CN117802128A - 提高e2蛋白表达量的重组基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物基因表达技术领域，尤其涉及一种提高E2蛋白表达量的重组基因及应用。本发明所述重组基因由信号肽的基因序列与E2蛋白的基因序列顺次连接得到，其中，所述E2蛋白的基因序列经密码子优化，可在重组细胞中高效表达。另外，本发明提供的重组基因引入了信号肽序列，所述信号肽序列与密码子优化后的E2蛋白基因序列连接后，E2蛋白的表达量显著提升。

Description

提高E2蛋白表达量的重组基因及应用

技术领域

本发明涉及生物基因表达技术领域，尤其涉及一种提高E2蛋白表达量的重组基因及应用。

背景技术

猪瘟(classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fevervirus,CSFV)感染引起的一种高热、免疫抑制性、致死性极高的高度接触性传染病。CSFV是一种单股正连RNA病毒，属于黄病毒科、瘟病毒属成员。全基因组为12.5kb，含一个开放阅读框，其基因组可作为mRNA直接翻译形成感染性蛋白。其中含有Erns、E1、E2和其他核心蛋白所组成，其中E2是CSFV中最主要的免疫原性蛋白，能诱导机体产生中和抗体。

利用生物工程构建特定蛋白的表达细胞有助于实现该特定蛋白的高效生产。本领域为增强抗原蛋白的表达，可能会在表达的蛋白中设计和添加一些修饰序列，以促进或维持抗原蛋白的表达和生物活性。但是，蛋白连接肽的成分和组成会影响目的抗原蛋白的表达甚至生物活性。现有技术中对提升E2蛋白表达量的研究较少，常规构建得到的E2蛋白表达细胞存在表达量低，蛋白活性低等问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种提高E2蛋白表达量的重组基因及应用。

具体地，本发明提供的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种提高E2蛋白表达量的重组基因，所述重组基因由信号肽的基因序列与E2蛋白的基因序列顺次连接得到；所述E2蛋白的基因序列如SEQ ID NO：01所示。

CTGGCCTGCAAGGAGGACTACAGATACGCTATTTCCTCTACCGATGAGATCGGCCTGCTCGGCGCTGGCGGCCTGACCACCACCTGGAAGGAGTACAACCATGACCTGCAGCTGAACGACGGCACCGTGAAGGCCTCTTGTGTGGCCGGCTCTTTCAAGGTGACCGCCCTGAACGTGGTGTCTAGGAGATACCTGGCCAGCCTGCACAAGAAGGCCCTGCCTACCTCTGTGACCTTCGAGCTGCTGTTCGACGGCACCAACCCTTCCACCGAGGAGATGGGCGACGACTTCAGATCCGGCCTGTGTCCTTTCGACACCTCTCCTGTGGTGAAGGGCAAGTACAACACCACCCTGCTGAACGGCTCTGCCTTCTACCTCGTGTGTCCTATCGGCTGGACCGGCGTGATCGAGTGTACCGCTGTGTCTCCTACCACCCTGAGAACCGAGGTGGTGAAGACCTTCAGAAGGGACAAGCCCTTTCCTCACCGGATGGACTGCGTGACCACAACCGTGGAGAACGAGGACCTGTTCTACTGCAAGCTGGGCGGCAACTGGACCTGTGTGAAGGGCGAGCCTGTGGTGTATACCGGCGGAGTGGTCAAGCAGTGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGACGGCCCTGACGGCCTGCCTCACTACCCTATCGGCAAGTGCATCCTGGCCAACGAGACCGGCTACCGGATCGTGGACTCTACCGACTGCAACAGAGATGGCGTGGTGATCTCTACCGAGGGCTCTCACGAGTGCCTGATCGGCAACACCACCGTGAAGGTCCATGCCTCTGACGAGAGACTGGGCCCTATGCCTTGCCGGCCTAAAGAGATCGTGTCCTCTGCTGGCCCTGTGATGAAGACCTCCTGTACCTTCAACTACACAAAGACCCTGAAGAACAGATACTACGAGCCTAGGGACTCCTACTTTCAGCAGTACATGCTGAAGGGCGAGTACCAGTATTGGTTTGACCTGGACGCCACCGACCGGCACTCTGACTACTTTGCC(SEQ ID NO：01)

本发明对猪瘟E2蛋白的基因进行了密码子优化。未优化之前，猪瘟E2蛋白无法表达。本发明优化后的猪瘟E2蛋白基因可在重组细胞中高效表达。

优选地，在本发明中，所述信号肽选自SEQ ID NO：02所示序列的信号肽、SEQ IDNO：03所示序列的信号肽或SEQ ID NO：04所示序列的信号肽中的任意一种。

