CN107760651A - 一种细胞培养基及生产蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药领域，提供了一种细胞培养基和利用该培养基培养细胞生产蛋白质的方法。本发明的细胞培养基是在化学成分限定的培养基基础上，进行了氨基酸优化，从而提高了细胞的蛋白表达能力。本发明的方法工艺控制简单，有利于大规模扩大生产。

Description

一种细胞培养基及生产蛋白质的方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种通过细胞培养生产蛋白质的方法。
背景技术
西妥昔单抗(cetuximab，商品名为爱必妥)是由ImClone Systems公司开发的一种抗EGFR人鼠嵌合型单克隆抗体，用于治疗EGFR高表达的转移性结直肠癌及头颈部癌症。表达西妥昔单抗的宿主细胞为鼠源骨髓瘤细胞SP2/0。SP2/0细胞表达的蛋白除了非人源NGNA(N-glycolylneuraminic acid，N-羟乙酰基神经氨酸)修饰外，还有少量的鼠源α-(1,3)半乳糖残基，其能触发机体严重的免疫反应。西妥昔单抗就因含鼠源“α-(1,3)半乳糖残基”结构而造成临床上出现过敏性休克等严重不良事件，该不良反应一定程度上限制了其使用。
目前，70％以上的抗体蛋白都是由CHO细胞生产的。对比其他哺乳动物细胞，CHO细胞的优点主要包括：①CHO细胞表达的蛋白糖基化修饰结构与人类基本一致，CHO细胞缺乏有活力的α-(1,3)半乳糖残基转移酶，因此其表达的重组蛋白末端不会有α-(1,3)半乳糖残基修饰；②CHO细胞能够在生物反应器培养的过程中获得较高的细胞密度；③CHO细胞相比其他生产用哺乳动物细胞基因组更容易进行改造和扩增；④易适应于无血清悬浮培养条件，工艺易放大。
CN 102994442A公开了一种悬浮培养CHO细胞生产重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的方法，其中培养CHO细胞的培养基含水解物成分，水解物具有促进细胞生长与重组蛋白表达的功能。但是水解物成分复杂，批间一致性难以控制，因此对产品质量的批间稳定性具有潜在风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种培养CHO细胞以生产蛋白质的方法，在化学成分限定的培养基基础上，对细胞培养基进行氨基酸优化，从而提高细胞的蛋白表达能力，解决现有技术中存在的蛋白生产的问题。
在第一个方面，本发明提供一种细胞培养基，包括基础培养基和补料培养基，其中，所述补料培养基包括40-80g/L的CD EfficientFeed C AGT、20-70g/L的Cell Boost 5、0.1-0.8g/L的谷氨酸、0.5-1.2g/L的酪氨酸、0.2-1.0g/L的半胱氨酸、0-0.8g/L的色氨酸、0.1-0.3g/L的苏氨酸、0-0.4g/L的苯丙氨酸和1-2g/L的PF68。
其中，上述基础培养基可以是任何用于细胞生长阶段的培养基。优选的为哺乳动物细胞培养用基础培养基，更优选的为CHO细胞培养用基础培养基。
优选地，所述补料培养基包括56-80g/L的CD EfficientFeed C AGT、更优选56g/L的CD EfficientFeed C AGT，20-70g/L的Cell Boost 5、更优选21g/L的Cell Boost 5，0.19-0.58g/L的谷氨酸、更优选0.58g/L的谷氨酸，0.5-1.02g/L的酪氨酸、更优选1.02g/L的酪氨酸，0.43-0.85g/L的半胱氨酸、更优选0.85g/L的半胱氨酸，0-0.8g/L的色氨酸、更优选0.4g/L的色氨酸，0.12-0.3g/L的苏氨酸、更优选0.12g/L的苏氨酸，0-0.35g/L的苯丙氨酸、更优选0.17g/L的苯丙氨酸，和1-2g/L的PF68、更优选1.5g/L的PF68。
进一步优选地，所述补料培养基包括56g/L的CD EfficientFeed C AGT、21g/L的Cell Boost 5、0.58g/L的谷氨酸、1.02g/L的酪氨酸、0.85g/L的半胱氨酸、0.4g/L的色氨酸、0.12g/L的苏氨酸、0.17g/L的苯丙氨酸和1.5g/L的PF68。
进一步优选地，所述补料培养基还包括pH调节剂，所述补料培养基的pH值为6.9-7.2。
优选地，所述基础培养基包括5-20g/L的CD FortiCHO AGT，进一步优选为12.5g/L的CD FortiCHO AGT，和5-15g/L的Ex-Cell 302，进一步优选为10.8g/L的Ex-Cell 302。进一步优选地，所述基础培养基还包括pH调节剂，所述基础培养基的pH值为6.9-7.2。
