CN103710341B - 一种miR1432靶基因串联模拟物、基因表达盒、表达载体、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种miR1432靶基因串联模拟物、基因表达盒、表达载体、制备方法及应用，属于植物生物技术领域。本发明根据miR1432的核苷酸序列设计并合成靶基因串联模拟物，构建籽粒特异启动子质粒表达载体，并转化农杆菌；利用农杆菌转化水稻愈伤组织，经过筛选、分化得到转基因阳性植株；再对转基因植株籽粒产量相关的表型进行鉴定。通过转基因植株表型分析表明，转miR1432靶基因串联模拟物水稻植株籽粒明显变大，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种miR1432靶基因串联模拟物，同时还涉及基因表达盒、表达载体、制备方法及应用，属于植物生物技术领域。
背景技术
近年来，通过大规模深度测序发现，在水稻籽粒发育过程中有大量的非编码小RNA（MicroRNAs，miRNAs）参与籽粒中的基因表达调控（Zhuetal.,2008;Johnsonetal.,2009;Xue,etal.,2009;Pengetal.,2011）。非编码小RNA是真核生物广泛存在的基因表达调控因子，通常长度在19～24nt之间，可在转录或转录后水平按照序列互补原则特异地作用于其靶基因，起到转录或翻译抑制的作用，在维持基因组稳定性、生长发育、生物和非生物胁迫响应等过程中起重要调控作用（Ruiz-FerrerandVoinnet,2009;Voinnet,2009;Vazquezetal.,2010）。
Zhu等对水稻花后两个时期的籽粒进行miRNAs分析，阐明了miRNAs在发育着籽粒中的动态变化（Zhuetal.,2008）。Peng等对花后18天水稻强弱势粒中miRNAs测序分析表明，miRNAs在强弱势粒中的表达存在差异（Pengetal.,2011）。Lan等研究了水稻籽粒整个发育过程不同时期的miRNAs表达类型，对其靶基因进行预测，结果可能参与碳水化合物代谢、激素信号和与种子成熟相关的途径中。水稻灌浆结实期是蔗糖、淀粉的代谢过程（Lanetal.,2012），对水稻库、源器官中参与淀粉合成的基因进行了表达谱分析，参与蔗糖/淀粉代谢过程中的一些关键基因的表达量随着籽粒发育不同时期存在差异（Ohdanetal.,2005）。而miRNAs是真核细胞中重要的在转录水平或转录后水平发挥作用的基因调控因子，可能在籽粒发育调控过程中起重要作用。迄今为止，现有技术中对水稻miR1432的功能并未阐明，关于miR1432调控籽粒大小的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种miR1432靶基因串联模拟物。
其次，本发明提供一种基于miR1432靶基因串联模拟物的基因表达盒。
再者，本发明提供一种基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体。
同时，本发明提供一种基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体的制备方法。
最后，本发明提供一种miR1432靶基因串联模拟物在提高水稻籽粒产量中的应用，以及一种基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体在提高水稻籽粒产量中的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种miR1432靶基因串联模拟物，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
一种基于miR1432靶基因串联模拟物的基因表达盒，其含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；还含有Gt13a启动子和NOS终止子。
具体的，一种基于miR1432靶基因串联模拟物的基因表达盒，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
一种基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体，其含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。
具体的，一种基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体，其含有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。
一种基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）从日本晴基因组DNA中扩增Gt13a启动子，连接到载体pCAMBIA1301中构建载体pCAMBIA1301-Gt13a；
（2）从pCAMBIA1301中扩增NOS终止子，连接到载体pCAMBIA1301-Gt13a中构建载体pCAMBIA1301-Gt13a-NOS；
