KR20230107724A - 변형된 식물 배유체 특이 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

변형된 식물 배유체 특이 프로모터 및 이의 용도 Download PDF

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다이창 양
쿤펑 리
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우한 헬스젠 바이오테크놀로지 코포레이션
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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나로 표시되는 서열을 갖는 변형된 벼 배유체 (endosperm)-특이적 프로모터를 제공한다. 서열번호 2로 표시되는 EnhGt13a 프로모터는 시험관 내 (in vitro)에서 GUS 활성을 유도시키고, 벼 배유체 세포에서 이질 단백질 (foreign protein)의 발현을 매개하는데, 이는 변형되지 않은 Gt13a 프로모터 대비 현저하게 높은 발현을 나타낸다. 프로모터는 종자 품질의 개선, 분자 조작 (molecular pharming) 등의 분야에 적용될 수 있다.

Description

변형된 식물 배유체-특이적 프로모터 및 이의 용도
본 발명은 유전공학 및 생명공학 분야에 속하며, 특히, 인위적으로 변형된 식물 배유체-특이적 프로모터 EnhGt13a 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 유전공학을 통한 식물 세포의 다양한 재조합 단백질의 발현 및 생산은 분자 조작 (molecular pharming)으로도 알려져 있으며, 재조합 단백질 제품은 식물성 의약품 (plant-made pharmaceutical, PMP)로 알려져 있다. 현재, 유전자 조작 식물에서 성공적으로 발현된 재조합 약물은 호르몬, 항체, 효소, 사이토카인, 혈장 단백질 인자 및 백신을 포함한다. 분자 조작은 재조합 단백질 생산에서, 특히, 다음과 같은 이점을 가진 이상적인 재조합 단백질 시스템인 벼 배유체에서 많은 이점을 보여주었다: 1) 모델 식물로서, 벼는 명확한 유전적 배경 및 자세한 유전자 정보를 가진다; 2) 성숙한 유전적 형질전환 기술; 3) 벼는 자가수분 (self-pollinated)을 하고, 이화수분 (cross-pollination)의 빈도는 매우 낮아 보통 1 내지 5% 미만이며, 유전자 이동 (gene drift) 빈도는 0.036%에 불과하고, 꽃가루 (pollen)는 꽃밥 (anther)을 떠난 후 5분이 지나면 활동성을 잃으며, 양호한 생물학적 안전성을 가진다; 4) 벼 종자는 성숙 및 탈수 후 재조합 단백질이 쉽게 분해되지 않는 재조합 단백질을 위한 이상적인 저장소를 제공한다; 5) 종자는 장기간 보관을 위해 저장될 수 있다; 6) 벼 배유체는 용해도가 낮은 몇 가지 유형의 저장 단백질을 포함하고 있으며, 표적 단백질의 분리 및 정제에 대한 이점이 있다; 7) 최근 연구는 벼 배유체에서 생산된 재조합 당단백질이 낮은 면역원성을 나타낸다는 것을 보여주었다; 8) 벼는 현장에서 재배 및 관리가 더 쉬워, 유전자 조작 벼의 대규모 재배가 가능하게 한다.
재조합 단백질의 발현 정도는 제품 원가 및 시장 경쟁력에 직접적으로 영향을 미치며, PMP 제품의 시장 진입 여부에 영향을 미치는 핵심이다. 그러므로, 재조합 단백질 발현의 지속적인 개선은 분자 조작 연구에서 끊임없는 주제이다. 지난 20년 동안, 식물 세포에서 재조합 단백질의 발현 정도를 개선하기 위해, 광범위한 연구가 수행되었으며, 많은 진전이 있었다. 재조합 단백질의 발현을 개선하기 위한 전략은 주로 다음 측면에 중점을 둔다: 1) 전사 활성이 높은 프로모터를 사용하는 것은 외인성 유전자 전사 수준을 증가시키고, 종자에서 재조합 단백질의 특이적 발현을 가능하게 한다; 2) 벼 선호 코돈으로 표적 유전자의 코돈 최적화는 mRNA 불안정성 및 번역 단계에서 재조합 단백질 발현을 개선할 수 있는 잠재적 인트론 스플라이스 부위를 유발하는 희귀 코돈을 피할 수 있다; 3) 특정 5' 및 3' UTR의 선별은 번역 개시 및 mRNA 안정성을 높일 수 있다; 4) 특정 단백질 분류 신호를 사용하는 것은 특정 세포 내 액포 (subcellular vacuole)에서 재조합 단백질을 위치시키고, 재조합 단백질의 발현 정도를 증가시킬 뿐만 아니라, 후속 분리 및 정제도 가능하게 한다. 특히, 벼 배유체-특이적이고 강력한 프로모터인 Gtl 및 Gt13a 등을 사용하는 것과 같은 강력한 프로모터를 선택하는 것은 가장 효과적이다. 예를 들어, Gt13a 프로모터의 전사 활성은 Gt1 대비 최소 48.8% 더 높다 (Ning, et al. 2008, Oral administration of recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor expressed in rice endosperm can increase leukocytes in mice. Biotechnol Lett. 30:1679-1686).
특허 ZL200510019084.4 및 ZL200610019285.9는 벼 저장 단백질인 Gt13a 프로모터의 용도에 대해 기술한다. Gt13a 프로모터는 자연에서 벼를 인코딩하는 13개의 벼 저장 글루테닌 (glutenin) 유전자 중 가장 전사적으로 (transcriptionally) 활성화된 프로모터이지만 (Kusaba et al., (2003) Low glutelin content1: a dominant mutation that suppresses the glutelin multigene family via RNA silencing in rice. Plant Cell 15:1455-1467), 벼 배유체 세포에서 재조합 인간 혈청 알부민의 수율은 현미 1 kg당 최대 2.75 g까지 도달하였다 (He et al., (2011) Large-scale production of functional human serum albumin from transgenic rice seeds, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2011. vol. 108 (47): 19078-19083). 벼 배유체 세포에서 재조합 단백질의 발현을 더 증가시키기 위해서는 Gt13a 프로모터가 벼 저장 단백질 유전자 중 가장 강력한 프로모터이기 때문에, 자연의 Gt13a 프로모터보다 더 강한 프로모터를 찾는 것은 어렵다. 그러므로, 벼 배유체 세포에서 재조합 단백질의 발현을 높이기 위해서는 Gt13a보다 높은 전사활성을 가진 프로모터를 인위적으로 제조할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 벼 배유체 세포에서 재조합 단백질의 발현을 더 향상시키기 위한 인위적으로 변형된 배유체-특이적 프로모터 EnhGt13a (향상된 Gt13a) 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명은 다음의 기술적인 해결방안을 제공한다:
서열번호 1 내지 서열번호 5의 서열 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 변형된 식물 배유체-특이적 프로모터로, 구체적으로, 다음과 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
1) 서열번호 1로 표시된 바와 같은 DNA 서열을 가짐; 상기 서열은 Gt13a 프로모터의 5' 말단에서 281개 염기의 결실 (deletion)에 의해 Gt13aΔ281bp 절단된 (truncated) 프로모터이다 (서열번호 6으로 표시됨); 또는
2) 서열번호 2로 표시된 바와 같은 DNA 서열을 가짐; 상기 서열은 위치 322, 708 및 712에서 부위 지향적 G→T 돌연변이 및 위치 733에서 부위 지향적 G→A 돌연변이를 갖는 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열에 의해 인위적으로 변형된 AT가 풍부한 프로모터이다; 또는
3) 서열번호 3으로 표시된 바와 같은 DNA 서열을 가짐; 상기 서열은 서열번호 1로 표시되는 새로운 후보 프로모터 Gt13aΔ281+CAAT 모티프이며, 위치 620에서 새로운 CAAT을 생성하기 위한 CC에서 TT로의 돌연변이가 있고, 위치 340에서 세 개의 CAAT 반복 요소를 생성하기 위한 TACAAATGATGTGTCAATTA CA 서열의 삽입을 갖는다; 또는
4) 서열번호 4로 표시되는 DNA 서열을 가짐; 서열은 서열번호 1로 표시되는 DEL 새로운 후보 프로모터이며, 위치 301 내지 322에서 AAGTCATAACTGAT 모티프의 결실, 위치 555에서 CAGTG 요소의 결실, 및 위치 708에서 GAAAG에서 CAATT로의 돌연변이를 갖는다; 또는
5) 서열번호 5로 표시되는 DNA 서열을 가짐; 서열은 서열번호 1로 표시되는 새로운 GCN4 요소-풍부 후보 프로모터이며, 2개의 GCN4 요소를 증가시키기 위해 위치 808 및 841에서 각각 서열 ATATATCATGAGTCACTTCAT 및 AACAAACTCTATCTT AACATT의 삽입을 갖는다.