优选地，所述基础培养基包括5-20g/L的Dynamis AGT，进一步优选为12.5g/L的Dynamis AGT，和5-15g/L的Ex-Cell 302，进一步优选为10.8g/L的Ex-Cell 302。进一步优选地，所述基础培养基还包括pH调节剂，所述基础培养基的pH值为6.9-7.2。
进一步优选地，所述基础培养基包括12.5g/L的CD FortiCHO AGT或Dynamis AGT，和10.8g/L的Ex-Cell 302。
在一种优选的实施方式中，所述细胞培养基包括基础培养基和补料培养基，其中，所述基础培养基包括12.5g/L的CD FortiCHO AGT或Dynamis AGT，和10.8g/L的Ex-Cell302；所述补料培养基包括56g/L的CD EfficientFeed C AGT、21g/L的Cell Boost 5、0.58g/L的谷氨酸、1.02g/L的酪氨酸、0.85g/L的半胱氨酸、0.4g/L的色氨酸、0.12g/L的苏氨酸、0.17g/L的苯丙氨酸和1.5g/L的PF68；所述基础培养基和补料培养基的pH值均为6.9-7.2。
本发明的细胞培养基中，所述基础培养基用于细胞生长阶段；和/或所述补料培养基用于细胞生产蛋白阶段。优选地，细胞培养过程中，细胞密度达到5-8×106细胞/ml时，细胞培养进入细胞生产蛋白阶段。
优选地，所述细胞培养基用于培养动物细胞；更优选地，所述细胞培养基用于培养CHO细胞；本发明同时提供利用上述培养基培养动物细胞的方法，尤其是用于培养CHO细胞的方法。
在第二个方面，本发明提供一种培养细胞生产蛋白质的方法，包括用本发明上述的细胞培养基培养细胞，其中，所述基础培养基用于细胞生长阶段，和/或所述补料培养基用于细胞生产蛋白质阶段。
优选地，细胞培养过程中，细胞密度达到5-8×106细胞/ml时，细胞培养进入细胞生产蛋白质阶段。
在一种实施方式中，所述方法包括步骤：
(1)细胞生长阶段：用基础培养基悬浮培养细胞，起始接种密度为0.5-1×106细胞/ml，培养温度为35℃以上，优选为36-37℃；
(2)细胞生产蛋白阶段：当细胞密度生长到5-8×106细胞/ml时，进入细胞生产蛋白质阶段，降低培养温度至31-35℃，优选为33℃，流加补料培养基促进细胞表达蛋白质，每天加入量为培养物体积的2-5％；此时细胞由对数生长期进入平台期并维持7-11天，其产物浓度逐渐提高；
(3)当细胞活率在60-80％时，停止流加补料培养基，结束培养；
其中，所述基础培养基和补料培养基如上文所述。
优选地，所述蛋白质为重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体；所述细胞为表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞；更优选的所述单克隆抗体为西妥昔单抗。
优选地，步骤(1)中，悬浮培养细胞采用一次性搅拌式生物反应器悬浮培养；进一步优选地，所述一次性搅拌式生物反应器主要由控制塔、罐体和一次性塑料培养袋组成，规模为50-500L，优选为200L。
优选地，步骤(1)中，转速为60-200rpm，pH维持在6.8-7.2；和/或步骤(2)中，转速为60-200rpm，pH维持在6.8-7.2。
优选地，步骤(1)中，控制葡萄糖浓度为1-3g/L；步骤(2)中，控制葡萄糖浓度为3-6g/L。
进一步地，本发明提供一种通过以下步骤制备用于步骤(1)的细胞的优选方法：
a.在含有基础培养基(30mL)的摇瓶中复苏细胞，悬浮培养，接种密度维持在0.3-0.5×106细胞/ml，细胞活率维持在85％以上；
b.在摇床中振荡培养2-3天后，以0.3-0.5×106细胞/ml的密度将细胞接入含基础培养基的1L摇瓶中培养，依此扩大培养至2L反应器；
c.在2L反应器中培养2-3天后，细胞密度达到3-4×106细胞/ml；将细胞培养液从2L反应器转入15L反应器中，补加基础培养基至细胞密度在0.5-0.7×106细胞/ml；
d.在15L反应器中培养细胞至密度为3-4×106细胞/ml时，将细胞培养液转入200L一次性搅拌式生物反应器，补加新鲜基础培养基将细胞密度调至0.5-0.7×106细胞/ml。
进一步优选地，在步骤a和b的培养阶段中，转速为80-120rpm，培养温度36-37℃，5％的CO2饱和度，80％空气湿度；在步骤c和d的2L和15L反应器培养阶段，温度为36-37℃，转速为120-150rpm，pH6.8-7.2，30％的溶氧饱和度。
本发明的有益效果在于：
