CN104560882B - 一种降低酸性变体含量的cho细胞培养工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养领域，公开了一种能降低酸性变体含量的CHO细胞培养工艺。本发明通过CHO细胞工艺培养过程中使用不同的基础培养基和浓缩培养基进行添加，能提高重组蛋白表达量的同时降低酸性峰水平，从而提高品质，适于抗体药物的大规模生产和商业应用，具有较好的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基于CHO表达系统的细胞培养工艺。
背景技术
目前，哺乳动物表达系统是实现重组蛋白异源表达最好的系统，最具代表性的是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，其主要有以下优势：能悬浮培养，操作简单，易于放大；具有高效表达能力，且所分泌的蛋白具有正确的翻译后修饰功能；只分泌自身蛋白，有利于产物的纯化。大规模动物细胞悬浮培养作为商业化生产重组蛋白等需要糖基化修饰、结构复杂的蛋白质的重要手段，已成为生物制药的核心技术之一。
抗体在生产或者贮存过程中，由于受到复杂的培养环境的影响，诸如转录修饰或者自发性降解，常常会引起抗体表面电荷不同而产生电荷异质性，比如谷胱甘肽化、脱酰胺作用和唾液酸化作用会产生酸性变体，琥珀酰亚胺、酰胺化和C端赖氨酸修饰会产生碱性变体，这些变体不仅影响抗体的活性，而且影响其有效期。而细胞培养工艺作为抗体生产过程中的重要环节，对最终抗体质量影响十分显著。由于哺乳动物细胞培养对于培养环境的要求非常苛刻，同时对表达抗体的质量要求极其严格，因此如何通过工艺条件优化达到产品的质量要求显得尤为关键。如何能提高抗体表达量同时又能降低酸性变体含量的方法是本领域一直难于解决的问题之一。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种能降低酸性变体含量的CHO细胞培养工艺，特别涉及一种重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基于CHO表达系统的细胞培养工艺。
为了实现上述目的，本发明通过对基础培养基和浓缩培养基的选择，以及其添加时间的控制，有效降低了酸性变体蛋白的含量。
具体的，本发明提供了一种重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基于CHO表达系统的细胞培养工艺，包括如下步骤：
(1)添加基础培养基总体积40％-60％的于基础培养基于培养反应器中，保持培养温度为33-37℃；
(2)在培养的第1天和第2天分别补加基础培养基总体积20％-30％；
(3)在培养的第3天加入当天培养体积7.5％-12.5％的CHO CD Efficient FeedTMA和CHO CD Efficient FeedTM B的混合物；
(4)第5天加入当天培养体积10-15％的CHO CD Efficient FeedTM A、CHO CDEfficient FeedTM B和CHO CD Efficient FeedTM C的混合物；
(5)在培养的第7天加入当天培养体积2-4.5％的Acti CHO Feed A和当天培养体积0.2-0.45％的Acti CHO Feed B；
(6)在培养的第9天加入当天培养体积1.5-4％的Acti CHO Feed A和当天培养体积0.15-0.4％的Acti CHO Feed B；
(7)在培养的第11天收获目的蛋白。
优选地，本发明的细胞培养工艺，是基于重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的CHO表达系统。
在一些实施方案中，步骤(1)和步骤(2)中基础培养基可为CD FortiCHO、TFS-RDMP-1、TFS-RDMP-9或Hycell CHO。CD FortiCHO、TFS-RDMP-1、TFS-RDMP-9或Hycell CHO均为商业优化过的基础培养基。
在另一些实施方案中，步骤(1)中基础培养基为CD FortiCHO。
在一些实施方案中，步骤(2)中第1天和第2天分别补加的基础培养基为HycellCHO。
在一些实施方案中，步骤(3)中CHO CD Efficient FeedTM A和CHO CD EfficientFeedTM B的体积比为1:1。
在一些实施方案中，步骤(4)中CHO CD Efficient FeedTM A、CHO CD EfficientFeedTM B和CHO CD Efficient FeedTM C的体积比为1:1:1。
另一些实施方案中，细胞培养工艺如下包括步骤：
(1)添加基础培养基总体积的50％于培养反应器中，保持培养温度为33-37℃；
(2)在培养的第1天和第2天分别补加基础培养基总体积的25％；
(3)在培养的第3天加入当天培养体积10％的CHO CD Efficient FeedTM A和CHOCD Efficient FeedTM B的混合物；
(4)第5天加入当天培养体积12.5％的CHO CD Efficient FeedTM A、CHO CDEfficient FeedTM B和CHO CD Efficient FeedTM C的混合物；