본 발명은 또한 상기 식물 배유체-특이적 프로모터 중 어느 하나를 포함하는 발현 카세트 (cassette)를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 식물 배유체-특이적 프로모터 중 어느 하나를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 식물 배유체-특이적 프로모터 중 어느 하나를 포함하는 숙주 박테리아를 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 조작 식물 세포주, 또는 상기 배유체-특이적 프로모터 중 하나를 포함하는 형질전환 식물 또는 세포주를 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 조작 또는 형질전환 식물의 제조에서 상기 식물 배유체-특이적 프로모터 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 임의의 재조합 단백질 또는 대사산물을 발현하는 유전자 조작 또는 형질전환 식물에서 상기 식물 배유체-특이적 프로모터의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 청구항 제1항의 식물 배유체-특이적 프로모터를 사용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 벼 배유체 세포에서 재조합 단백질의 발현을 더 향상시키기 위한 인위적으로 변형된 배유체-특이적 프로모터 EnhGt13a (향상된 Gt13a) 및 이의 용도를 제공한다.
발현을 부정적으로 조절하는 여러 전사 시스 (cis)-작용 요소 (리프레서 (repressor))는 제거되고, 발현을 긍정적으로 조절하는 새로운 시스-작용 요소 (인핸서 (enhancer) 또는 TATA 카세트 (TATA cassette) 및 매트릭스 부착 영역 (matrix attachment region, MAR)의 인핸서 등)는 Gt13a (Os01g0762500, EU264102)의 시스-작용 요소에 대한 부위 지향적 (site-directed) 돌연변이에 의해 생성된다. 일시적인 (transient) GUS 유전자 발현에 의해 테스트된 프로모터의 전사 활성을 증가시키고 외인성 단백질의 발현을 더욱 증가시키는 것은 벼 배유체에서 입증되었다.
본 발명은 다음의 기술적인 해결방안을 제공한다:
서열번호 1 내지 서열번호 5의 서열 중 어느 하나로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 변형된 식물 배유체-특이적 프로모터로, 구체적으로, 다음과 같은 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
1) 서열번호 1로 표시된 바와 같은 DNA 서열을 가짐; 상기 서열은 Gt13a 프로모터의 5' 말단에서 281개 염기의 결실 (deletion)에 의해 Gt13aΔ281bp 절단된 (truncated) 프로모터이다 (서열번호 6으로 표시됨); 또는
2) 서열번호 2로 표시된 바와 같은 DNA 서열을 가짐; 상기 서열은 위치 322, 708 및 712에서 부위 지향적 G→T 돌연변이 및 위치 733에서 부위 지향적 G→A 돌연변이를 갖는 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열에 의해 인위적으로 변형된 AT가 풍부한 프로모터이다; 또는
3) 서열번호 3으로 표시된 바와 같은 DNA 서열을 가짐; 상기 서열은 서열번호 1로 표시되는 새로운 후보 프로모터 Gt13aΔ281+CAAT 모티프이며, 위치 620에서 새로운 CAAT을 생성하기 위한 CC에서 TT로의 돌연변이가 있고, 위치 340에서 세 개의 CAAT 반복 요소를 생성하기 위한 TACAAATGATGTGTCAATTA CA 서열의 삽입을 갖는다; 또는
4) 서열번호 4로 표시되는 DNA 서열을 가짐; 서열은 서열번호 1로 표시되는 DEL 새로운 후보 프로모터이며, 위치 301 내지 322에서 AAGTCATAACTGAT 모티프의 결실, 위치 555에서 CAGTG 요소의 결실, 및 위치 708에서 GAAAG에서 CAATT로의 돌연변이를 갖는다; 또는
5) 서열번호 5로 표시되는 DNA 서열을 가짐; 서열은 서열번호 1로 표시되는 새로운 GCN4 요소-풍부 후보 프로모터이며, 2개의 GCN4 요소를 증가시키기 위해 위치 808 및 841에서 각각 서열 ATATATCATGAGTCACTTCAT 및 AACAAACTCTATCTT AACATT의 삽입을 갖는다.
바람직하게, 본 발명의 새로운 식물 배유체-특이적 프로모터는 서열 목록의 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 가장 바람직한 프로모터는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본 발명에 따르면, 새로운 식물 배유체-특이적 프로모터는 약제학적 또는 산업용 단백질 또는 폴리펩타이드 유전자를 인코딩하는 유전자, 구조 유전자, 조절 유전자, 구조 유전자의 안티센스 (antisense) 유전자, 구조 유전자의 발현을 유도하기 위한 조절 유전자의 안티센스 유전자, 조절 유전자, 구조 유전자의 안티센스 유전자 및 조절 유전자의 안티센스 유전자, 대사 산물을 조절하는 유전자, 대사산물을 조절하는 안티센스 유전자와 융합된다.
본 발명은 또한 상기 식물 배유체-특이적 프로모터 중 어느 하나를 포함하는 발현 카세트 (cassette)를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 식물 배유체-특이적 프로모터 중 어느 하나를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
상기 재조합 단백질 발현 벡터는 플라스미드 및 전달 벡터 내에 상기 발현 카세트를 포함하여 구성된 재조합 단백질 발현 벡터이다. 재조합 단백질 발현 벡터는 재조합 단백질 식물 발현 벡터이고, 재조합 단백질 발현 벡터는 상기 발현 카세트를 포함하며, 발현 카세트를 식물 숙주 세포, 조직 또는 기관으로 형질전환 시킬 수 있고, 그 자손은 숙주의 게놈에 통합될 수 있다.
재조합 단백질 발현 벡터는 Ti 플라스미드, Ri 플라스미드, 식물 바이러스 벡터, 직접 DNA 형질전환, 미세 주사 (microinjection), 아그로박테리움 매개 또는 유전자 총 (gene gun)과 같은 통상적인 유전자 형질전환 접근법을 사용하여 식물 세포, 조직 또는 기관으로 형질전환 될 수 있으며, 유전자 조작된 형질전환 식물 세포, 조직 또는 기관뿐만 아니라 완전한 식물과 이로부터 분화하고 재생하는 클론 또는 자손을 얻을 수 있다.
본 발명은 또한 상기 식물 배유체-특이적 프로모터 중 어느 하나를 포함하는 숙주 박테리아를 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 조작 식물 세포주, 또는 상기 배유체-특이적 프로모터 중 하나를 포함하는 형질전환 식물 또는 세포주를 제공한다.
본 발명은 또한 유전자 조작 또는 형질전환 식물의 제조에서 상기 식물 배유체-특이적 프로모터 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 임의의 재조합 단백질 또는 대사산물을 발현하는 유전자 조작 또는 형질전환 식물에서 상기 식물 배유체-특이적 프로모터의 용도를 제공한다.
상기 식물 배유체-특이적 프로모터를 사용하여 외인성 유전자의 식물 배유체-특이적 발현을 일으키는 방법 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
외인성 유전자의 배유체-특이적 발현을 하는 식물을 육종하는 (breeding) 방법은 배유체에서 외인성 유전자를 특이적으로 발현시키는 형질전환 식물을 선별하기 위해 식물 발현 벡터를 식물에 형질전환 시키는 것을 포함한다.
상술한 임의의 형질전환 식물은 외떡잎식물 (monocotyledonous) 또는 쌍떡잎식물 (dicotyledonous)이다. 외떡잎식물은 벼, 밀, 옥수수, 보리, 밤, 수수 또는 귀리 등과 같은 목초성 (graminaceous) 식물일 수 있다; 쌍떡잎식물은 대두, 유채 또는 해바라기 등일 수 있다.
본 발명은 또한 청구항 제1항의 식물 배유체-특이적 프로모터를 사용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 다음 단계를 포함한다:
1) 청구항 제1항의 식물 배유체-특이적 프로모터를 사용하여 벼 배유체-특이적 중간 벡터를 구성하는 단계;
2) 재조합 단백질 유전자를 합성하는 단계;
3) 단계 1의 벡터를 단계 2의 유전자와 작동가능하게 연결 (operably ligating)하여, 프로모터에 의해 유도되는 재조합 단백질 발현을 위한 벡터를 얻는 단계;
4) 단계 3의 발현 벡터로 식물을 형질전환하고, 배유체에서 재조합 단백질을 발현시키는 단계;
5) 식물로부터 재조합 단백질을 추출 및 정제하는 단계.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 재조합 고양이 혈청 알부민 (feline serum albumin, FSA)의 제조방법을 제공하며, FSA 유전자는 서열번호 7로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
Gt13a 프로모터와 비교하여, 본 발명의 변형 프로모터의 유익한 효과는 다음과 같다:
1) 새로운 프로모터 서열은 Gt13a의 결실을 통해 얻었으며, 이는 변형되지 않은 프로모터와 비교하여 β-glucosidase (GUS) 유전자의 전사활성을 7.2% 증가시킨다;
2) Gt13a의 결실 형태에서 시스-요소의 코어 부위의 돌연변이에 의해 얻어진, EnhGt13a로 명명된 새로운 프로모터는 시험관 내에서 벼 미성숙 (immature) 배유체의 일시적인 GUS 발현 시스템을 사용한 Gt13a 프로모터와 비교하여 상대 (relative) GUS 활성을 28.52% 증가시킨다;
3) 본 발명의 EnhGt13a 프로모터는 외인성 유전자의 안정적인 발현을 유도시켜, 외인성 재조합 단백질인 FSA의 배유체 생물반응기 (bioreactor) 내 수준은 변형되지 않은 Gt13a 프로모터와 비교하여 46.57%로 유의하게 증가되었다.