其中：

SEQ ID NO：02所示序列的信号肽为Erns信号肽：EKALLAWAVIAIMLYQPVEA(SEQ IDNO：02)。

SEQ ID NO：03所示序列的信号肽为PS猪间质胶原酶前体信号肽：MFSLLLLLLLLCNTGSHGFP(SEQ ID NO：03)。

SEQ ID NO：04所示序列的信号肽为原猪瘟E2信号肽：MKVLRGQIVQGVVWLLLVTGAQGR(SEQ ID NO：04)。

本发明选用原猪瘟E2信号肽的基因序列与密码子优化后的E2蛋白序列连接，E2蛋白的基因序列因进行了密码子优化，能获得较高的表达量。

Erns蛋白具有一定细胞毒性，诱导T淋巴细胞凋亡，且未对细胞膜产生损伤，在CSFV的感染和免疫抑制过程发生作用，其是胞外分泌蛋白，其上游羧基端，具有一段含20个氨基酸的信号肽序列，可以促进Erns蛋白分泌至细胞上清中，且胞外释放的蛋白会有较高级的糖基化蛋白形式存在。本发明选用Erns信号肽的基因序列与密码子优化后的E2蛋白序列连接，E2蛋白的表达量相较具有显著提升。

本发明同时还筛选了signalpeptide.de德国信号肽数据库，选择了猪间质胶原酶前体信号肽(PS信号肽)，其具有21个氨基酸序列，且该信号肽具有较好的分泌性。本发明研究表明：通过使用PS信号肽取代原猪瘟E2信号肽与密码子优化后的E2蛋白序列连接，构建的重组质粒在CHO细胞中表达E2蛋白的效率相较更高。

在本发明其中一种优选的实施方式中，所述信号肽选自SEQ IDNO：02所示序列的信号肽。

在本发明另外一种更优选的实施方式中，所述信号肽选自SEQ ID NO：03所示序列的信号肽。

第二方面，本发明提供了一种重组载体，其由所述重组基因连接至基础载体得到。

优选地，所述基础载体选自pCDNA3.1或者pEE12.4。

第三方面，本发明提供了一种提高E2蛋白表达量的重组细胞，其由所述重组载体转染基础细胞得到。

优选地，所述基础细胞选自CHO-K1(仓鼠卵巢细胞亚株)或者CHO-S(中国仓鼠卵巢细胞)。CHO细胞更适于本发明所述重组基因及重组载体(尤其是含有PS信号肽的重组基因及重组载体)的表达。

第四方面，本发明提供了所述重组基因，或者所述重组载体，或者所述重组细胞在提高E2蛋白表达量中的应用。可显著提高E2蛋白的表达量，提高E2蛋白的工业产能。

第五方面，本发明还提供了一种提高E2蛋白表达量的方法，包括：将所述重组基因置于表达体系中表达得到E2蛋白。

本发明对所述表达体系的具体组成方式不作特别限定，本领域常规用于目标蛋白表达的细胞生物体系均可。

有益效果：

本发明提供了一种提高E2蛋白表达量的重组基因及应用。本发明所述重组基因由信号肽的基因序列与E2蛋白的基因序列顺次连接得到，其中，所述E2蛋白的基因序列经密码子优化，可在重组细胞中高效表达。另外，本发明提供的重组基因引入了信号肽序列，所述信号肽序列与密码子优化后的E2蛋白基因序列连接后，E2蛋白的表达量显著提升。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。

图1为pCDNA3.1-BET-E2质粒图谱。

图2为pCDNA3.1-PS-E2质粒图谱。

图3为BET-E2、PS-E2、EP-E2片段酶切电泳图。

图4为pCDNA3.1-BET/PS-E2/EP-E2菌落PCR鉴定结果，其中通道1为2000bpMarker，2-5为BET-E2挑菌样品，6-9为PS-E2挑菌样品，10-13为EP-E2挑菌样品。