(5)在培养的第7天加入当天培养体积3％的Acti CHO Feed A和当天培养体积0.3％的Acti CHO Feed B；
(6)在培养的第9天加入当天培养体积2％的Acti CHO Feed A和当天培养体积0.2％的Acti CHO Feed B；
(7)在培养的第11天收获目的蛋白。
本发明中涉及到的加入培养基的时间不限定于某一特定时间，只需要在本发明具体实施例中要求的当天加入即可，培养基加入的速度也无特殊要求。
本发明合适的发酵培养温度为33-37℃，在此区间内，可以一直此其区间内恒温培养，也可以对中间步骤进行变温培养，如在培养的第3天或第5天或第7天将培养温度由37℃转入33℃也是可行的。
基础培养基指为生长的哺乳动物细胞提供营养的含有营养物的溶液。通常，此类溶液提供细胞的基本生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂类和微量元素。本发明中涉及的基础培养基CD FortiCHO、TFS-RDMP-1、TFS-RDMP-9和Hycell CHO，其中CD FortiCHO购自Gibco，其他的三种基础培养基购自Hyclone。
浓缩培养基指在细胞培养开始后加入的溶液，其含有为哺乳动物细胞生长和表达提供营养的营养物，与基础培养基比含有更高浓度的营养物。本发明中涉及的浓缩培养基CHO CD Efficient FeedTM A、CHO CD Efficient FeedTM B、CHO CD Efficient FeedTM C、Acti CHO Feed A和Acti CHO Feed B，前三种购自Gibco，后两种购自GE Healthcare。
本发明提供的培养工艺，其有益效果在于，建立了一种简单的、易于操作的涉及重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白基于CHO表达系统的细胞培养工艺，既能提高抗体表达量，同时与现有上市药物标准品相比降低酸性变体含量2％以上，提高了药物的品质。
附图说明
图1实施例1中的细胞株A补料批次实验的抗体表达量图；
图2实施例1中的细胞株A补料批次实验的酸性峰比例图；
图3实施例2中的细胞株B补料批次实验的抗体表达量图；
图4实施例2中的细胞株B补料批次实验的酸性峰比例图；
具体实施方式
以下实施例中的细胞株A和细胞株B是指中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，购自invitrogen公司，重组人肿瘤坏死因子受体-Fc重组蛋白(rhTNFR-Fc)抗体的细胞株为自主构建。
实施例1
1、细胞株A进行重组人肿瘤坏死因子受体-Fc重组蛋白(rhTNFR-Fc)抗体的表达培养
表一、表二、图1和图2中的Cell line A-CD FortiCHO、Cell line A-TFS-RDMP-1、Cell line A-TFS-RDMP-9和Cell line A-Hycell CHO指以基础培养基总体积50％的CDFortiCHO基础培养基进行接种，在培养的第1天和第2天分别补加基础培养基总体积25％的CD FortiCHO基础培养基或者TFS-RDMP-1基础培养基或者TFS-RDMP-9基础培养基或者Hycell CHO基础培养基。
2、浓缩培养基补料批次实验方法的优化和筛选
浓缩培养基补料批次实验方法：在培养的第3天加入10％的CHO CD EfficientFeedTM A和CHO CD Efficient FeedTM B的混合物(两者的体积比为1:1)，第5天加入12.5％的CHO CD Efficient FeedTM A、CHO CD Efficient FeedTM B和CHO CD Efficient FeedTMC的混合物(三者的体积比为1:1:1)，第7天加入3％Acti CHO Feed A和0.3％Acti CHOFeed B，第9天加入2％Acti CHO Feed A和0.2％Acti CHO Feed B。
在补料批次实验中，细胞以5×105cells/mL进行接种，在37℃培养的第5天转入33℃进行培养。在培养的第3、5、7、9、11天检测细胞密度、活力和代谢参数。根据生化分析仪检测的结果控制8-10g/L的葡萄糖，4-10mM的谷氨酸单钠盐，在细胞培养的第11天进行收获。收取上清后，用高效液相色谱(HPLC)的方法，通过Protein A柱检测目的蛋白rhTNFR-Fc的含量。细胞株A补料批次实验的细胞活率、活细胞密度、抗体表达量、酸性峰比例分别依次见表一、表二、图1和图2。
表一：细胞株A补料批次实验的细胞活率
表二：细胞株A补料批次实验的活细胞密度
细胞株A在不同补料批次实验中的细胞活率和活细胞密度如表一、二所示，使用上述基础培养基，其在培养的第11天都能维持90％以上的细胞活率，但当在培养的第1天和第2天补加不同的基础培养基后，蛋白表达量增加了，酸性峰比例降低了，其中表达量最高和酸性峰比例最低的是补加Hycell CHO的实验组，表达量由原来的1.5g/L上升至2.5g/L，酸性峰由原来的16％下降至11％，比现有标准品酸性峰比例低了约3％(图1和图2所示)，而酸性峰在此种单抗药物中的比例要低于15％，说明在培养的第0天以基础培养基总体积50％的CD FortiCHO基础培养基进行接种，在培养的第1天和第2天分别补加基础培养基总体积25％的Hycell CHO基础培养基，不仅提高了蛋白表达，同时也降低了酸性峰水平，提高了蛋白质量。