4) 벼 배유체에서 GUS 리포터 유전자의 발현을 유도시키는 본 발명의 EnhGt13a 프로모터는 모든 배유체 종자 식물에 적합하고, 특히, 약제학적 단백질 (pharmaceutical protein)을 발현하는 유전자 조작 벼 품종을 육종 시키는데 적합하다.
5) 본 발명의 EnhGt13a 프로모터는 배유체 내 외인성 단백질의 발현 및 축적을 유의하게 향상시킬 수 있어, 생명공학을 이용한 종자 품질 개선 및 분자 약제학 연구의 토대를 만들었으며, 넓은 응용 가능성을 가진다.
도 1. GUS 발현을 유도시키는 벡터, pOsPMP42의 구조 모식도;
도 2. 미성숙 벼 배유체 발현에서 GUS 일시적인 발현의 염색 이미지;
도 3. 인위적으로 변형된 프로모터에 의해 매개된 상대 GUS 활성의 비교 다이어그램;
도 4. 벼 배유체-특이적 발현 벡터, pOsPMP849 및 pOsPMP852의 구조 모식도;
도 5. T0 세대 식물에서 표적 유전자의 PCR 생성물의 전기영동도;
도 6. pOsPMP849를 사용한 T0 세대 종자로부터 추출된 FSA 단백질의 SDS-PAGE;
도 7. pOsPMP852를 사용한 T0 세대 종자로부터 추출된 FSA 단백질의 SDS-PAGE;
도 8. Gt13a 및 EnhGt13a 프로모터에 의해 유도된 벼 배유체에서 FSA 발현 정도의 비교 다이어그램.
이하, 본 발명의 이점을 보다 잘 이해하기 위하여, 본 발명의 기술적 사상을 실시예 및 도면 데이터를 통해 상세히 설명한다. 제공된 실시예는 본 발명의 방법의 예시적인 실시예로 해석되어야 하며, 본 발명이 개시하는 기술적 제안 및 보호 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것을 의미하지 않는다.
실험 재료:
벡터 pOsPMP42, 벡터 pOsPMP002: Ning, et al. 2008, Biotechnol Lett. 30:1679-1686에 따라 준비됨.
금 마이크로캐리어 (microcarrier): Cat. No: 1652263, BioRad, Inc.
pBI221 벡터: Clontech, Inc., USA
pUC57 벡터: GenScript Biotech Corporation
E. coli 염색 DH5α: Cat. No: 9057, Takara Corporation
아그로박테리움 플라스미드 pCAMBLA1300: Cat. No:HG-VZC0323, CAMBIA (Australia)
벼 (Oryza sativa): 품종 9-2-5
아그로박테리움 EHA105: Cat.No:MF2302-1000UL, MKBio Inc.
유전자 총 PDS-1000/He: BioRad Inc.
마이크로플레이트 리더: 분광광도계, Varioskan, Thermo Scientific Inc.
[실시예 1] 벼 배유체 프로모터 GT13a 의 클로닝, 시퀀싱 및 생물정보학 분석
1. 벼 배유체-특이적 프로모터 GT13a 의 부위-지향적 돌연변이
벼 배유체 Gt13a 프로모터 서열의 생물정보학 분석은 식물 시스-작용 요소에 대한 온라인 분석 도구인 PLANTCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)를 사용하여 수행되었다. 결과는 벼 배유체 Gt13a 프로모터가 AACA-모티프, CAAT-박스 및 GCN4-모티프와 같은 배유체-특이적 조절 요소를 가지고 있음을 보여주었다. 인위적으로 변형된 5개의 프로모터 서열은 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명에 의해 설계되었다.
서열번호 변형된 프로모터 변형 부위
1 Gt13aΔ281bp Gt13aΔ1 내지 281
2 Gt13aΔ281bp+AT Gt13aΔ281bp, 위치 322, 708 및 712에서 G→T; 위치 736에서 G→A.
3 Gt13aΔ281+CAAT Gt13aΔ281bp, 새로운 CAAT를 생성하기 위한 위치 620에서 CC에서 TT로의 돌연변이; 세 개의 CAAT 반복 요소를 생성하기 위해 위치 340에서 삽입된 TACAAATGATGTGTCAATTACA 서열.
4 Gt13aΔ281/Del Gt13aΔ281bp, 위치 301 내지 302에서AAGTCATAACTGAT 모티프는 결실되었다; 위치 526에서 CAGTG 요소는 결실되었다; 위치 708에서 GAAAG에서 CAATT로 변형되었다
5 Gt13aΔ Gt13aΔ281bp, ATATCATGAGTC ACTTCAT서열은 위치 808에 삽입되었다; AACAAACTCTATCTTAACATT 서열은 위치 841에 삽입되었다; 두개의 GCN4 요소는 추가되었다
6 Gt13a (CK) 대조군으로서 변형되지 않은 프로모터
표 1에서:
프로모터 Gt13aΔ281bp (서열번호 1)는 프로모터 Gt13a의 5' 말단에서 281bp의 결실에 의해 얻어졌으며, 상기 프로모터는 음성 전사 조절 인자 WRKY의 2개의 시스-작용 요소를 포함한다;
프로모터 Gt13aΔ281bp+AT (서열번호 2)는 서열번호 1을 기반으로 얻어졌으며, TATA BOX5 (TTATTT)뿐만 아니라 새로운 매트릭스 결합 영역을 생성하기 위한; 위치 322, 708 및 712에서 G→T, 위치 733에서 G→A, 위치 710에서 전사 활성 인자 시스 조절 요소 TAAAG를 생성하기 위한 점 돌연변이; 및 위치 701 및 706에서 TATA BOX 서열을 생성하기 위한 점 돌연변이를 갖는다;
프로모터 Gt13aΔ281bp+CAAT (서열번호 3)는 서열번호 1을 기반으로 얻어졌으며, 위치 620에서 새로운 CAAT를 생성하기 위한 CC에서 TT로의 돌연변이, 및 340 위치에서 세 개의 CAAT 반복 요소를 생성하기 위해 삽입된 TACAAATGATGTGTCAATTACA 서열을 갖는다;
프로모터 Gt13aΔ281/Del (서열번호 4)는 서열번호 1을 기반으로 얻어졌으며, 위치 301 내지 322에서 AAGTCAT AACTGAT 모티프는 결실되었고; 위치 526의 CAGTG 요소는 결실되었으며; 위치 708에서 GAAAG에서 CAATT로의 돌연변이를 갖는다.
프로모터 Gt13aΔ (서열번호 5)는 서열번호 1을 기반으로 얻어졌으며, ATATATCATGAGTCACTTC AT서열은 위치 808에서 삽입되었고; AACAAACTCTATCTTAACATT서열은 위치 841에서 두개의 GCN4 요소를 생성하기 위해 삽입되었다.
인위적으로 변형된 프로모터 서열은 진스크립트 바이오테크 코포레이션 (GenScript Biotech Corporation)에 의해 합성되었다. 합성된 서열을 GUS 발현 벡터에 연결시켜, 인위적으로 변형된 다양한 프로모터에 의해 유도되는 일련의 GUS 유전자 발현 플라스미드를 생성하였다. 도 1은 벡터 중 하나인, pOsPMP42의 구조를 나타낸다.