（3）将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列连接到载体pCAMBIA1301-Gt13a-NOS中构建表达载体pCAMBIA1301-miR1432_STTM。
所述步骤（1）中扩增Gt13a启动子采用的引物序列如下：
Gt13a_F：5’-CCCAAGCTT (HindIII)CATGAGTAATGTGTGAGCATTATGGGA-3’（如SEQIDNO.3所示），
Gt13a_R：5’-TTTTGGATCC (BamHI)GTTGTTGTAGTACTAATGAACTTGAATGG-3’（如SEQIDNO.4所示）；
扩增反应程序为：94度预变性2min，94度变性30s，58度退火30s，72度延伸2min，35个循环，最后72度延伸10min。
所述步骤（2）中扩增NOS终止子采用的引物序列如下：
NOS_F：5’-AAAAGAGCTC (SacI)AAATCTGCAGCGTTCAAAC-3’（如SEQIDNO.5所示），
NOS_R：5’-AAAAGAATTC (EcoRI)CGCGAAGCTTCCCGATCTAG-3’（如SEQIDNO.6所示）；
扩增反应程序同上。
一种miR1432靶基因串联模拟物在提高水稻籽粒产量中的应用。
一种基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体在提高水稻籽粒产量中的应用。
具体的，一种基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体在提高水稻籽粒产量中的应用，包括以下步骤：取表达载体pCAMBIA1301-miR1432转化农杆菌，浸染水稻愈伤组织，经含潮霉素筛选培养基的筛选和分化，得到转基因阳性植株，PCR鉴定即可。
所述的鉴定采用的引物序列为：
Gt13a_VF：5’-TATCCATCCACCTTCCGTGT-3’（如SEQIDNO.7所示），
Gt13a_VR：5’-GCAACAGGATTCAATCTTAA-3’（如SEQIDNO.8所示）。
本发明的有益效果：
本发明根据miR1432的核苷酸序列设计并合成靶基因串联模拟物，构建籽粒特异启动子质粒表达载体，并转化农杆菌；利用农杆菌转化水稻愈伤组织，经过筛选、分化得到转基因阳性植株；再对转基因植株籽粒产量相关的表型进行鉴定。通过转基因植株表型分析表明，转miR1432靶基因串联模拟物水稻植株籽粒明显变大、产量增加，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中miR1432靶基因串联模拟物的设计图；
图2为实施例4中阳性植株PCR鉴定的凝胶电泳图；
图3为实施例5中转基因植株miR1432表达量鉴定图；
图4为实施例6中转基因植株籽粒与野生型及空白载体对照的比较图。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
miR1432靶基因串联模拟物的设计：
根据miR1432的序列设计一段miR1432靶基因串联模拟物，其中miR1432序列来自于miRBase（accessionnumberMIMAT0005966）。miR1432靶基因模拟物与miR1432序列互补，但模拟物在miR1432自5’端第10位碱基与第11位碱基之间的位置插入3个碱基，从而造成miR1432与模拟物匹配时在第10位碱基与第11位碱基之间形成一个突起。两个靶基因模拟物以串联方式排列，两者中间加48nt的中间序列，构成miR1432靶基因串联模拟物（见图1）。
miR1432靶基因模拟物的核苷酸序列如下：
5’-TGTCGGTGTCATTCACTCTCCTGAT-3’（见SEQIDNO.9）。
miR1432的核苷酸序列如下：
3’-ACAGCCACAGUAGAGAGGACUA-5’（见SEQIDNO.10）。
设计得到的miR1432靶基因串联模拟物的核苷酸序列如下：
5’-GGTACC(KpnI)TGTCGGTGTCATTCA(insertion)CTCTCCTGATGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT(spacer)TGTCGGTGTCATTCA(insertion)CTCTCCTGATACTAGT(SpeI)-3’（见SEQIDNO.1）。
实施例2
表达载体pCAMBIA1301-miR1432_STTM的构建：
1、从日本晴基因组DNA（DNA提取方法同常规植物基因组DNA提取方法）中扩增出Gt13a启动子，扩增采用的引物序列为：
Gt13a_F：5’-CCCAAGCTTCATGAGTAATGTGTGAGCATTATGGGA-3’（见SEQIDNO.3），
Gt13a_R：5’-TTTTGGATCCGTTGTTGTAGTACTAATGAACTTGAATGG-3’（见SEQIDNO.4）。
PCR扩增体系如下表1所示，PCR反应程序为：94度预变性2min，94度变性30s，58度退火30s，72度延伸2min，35个循环，最后72度延伸10min。
表1Gt13a启动子PCR扩增体系
PCR反应产物经DNA胶回收试剂盒回收纯化，使用HindIII和BamHI双酶切PCR产物和pCAMBIA1301载体，酶切体系如下表2所示。
表2HindIII和BamHI双酶切体系
