CN117305393A - 提高csfv-e2蛋白表达量的培养基的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及兽用疫苗及微生物细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高CSFV‑E2蛋白表达量的培养基的应用。本发明所述提高CSFV‑E2蛋白表达量的培养基，以CD CHO 011为基础培养基，添加8‑12mM的L‑精氨酸。该培养基能极大程度地提升细胞活率和培养后期的活细胞数量，提高CSFV‑E2蛋白的表达量。本发明在使用前述培养基发酵生产CSFV‑E2蛋白的过程中，添加CD Feed 002营养补充剂，有助于降低因前期添加L‑精氨酸导致的细胞代谢产物积聚，进而减少代谢产物对细胞后期生长和蛋白表达造成的不利影响。
Description
技术领域
本发明涉及兽用疫苗及微生物细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高CSFV-E2蛋白表达量的培养基的应用。
背景技术
CSFV-E2蛋白，即猪瘟病毒E2蛋白，因其具有相较优势的序列保守性和免疫显性，在猪瘟病毒疫苗的开发中具有广泛应用。
本领域常使用CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）用于CSFV-E2蛋白的表达。早期的CHO细胞表达CSFV-E2蛋白时，存在细胞过早凋亡，蛋白表达量低的问题。高密度培养CHO细胞时，受到培养条件等诸多因素影响，同样存在细胞表达蛋白效率较低的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种提高CSFV-E2蛋白表达量的培养基的应用。具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种提高CSFV-E2蛋白表达量的培养基在发酵生产CSFV-E2蛋白中的应用，所述培养基以CD CHO 011为基础培养基，添加8-12mM的L-精氨酸；所述CSFV-E2蛋白由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列表达获得。
本领域常采用细胞发酵方式生产CSFV-E2蛋白，早期的细胞发酵表达CSFV-E2蛋白时，存在细胞过早凋亡，蛋白表达量低的问题。本发明使用CD CHO 011无血清培养基培养具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞，发现在CD CHO 011无血清培养基中补充加入L-精氨酸，使培养基中L-精氨酸的浓度控制在8-12mM，优选8mM，能极大程度地提升细胞活率和培养后期的活细胞数量，提高CSFV-E2蛋白的表达量。
CD CHO 011是一种无血清培养基，L-精氨酸是一种常见氨基酸成分，二者均可从常规市售渠道购买得到。在本发明提供的实施例中，所述CD CHO 011培养基购买自甘肃健顺生物科技有限公司，货号：88011-317；所述L-精氨酸购买自Sigma（西格玛）公司。
优选的，本发明所述培养基还添加有D-葡萄糖。
在本发明中，所述D-葡萄糖的添加量优选为2.5-4g/L，更优选为4g/L。
本发明对所述D-葡萄糖的来源不作特别限定，本领域常规市售来源均可。在本发明提供的实施例中，所述D-葡萄糖购买自Gibco（赛默飞世尔科技公司）。
进一步优选地，本发明在发酵生产CSFV-E2蛋白的过程中添加CD Feed 002营养补充剂。
本发明在使用前述培养基发酵生产CSFV-E2蛋白的过程中，添加CD Feed 002营养补充剂，有助于降低因前期添加L-精氨酸导致的细胞代谢产物积聚，进而减少代谢产物对细胞后期生长和蛋白表达造成的不利影响。
在本发明中，所述培养基和所述CD Feed 002营养补充剂的体积比优选为6-14:1，更优选为8-12:1更优选为10:1。
在本发明提供的更为优选的实施方式中，所述培养基以CD CHO 011为基础培养基，添加8mM的L-精氨酸，4g/L的D-葡萄糖；且所述培养基和所述CD Feed 002营养补充剂的体积比为10:1。
CD Feed 002营养补充剂可以从公开市售渠道购买获得。在本发明提供的实施例中，所述CD Feed 002营养补充剂购买自甘肃健顺生物科技有限公司，货号：99014-302。