[실시예 2] 인위적인 프로모터의 GUS 전사 활성 확인
인위적으로 변형된 프로모터가 배유체에서 전사 활성을 향상시키는지 여부를 확인하기 위해, 일시적인 발현 시스템으로서 미성숙 벼 배유체 세포를 사용하였다. 인위적으로 변형된 프로모터에 의해 유도되는 GUS 일시적 발현 벡터를 구축하였다. 프로모터의 전사 활성은 시험관 내 미성숙 벼 배유체 세포에서 GUS 일시적 발현에 의해 확인되었다. 주요 단계는 다음과 같다:
1. 금 마이크로캐리어의 전처리
1) 직경 1 μm의 금 마이크로캐리어 50 mg를 칭량하고 1.5 ml 원심분리기 튜브에 넣었다;
2) 1 ml의 무수 에탄올을 추가하였다;
3) 매 30초 동안 초음파 처리 후, 30초 간격으로 2분 동안 아이스 배쓰 (ice bath)에서 초음파 처리를 하였다;
4) 1초 동안 4000 rpm 미만으로 원심 분리하였고, 상층액을 빨아들였다;
5) 1 ml의 멸균 증류수를 추가하였고, 2분 동안 아이스 배쓰에서 초음파 처리를 하였으며, 단계 3과 4를 반복하며 상층액을 제거하였다;
6) 단계 5를 한 번 더 반복하였다;
7) 1 ml의 멸균 증류수를 추가하였고, 아이스 배쓰에서 초음파 처리를 하였으며, 사용을 위해 재현탁하였다 (50 mg/ml 금 마이크로캐리어 현탁액).
2. 벡터 DNA로 코팅
1) 50 μl의 금 마이크로캐리어 현탁액을 취한다;
2) 15 μg의 GUS 플라스미드 DNA 및 15 μg의 LUC 플라스미드 DNA를 포함하는 30 μl (2 μg/μl)의 플라스미드 DNA를 추가한다;
3) 50 μl의 2.5 M 염화칼슘을 천천히 점적하여 가하고 볼텍싱 (voltexing)해준다;
4) 20 μl의 0.1 M 스페르미딘 (spermidine)을 천천히 점적하여 가하고 볼텍싱해준다;
5) 혼합액을 1분 간격으로 10분 동안 볼텍싱을 이용하여 잘 섞어준다;
6) 상층액을 제거한다;
7) 튜브 바닥에 있는 금 마이크로캐리어를 재현탁하기 위해 50 μl의 무수 에탄올을 추가한다;
8) 코팅된 금 입자를 세척하기 위해 또 다른 500 μl의 무수에탄올을 추가한다;
9) 간단한 원심분리 및 상층액을 제거한 후, 즉시 사용하기 위해 40 μl의 무수 에탄올에 의해 재현탁되었다;
10) 12 μl의 재현탁액을 취하고 멸균된 캐리어 멤브레인의 중심에 추가한다.
3. 유전자 폭격 (bombardment)에 의한 미성숙 벼 배유체 세포에서 GUS의 일시적 발현
1) 미성숙 벼 배유체의 분리. 개화 7일 내지 10일 후 벼 원추꽃차례 (panicle)를 취하고, 1분 동안 70% 알코올로 멸균시켰으며, 15분 동안 20% 차아염소산나트륨로 멸균시키고, 멸균 증류수로 5회 세척한 후 사용을 위해 멸균 증류수에 벼 원추꽃차례를 넣었다.
2) 두 겹의 여과지가 있는 페트리접시에 적정량의 TAIB (20 mM NH4NO3, 100 μg/ml 세포탁심 (Cefotaxime), 100 μg/ml 티멘틴 (Timentin)이 보충된 완전 배지) 배지를 넣었다. 외과용 메스 (scalpel)는 미성숙 배아를 자르기 위해 사용되었고, 그 다음 완전한 미성숙 배유체를 부드럽게 짜내고, TAIB를 포함하는 배지의 중앙에 배치하였으며, 각 접시에 약 15개의 미성숙 배유체를 넣었다.
3) PDS-1000/He 유전자 총은 제조업체의 지침에 따라 형질전환을 위해 사용되었다.
4) 폭격된 미성숙 배유는 25℃에서 밤새 배양되었다.
4. GUS 염색의 정성 분석
미성숙 벼 배유체에서 GUS 일시적 발현 시스템의 생존율을 테스트하기 위해, 형질전환된 미성숙 배유체를 25℃에서 18시간 내지 24시간 동안 배양하였다. 접시 내 배지액을 흡인하고 2 ml의 GUS 염색 용액을 배유체에 직접적으로 첨가하였다. 37℃에서 2 내지 10시간 발색 후 관찰 및 이미지를 촬영하였다.
5. 배유-특이적 프로모터에 의해 매개되는 상대적 전사 활성의 정량 GUS 분석
1) 폭격된 미성숙 벼 배유는 25℃에서 24시간 동안 배양되었다. 배유체는 원심분리 튜브로 옮기고 분쇄한 후, 55 μl의 추출 용액 (루시퍼레이즈 (Luciferase) 세포 배양 용해 시약, 1X, Promega Ltd, USA, Cat no. E1500)으로 추출하고 13,000 rpm에서 5분 동안 원심 분리하였다. GUS 및 LUC 활성을 각각 검출하기 위해 각 상층액 샘플 20 μl를 96 well ELISA 플레이트에 분주하였다.
2) LUC의 정량 분석: 100 μl의 반응 시약 (루시퍼레이즈 검출 시약, Promega Ltd., USA, Cat no. E1500)은 추출용 용제 (extratant)에 추가되었고, 25분 동안 25℃에서 배양되었다. 그리고 샘플은 LUC 활성을 얻기 위해 마이크로플레이트 리더를 사용하여 화학발광 방법으로 검출되었다.
3) GUS의 정량 분석: 10 μl의 4-MUG (2 mmol/L)는 샘플에 추가되었고, 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 그 후, 정지용액 (200 mM Na2CO3)에 의해 반응이 정지되었다. 형광 값은 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 방출 광원 (emission light)의 경우, 445 nm, 여기 광원 (excitation light)의 경우, 365 nm에서 측정되었다. 각 샘플의 GUS 활성 값을 얻었다. 2단계와 3단계에서 측정한 LUC 및 GUS 활성 값을 바탕으로 상대적인 GUS 유전자 효소 활성도를 계산하였다.
6. 실험적 결과
1) 미성숙 벼 배유체의 일시적 발현 시스템이 작동하는지 여부를 테스트하기 위해, 폭격 (bombardment)을 매개로 형질 전환된 미성숙 배유체에 대해 GUS 염색을 수행하였다. 결과는 모든 미성숙 벼 배유체 세포가 GUS 염색 시약에 의해 염색될 수 있다는 것을 보여주었으며, 이는 미성숙 벼 배유체의 일시적인 발현 시스템이 정상적으로 작동하고 있음을 나타낸다 (도 2).
2) 미성숙 벼 배유체 세포에서 다섯 개의 변형된 배유체-특이적 프로모터의 상대적인 GUS 활성 분석은 Gt13a 프로모터를 대조군으로 사용하여 측정되었다. 결과는 5' 말단에서 281 bp가 결실된 프로모터 (Gt13aΔ281)의 상대적인 GUS 활성은 대조군 Gt13a 프로모터에 비해 7.27% 증가된 것으로 나타났다. 전사활성의 중심 영역에서 부위-지향적 돌연변이를 갖는 프로모터 (Gt13aΔ281+AT)의 상대적인 GUS 활성은 대조군인 Gt13a 프로모터와 비교하여 28.53% 증가되어, 유의미한 수준 (P<0.05)에 도달하였다. Gt13aΔ281+CAAT의 상대적인 GUS 활성은 Gt13a 프로모터와 비교하여 23.08% 감소되었다. Gt13aΔ281+DEL의 상대적인 GUS 활성은 Gt13a 프로모터와 비교하여 64.49% 감소되었다. Gt13aΔ281+GCN4의 상대적인 GUS 활성은 Gt13a 프로모터와 비교하여 86.53% 감소되었다 (도 3). 결과는 Gt13a 프로모터의 5' 말단에서 두개의 음성 조절 시스-작용 요소의 결실을 갖는 프로모터 (Gt13aΔ281) 및 중심 전사 조절 영역에서 AT의 부위-지향적 돌연변이를 갖는 프로모터 (Gt13aΔ281+AT)는 미성숙 배유체 일시적 발현 시스템에서 전사 활성을 유의하게 증가시킬 수 있다는 것을 보여주었다.
[실시예 3] 돌연변이 부위의 기능적 분석
결실 후 새로운 시스 요소 생성 및 부위-지향적 돌연변이 발생의 여부를 밝히기 위해, 전사활성이 현저히 증가한 두개의 인위적으로 변형된 프로모터 시스 작용 요소는 PLACECARE 프로모터 분석 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
Gt13aΔ281bp (서열번호 1)의 시스-작용 요소의 분석 결과는 전사 음성 조절자 WRKY의 2개의 시스-작용 요소가 포함된 Gt13a의 5' 말단에서 결실된 281bp를 보여주었다 (표 2 참고). Gt13aΔ281bp로부터 2개의 전사 음성 조절자 WRKY 모티프를 제거한 결과 Gt13a 프로모터에 비해 상대적인 GUS 활성이 7.2% 증가하였다.