图5为三种信号肽分泌表达发酵液纯化后电泳图。

图6为三种信号肽分泌表达发酵液纯化后BCA检测的蛋白浓度。

图7为pEE12.4-PS-E2质粒图谱。

图8为pEE12.4-PS-E2菌落PCR鉴定结果，其中通道10为2000bp Marker，剩余为挑菌样品。

图9为pEE12.4-PS-E2双酶切鉴定结果，其中通道7为2000bp Marker，剩余为酶切质粒样品。

图10为筛选单克隆细胞摇瓶发酵结果。

图11为CHO-K1-JY单克隆细胞验证结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。

本发明所涉及的细胞、菌株、质粒来源如下：CHO-S购自Gibco(赛默飞)公司；CHO-K1购自广州赛库生物技术有限公司；真核表达载体pEE12.4购自吉满生物科技有限公司；真核表达载体pCDNA3.1购自Invitrogen(美国英杰)公司；DH5α感受态及JM109感受肽购自TaKaLa(塔克拉)公司。

本发明所涉及的培养基与试剂来源如表1所示，仪器如表2所示：

表1

试剂名称	厂家
		MSX	Sigma(西格玛)
ExpiCHO表达培养基	Gibco(赛默飞)
		FeedC+AGT	Gibco(赛默飞)
D-Glucose(葡萄糖)	Gibco(赛默飞)
		L-谷氨酰胺	Gibco(赛默飞)
His Elisa试剂盒	金斯瑞
		BCA试剂盒	Thermo(赛默飞)
质粒小提试剂盒	TIANGEN(天根)
		质粒无内毒素大提试剂盒	TIANGEN(天根)
PolyJet转染试剂	SignaGen(思恩生物)
		ExpiFectamine CHO转染试剂	Gibco(赛默飞)

表2

仪器名称	厂家
		生物安全柜	Heal Force(力康)
摇床	Kuhner(科耐)
		摇瓶	Nalgene(耐洁)
细胞计数仪	Count star(瑞珏科技)
		PCR仪	Themo(赛默飞)
琼脂糖水平电泳仪	伯乐
		蛋白凝胶电泳仪	伯乐

实施例1

本实施例对猪瘟E2蛋白的核苷酸序列进行了密码子优化，CSFV E2密码子优化后的序列如下：

CTGGCCTGCAAGGAGGACTACAGATACGCTATTTCCTCTAC

CGATGAGATCGGCCTGCTCGGCGCTGGCGGCCTGACCACCACC

TGGAAGGAGTACAACCATGACCTGCAGCTGAACGACGGCACCG

TGAAGGCCTCTTGTGTGGCCGGCTCTTTCAAGGTGACCGCCCT

GAACGTGGTGTCTAGGAGATACCTGGCCAGCCTGCACAAGAAG

GCCCTGCCTACCTCTGTGACCTTCGAGCTGCTGTTCGACGGCAC

CAACCCTTCCACCGAGGAGATGGGCGACGACTTCAGATCCGGC

CTGTGTCCTTTCGACACCTCTCCTGTGGTGAAGGGCAAGTACA

ACACCACCCTGCTGAACGGCTCTGCCTTCTACCTCGTGTGTCCT

ATCGGCTGGACCGGCGTGATCGAGTGTACCGCTGTGTCTCCTAC

CACCCTGAGAACCGAGGTGGTGAAGACCTTCAGAAGGGACAA

GCCCTTTCCTCACCGGATGGACTGCGTGACCACAACCGTGGAG

AACGAGGACCTGTTCTACTGCAAGCTGGGCGGCAACTGGACCT

GTGTGAAGGGCGAGCCTGTGGTGTATACCGGCGGAGTGGTCAA

GCAGTGTAGATGGTGTGGCTTCGACTTCGACGGCCCTGACGGC

CTGCCTCACTACCCTATCGGCAAGTGCATCCTGGCCAACGAGAC

CGGCTACCGGATCGTGGACTCTACCGACTGCAACAGAGATGGC

GTGGTGATCTCTACCGAGGGCTCTCACGAGTGCCTGATCGGCA

ACACCACCGTGAAGGTCCATGCCTCTGACGAGAGACTGGGCCC

TATGCCTTGCCGGCCTAAAGAGATCGTGTCCTCTGCTGGCCCTG

TGATGAAGACCTCCTGTACCTTCAACTACACAAAGACCCTGAA

GAACAGATACTACGAGCCTAGGGACTCCTACTTTCAGCAGTACA

TGCTGAAGGGCGAGTACCAGTATTGGTTTGACCTGGACGCCAC

CGACCGGCACTCTGACTACTTTGCC(SEQ ID NO：01)