(1)对细胞培养基特别是补料培养基进行了优化，从而提高了细胞的蛋白表达能力；
(2)细胞培养基均为化学限定培养基，所有原材料都是非动物来源，不含水解物，在生产蛋白中更加容易进行品质管理；
(3)对生产蛋白的方法进行了优化，特别是对温度等参数进行了优化；采用优化后的方法生产蛋白，产量显著提高；
(4)采用优化后的方法和培养基生产的蛋白，小规模和大规模培养的产品一致性好，有利于大规模扩大生产。
附图说明
图1、实施例9的200L反应器培养生产重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞的细胞密度和活率变化曲线；
图2、实施例9的200L反应器培养生产重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞的产量变化曲线；
图3、实施例9的200L培养获得产物的检测结果，聚体0.62％，主峰99.38％；
图4、实施例8的2L培养获得的产物检测结果，聚体0.86％，主峰99.14％；
图5、使用优化前后的补料培养基流加培养细胞的生长曲线；
图6、使用优化前后的补料培养基流加培养细胞的细胞活率曲线；
图7、不同培养温度条件下的细胞生长曲线；
图8、不同培养温度条件下的细胞活率曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但不限制本发明的范围。
以下实施例和实验例中，如无具体说明，使用的试剂、仪器均为本领域常规试剂、仪器，可从普通商购途径获得；使用的方法为本领域常规方法，本领域技术人员根据常识可以毫无疑义地确定如何实现所述方法并获得相应的结果。
本发明中蛋白质可以为抗体，如任意靶点的抗体；优选地，为抗EGFR的抗体。进一步优选地，所述抗体为西妥昔单抗(cetuximab，商品名为爱必妥)，可选的其氨基酸序列如下：
轻链氨基酸序列：
MVSTPQFLVFLLFWIPASRSDILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
重链氨基酸序列：
MAVLGLLFCLVTFPSCVLSQVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
本申请人通过合成上述重链和轻链的基因序列，分别构建了重组轻、重链质粒；利用脂质体转染技术转染CHO-K1细胞(购自ATCC(ATCC CCL-61))，通过加压筛选和有限稀释法获得生产重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的工程细胞株CHO细胞，由此建立细胞库。上述通过基因工程手段构建CHO工程细胞株的方法是本领域所公知的，如可参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著)、《医用分子生物学》(杨吉成,陈于兴主编)等中描述的方法构建，或如参考CN102277380A、CN105820248A、CN104341505A等专利中所描述的方法构建。
本发明中的“培养基”指的是供细胞生长和维持用的人工配制的溶液。
本发明中所述的CD FortiCHO AGT、Dynamis AGT、Ex-Cell 302、CDEfficientFeed C AGT、Cell Boost 5、PF68均是本领域技术人员所公知的商品化细胞培养用产品，可通过市售渠道购买获得。
本发明基础培养基中所述CD FortiCHO AGT购自Thermo Fisher公司，货号A14286；所述Dynamis AGT购自Thermo Fisher公司，商品名全称为DynamisTM AGTTM Medium货号A26175；所述Ex-Cell 302购自Sigma-Aldrich公司，其商品名全称为302Serum-Free Medium for CHO Cells,货号24326C。
本发明补料培养基中所述CD EfficientFeed C AGT购自Thermo Fisher公司，其商品名全称为CD EfficientFeedTM C AGTTM Nutrient supplement,货号为A13275；所述Cell Boost 5购自GE Healthcare公司，其商品名全称为Cell BoostTM 5Supplement，货号SH30865；所述PF68即普朗尼克F 68或Pluronic F-68，是一种环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，被用作消泡剂和抗击细胞培养中剪切力的细胞膜稳定剂，可商品化购买，如购自德国BASF公司。