인자 또는 부위 이름 Loc.(Str.) 신호 서열 신호 서열 기능 정의 참조
WRKY71OS 70(+) TGAC S000447 음성조절자 Plant Physiol. 134:1500-1513(2004)
WRKY71OS 77(-) TGAC S000447 음성조절자
Gt13aΔ281bp+AT (서열번호 2)의 점 돌연변이의 분석은 복수의 양성 전사 조절 시스-작용 요소는 부위-지향적 AT 돌연변이에 의해, 즉, 701 및 706 위치에서 AT의 부위 지향적 점 돌연변이가 생성되고, 1) AAGAA 모티프의 전사 리프레서 (repressor)가 제거되며 (Intnatl Rev Cyto Vol 119:57-96); 2); 2) 새로운 핵 매트릭스 부착 영역 및 TATA BOX5 (TTATTT)가 생성되고 (Matrix Attachment Region, Plant Journal, 21, 281-288); 3) TATA 박스 서열이 추가되며; 4) 위치 710에서 점 돌연변이는 전사 활성 조절자 시스-작용 요소 TAAAG가 생성되고; 위치 317에서 점 돌연변이는 조직 특이성이 증가한 새로운 시스-작용 요소 CAAT BOX1 및 DPBF CORE DCDC3 전사 활성 조절자 ZIP 결합인자를 생성된다는 것을 보여주었다 (표 3).
인자 또는 부위 이름 Loc.(Str.) 신호 서열 신호 서열 기능 정의
CAAT BOX1 317(+) CAAT S000028 조직 특이성 증가
DPBF CORE DCDC3 329(+) ACACNNG S000292 ZIP 결합 부위
-300 ELEMENT 701(+) TGHAAARK S000122 AAGAA 리프레서 cis 요소
TATA BOX5 705(-) TTATTT S000203 생성된 TATA box
MARA BOX1 706(+) AATAAAYAAA S000063 핵 매트릭스 부착 영역 MAR을 추가
TAAAG STKST1 712(+) TAAAG S000387 전사 활성제 cis-작용 요소
그러므로, 본 발명의 프로모터 Gt13aΔ281+AT는 유의적으로 유전자 발현을 향상시켰으며, 이 프로모터를 EnhGt13a (향상된 Gt13a)로 명명하였다.
[실시예 4] EnhGt13a 프로모터의 응용
벼 배유체 세포에서 EnhGt13a를 사용한 배유체 내 재조합 단백질 발현 개선 효과를 확인하기 위해, 고양이 혈청 알부민 (FSA) 유전자를 포함하는 각각 Gt13a 및 EnhGt13a에 의해 매개되는 두 개의 발현 벡터를 제작하였고, EnhGt13a 프로모터가 벼 배유체 세포에서 고양이 혈청 알부민의 발현을 향상시킬 수 있는지 확인하기 위해 사용되었다.
1. 발현 벡터의 제작
발현 중간 벡터는 EnhGt13a를 사용하여 제작되었다. Gt13a 신호 펩타이드를 갖는 EnhGt13a 프로모터의 930bp DNA 조각은 중간 플라스미드를 생성하기 위해 pBI221 벡터에 클로닝되었고, 그 다음 pOsPMP862로 명명된 벼 배유체-특이적 중간 벡터 균주를 구축하기 위해 E. coli 균주 DH5α에 도입되었다.
성체 고양이 혈청 알부민 유전자 (Gene Bank 등록번호 NP_00109961.1)의 아미노산 서열 (서열번호 8)은 미국 국립생물공학정보센터 (NCBI) 유전자 은행 (Gene Bank)으로부터 얻었고, 합성 FSA 유전자 (서열번호 7)에 나타낸 바와 같이, FSA 유전자의 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열로 전환되었으며, 벼 선호 유전적 코돈을 사용하여 최적화되었다. FSA 유전자의 인위적 합성에서, 제한 엔도뉴클레이즈 MlyI 및 XhoI 부위는 유전자의 양쪽 말단에 추가되었고, 그 후, pOsPMP850으로 명명된 pUC57 벡터 (Kingsray Biosciences Ltd.) 내로 클로닝되었다.
Gt13a 매개 FSA 발현 벡터를 구축하기 위하여, pOsPMP850 DNA는 MlyI 및 XhoI에 의해 분해되어 합성 FSA 유전자를 얻었고, 그 후, NaeI 및 XhoI에 의해 분해된 pOsPMP002 중간 벡터에 연결되어 pOsPMP848로 명명되었다; pOsPMP848은 HindIII 및 EcoRI로 분해되어 전체 발현 카세트를 얻었고, 그 후 아그로박테리움 플라스미드 pCAMBIA1300의 동일한 효소부위에 연결되어 pOsPMP849로 명명된 벡터를 생성하였다 (도 4).
EnhGt13a 매개 발현 벡터를 제작하기 위해, pOsPMP 850 플라스미드 DNA는 MylI 및 XhoI에 의해 분해되었고, FSA DNA 단편을 얻었다. 그 후, NaeI 및 XhoI에 의해 분해된 플라스미드 pOsPMP862에 연결되었다. 생성된 플라스미드는 pOsPMP851로 명명되었다. pOsPMP851 플라스미드 DNA는 HindIII 및 EcoRI에 의해 분해되었고, 전체 발현 카세트 DNA 단편을 얻었으며, 그 후, 동일한 효소에 의해 분해된 아그로박테리움 플라스미드인 플라스미드 pCAMBIA1300에 연결되었다. 생성된 플라스미드는 pOsPMP852 (도 4)로 명명되었다.
아그로박테리아-매개 유전자 형질 전환을 위해, pOsPMP849 및 pOsPMP852 벡터는 각각 아그로박테리움 EHA105 내로 이동되었다.
2. 아그로박테리아-매개 유전자 형질전환 과정
2.1 캘러스 (Calli) 유도
1) 성숙 벼 종자의 껍질을 벗기고, 70% 알코올에 1분 동안 담가 멸균한 후, 20% 차아염소산나트륨으로 30분간 더 처리하였다;
2) 멸균 증류수로 5 내지 7회 세척하였다;
3) 멸균된 종자는 각 접시에 6 내지 8개를 유도 배지 (N6배지)에 접종하였다;
4) 약 5 내지 7일 동안 32℃에서 광 처리하였다.
2.2 아그로박테리움 준비
플라스미드 pOsPMP849 및 pOsPMP852 각각을 포함하는 아그로박테리움은 28℃에서 2 내지 3일동안 카라마이신 (Caramycin)이 함유된 평평한 접시에서 배양되었다.
2.3 아그로박테리움의 단일 콜로니는 접종 루프를 사용하여 현탁 배지 (AAM 액체 배지)에 채취하고, 28℃에서 진탕(160rpm) 배양되었다. 일반적으로 접종 루프를 사용하여 100ml의 배지를 3 내지 4개의 루프로 긁어낼 수 있다.
2.4 아그로박테리움 감염 (공동 배양 (Co-incubation))
1) 캘러스 조직은 멸균된 삼각 플라스크에 이동되었다;
2) 아그로박테리움 현탁액의 OD-600 값은 0.05 내지 0.1 사이로 조정되었다;
3) 캘러스는 AAM 배지에 현탁되었고, 1.5분 동안 연속 진탕 배양되었다;
4) 아그로박테리움 용액을 버리고, 여분의 용액을 멸균 여과지에 닦아낸 후, 캘러스 조직을 멸균 여과지에 올려 30분 내지 45분 동안 물기를 제거한다;
5) 멸균 여과지는 2N6-AS 배지에 올려두었다. 그 다음 AS (아세토시린곤 (acetosyringone), 250 mg/ml)을 포함하는 500 μl의 AAM을 멸균 여과지에 방울로 떨어뜨리고, 감염된 캘러스는 여과지에 올려 두고, 암 조건에서 25℃에서 3일동안 공동 배양되었다.
2.5 물 세척 및 스크리닝
1) 캘러스 조직은 멸균 삼각 플라스크에 이동되었다;
2) 캘러스 조직은 멸균 증류수로 5 내지 7회 세척되었다;
3) 감염된 캘러스 조직은 0.5 g/L의 세팔렉신 (cephalexin)을 포함하는 증류수에 약 30분간 담근 후, 그 다음 20 내지 30분 동안 28℃에서 180 내지 200 RPM으로 진탕되었다.