实施例2

本实施例以实施例1中优化后的密码子分别连接三种不同的信号肽(Erns信号肽、PS猪间质胶原酶前体信号肽和原猪瘟E2信号肽)，各自构建得到pCDNA3.1-BET-E2(对应Erns信号肽)、pCDNA3.1-PS-E2(对应PS猪间质胶原酶前体信号肽)、pCDNA3.1-EP-E2(对应原猪瘟E2信号肽)三种重组质粒，实验过程具体如下：

三种不同的信号肽序列如下：

Erns信号肽：EKALLAWAVIAIMLYQPVEA(SEQ ID NO：02)；

PS猪间质胶原酶前体信号肽：MFSLLLLLLLLCNTGSHGFP(SEQ ID NO：03)；

原猪瘟E2信号肽MKVLRGQIVQGVVWLLLVTGAQGR(SEQ ID NO：04)。

pUC57载体序列由生工生物进行合成，从pUC57载体中双酶切回收BET-E2、PS-E2、EP-E2片段：标记好所需EP管，在1.5mL EP管中按照表3进行加样、混合反应体系，后将EP管放置于37℃金属浴中，静置1h。

表3

加样成分名称	体积(μL)
		10×buffer	5
质粒样品	2μg
		HindⅢ	2.5
EcoRⅠ	2.5
		ddH2O	补至50

pCDNA3.1双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳，120V35min；将目的条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下，放入1.5mL离心管中；用TIANGEN通用型DNA纯化回收试剂盒(离心柱型)进行胶回收；将回收的样品，测定DNA浓度并置于-20℃保存。

载体双酶切反应：标记好所需EP管，在1.5mL EP管中进行加样、混合反应体系及反应条件如上表所示。双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以及进行质粒DNA回收。

BET-E2、PS-E2、EP-E2与pCDNA3.1产物连接：准备洁净200μLEP管，做好标记，至于板子上待用；在200μL EP管按照表4进行加样、混匀。

表4

加样成分名称	体积(μL)
		10×T4连接buffer	1
目的片段	6
		载体	1
T4连接酶	1
		ddH2O	补至10

加样后，将10μL反应体系至于16℃过夜连接；第二日将连接产物取出，放置于4℃保存。

转化：将JM109感受态细胞至于冰浴融化，将连接产物快速加入到100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；取出样品管，至于42℃金属浴90s，然后快速放于冰中，冰浴2min；取出样品管，在生物安全柜中，向样品管内加入500μL液体感受态培养基，然后放入37℃恒温振荡培养箱中，200rpm/min，培养1h。

涂板：摇好的菌液样品管，室温3000rpm/min，离心10min，弃去上清。用剩余上清液重悬菌体，将重悬菌体滴入Amp+抗性LB平皿中，中涂菌棒均匀铺开，并至于37℃培养箱中过夜培养，第二日观察转化结果。

菌落PCR扩增及双酶切鉴定：

PCR反应：

(1)引物设计及合成

上游引物：5’-CTAGAGAACCCACTGCTTAC-3’(SEQ ID NO：05)

下游引物：5’-TAGAAGGCAGTCGAGG-3’(SEQ ID NO：06)

(2)加样体系10μL，如表5所示：

表5

(3)PCR扩增程序：(opti-E2)

95℃，5min；

95℃，10s，55℃，20s，72℃，1min10s；30cycle；

72℃，7min，4℃，forever。

PCR扩增程序：(BET-E2、PS-E2)

94℃，5min；

94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min；30cycle；

72℃，7min，4℃，forever。

(4)PCR产物鉴定：

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，120v，30min，观测目的条带。

质粒抽提：将鉴定过的菌落挑进5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；将菌液12000rpm/min，2min离心，弃上清；用TIANGEN小提试剂盒按说明书提取质粒，-20℃保存质粒。

双酶切鉴定：标记好所需的1.5mL EP管，按照表6进行加样。

表6

加样成分名称	体积(μL)
		10×buffer	2
质粒样品	1μg
		HindⅢ	1
EcoRⅠ	1
		ddH2O	补至20

将EP管放置于37℃金属浴中，静置1h。1h后进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见附图，并将克隆质粒送测序公司测序。

菌液扩大培养并进行无内毒素大提：将测序正确的菌液，按1％接种体积，扩大为200mL，37℃，220rpm/min摇菌过夜；用TIANGEN无内毒素大提试剂盒提取质粒，测浓度，调整为1μg/mL的浓度，-20℃保存。