第二方面，本发明更为具体地提供了一种生产CSFV-E2蛋白的方法，包括如下步骤：使用所述培养基培养具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞。
优选地，所述培养的初始细胞密度＞2×105cells/ml，二氧化碳浓度为6-10%，培养温度为37±0.5℃。
更优选地，所述培养的初始细胞密度为8×105cells/ml，二氧化碳浓度为8%，培养温度为37℃。
上述培养条件下的细胞生长效率及细胞活率更高，CSFV-E2蛋白产量高，生产效率高。
在本发明提供的更为优选的实施方式中，所述生产CSFV-E2蛋白的方法使用所述培养基培养具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞；在培养至第3-5天时，按照细胞初始培养体积的6-14vol%添加CD Feed 002营养补充剂；在培养至第8-10天时，再次按照细胞初始培养体积的6-14vol%添加CD Feed 002营养补充剂；培养至第12-14天收获培养液。
更优选地，本发明使用所述培养基培养具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞；在培养至第4天时，按照细胞初始培养体积的10vol%添加所述CD Feed 002营养补充剂；在培养至第9天时，再次按照细胞初始培养体积的10vol%添加所述CD Feed 002营养补充剂；培养至第13天收获培养液。
在本发明中，所述具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞可选自本领域任何已知具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞，或者采用本领域常规方法构建获得的具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞。优选地，所述具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞为CHO细胞，该CHO细胞用于表达CSFV-E2蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
有益效果：
本发明提供了一种提高CSFV-E2蛋白表达量的培养基的应用。本发明所述提高CSFV-E2蛋白表达量的培养基，以CD CHO 011为基础培养基，添加8-12mM的L-精氨酸。该培养基能极大程度地提升细胞活率和培养后期的活细胞数量，提高CSFV-E2蛋白的表达量。本发明在使用前述培养基发酵生产CSFV-E2蛋白的过程中，添加CD Feed 002营养补充剂，有助于降低因前期添加L-精氨酸导致的细胞代谢产物积聚，进而减少代谢产物对细胞后期生长和蛋白表达造成的不利影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为本发明中pEE12.4-PS-E2质粒图谱。
图2为本发明中pEE12.4-PS-E2菌落PCR鉴定结果。
图3为本发明中pEE12.4-PS-E2双酶切鉴定结果。
图4为本发明中摇瓶发酵结果。
图5为本发明中单克隆细胞验证结果。
图6为本发明实验例1中的活细胞数图。
图7为本发明实验例1中的细胞活率图。
图8为本发明实验例1中CHO细胞的CSFV-E2蛋白表达量图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
本发明实施案例中使用的细胞、菌株、质粒及试剂等均为市售产品。
以下实施例所用细胞、菌株、质粒、培养基及试剂包括：CHO-K1购自广州赛库生物技术有限公司；真核表达载体pEE12.4购自吉满生物科技有限公司；甲硫氨酸亚砜亚铵（L-methioninesulfoximine，MSX）购自Sigma（西格玛）；BCA（tm）protein Assay Kit试剂盒购自Thermo（赛默飞世尔科技公司）；His ELISA试剂盒购自金斯瑞；质粒小提试剂盒购自TIANGEN（天根）；质粒无内毒素大提试剂盒购自TIANGEN（天根）；CD CHO 011基础培养基（甘肃健顺生物科技有限公司），CD Feed 002营养补充剂（甘肃健顺生物科技有限公司），D-Glucose(葡萄糖)，Sigma（西格玛）；L-arginine（精氨酸），Sigma（西格玛）。