实施例1、细胞培养基
1.基础培养基的配制
基础培养基的配方：CD FortiCHO AGT(Thermo Fisher公司)，12.5g/L；Ex-Cell302(Sigma-Aldrich公司)，10.8g/L。
配制方法：取80％配制体积的注射用水于配液容器，称量培养液所需的Ex-cell302干粉和CD FortiCHO AGT干粉，加入到配液容器，搅拌30分钟。用5M氢氧化钠调pH至6.9-7.0，继续搅拌10分钟左右。定容至配制体积，过滤分装。过滤后无菌验证并检查滤膜完整性。置于4℃冰箱内储存。
2.补料培养基的配制
补料培养基的配方和配制方法如下：
表1：补料培养基的配方
配制方法：取80％配制体积的注射用水于配液容器，称量培养液所需的CellBoost 5干粉和CD EfficientFeed C AGT干粉，加到配液容器，搅拌30分钟；然后调pH至9.2左右，加入以下物质：PF68、谷氨酸、色氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、酪氨酸，继续搅拌20分钟左右。用6M盐酸调pH至6.9-7.0，继续搅拌10分钟左右。定容至配制体积，过滤分装。过滤后无菌验证并检查滤膜完整性。置于4℃冰箱内储存。
实施例2
一种细胞培养基，包括基础培养基和补料培养基，
基础培养基的配方：CD FortiCHO AGT，5g/L；Ex-Cell 302，5g/L。
补料培养基的配方：CD EfficientFeed C AGT，40g/L；Cell Boost 5，20g/L；谷氨酸0.1g/L；酪氨酸0.5g/L；半胱氨酸0.2g/L；苏氨酸0.1g/L；PF68 1g/L。
实施例3
一种细胞培养基，包括基础培养基和补料培养基，
基础培养基的配方：CD FortiCHO AGT，20g/L；Ex-Cell 302，15g/L。
补料培养基的配方：CD EfficientFeed C AGT，80g/L；Cell Boost 5，70g/L；谷氨酸0.8g/L；酪氨酸1.2g/L；半胱氨酸1g/L；色氨酸0.8g/L；苏氨酸0.3g/L；苯丙氨酸0.4g/L；PF68 2g/L。
实施例4
一种细胞培养基，包括基础培养基和补料培养基，
基础培养基的配方：CD FortiCHO AGT，9.8g/L；Ex-Cell 302，7.6g/L。
补料培养基的配方：CD EfficientFeed C AGT，56g/L；Cell Boost 5，30g/L；谷氨酸0.19g/L；酪氨酸0.6g/L；半胱氨酸0.43g/L；色氨酸0.2g/L；苏氨酸0.15g/L；苯丙氨酸0.1g/L；PF68 1.2g/L。
实施例5
一种细胞培养基，包括基础培养基和补料培养基，
基础培养基的配方：CD FortiCHO AGT，17.5g/L；Ex-Cell 302，12g/L。
补料培养基的配方：CD EfficientFeed C AGT，65g/L；Cell Boost 5，52g/L；谷氨酸0.35g/L；酪氨酸0.8g/L；半胱氨酸0.6g/L；色氨酸0.5g/L；苏氨酸0.2g/L；苯丙氨酸0.25g/L；PF68 1.6g/L。
实施例6
一种细胞培养基，包括基础培养基和补料培养基，
基础培养基的配方：CD FortiCHO AGT，18g/L；Ex-Cell 302，14g/L。
补料培养基的配方：CD EfficientFeed C AGT，72g/L；Cell Boost 5，61g/L；谷氨酸0.7g/L；酪氨酸1.1g/L；半胱氨酸0.92g/L；色氨酸0.6g/L；苏氨酸0.25g/L；苯丙氨酸0.32g/L；PF68 1.8g/L。
实施例7
一种细胞培养基，包括基础培养基和补料培养基，制备方法参照实施例1所示，
基础培养基的配方：Dynamis AGT，12.5g/L；Ex-Cell 302，10.8g/L。
补料培养基的配方：CD EfficientFeed C AGT，56g/L；Cell Boost 5，21g/L；谷氨酸0.58g/L；酪氨酸1.02g/L；半胱氨酸0.85g/L；色氨酸0.4g/L；苏氨酸0.12g/L；苯丙氨酸0.17g/L；PF68 1.5g/L。
实施例8、2L反应器培养CHO细胞生产重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体