本实施例中：从合成载体pUC57中将BET-E2、PS-E2、EP-E2片段酶切，然后与pCDNA3.1酶切线性化的载体连接，通过菌落PCR及双酶切鉴定，如图3、4所示，以及生工生物测序，确定pCDNA3.1-BET-E2、pCDNA3.1-PS-E2、pCDNA3.1-EP-E2重组质粒构建成功。其中pCDNA3.1-BET-E2、pCDNA3.1-PS-E2质粒图谱分别如图1和图2所示。

实施例3

本实施例以实施例2构建的pCDNA3.1-BET-E2、pCDNA3.1-PS-E2、pCDNA3.1-EP-E2重组质粒转染CHO-S细胞，实验过程如下：

CHO-S细胞培养，500mL体积摇瓶培养体积为100mL，生长至6*10⁶个/mL，进行转染。将ExpiFectamine CHO转染试剂上下颠倒4-5次，充分混匀。用OPTI-MEM稀释质粒，1800μLOPTI-MEM中加入80μg质粒，轻混。用OPTI-MEM稀释转染试剂ExpiFectamine CHO，1800μLOPTI-MEM中加入320μL Lipofectamine，轻混。将质粒缓慢加入转染试剂中轻混，室温静置3min，然后逐滴均匀加入到摇瓶中。转染后第一日及第五日加入Feed补料，于12天收获。

纯化：将细胞培养上清液1000rpm离心30min，取上清液，过0.45μm滤膜，上样。镍柱上样量为2-3个柱体积，流速为8ml/min。洗涤液为20Mm磷酸二氢钠+0.3M氯化钠，pH值为7.4，洗脱液为20Mm磷酸二氢钠+0.3M氯化钠+0.5M咪唑。收集样品混合后，取20uL进行SDS-PAGE检测，收集蛋白样品进行BCA蛋白含量检测。

本实施例中：CHO-S细胞培养体积为100mL转染三种质粒，镍柱纯化后如图5所示。纯化后样品进行BCA检测，检测的蛋白浓度如图6所示，其中CHO-S-BET-E2浓度为0.56g/L，CHO-S-EP-E2浓度为0.32g/L，CHO-S-PS-E2浓度为1.15g/L。

实施例4

本实施例以实施例1优化后的密码子连接PS猪间质胶原酶前体信号肽构建pEE12.4-PS-E2重组质粒，实验过程如下：

pEE12.4载体双酶切反应：标记好所需EP管，在1.5mL EP管中进行加样、混合反应体系及反应条件如上表所示。双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以及进行质粒DNA回收。

PS-E2及pEE12.4产物连接：准备洁净200μL EP管，做好标记，至于板子上待用；在200μL EP管按照pCDNA3.1-BET-E2进行加样、混匀；加样后，将10μL反应体系至于16℃过夜连接；第二日将连接产物取出，放置于4℃保存。用感受态DH5α进行转化，Amp+抗性LB平皿涂板培养，37℃培养箱中过夜培养，第二日观察转化结果。

菌落PCR扩增PS-E2及双酶切鉴定

PCR反应：

(1)引物设计及合成

上游引物：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’(SEQ ID NO：07)

下游引物：5’-AGTGATGGTGATGGTGATGT-3’(SEQ ID NO：08)

(2)加样体系10μL，如表7所示：

表7

加样成分名称	体积(μL)
		2×Mix	5
上游引物(10μM)	1
		下游引物(10μM)	1
ddH2O	补至10

(3)PCR扩增程序：

94℃，2min；

94℃，30s，57℃，45s，72℃，1min，30cycle；

72℃，10min，4℃，forever。

(4)PCR产物鉴定：

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，120v，30min，观测目的条带。

质粒抽提：将鉴定过的菌落挑进5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；将菌液12000rpm/min，2min离心，弃上清；用TIANGEN小提试剂盒按说明书提取质粒，-20℃保存质粒。

双酶切鉴定：标记好所需的1.5mL EP管，按照下表进行加样；

将EP管放置于37℃金属浴中，静置1h。1h后进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见附图，并将克隆质粒送测序公司测序。

菌液扩大培养并进行无内毒素大提：将测序正确的菌液，按1％接种体积，扩大为200mL，37℃，220rpm/min摇菌过夜；用TIANGEN无内毒素大提试剂盒提取质粒，测浓度，调整为1μg/mL的浓度，-20℃保存。

本实施例中：通过菌落PCR及双酶切鉴定，如图8、9所示，以及生工生物测序，确定pEE12.4-PS-E2重组质粒构建成功。连接产物后pEE12.4-PS-E2质粒图谱如附图7所示，其中HindⅢ与EcoRⅠ之间为PS-E2片段连接位置。