4) 항생제를 포함하는 멸균 증류수를 붓고, 삼각 플라스크를 여과지를 포함하는 멸균 배양 접시에 거꾸로 놓고 약 15분간 보관하였다;
5) 캘러스 조직은 멸균 여과지 위에서 건조되었다;
6) 캘러스 조직은 HPT 항생제를 포함하는 선택적 배지에 20 내지 30일동안 이동되었다.
2.6 캘러스 조직 분화
20일 내지 30일 동안 선별한 후, HPT 저항성을 가진 캘러스 조직을 분화 배지 (N6 배지)로 옮겨 26℃에서 20 내지 30일동안 광조건에서 배양하였다.
2.7 발근 (Rooting)
20일 내지 30일 분화 후, 분화배지로부터 분화된 묘목은 1/2 MS를 포함하는 배지에 옮겨졌고, 28℃, 광조건에서 30일 동안 배양하여 발근시킨 후 밭으로 옮겨 생육시켰다.
3. 유전자 조작 묘목 (planting)의 식별 및 재배
3.1 게놈 DNA의 추출
1) T0 세대 HPT-양성 식물체의 잎 약 2 cm를 튜브 안에 넣고, 600 μl의 CTAB 추출 버퍼 (2% CTAB, 1.38 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl, 20 mM EDTA, pH 8.0)를 추가하였으며, 진동 파쇄기로 분쇄 후, 65℃ 워터 배쓰 (water bath)에서 60분 동안 배양하였다. 동량의 클로로포름/이소아밀 알코올 (isoamyl alcohol)을 추가하였고, 인버팅 (inverting)으로 부드럽게 혼합한 후, 10분 동안 12000 rpm에서 원심 분리하였다. 상층액은 새로운 1.5 ml 원심분리 튜브에 옮겨졌고, 동량의 이소프로판올을 추가하고, 인버팅으로 부드럽게 혼합하였다. 60분 동안 상온에서 보관 후, 재료는 10분 동안 12000 rpm에서 원심 분리되었다. 상층액을 제거하고, DNA 침전물을 미리 냉각된 70% 에탄올로 헹구고 공기 건조를 시켰다. 그런 다음, DNA를 80 μl의 TE 버퍼에 용해시키고, 사용을 위해 -20℃에 보관하였다.
2) PCR 증폭
게놈 DNA는 유전자 조작된 식물의 잎으로부터 추출되었고, FSA-특이적 프라이머 (서열번호 9로 나타낸 순방향 프라이머 서열: AGCTACCAGGGCAACAGCGA; 서열번호 10으로 나타낸 역방향 프라이머 서열: ATCTCGTAGAGGTACTTGCCGA)를 사용하여 PCR에 의해 식별되었다. PCR 분석은 다음과 같이 수행되었다:
1) 1 μl의 벼 게놈 DNA는 주형으로 사용되었고, 양성 (플라스미드 DNA) 및 음성 (멸균 증류수) 대조군이 제공되었다.
2) PCR 증폭 반응은 2.5 μl의 10X 버퍼, 0.15 μl의 5 U/μl rTaqase, 4 μl의 2.5 mM dNTP, 각각 0.5 μl의 순방향 및 역방향 프라이머로 구성되었으며, ddH20 25 μl를 추가하였다.
3) 94℃에서 5분간 사전 변성 후, 94℃에서 30초간 변성 (denaturation), 55℃에서 30초간 어닐링 (annealing), 72℃에서 40초간 연장 (extension)하는 35사이클을 반복하고, 72℃에서 10분간 최종 연장하였다.
4) PCR 증폭 산물을 1% 아가로스 젤에 전기영동하였고, EB로 염색하였다. PCR 결과는 젤 이미저 (imager)로 관찰되었다.
4. 발현 정도의 결정
T0 종자로부터 생산된 T1세대 종자는 FSA 단백질 분석을 위해 수확되었고, 구체적인 단계는 다음과 같다:
1) 조 배유체 단백질 추출: 5개의 곡물의 껍질을 벗기고 (현미 약 77 mg) 쌀가루로 분쇄한 다음 1 ml의 추출 용액 (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5)으로 상온에서 60분 동안 추출한 뒤, 13000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액은 SDS-PAGE 분석에 사용되었다.
2) SDS-PAGE 분석: 50 μl의 조 추출물 또는 5 μg의 FSA 표준 단백질은 10 μl의 샘플 완충액과 함께 첨가되었고, 5분 동안 100℃에서 변성되었다. 10 μl의 각 샘플은 10% 폴리프로필렌 젤 변성 젤에 로딩되었고, 160 V에서 45분 동안 전기영동하였다. 그 다음 0.1 mg/ml 코마스 브릴리언트 블루 (Komas Brilliant Blue)를 사용하여 염색되었고, 탈색한 다음 이미지를 촬영하였다.
3) 재조합 FSA 발현의 반정량적 분석. 각 라인의 FSA 발현은 동일 SDS-PAGE 젤에서 FSA의 알려진 함량의 그레이 스케일을 기준으로 반정량적으로 분석되었다. 각 라인의 FSA 단백질 함량은 그레이 스케일에 따라 계산되었다.
5. 결과 및 분석
1) 표적 유전자 양성 식물의 식별
순방향 프라이머 (서열번호 9로 나타냄)로서 프로모터 부위 특이적 서열을 사용하는 것 및 역방향 프라이머 (서열번호 10으로 나타냄)로서 FSA 유전자 특이적 서열, 14개의 표적 유전자 양성 T0 식물의 pOsPMP849 (Gt13a 프로모터) 및 36개의 표적 유전자 양성 식물의 pOsPMP852 (EnhGt13a)는 PCR로부터 얻었다 (도 5). 이 식물들은 성숙기까지 자랐으며, 이 중 총 10개의 pOsPMP849 식물에서 씨앗이 생산되었고, 총 20개의 pOsPMP852 식물에서 씨앗이 생산되었다.
2) FSA 발현의 반정량 분석
각 균주의 FSA 발현을 대략적으로 추정하기 위해, 그레이 스케일 비교를 참조로서 FSA의 농도가 알려진 동일한 PAGE 젤을 사용하여 수행하였고, FSA의 발현 정도는 그레이 스케일을 기반으로 추정되었다. 그 중, FSA가 발현된 pOsPMP849의 7개의 라인 (도 6); 및 FSA다 발현된 pOsPMP852의 11개의 균주 (도 7)가 분석되었다. 결과는 도 8에 나타내었다. pOsPMP849의 FSA 발현 정도는 평균 현미 1 g 당 6.71 mg으로 현미 1 g당 3.08 내지 10.01 mg의 범위였으며; pOsPMP852의 FSA 발현은 현미 1 g 당 평균 9.84 mg으로, 현미 1 g 당 2.31 내지 13.86 mg 범위였다. EnhGt13a 프로모터 매개 FSA 발현은 현미 1 g당 3.13 mg 증가하여 Gt13a 프로모터 매개 FSA 발현보다 46.57% 더 높게 계산되었다. 결과는 EnhGt13a 프로모터는 벼 배유체에서 재조합 단백질의 발현을 유의하게 증가할 수 있다는 것을 보여주었다.
요약하면, 프로모터 영역에는 전사를 향상시키는 인핸서(enhancer) 및 전사를 차단하는 리프레서(repressor)와 같은 다양한 시스-작용 요소가 있다. 이러한 시스-작용 요소는 트랜스 (trans)-작용 인자와 상호작용하여 유전자의 공간적 시간적 발현은 물론 발현 수준도 조절한다. 보통, 트랜스 작용 인자는 이러한 시스-조절 요소를 통해 유전자 전사를 긍정적으로 또는 부정적으로 조절한다. 프로모터 영역에서 핵 매트릭스 부착 영역을 도입하는 것은 또한 프로모터 영역으로의 RNA 합성 효소의 진입을 유의하게 향상시켜 전사 활성을 증가시킨다. 본 발명은 자연 배유체-특이적 프로모터 Gt13a보다 강한 전사활성을 갖는 새로운 프로모터 EnhGt13a를 얻으며, Gt13a 프로모터의 주요 시스-작용 요소의 부위-지향적 돌연변이에 의하거나, 전사를 부정적으로 조절하는 시스-작용 요소가 제거되거나, 전사 및 핵 매트릭스 부착영역을 긍정적으로 조절하는 새로운 시스-작용 요소의 생성에 의해 얻어진다. 배유체-특이적 프로모터 EnhGt13a의 상대적 GUS 활성은 시험관 내 벼 미성숙 배유체 일시적 발현 시스템에서 Gt13a보다 28.52% 더 높았다. EnhGt13a 프로모터에 의해 매개되는 재조합 고양이 혈청 알부민 (FSA)의 발현은 현미 1 g 당 9.84 mg에 도달하여, 현미 1 kg 당 6.71 mg의 Gt13a 매개 FSA에 비해 46.57% 증가하였다.