复苏一支上述的表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞到含有30ml基础培养基的100ml摇瓶中，直接悬浮培养，接种密度维持在0.3-0.5×106细胞/ml，细胞活率维持在85％以上。在摇床中振荡培养3天后，以0.4×106细胞/ml的密度将细胞接入含新鲜基础培养基的1L摇瓶中培养。依此逐级扩大培养至2L反应器(赛多利斯B2L反应器)。当活细胞密度在1L摇瓶中达到3×106细胞/ml时，接种至2个2L反应器(赛多利斯B2L反应器)进行培养，接种量为0.7×106细胞/ml。
在2L反应器培养阶段，初始温度37℃，转速150rpm，pH6.8-7.2，30％的溶氧饱和度。培养4天后，达到6×106细胞/ml，降低培养温度至33℃，流加补料培养基，每天的流加量为实际培养物体积的4％。补料培养至细胞活率约60％时，结束培养。
实施例9、200L反应器培养CHO细胞生产重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体
1.培养基的配制
参见实施例1制备基础培养基和补料培养基的配方和配制方法。
2.CHO种子细胞的制备
2.1种子复苏
将表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞浸入37℃的水浴中，不断搅动，使之迅速融化。将融化的细胞液转移到15ml离心管中，加入10ml基础培养液离心后弃上清，用30ml基础培养液重悬，转入125ml摇瓶，并放入37℃、5％CO2的摇床中培养，摇床转速100rpm。
2.2摇瓶扩增
细胞在125ml摇瓶中生长2-3天后，细胞密度达到2-3×106细胞/ml。将细胞以0.3-0.5×106细胞/ml的密度接种到1L摇瓶，培养体积200ml。放入37℃、5％CO2的摇床中培养，摇床转速100rpm。摇床培养3天后，细胞密度达到3×106细胞/ml，再以0.6×106细胞/ml的密度将细胞接入含1200ml新鲜基础培养基的2L玻璃反应器中培养。
2.3反应器扩增
2L反应器培养阶段，温度36-37℃，转速150rpm，pH6.8-7.2，30％的溶氧饱和度，培养3天后，细胞密度达到4×106细胞/ml，将种子液转到15L反应器培养。15L反应器温度36℃，转速120rpm，pH 7.0，30％的溶氧饱和度，接种密度0.6×106细胞/ml，每天取样计数，葡萄糖控制在3g/L。培养细胞密度到4×106细胞/ml，活率要求大于95％，作为接种200L反应器生产的种子来源。
3.200L反应器培养
将CHO种子细胞培养液从15L反应器转入200L一次性搅拌式生物反应器，补加新鲜基础培养基将细胞密度调至0.7×106细胞/ml。初始转速60rpm，培养温度37℃，葡萄糖含量维持在1-3g/L。培养4天后，细胞密度到8×106细胞/ml，降低培养温度至33℃，开始流加补料培养基促进细胞生产目的蛋白，每天流加量为实际培养物体积的4％，葡萄糖含量维持在3-6g/L。细胞由生长期进入生产期，维持7天，其产物浓度逐渐提高。当细胞进入衰退期，活率达到80％左右时，停止流加补料培养基，结束培养。
4.培养结果检测
4.1细胞密度和活率
采用CountStar细胞计数仪检测细胞密度和活率，检测结果见图1。以200L反应器培养CHO细胞，在培养第7天，获得最高细胞密度10.1×106细胞/ml，在第11天结束培养时，细胞密度为8.1×106细胞/ml；在细胞培养的前10天，细胞活率在90％以上，在第11天结束培养时，细胞活率为86.7％。
4.2表达的目标蛋白测定
通过HPLC测定培养液的抗体表达量。采用POROS A/20色谱柱，先在流动相A：25mMNa2HPO4，75mMNaCl，pH 7.5，5％CAN的条件下捕获细胞液中的抗体后，通过流动相B：25mMNaH2PO4，75mMNaCl，pH 2.5，5％CAN进行洗脱，收集色谱峰。利用外标法计算抗体表达量。200L反应器培养CHO细胞生产重组抗EGFR人鼠嵌合单抗的产量变化曲线见图2。
整个培养过程，表达量逐渐增加，在第11天结束培养时，目的蛋白表达量为1.98g/L。
4.3高分子量种类(聚集体)和低分子量水解产物(LMW)测定
以大小排阻层析(SEC)来检测产物中的可溶性高分子量种类(聚集体)和低分子量水解产物(LMW)，在具有WatersW2487双重吸光度检测仪并装备有TosoHaasTSK凝胶G3000SWXL柱的WatersAlliance2695HPLC仪上实施该方法。使用200mM磷酸钠，pH7.0作为流动相通过等度洗脱模式来分开完整的单体、聚集体和水解产物，并以280nm的波长检测。
对实施例8的2L培养的样品和实施例9的200L规模培养获得的样品进行了SEC色谱分析，结果见图3、4，聚体和主峰变化不大：如图4所示，实施例8的样品的聚体0.86％，主峰99.14％；如图3所示，实施例9的样品的聚体0.62％，主峰99.38％。这说明规模化培养以后，产品的质量一致性好，本发明的方法适合规模化扩大培养。