以下实施例所用仪器包括：生物安全柜，Heal Force（力康）；摇床，Kuhner（瑞士阿道夫科耐）；摇瓶，Nalgene（耐洁）；细胞计数仪，Count star（艾力特生物科技）；PCR仪，thermo（赛默飞世尔科技公司），琼脂糖水平电泳仪，伯乐；蛋白凝胶电泳仪，伯乐。
以下生产CSFV-E2蛋白所用的细胞为CHO-K1-JY株，其构建过程具体包括：
（一）密码子优化：
对猪瘟E2蛋白核苷酸序列进行密码子优化，得到PS-E2序列，如SEQ NO：1所示，该工作为生工生物进行序列合成。
CTGGCCTGCAAGGAGGACTACAGATACGCTATTTCCTCTACCGATGAGATCGGCCTGCTCGGCGCTGGCGGCCTGACCACCACCTGGAAGGAGTACAACCATGACCTGCAGCTGAACGACGGCACCGTGAAGGCCTCTTGTGTGGCCGGCTCTTTCAAGGTGACCGCCCTGAACGTGGTGTCTAGGAGATACCTGGCCAGCCTGCACAAGAAGGCCCTGCCTACCTCTGTGACCTTCGAGCTGCTGTTCGACGGCACCAACCCTTCCACCGAGGAGATGGGCGACGACTTCAGATCCGGCCTGTGTCCTTTCGACACCTCTCCTGTGGTGAAGGGCAAGTACAACACCACCCTGCTGAACGGCTCTGCCTTCTACCTCGTGTGTCCTATCGGCTGGACCGGCGTGATCGAGTGTACCGCTGTGTCTCCTACCACCCTGAGAACCGAGGTGGTGAAGACCTTCAGAAGGGACAAGCCCTTTCCTCACCGGATGGACTGCGTGACCACAACCGTGGAGAACGAGGACCTGTTCTACTGCAAGCTGGGCGGCAACTGGACCTGTGTGAAGGGCGAGCCTGTGGTGTATACCGGCGGAGTGGTCAAGCAGTGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGACGGCCCTGACGGCCTGCCTCACTACCCTATCGGCAAGTGCATCCTGGCCAACGAGACCGGCTACCGGATCGTGGACTCTACCGACTGCAACAGAGATGGCGTGGTGATCTCTACCGAGGGCTCTCACGAGTGCCTGATCGGCAACACCACCGTGAAGGTCCATGCCTCTGACGAGAGACTGGGCCCTATGCCTTGCCGGCCTAAAGAGATCGTGTCCTCTGCTGGCCCTGTGATGAAGACCTCCTGTACCTTCAACTACACAAAGACCCTGAAGAACAGATACTACGAGCCTAGGGACTCCTACTTTCAGCAGTACATGCTGAAGGGCGAGTACCAGTATTGGTTTGACCTGGACGCCACCGACCGGCACTCTGACTACTTTGCC（SEQ ID NO：1）
（二）pEE12.4-PS-E2重组质粒构建：
（1）pUC57载体双酶切回收PS-E2片段：
标记好所需EP管，在1.5mL EP管中按照下表1进行加样、混合反应体系，并将其放置于37℃金属浴中，静置1h。
表1
取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳，120V 35min；将目的条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下，放入1.5mL离心管中；用TIANGEN通用型DNA纯化回收试剂盒（离心柱型）进行胶回收；将回收的样品，测定DNA浓度并置于-20℃保存。
（2）pEE12.4载体双酶切反应：
标记好所需EP管，在1.5mL EP管中进行加样、混合反应体系及反应条件同（1）。双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以及进行质粒DNA回收，方法同（1）。
（3）PS-E2及pEE12.4产物连接：
准备洁净200µL EP管，做好标记，至于板子上待用；在200µL EP管按照下表2进行加样、混匀。