결과는 본 발명의 EnhGt13a 프로모터는 β-glucosidase (GUS) 리포터 유전자의 발현을 매개하므로, 배유체 종자를 갖는 모든 식물, 특히 제약 단백질을 발현하는 유전자 조작된 벼 품종 육종에 적합하다는 것을 보여준다. 본 발명의 EnhGt13a 프로모터는 배유체에서 외인성 유전자의 발현 및 축적을 유의하게 향상시킬 수 있으며, 생명공학을 이용한 종자 품질 개선 및 분자 약제학 연구의 토대를 마련하고 응용 가능성이 매우 높다.
[서열목록]
서열번호 1
>Gt13aΔ281
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC
AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG
CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG
TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG
TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TGGGTGTAAC ACATGACAAA CCAGAGAGTC
AAGCAAGATA AAGCAAAAGG ATGTGTACAT AAAACTACAG AGCTATATGT CATGTTGCGA AAAGAGGAGA
GCTTATAAGA CAAGCCATGA CTCAAAAAAA ATTCACATGC CTACTGTGGC CCATATATCA TGCAACAATC
CAAAAACTCA CAGGTCTCGG TGTTGATCGT GTCAACATGT GACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT
AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG
AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT
TGCAAAAGAA AGAAAGAGAG AACAATACAA ATGATGTGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT
TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATGT CTGGACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT
CAAATGCATG AGACTTTATC TCAC TATAAA T GCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA
GTTCATTAGT ACTACAACAA
서열번호 2
>Gt13aΔ281+AT
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC
AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG
CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG
TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG
TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TTGGTGTAAC ACATGACAAA CCAGAGAGTC
AAGCAAGATA AAGCAAAAGG ATGTGTACAT AAAACTACAG AGCTATATGT CATGTTGCGA AAAGAGGAGA
GCTTATAAGA CAAGCCATGA CTCAAAAAAA ATTCACATGC CTACTGTGGC CCATATATCA TGCAACAATC
CAAAAACTCA CAGGTCTCGG TGTTGATCGT GTCAACATGT GACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT
AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG
AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT
TGCAAAATAA ATAAAGAGAG AACAATACAA ATGATATGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT
TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATGT CTGGACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT
CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA
GTTCATTAGT ACTACAACAA
서열번호 3
>Gt13aΔ281+CAAT
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG
TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG
TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TGGGTGTAAC ACATGACCAA TACAAATGAT
GTGTCAATTA CACATGAGAG TCAAGCAAGA TAAAGCAAAA GGATGTGTAC ATAAAACTAC AGAGCTATAT GTCATGTTGC GAAAAGAGGA GAGCTTATAA GACAAGCCAT GACTCAAAAA AAATTCACAT GCCTACTGTG GCCCATATAT CATGCAACAA TCCAAAAACT CACAGGTCTC GGTGTTGATC GTGTCAATAT GTGACCACCC TAAAAACTCT TCACTAAATA TTAAAGTATT GCTAGAACAG AGCTTCAAGA TATAAGTCAT GATCACCAAC AATTATGTTC AAAAAGAAAT AGAAAGCTAT GGCACAGCAA CAAAAAGCAA AAGCATGCAT GGATATAATC TTTAACATCA TCCATGTCAT ATTGCAAAAG AAAGAAAGAG AGAACAATAC AAATGATGTG TCAATTACAC ATCCATCATT ATCCATCCAC CTTCCGTGTA CCACACTTCA TATATCATGA GTCACTTCAT GTCTGGACAT TAACAAACTC TATCTTAACA TTCAAATGCA TGAGACTTTA TCTCAC TATA AAT GCACAAT GATTTAGCAT TGTTTCTCAC AAAACCATTC AAGTTCATTA GTACTACAAC AA
서열번호 4
>Gt13aΔ281/Del
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC
AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG
CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG
TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG
TGTTAGAACT TCCCATACAT GACAATTTGG TGTAACACAT GACAAACCAG AGAGTCAAGC AAGATAAAGC AAAAGGATGT GTACATAAAA CTACAGAGCT ATATGTCATG TTGCGAAAAG AGGAGAGCTT ATAAGACAAG CCATGACTCA AAAAAAATTC ACATGCCTAC TGTGGCCCAT ATATCATGCA ACAATCCAAA AACTCACAGG
TCTCGGTGTT GATCGTGTCA AACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT TGCAAAACAA TTAAAGAGAG AACAATACAA ATGATGTGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATGT CTGGACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCAC TATAAA T GCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
서열번호 5
>Gt13aΔ281+GCN4
TGAAACAATA TTATGAGTAA TGTGTGAGCA TTATGGGACC ACGAAATAAA AAAAGAACAT TTTTATGAGC
AGTGTGTTCT CAATGAGCCT TGAATGTTAT CACCCAGGAT AAGAAACCCT TAAGCAATGA AACATGCAAG
CGTTTAATGT GCAAAGTTGG CATTCTCCAC GACATAATGC AAAAGAAGAT ATAATCTATG ACATAGCAAG
TCATGCATCA TTTCATGCCT CTGTCAACCT ATTCATTTCT AGTCATCTAG GTAAGTATCT TAAGCTAAAG
TGTTAGAACT TCCCATACAT AAGTCATAAC TGATGACAAT TGGGTGTAAC ACATGACAAA CCAGAGAGTC
AAGCAAGATA AAGCAAAAGG ATGTGTACAT AAAACTACAG AGCTATATGT CATGTTGCGA AAAGAGGAGA
GCTTATAAGA CAAGCCATGA CTCAAAAAAA ATTCACATGC CTACTGTGGC CCATATATCA TGCAACAATC
CAAAAACTCA CAGGTCTCGG TGTTGATCGT GTCAACATGT GACCACCCTA AAAACTCTTC ACTAAATATT
AAAGTATTGC TAGAACAGAG CTTCAAGATA TAAGTCATGA TCACCAACAA CCATGTTCAA AAAGAAATAG
AAAGCTATGG CACAGCAACA AAAAGCAAAA GCATGCATGG ATATAATCTT TAACATCATC CATGTCATAT
TGCAAAAGAA AGAAAGAGAG AACAATACAA ATGATGTGTC AATTACACAT CCATCATTAT CCATCCACCT
TCCGTGTACC ACACTTCATA TATCATGAGT CACTTCATAT ATCATGAGTC ACTTCATGTC TGGACATTAA CAAACTCTAT CTTAACATTA ACAAACTCTA TCTTAACATT CAAATGCATG AGACTTTATC TCACTATAAA TGCACAATGA TTTAGCATTG TTTCTCACAA AACCATTCAA GTTCATTAGT ACTACAACAA
서열번호 6
>Gt13a (Control)
TCACACCTTA TGTAAAGTAT TTGTTGCAAG AAAAGTCTAA GATGACAGCA ACCTGCTGAG AAGAACAACT
GACGATGTCA TAAGGAGAGG GAGCTTTTCG ATAGGTGCCG TGCAGTTCAA AGAGTTAGTT AGCAGTAGGA