4.4抗原结合活性测定
直接包被EGFR蛋白来检测不同浓度的供试品与其结合的能力，采用夹心ELISA法对系列稀释的样品进行检测，使用四参数方程拟合，计算二者的半数有效浓度(EC50)，分析其与抗原的结合活性。
实验中所使用的试剂分别如下：
包被液：称取0.32gNa2CO3、0.59g NaHCO3溶解在200mL去离子水中；
稀释液/PBST：称取1.420gNa2HPO4、0.227gKH2PO4、9.935gNaCl、0.224gKCl、0.0625％Tween-20，定容至1L；
酶联抗体：山羊抗人IgG(Fc)-HRP，Thermo公司。
将EGFR抗原(上海强邦生物科技有限公司)用包被液稀释到2μg/mL，100μL/孔加入酶标板，包被过夜。弃去孔中液体，用PBST溶液洗板4次，拍干后每孔加入300μL的封闭液(2％的BSA牛血清白蛋白)，37℃培养箱放置2h。参比品抗体(经过德国默克的ERBITUX标定)和供试品抗体(实施例8和9的产品)用稀释液稀释至1mg/mL，然后梯度稀释，取500ng/mL至0.052ng/mL的11个稀释度的溶液做剂量反应曲线，100μL/孔，2复孔加样至酶标板中，37℃振荡1h，加入酶联抗体，7℃温育1h，加入TMB(四甲基联苯胺)于37℃作用5分钟，最后用HSO终止反应，测A450/630nm处OD值，选取四参数方程拟合曲线。
表2：实施例8和实施例9的产品的抗原结合活性测定结果
抗体浓度ng/ml 参比品 实施例8产品 实施例9产品
500.000 2.810 2.809 2.808
200.000 2.782 2.768 2.772
80.000 2.780 2.774 2.774
32.000 2.762 2.746 2.750
12.800 2.580 2.528 2.577
5.120 1.788 1.681 1.731
2.048 0.860 0.824 0.900
0.819 0.410 0.415 0.462
0.328 0.198 0.210 0.237
0.131 0.106 0.131 0.153
0.052 0.087 0.101 0.142
EC50ng/ml 3.663 3.982 3.787
表2的结果表明，实施例8和实施例9的产品与参比品比较均能与EGFR蛋白结合，样品与参比品的EC50相当，均具有结合活性，并且放大规模培养后的结合活性一致，本发明的方法适合规模化扩大培养。
实验例1、补料培养基氨基酸优化前后的比较
1.培养基的配制
1.1.参照实施例1配制基础培养基和优化后的补料培养基。
1.2.未优化氨基酸的补料培养基的配制按照表3的配方进行。
表3：配方
成分 含量
CD EfficientFeed C AGT(Thermo Fisher公司) 56g/L
Cell Boost 5(购自GE Healthcare) 21g/L
PF68(即普朗尼克F 68，购自德国BASF公司) 1.5g/L
配制方法：取80％配制体积的注射用水于配液容器。准确称量培养液所需的CellBoost 5干粉和CD EfficientFeed C AGT干粉，加入到配液容器，搅拌30分钟；加入PF68，然后用5M NaOH调pH至6.9-7.0，继续搅拌10分钟左右。定容至配制体积，过滤分装。过滤后无菌验证并检查滤膜完整性。
2.细胞培养过程描述
复苏表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞到含有30ml基础培养基的100ml摇瓶中，直接悬浮培养，接种密度维持在0.3-0.5×106细胞/ml，细胞活率维持在85％以上。在摇床中振荡培养3天后，以0.5×106细胞/ml的密度将细胞接入含新鲜基础培养基的1L摇瓶中培养。依此逐级扩大培养至2L反应器(赛多利斯B2L反应器)。当活细胞密度在1L摇瓶中达到4×106细胞/ml时，接种至2个2L反应器(赛多利斯B2L反应器)进行培养，接种量为0.5×106细胞/ml。
在2L反应器培养阶段，初始温度37℃，转速150rpm，pH 7.0，30％的溶氧饱和度。培养4天后，达到6×106细胞/ml，降低培养温度至33℃，分别流加氨基酸优化前后的补料培养基，每天的流加量为实际培养物体积的4％。补料培养至细胞活率约60％时，结束培养。
经SDS-PAGE分析，使用氨基酸优化前后的补料培养基培养细胞得到的蛋白质产物与参比品抗体(经过德国默克的ERBITUX标定的抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体)的条带接近，分子量一致，所得产物为抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体。