表2
加样后，将10µL反应体系至于16℃过夜连接；连接产物取出，放置于4℃保存，连接后产物pEE12.4-PS-E2质粒图谱如附图1所示，其中HindⅢ与EcoRⅠ之间为CSFV-E2片段连接位置。
（4）转化反应：
将DH5α感受态细胞至于冰浴融化，将连接产物快速加入到100µL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。取出样品管，至于42℃金属浴90s，然后快速放于冰中，冰浴2min；取出样品管，在生物安全柜中，向样品管内加入500µL液体感受态培养基，然后放入37℃恒温振荡培养箱中，200rpm/min，培养1h后将样品管，室温3000rpm/min，离心10min，弃去上清。用剩余上清液重悬菌体，将重悬菌体滴入Amp+抗性LB平皿中，用涂菌棒均匀铺开。然后至于37℃培养箱中过夜培养，并于第二日观察转化结果。
（5）菌落PCR扩增PS-E2及双酶切鉴定：
步骤一：PCR反应
1，引物设计及合成。
上游引物：
5’- CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’（SEQ ID NO：2）
下游引物：
5’- AGTGATGGTGATGGTGATGT-3’（SEQ ID NO：3）
2，加样体系10µL，如下表3所示：
表3
3，PCR扩增程序：
94℃，2min。
94℃，30s；57℃，45s；72℃，1min；30个循环。
72℃，10min；4℃，延伸。
4，PCR产物鉴定：
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，120v，30min，观测目的条带，如附图2所示，其中通道10为2000kd 蛋白marker，产物连接成功再1000kd处产生条带。
步骤二：质粒抽提
将步骤一鉴定过的菌落挑进5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；将菌液12000rpm/min，2min离心，弃上清；用TIANGEN小提试剂盒按说明书提取质粒，-20℃保存质粒。
步骤三：双酶切鉴定
标记好所需的1.5mL EP管，按照下表4进行加样。
表4
然后将EP管放置于37℃金属浴中，静置1h。1h后将体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图3，若成功插入片段则出现两条带，上面为线性化载体，下面为连接E2片段。将克隆质粒送测序公司测序。
（6）无内毒素质粒大提
菌液扩大培养：将测序正确的菌液，按1%接种体积，扩大为200mL，37℃，220rpm/min摇菌过夜；用TIANGEN无内毒素大提试剂盒提取质粒，测浓度，调整为1µg/mL的浓度，-20℃保存。
（三）用于表达CSFV-E2蛋白的CHO-K1-D133株的构建：
（1）CHO-K1细胞转染：
生物安全柜灭菌30min，培养基室温回温。将悬浮细胞计数1×106个/mL，铺24孔板500µL/孔，37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育过夜培养。24h观察细胞状态，细胞交汇度为90%以上。用OPTI-MEM稀释质粒，125µL OPTI-MEM中加入1µg质粒，轻混，室温静置5min。
用OPTI-MEM稀释转染试剂，125µL OPTI-MEM中加入3µL Lipofectamine，再加入1.5µL plus，轻混，室温静置5min。将质粒缓慢加入到转染试剂中轻混，室温静置5min，然后逐滴均匀加入孔板中。将孔板放入培养箱中，静置6h，换正常培养基，过夜培养。
（2）加压筛选：
转染24h后开始加压，加入50µM MSX，加压7天，中间观察细胞。
（3）单克隆筛选：
加压至阴性对照活率低于10%，进行单克隆筛选。将转染细胞孔移至15mL离心管中，800rpm/min，离心5min，去上清。用细胞培养基重悬细胞计数，稀释至1.5个细胞/200µL，铺入96孔板中。24h后显微镜观察，记录单细胞孔。待细胞长满取上清液ELISA检测克隆是否为阳性株，若为阳性则继续扩大培养，冻存。经过筛选，收获3株细胞株，分别为PS-C4-8、PS-C7-26、PS-C22-24。
（4）摇瓶发酵培养：