TGAAGATTTT TGCACATGGC AATGAGAAGT TAATTATGGT GTAGGCAACC CAAATGAAAC ACCAAAATAT
GCACAAGACA GTTTGTTGTA TTCTGTAGTA CAGAATAAAC TAAAGTAATG AAAGAAGATG GTGTTAGAAA
ATGAAACAAT ATTATGAGTA ATGTGTGAGC ATTATGGGAC CACGAAATAA AAAAAGAACA TTTTTATGAG
CAGTGTGTTC TCAATGAGCC TTGAATGTTA TCACCCAGGA TAAGAAACCC TTAAGCAATG AAACATGCAA
GCGTTTAATG TGCAAAGTTG GCATTCTCCA CGACATAATG CAAAAGAAGA TATAATCTAT GACATAGCAA
GTCATGCATC ATTTCATGCC TCTGTCAACC TATTCATTTC TAGTCATCTA GGTAAGTATC TTAAGCTAAA
GTGTTAGAAC TTCCCATACA TAAGTCATAA CTGATGACAA TTGGGTGTAA CACATGACAA ACCAGAGAGT
CAAGCAAGAT AAAGCAAAAG GATGTGTACA TAAAACTACA GAGCTATATG TCATGTTGCG AAAAGAGGAG
AGCTTATAAG ACAAGCCATG ACTCAAAAAA AATTCACATG CCTACTGTGG CCCATATATC ATGCAACAAT
CCAAAAACTC ACAGGTCTCG GTGTTGATCG TGTCAACATG TGACCACCCT AAAAACTCTT CACTAAATAT
TAAAGTATTG CTAGAACAGA GCTTCAAGAT ATAAGTCATG ATCACCAACA ACCATGTTCA AAAAGAAATA
GAAAGCTATG GCACAGCAAC AAAAAGCAAA AGCATGCATG GATATAATCT TTAACATCAT CCATGTCATA
TTGCAAAAGA AAGAAAGAGA GAACAATACA AATGATGTGT CAATTACACA TCCATCATTA TCCATCCACC
TTCCGTGTAC CACACTTCAT ATATCATGAG TCACTTCATG TCTGGACATT AACAAACTCT ATCTTAACAT
TCAAATGCAT GAGACTTTAT CTCACTATAA ATGCACAATG ATTTAGCATT GTTTCTCACA AAACCATTCA
AGTTCATTAG TACTACAACA A
서열번호 7
>FSA-DNA
GAGTCTAGCG GAGGCCCACC AGAGCGAGAT CGCCCACCGC TTCAACGACC TCGGCGAGGA GCACTTCCGC
GGCCTCGTGC TCGTGGCCTT CAGCCAGTAC CTCCAGCAGT GCCCGTTCGA GGACCACGTG AAGCTCGTGA
ACGAGGTGAC CGAGTTCGCC AAGGGCTGCG TGGCCGACCA GAGCGCCGCC AACTGCGAGA AGAGCCTCCA
CGAGCTCCTC GGCGACAAGC TCTGCACCGT GGCCAGCCTC CGCGACAAGT ACGGCGAGAT GGCCGACTGC
TGCGAGAAGA AGGAGCCGGA GCGCAACGAG TGCTTCCTCC AGCACAAGGA CGACAACCCG GGCTTCGGCC
AGCTCGTGAC CCCGGAGGCC GACGCCATGT GCACCGCCTT CCACGAGAAC GAGCAGCGCT TCCTCGGCAA
GTACCTCTAC GAGATCGCCC GCCGCCACCC GTACTTCTAC GCCCCGGAGC TCCTCTACTA CGCCGAGGAG
TACAAGGGCG TGTTCACCGA GTGCTGCGAG GCCGCCGACA AGGCCGCCTG CCTCACCCCG AAGGTGGACG
CCCTCCGCGA GAAGGTGCTC GCCAGCAGCG CCAAGGAGCG CCTCAAGTGC GCCAGCCTCC AGAAGTTCGG
CGAGCGCGCC TTCAAGGCCT GGAGCGTGGC CCGCCTCAGC CAGAAGTTCC CGAAGGCCGA GTTCGCCGAG
ATCAGCAAGC TCGTGACCGA CCTCGCCAAG ATCCACAAGG AGTGCTGCCA CGGCGACCTC CTAGAGTGCG
CCGACGACCG CGCCGACCTC GCCAAGTACA TCTGCGAGAA CCAGGACAGC ATCAGCACCA AGCTCAAGGA
GTGCTGCGGC AAGCCGGTGC TAGAGAAGAG CCACTGCATC AGCGAGGTGG AGCGCGACGA GCTCCCGGCC
GACCTCCCGC CGCTCGCCGT GGACTTCGTG GAGGACAAGG AGGTGTGCAA GAACTACCAG GAGGCCAAGG
ACGTGTTCCT CGGCACCTTC CTCTACGAGT ACAGCCGCCG CCACCCGGAG TACAGCGTGA GCCTCCTCCT
CCGCCTCGCC AAGGAGTACG AGGCCACCCT AGAGAAGTGC TGCGCCACCG ACGACCCGCC GGCCTGCTAC
GCCCACGTGT TCGACGAGTT CAAGCCGCTC GTGGAGGAGC CGCACAACCT CGTGAAGACC AACTGCGAGC
TCTTCGAGAA GCTCGGCGAG TACGGCTTCC AGAACGCCCT CCTCGTGCGC TACACCAAGA AGGTGCCGCA
GGTGAGCACC CCGACCCTCG TGGAGGTGAG CCGCAGCCTC GGCAAGGTGG GCAGCAAGTG CTGCACCCAC
CCGGAGGCCG AGCGCCTCAG CTGCGCCGAG GACTACCTCA GCGTGGTGCT CAACCGCCTC TGCGTGCTCC
ACGAGAAGAC CCCGGTGAGC GAGCGCGTGA CCAAGTGCTG CACCGAGAGC CTCGTGAACC GCCGCCCGTG
CTTCAGCGCC CTCCAGGTGG ACGAGACCTA CGTGCCGAAG GAGTTCAGCG CCGAGACCTT CACCTTCCAC
GCCGACCTCT GCACCCTCCC GGAGGCCGAG AAGCAGATCA AGAAGCAGAG CGCCCTCGTG GAGCTCCTCA
AGCACAAGCC GAAGGCCACC GAGGAGCAGC TCAAGACCGT GATGGGCGAC TTCGGCAGCT TCGTGGACAA
GTGCTGCGCC GCCGAGGACA AGGAGGCCTG CTTCGCCGAG GAGGGCCCGA AGCTCGTGGC CGCCGCCCAG
GCCGCCCTCG CCTGAGCTCG AG
서열번호 8
>FSA-AA
EAHQSEIAHR FNDLGEEHFR GLVLVAFSQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KGCVADQSAA NCEKSLHELL
GDKLCTVASL RDKYGEMADC CEKKEPERNE CFLQHKDDNP GFGQLVTPEA DAMCTAFHEN EQRFLGKYLY
EIARRHPYFY APELLYYAEE YKGVFTECCE AADKAACLTP KVDALREKVL ASSAKERLKC ASLQKFGERA
FKAWSVARLS QKFPKAEFAE ISKLVTDLAK IHKECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISTKLKECCG
KPVLEKSHCI SEVERDELPA DLPPLAVDFV EDKEVCKNYQ EAKDVFLGTF LYEYSRRHPE YSVSLLLRLA
KEYEATLEKC CATDDPPACY AHVFDEFKPL VEEPHNLVKT NCELFEKLGE YGFQNALLVR YTKKVPQVST
PTLVEVSRSL GKVGSKCCTH PEAERLSCAE DYLSVVLNRL CVLHEKTPVS ERVTKCCTES LVNRRPCFSA
LQVDETYVPK EFSAETFTFH ADLCTLPEAE KQIKKQSALV ELLKHKPKAT EEQLKTVMGD FGSFVDKCCA
AEDKEACFAE EGPKLVAAAQ AALA
서열번호 9
> Forward primer
AGCTACCAGG GCAACAGCGA
서열번호 10
> Reverse primer
ATCTCGTAGA GGTACTTGCC GA
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 5 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 갖는, 변형된 식물 배유체-특이적 발현 프로모터.
  2. 제1항의 식물 배유체-특이적 발현 프로모터를 포함하는, 발현 카세트.
  3. 제1항의 식물 배유체-특이적 발현 프로모터를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  4. 제1항의 식물 배유체-특이적 발현 프로모터를 포함하는, 숙주 아그로박테리움 (agrobacterium).
  5. 제1항의 식물 배유체-특이적 발현 프로모터를 포함하는, 형질전환 식물 또는 세포주.
  6. 유전자 조작된 식물 또는 형질전환 식물의 제조에 있어서, 제1항의 식물 배유체-특이적 발현 프로모터의 용도.
  7. 재조합 단백질 또는 대사 산물을 발현하는 유전자 조작된 식물 또는 형질전환 식물의 제조에 있어서, 제1항의 식물 배유체-특이적 발현 프로모터의 용도.
  8. 제6항에 있어서, 상기 식물은 외떡잎 식물 또는 쌍떡잎 식물인, 용도.
  9. 제8항에 있어서, 상기 외떡잎 식물은 벼, 밀, 옥수수, 보리, 밤, 수수 또는 귀리이고; 쌍떡잎 식물은 대두, 유채 또는 해바라기인, 용도.
  10. 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항의 식물 배유체-특이적 발현 프로모터를 사용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법:
    1) 제1항의 식물 배유체-특이적 발현 프로모터를 사용하여 벼 배유 세포-특이적 중간 벡터를 구성하는 단계;
    2) 재조합 단백질을 합성하는 단계;
    3) 상기 단계1의 벡터와 단계 2의 유전자를 작동가능하게 연결하여 프로모터에 의해 매개되는 재조합 단백질 발현 벡터를 얻는 단계;
    4) 식물을 상기 단계 3의 발현벡터로 형질전환하고, 배유체에서 재조합 단백질을 발현시키는 단계; 및
    5) 식물로부터 재조합 단백질을 추출 및 정제하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 고양이 혈청 알부민(feline serum albumin)인, 방법.
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