3.结果分析
采用细胞计数仪检测细胞密度和活率。补料培养基优化前后，细胞生长情况的比较见图5、图6。
图5显示了在培养第6天以后，采用优化后的补料培养基培养的细胞密度逐渐高于采用优化前的补料培养基培养的细胞密度。在培养第8天，采用优化后的补料培养基获得最高细胞密度11.2×106细胞/ml。
图6显示了在培养中后期，采用优化后的补料培养基培养的细胞活率优于采用优化前的补料培养基培养的细胞活率。在培养第11天，以优化后的补料培养基培养的细胞活率为84.51％，以优化前的补料培养基培养的细胞活率为64.93％。
4.通过HPLC测定培养液中的抗体表达量。采用POROS A/20色谱柱，先在流动相A：25mM Na2HPO4，75mMNaCl，pH 7.5，5％CAN的条件下捕获细胞液中的抗体后，通过流动相B：25mM NaH2PO4，75mMNaCl，pH 2.5，5％CAN进行洗脱，利用外标法计算抗体表达量。以优化前后的补料培养基培养细胞，抗体表达量的比较结果见表4。
表4：以不同的补料培养基培养细胞的抗体表达量比较
表达量(g/L)
优化前 1.68
优化后 2.16
结果表明，采用本发明优化后的补料培养基，最终抗体表达量较使用优化前的补料培养基培养的细胞的抗体表达量提高了36％。
实验例2、培养温度优化前后的比较
1.培养基的配制
基础培养基、优化后的补料培养基的配制见实施例1。
2.细胞培养过程描述
复苏表达重组抗EGFR人鼠嵌合单抗的CHO细胞，振荡培养。如实验例1所述逐级放大，经过125mL→500mL→1L摇瓶的传代扩增，当活细胞密度在1L摇瓶中达到4×106细胞/ml时，接种至3个2L反应器(赛多利斯B2L反应器)进行培养，3个2L反应器分别为BR1、BR2、BR3，接种量为0.7×106细胞/ml。
BR1：整个培养过程温度控制在37℃，转速150rpm，pH7.2，30％的溶氧饱和度。培养4天后，达到8×106细胞/ml，流加补料培养基，每天的流加量为实际培养物体积的4％。补料培养至细胞活率约60％时，结束培养。
BR2：起始培养温度37℃，转速150rpm，pH7.2，30％的溶氧饱和度。培养4天后，达到8×106细胞/ml，降低培养温度至33℃，流加补料培养基，每天的流加量为实际培养物体积的4％。补料培养至细胞活率约60％时，结束培养。
BR3：起始培养温度37℃，转速150rpm，pH7.2，30％的溶氧饱和度。培养4天后，达到8×106细胞/ml，降低培养温度至31℃，流加补料培养基，每天的流加量为实际培养物体积的4％。补料培养至细胞活率约60％时，结束培养。
3.结果分析
不同培养温度条件下，细胞生长情况的比较见图7、图8。
由图7可知，降低培养温度，虽然细胞增长速率减缓，但在培养后期，活细胞密度维持较为稳定。
由图8可知，降低培养温度，利于维持细胞高活率，可延长发酵培养周期。
4.利用实验例1的方法测定温度优化前后培养液中抗体表达量，结果见表5。
表5：不同培养温度条件下抗体最终产量比较
温度 表达量(g/L)
37℃ 2.04
37→33℃ 2.18
37→31℃ 1.93
结果显示，适当降低培养温度，可改善细胞存活率，进而延长发酵培养周期；但培养温度降低过多会减缓细胞的增殖速度，总细胞数减少，从而影响总蛋白表达量。综合表明，降低培养温度至33℃培养，效果最好。
本发明采用实施例7所述的培养基进行实施例8-9及实验例1-2所述的实验，与上述结论一致。

Claims (14)

1.一种细胞培养基，包括基础培养基和补料培养基，其中，
所述补料培养基包括40-80g/L的CD EfficientFeed C AGT、20-70g/L的Cell Boost5、0.1-0.8g/L的谷氨酸、0.5-1.2g/L的酪氨酸、0.2-1g/L的半胱氨酸、0-0.8g/L的色氨酸、0.1-0.3g/L的苏氨酸、0-0.4g/L的苯丙氨酸和1-2g/L的PF68；优选地，所述补料培养基还包括pH调节剂，所述补料培养基的pH值为6.9-7.2。
2.根据权利要求1所述的细胞培养基，其中，所述基础培养基为哺乳动物细胞培养用基础培养基，优选所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养基，其中，所述基础培养基包括5-20g/L的CDFortiCHO AGT或Dynamis AGT，和5-15g/L的Ex-Cell 302；优选地，所述基础培养基还包括pH调节剂，所述基础培养基的pH值为6.9-7.2。