实施例5

本实施例以实施例4构建的pEE12.4-PS-E2重组质粒为基础，进一步构建表达PS-E2的细胞株，实验过程如下：

生物安全柜灭菌30min，培养基室温回温。悬浮细胞CHO-K1计数1*10⁶个/mL，铺24孔板500μL/孔，37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育过夜培养。24h后观察细胞状态，细胞交汇度为90％以上。用OPTI-MEM稀释质粒，125μL OPTI-MEM中加入1μg质粒，轻混，室温静置5min。用OPTI-MEM稀释转染试剂Lipofectamine，125μLOPTI-MEM中加入3μL Lipofectamine，再加入1.5μL plus，轻混，室温静置5min。将质粒缓慢加入转染试剂中轻混，室温静置5min，然后逐滴均匀加入孔中。将孔板放入培养箱中，静置6h，换正常培养基，过夜培养。

转染24h后开始加压，加入50μM MSX，加压7天，中间观察细胞。加压至阴性对照活率低于10％，进行单克隆筛选。转染细胞孔移至15mL离心管中，800rpm/min，离心5min，去上清。用CHO-2培养基重悬细胞计数，稀释至1.5个细胞/200μL，铺入96孔板中。24h后显微镜观察，记录单细胞孔。待细胞长满取上清液ELISA检测克隆是否为阳性株，若为阳性则继续扩大培养，冻存。经过筛选，收获3株细胞株。

本实施例中：经过细胞转染及单克隆筛选的过程后，得到三株表达量较高的细胞株分别为PS-C4-8、PS-C7-26、PS-22-24，取1mL上清液1000rpm/min离心10min，取20μL进行蛋白凝胶电泳，在55kd处均出现条带，如图10所示。剩余部分进行ELISA检测，取ELISA值最高的细胞株PS-C4-8进行培养基的筛选。

实施例6

本实施例采用摇瓶发酵培养并鉴定实施例5获得的表达猪瘟E2的细胞，实验过程如下：

将3细胞株细胞用125mL摇瓶，培养30mL体积，37℃，5％CO₂，100rpm摇床培养。分别在第3、5、7、9天补加葡萄糖至5g/L，在第4、9天按培养体积10％进行补料。在细胞活率低于50％收获。将收获样品进行检测，取ELISA值最高的细胞株进行培养基的筛选。

取200μL发酵细胞提取细胞基因组，用引物PS-F、PS-R进行PCR鉴定，产物进行琼脂糖凝胶电泳，120V，40min。比较目的片段长度，并送至生工生物进行测序确认。

本实施例中：通过进行30mL体积细胞发酵，发现PS-C4-8单克隆株(命名CHO-K1-JY)，其表达CSFV-E2蛋白且稳定，并在提取细胞基因组进行目的片段PCR，跑琼脂糖凝胶电泳，结果如图11所示，特异性目的片段在1200kd左右。片段大小正确，送生工测序鉴定后，确定其序列正确。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.提高E2蛋白表达量的重组基因，其特征在于，所述重组基因由信号肽的基因序列与E2蛋白的基因序列顺次连接得到；所述E2蛋白的基因序列如SEQ ID NO：01所示。

2.根据权利要求1所述重组基因，其特征在于，所述信号肽选自SEQ ID NO：02所示序列的信号肽、SEQ ID NO：03所示序列的信号肽或SEQ ID NO：04所示序列的信号肽中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的重组基因，其特征在于，所述信号肽选自SEQ ID NO：02所示序列的信号肽。

4.根据权利要求2所述的重组基因，其特征在于，所述信号肽选自SEQ ID NO：03所示序列的信号肽。

5.提高E2蛋白表达量的重组载体，其特征在于，由权利要求1-4任意一项所述重组基因连接至基础载体得到。

6.根据权利要求5所述重组载体，其特征在于，所述基础载体选自pCDNA3.1或者pEE12.4。

7.提高E2蛋白表达量的重组细胞，其特征在于，由权利要求5或6所述重组载体转染基础细胞得到。

8.根据权利要求7所述重组细胞，其特征在于，所述基础细胞选自CHO-K1或者CHO-S。

9.权利要求1-4任意一项所述重组基因，或者权利要求5或6所述重组载体，或者权利要求7或8所述重组细胞在提高E2蛋白表达量中的应用。

10.提高E2蛋白表达量的方法，其特征在于，包括：将权利要求1-4任意一项所述重组基因置于表达体系中表达得到E2蛋白。