止流加。开始流加添加剂后，每天取样，进行细胞计数，细胞活率和利妥昔单抗含量。
表1：实施例1-4中的培养基添加剂配方
对比例1
按表2中的配方配置水相和油相溶剂，水相占比85％，将水相和油相混合，1000rpm/min搅拌30min，进行高压均质处理，均质压力160mPa，均质时间，循环次数6次，得纳米乳液，平均粒径239nm，即为稳定的培养基添加剂，添加剂稀释20倍经过滤除菌后使用，CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤生产西妥昔单抗，在细胞密度达到18×106细胞/mL后，每隔24h按10g/L进行流加，在100min内流加完毕。当细胞活率降至85％以下时停止流加。开始流加添加剂后，每天取样，进行细胞计数，细胞活率和西妥昔单抗含量。
对比例2
按表2中的配方配置水相和油相溶剂，水相占比94％，将水相和油相混合，1000rpm/min搅拌30min，进行高压均质处理，均质压力160mPa，均质时间，循环次数6次，得纳米乳液，平均粒径123nm，即为稳定的培养基添加剂，添加剂稀释20倍经过滤除菌后使用，按上述CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤生产西妥昔单抗，在细胞密度达到18×106细胞/mL后，每隔24h按3g/L进行流加，在100min内流加完毕。当细胞活率降至85％以下时停止流加。开始流加添加剂后，每天取样，进行细胞计数，细胞活率和西妥昔单抗含量。
对比例3
按表2中的配方配置水相和油相溶剂，水相占比94％，将水相和油相混合，1000rpm/min搅拌30min，进行高压均质处理，均质压力160mPa，均质时间，循环次数6次，得纳米乳液，平均粒径123nm，即为稳定的培养基添加剂，添加剂稀释20倍经过滤除菌后使用，按上述CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤生产西妥昔单抗，在细胞密度达到18×106细胞/mL后，每隔24h按12g/L进行流加，在100min内流加完毕。当细胞活率降至85％以下时停止流加。开始流加添加剂后，每天取样，进行细胞计数，细胞活率和西妥昔单抗含量。
对比例4
按表2中的配方配置水相和油相溶剂，水相占比98.5％，将水相和油相混合，1000rpm/min搅拌30min，进行高压均质处理，均质压力160mPa，均质时间，循环次数6次，得纳米乳液，平均粒径227nm，即为稳定的培养基添加剂，添加剂稀释20倍经过滤除菌后使用，按上述CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤生产西妥昔单抗，在细胞密度达到18×106细胞/mL后，每隔24h按3g/L进行流加，在100min内流加完毕。当细胞活率降至85％以下时停止流加。开始流加添加剂后，每天取样，进行细胞计数，细胞活率和西妥昔单抗含量。
对比例5
不使用该添加剂，以生产西妥昔单抗的CHO细胞株，按实施例1-4和对比例1-4中CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤进行培养。
对比例6
不使用该添加剂，以生产地舒单抗的CHO细胞株，按实施例1-4和对比例1-4中CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤进行培养。
对比例7
不使用该添加剂，以生产利妥昔单抗的CHO细胞株，按实施例1-4和对比例1-4中CHO细胞培养生产单克隆抗体工艺和步骤进行培养。
表2：对比例1-4中培养基配方
表3：实施例1-4CHO细胞生产西妥昔单抗过程中对大细胞密度、培养周期和抗体产量(Titer)
表4：对比例1-7中CHO细胞生产西妥昔单抗过程中对大细胞密度、培养周期和抗体产量(Titer)
Claims (4)
1.一种支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基添加剂，其特征在于，每1千克所述培养基添加剂由以下组分组成：15-40g苦瓜多肽、10-30g核桃油、30-50g大豆卵磷脂、160-420μg脂溶性维生素、50.1-150.36mg微量元素、3.25-7.75g氨基酸和余量的水；
所述脂溶性维生素为维生素E、维生素K或二者的混合物；每1千克培养基添加剂含有的脂溶性维生素为100-300μg维生素E和60-120μg维生素K的混合物；
所述微量元素包括柠檬酸铁、五水硫酸铜、一水合硫酸锰或其混合物；每1千克培养基添加剂含有的微量元素为50-150mg柠檬酸铁、60-200μg五水硫酸铜和40-160μg一水合硫酸锰的混合物；
所述氨基酸包括L-精氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-缬氨酸或其混合物；每1千克培养基添加剂含有的氨基酸为0.8-1.5g L-精氨酸、200-600mg L-赖氨酸、150-400mgL-亮氨酸、2-5g L-谷氨酰胺和100-250mg L-缬氨酸的混合物。
2.根据权利要求1所述的培养基添加剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将各组分混合，搅拌，均质处理得纳米乳液，即为所述培养基添加剂。
3.一种支持CHO细胞高效生产单克隆抗体的培养基，其特征在于含有根据权利要求1或2所述的培养基添加剂。
4.根据权利要求1所述的所述培养基添加剂用于促进CHO细胞生产单克隆抗体的用途。
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