4.根据权利要求1-3任一所述的细胞培养基，其中，所述补料培养基包括56-80g/L的CDEfficientFeed C AGT、20-70g/L的Cell Boost 5、0.19-0.58g/L的谷氨酸、0.5-1.02g/L的酪氨酸、0.43-0.85g/L的半胱氨酸、0-0.8g/L的色氨酸、0.12-0.3g/L的苏氨酸、0-0.35g/L的苯丙氨酸和1-2g/L的PF68。
5.根据权利要求3所述的细胞培养基，其中，
所述基础培养基包括12.5g/L的CD FortiCHO AGT或Dynamis AGT，和10.8g/L的Ex-Cell 302；
所述补料培养基包括56g/L的CD EfficientFeed C AGT、21g/L的Cell Boost 5、0.58g/L的谷氨酸、1.02g/L的酪氨酸、0.85g/L的半胱氨酸、0.4g/L的色氨酸、0.12g/L的苏氨酸、0.17g/L的苯丙氨酸和1.5g/L的PF68。
6.根据权利要求1-5任一所述的细胞培养基培养动物细胞的方法，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞，优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
7.一种培养细胞生产蛋白质的方法，包括用根据权利要求1-5中任一项所述的细胞培养基培养细胞，其中，所述基础培养基用于细胞生长阶段，所述补料培养基用于细胞生产蛋白质阶段；
优选地，细胞培养过程中，细胞密度达到5-8×106细胞/ml时，细胞培养进入细胞生产蛋白质阶段。
8.根据权利要求7所述的方法，包括步骤：
(1)用如权利要求1-5中任一项所述的细胞培养基中的基础培养基悬浮培养细胞，起始接种密度为0.5-1×106细胞/ml，培养温度为35℃以上，优选为36-37℃；
(2)当细胞密度生长到5-8×106细胞/ml时，降低培养温度至31-35℃，优选至33℃，流加如权利要求1-5中任一项所述的细胞培养基中的补料培养基，每天加入量为培养物体积的2-5％；
(3)当细胞活率在60-80％时，停止流加补料培养基，结束培养。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述步骤(1)的悬浮培养细胞采用一次性搅拌式生物反应器悬浮培养；优选地，所述一次性搅拌式生物反应器主要由控制塔、罐体和一次性塑料培养袋组成，规模为50-500L，优选为200L。
10.根据权利要求8-9任一所述的方法，其中，步骤(1)中，控制葡萄糖浓度为1-3g/L；和/或步骤(2)中，控制葡萄糖浓度为3-6g/L。
11.根据权利要求8-10任一所述的方法，其中，步骤(1)中，转速为60-200rpm，pH维持在6.8-7.2；和/或步骤(2)中，转速为60-200rpm，pH维持在6.8-7.2。
12.根据权利要求7-10任一所述的方法，其中，所述蛋白质为重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体；所述细胞为表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞；优选的所述单克隆抗体为西妥昔单抗。
13.根据权利要求8-12任一所述的方法，其中，通过以下步骤制备用于步骤(1)的细胞：
a.在含有基础培养基的摇瓶中复苏细胞，悬浮培养，接种密度维持在0.3-0.5×106细胞/ml，细胞活率维持在85％以上；
b.在摇床中振荡培养2-3天后，以0.3-0.5×106细胞/ml的密度将细胞接入含基础培养基的1L摇瓶中培养，依此扩大培养至2L反应器；
c.在2L反应器中培养2-3天后，细胞密度达到3-4×106细胞/ml；将细胞培养液从2L反应器转入15L反应器中，补加基础培养基至细胞密度在0.5-0.7×106细胞/ml；
d.在15L反应器中培养细胞至密度为3-4×106细胞/ml时，将细胞培养液转入200L一次性搅拌式生物反应器，补加基础培养基将细胞密度调至0.5-0.7×106细胞/ml。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，在步骤a和b的培养阶段中，转速80-120rpm，培养温度36-37℃，5％的CO2饱和度，80％空气湿度；在步骤c和d的2L和15L反应器培养阶段，温度为36-37℃，转速为120-150rpm，pH6.8-7.2，30％的溶氧饱和度。
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