将3株细胞株细胞用125mL摇瓶，培养30mL体积，37℃，5%CO2，100rpm摇床培养。分别在第3、5、7、9天补加葡萄糖至5g/L，在第4、9天按培养体积10%进行补料。在细胞活率低于50%收获。将收获样品进行检测，取1mL上清液1000rpm/min离心10min，取20µL进行蛋白凝胶电泳，在55kd处均出现条带，如图4所示。剩余部分进行ELISA检测，取ELISA值最高的细胞株PS-C4-8进行培养基的筛选。
（5）表达猪瘟E2细胞鉴定：
取200µL发酵细胞提取细胞基因组，用引物PS-F、PS-R进行PCR鉴定，反应体系同（二）-（5）-步骤一；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，120V，40min，见图5所示，特异性目的片段在1200kd左右。比较目的片段长度，并送至生工生物进行测序确认。
实施例1
本实施例提供了一种提高CSFV-E2蛋白表达量的培养基：以CD CHO 011为基础培养基，添加8mM的L-精氨酸。
本实施例同时提供了一种提高CSFV-E2蛋白表达量的组合物，该组合物包括本实施例提供的培养基，还包括CD Feed 002营养补充剂（培养基与CD Feed 002营养补充剂的体积比为10：1）。
本实施例还提供了一种生产CSFV-E2蛋白的方法，包括如下步骤：
将L-精氨酸配成200mM浓度的浓缩液，按比例稀释到CD CHO 011培养基中，使培养基中L-精氨酸浓度为8mM。用该培养基进行细胞培养，使用250ml摇瓶作为培养容器，细胞初始培养密度为8×105cells/ml，培养体积60ml，摇床转速100rpm，二氧化碳浓度8%，培养温度37℃。培养至第4、9天分别添加6ml CD Feed 002营养补充剂，培养至第13天离心收获上清。
实施例2
本实施例提供了一种提高CSFV-E2蛋白表达量的培养基：以CD CHO 011为基础培养基，添加12mM的L-精氨酸。
本实施例同时提供了一种提高CSFV-E2蛋白表达量的组合物，该组合物包括本实施例提供的培养基，还包括CD Feed 002营养补充剂（培养基与CD Feed 002营养补充剂的体积比为10：1）。
本实施例还提供了一种生产CSFV-E2蛋白的方法，包括如下步骤：
将L-精氨酸配成200mM浓度的浓缩液，按比例稀释到CD CHO 011培养基中，使培养基中L-精氨酸浓度为12mM。用该培养基进行细胞培养，使用250ml摇瓶作为培养容器，细胞初始培养密度为8×105cells/ml，培养体积60ml，摇床转速100rpm，二氧化碳浓度8%，培养温度37℃。培养至第4、9天分别添加6ml CD Feed 002营养补充剂，培养至第13天离心收获上清。
实施例3
本实施例提供了一种提高CSFV-E2蛋白表达量的培养基：以CD CHO 011为基础培养基，添加10mM的L-精氨酸。
本实施例同时提供了一种提高CSFV-E2蛋白表达量的组合物，该组合物包括本实施例提供的培养基，还包括CD Feed 002营养补充剂（培养基与CD Feed 002营养补充剂的体积比为60：8）。
本实施例还提供了一种生产CSFV-E2蛋白的方法，包括如下步骤：
将L-精氨酸配成200mM浓度的浓缩液，按比例稀释到CD CHO 011培养基中，使培养基中L-精氨酸浓度为10mM。用该培养基进行细胞培养，使用250ml摇瓶作为培养容器，细胞初始培养密度为6×105cells/ml，培养体积60ml，摇床转速100rpm，二氧化碳浓度7%，培养温度37℃。培养至第3、8天分别添加4ml CD Feed 002营养补充剂，培养至第12天离心收获上清。
对比例1
本对比例提供了一种用于生产CSFV-E2蛋白的培养基：以CD CHO 011为基础培养基，添加4mM的L-精氨酸。
本对比例同时提供了一种用于生产CSFV-E2蛋白的组合物，该组合物包括本对比例提供的培养基，还包括CD Feed 002营养补充剂（培养基与CD Feed 002营养补充剂的体积比为10：1）。
本对比例还提供了一种生产CSFV-E2蛋白的方法，包括如下步骤：
将L-精氨酸配成200mM浓度的浓缩液，按比例稀释到CD CHO 011培养基中，使培养基中L-精氨酸浓度为4mM。用该培养基进行细胞培养，使用250ml摇瓶作为培养容器，细胞初始培养密度为8×105cells/ml，培养体积60ml，摇床转速100rpm，二氧化碳浓度8%，培养温度37℃。培养至第4、9天分别添加6ml CD Feed 002营养补充剂，培养至第13天离心收获上清。