实施例2
1、细胞株B进行重组人肿瘤坏死因子受体-Fc重组蛋白(rhTNFR-Fc)抗体的表达培养
表三、表四、图3和图4中的Cell line B-CD FortiCHO、Cell line B-TFS-RDMP-1、Cell line B-TFS-RDMP-9和Cell line B-Hycell CHO指以基础培养基总体积50％的CDFortiCHO基础培养基进行接种，在培养的第1天和第2天分别补加基础培养基总体积25％的CD FortiCHO基础培养基或者TFS-RDMP-1基础培养基或者TFS-RDMP-9基础培养基或者Hycell CHO基础培养基。
按照实施例1的方法，利用细胞株B进行表达重组人肿瘤坏死因子受体-Fc重组蛋白(rhTNFR-Fc)抗体的表达。
细胞株B在不同基础培养基补料方法中的细胞活率和活细胞密度如表3和4所示，其中不同基础培养基补料方法对细胞活率没有明显影响，细胞活率都能维持90％以上，当在培养的第2天补加不同的基础培养基后，细胞密度和抗体表达量增加，最好的工艺是在培养的第0天以50％体积的CD FortiCHO基础培养基进行接种，在培养的第2天和第3天分别补加25％(初始培养体积)的Hycell CHO基础培养基，细胞密度由原来的2.2×106cells/mL增加到3.4×106cells/mL(如表4所示)，表达量由原来的1.7g/L增加到2.4g/L(如图3所示)，酸性峰由原来的15％降低至13％(如图4所示)，酸性峰比例符合标准品水平。
表三：细胞株B补料批次实验的细胞活率
表四：细胞株B补料批次实验的活细胞密度
Claims (6)
1.一种CHO表达系统的细胞培养工艺，包括如下步骤：
(1)添加基础培养基总体积的40％-60％的基础培养基于培养反应器中，进行接种；
(2)在培养的第1天和第2天分别补加基础培养基总体积20％-30％的基础培养基；
(3)在培养的第3天加入当天培养体积7.5％-12.5％的CHO CD Efficient FeedTM A和CHO CD Efficient FeedTM B的混合物；
(4)第5天加入当天培养体积10-15％的CHO CD Efficient FeedTM A、CHO CDEfficient FeedTM B和CHO CD Efficient FeedTM C的混合物；
(5)在培养的第7天加入当天培养体积2-4.5％的Acti CHO Feed A和当天培养体积0.2-0.45％的Acti CHO Feed B；
(6)在培养的第9天加入当天培养体积1.5-4％的Acti CHO Feed A和当天培养体积0.15-0.4％的Acti CHO Feed B；
(7)在培养的第11天收获目的蛋白；
其中，所述CHO表达系统为基于重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的CHO表达系统；
步骤(1)所述基础培养基为CD FortiCHO，步骤(2)所述补加的基础培养基选自TFS-RDMP-9或者Hycell CHO。
2.根据权利要求1所述的培养工艺，其特征在于，步骤(2)中第1天和第2天分别补加的基础培养基为Hycell CHO。
3.根据权利要求1所述的培养工艺，其特征在于，步骤(3)中CHO CD Efficient FeedTMA和CHO CD Efficient FeedTM B的体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的培养工艺，其特征在于，步骤(4)中CHO CD Efficient FeedTMA、CHO CD Efficient FeedTM B和CHO CD Efficient FeedTM C的体积比为1:1:1。
5.根据权利要求1所述的培养工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)添加基础培养基总体积的50％的基础培养基于培养反应器中，进行接种；
(2)在培养的第1天和第2天分别补加基础培养基总体积的25％的基础培养基；
(3)在培养的第3天加入当天培养体积10％的CHO CD Efficient FeedTM A和CHO CDEfficient FeedTM B的混合物；
(4)第5天加入当天培养体积12.5％的CHO CD Efficient FeedTM A、CHO CD EfficientFeedTM B和CHO CD Efficient FeedTM C的混合物；
(5)在培养的第7天加入当天培养体积3％的Acti CHO Feed A和当天培养体积0.3％的Acti CHO Feed B；
(6)在培养的第9天加入当天培养体积2％的Acti CHO Feed A和当天培养体积0.2％的Acti CHO Feed B；
(7)在培养的第11天收获目的蛋白。
6.根据权利要求1所述的培养工艺，其特征在于，在37℃培养的第5天转入33℃进行培养。
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