对比例2
本对比例提供了一种用于生产CSFV-E2蛋白的培养基：以CD CHO 011为基础培养基，不添加L-精氨酸。
本对比例同时提供了一种用于生产CSFV-E2蛋白的组合物，该组合物包括本对比例提供的培养基，还包括CD Feed 002营养补充剂（培养基与CD Feed 002营养补充剂的体积比为10：1）。
本对比例还提供了一种生产CSFV-E2蛋白的方法，包括如下步骤：
使用CD CHO 011进行细胞培养，使用250ml摇瓶作为培养容器，细胞初始培养密度为8×105cells/ml，培养体积60ml，摇床转速100rpm，二氧化碳浓度8%，培养温度37℃。培养至第4、9天分别添加6ml CD Feed 002营养补充剂，培养至第13天离心收获上清。
实验例1
本发明在实施例1-2及对比例1-2生产CSFV-E2蛋白的过程中，每天取样测定细胞密度和细胞活率、抗原上清测定csfv-E2蛋白含量。结果参见图6、图7和图8。
由图6、图7和图8可知：经过12天摇瓶培养，CHO细胞的最高生长密度、存活时间、csfv-E2蛋白表达量与培养基中的L-精氨酸浓度存在相关性。在培养基中不含L-精氨酸时，细胞培养至第6天便进入死亡期，细胞密度没有超过6×106vc/mL。随着培养基中L-精氨酸浓度的增加，细胞的存活时间逐渐延长，当L-精氨酸浓度为8mM时，培养基完全可以支持细胞生长，且最大密度达到1.4×107vc/mL,在细胞培养12天时，细胞活率维持在90%以上，精氨酸浓度为8mM和12mM时，csfv-E2表达量相近。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.培养基在发酵生产CSFV-E2蛋白中的应用，其特征在于，所述培养基以CD CHO 011为基础培养基，添加8-12mM的L-精氨酸；所述CSFV-E2蛋白由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列表达获得。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述培养基还添加有D-葡萄糖，所述D-葡萄糖的浓度为2.5-4g/L。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，在发酵生产CSFV-E2蛋白的过程中添加CDFeed 002营养补充剂；所述培养基和所述CD Feed 002营养补充剂的体积比为6-14:1。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述培养基以CD CHO 011为基础培养基，添加8mM的L-精氨酸，4g/L的D-葡萄糖；所述培养基和所述CD Feed 002营养补充剂的体积比为10:1。
5.一种生产CSFV-E2蛋白的方法，其特征在于，使用培养基培养具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞，所述培养基以CD CHO 011为基础培养基，添加8-12mM的L-精氨酸；所述CSFV-E2蛋白由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列表达获得。
6.根据权利要求5所述生产CSFV-E2蛋白的方法，其特征在于，所述培养的初始细胞密度＞2×105cells/ml，二氧化碳浓度为6-10%，培养温度为37±0.5℃。
7.根据权利要求6所述生产CSFV-E2蛋白的方法，其特征在于，使用所述培养基培养具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞；在培养至第3-5天时，按照细胞初始培养体积的6-14vol%添加CD Feed 002营养补充剂；在培养至第8-10天时，再次按照细胞初始培养体积的6-14vol%添加CD Feed 002营养补充剂；培养至第12-14天收获培养液。
8.根据权利要求7所述生产CSFV-E2蛋白的方法，其特征在于，所述具有表达CSFV-E2蛋白功能的细胞为CHO细胞。
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