将Gt13a启动子和pCAMBIA1301酶切产物纯化，再用T4连接酶将两个DNA片段连接起来，连接体系如下表3所示。
表3Gt13a启动子和pCAMBIA1301酶切产物连接体系
将连接后的质粒载体转化大肠杆菌，转化方法如下：
（1）取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上，加入20ul质粒T+G（提取的质粒DNA稀释500X），用移液器轻柔混匀，冰上静置20min；
（2）42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3～5min（4min），整个过程不要振荡菌液；
（3）加入1mlLB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养（180rpm）1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；
（4）取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀；
（5）待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12～16小时（14小时），菌落生长良好而又未互相重叠时取出；
（6）从平板中挑选阳性菌株，提取质粒DNA命名为pCAMBIA1301-Gt13a。
2、从pCAMBIA1301中扩增出NOS终止子，扩增采用的引物序列为：
NOS_F：5’-AAAAGAGCTCAAATCTGCAGCGTTCAAAC-3’（见SEQIDNO.5），
NOS_R：5’-AAAAGAATTCCGCGAAGCTTCCCGATCTAG-3’（见SEQIDNO.6）。
PCR扩增体系和PCR反应程序同上。
将阳性克隆用LB培养基摇菌后提取的质粒DNA和NOS终止子PCR产物用SacI和EcoRI双酶切，双酶切体系如下表4所示。
表4SacI和EcoRI双酶切体系
将质粒载体和NOS终止子PCR片段用T4连接酶连接，连接体系同上。将连接后的质粒载体转化大肠杆菌，转化方法同上，从平板中挑选阳性菌株，提取质粒DNA，命名为pCAMBIA1301-Gt13a-NOS。
3、将人工合成的miR1432靶基因串联模拟物序列和pCAMBIA1301-Gt13a-NOS载体用KpnI和SpeI双酶切后纯化，双酶切体系如下表5所示。
表5KpnI和SpeI双酶切体系
将纯化后的两个DNA片段连接（连接体系同上），转化大肠杆菌（转化方法同上），并筛选阳性质粒，提取质粒DNA并命名为pCAMBIA1301-miR1432_STTM。其中，基因表达盒miR1432_STTM的核苷酸序列如下：
AAGCTT(HindIII)TGAGTAATGTGTGAGCATTATGGGACCACGAAATAAAAAAAGAACATTTTTATG
AGCAGTGTGTTCTCAATGAGCCTTGAATGTTATCACCCAGGATAAGAAACCCTTAAGCAA
TGAAACATGCAAGCGTTTAATGTGCAAAGTTGGCATTCTCCACGACATAATGCAAAAGAA
GATATAATCTATGACATAGCAAGTCATGCATCATTTCATGCCTCTGTCAACCTATTCATT
TCTAGTCATCTAGGTAAGTATCTTAAGCTAAAGTGTTAGAACTTCCCATACATAAGTCAT
AACTGATGACAATTGGGTGTAACACATGACAAACCAGAGAGTCAAGCAAGATAAAGCAAA
AGGATGTGTACATAAAACTACAGAGCTATATGTCATGTTGCGAAAAGAGGAGAGCTTATA
AGACAAGCCATGACTCAAAAAAAATTCACATGCCTACTGTGGCCCATATATCATGCAACA
ATCCAAAAACTCACAGGTCTCGGTGTTGATCGTGTCAACATGTGACCACCCTAAAAACTC
TTCACTAAATATTAAAGTATTGCTAGAACAGAGCTTCAAGATATAAGTCATGATCACCAA
CAACCATGTTCAAAAAGAAATAGAAAGCTATGGCACAGCAACAAAAAGCAAAAGCATGCA
TGGATATAATCTTTAACATCATCCATGTCATATTGCAAAAGAAAGAAAGAGAGAACAATA
CAAATGATGTGTCAATTACACATCCATCATTATCCATCCACCTTCCGTGTACCACACTTC
ATATATCATGAGTCACTTCATGTCTGGACATTAACAAACTCTATCTTAACATTCAAATGC
ATGAGACTTTATCTCACTATAAATGCACAATGATTTAGCATTGTTTCTCACAAAACCATT
CAAGTTCATTAGTACTACAACAAC(Gt13a)GGATCC(BamHI)CCGGGTACC(KpnI)TGTCGGTGTCATTCACTCTCC
TGAT(targetmimic)GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATATGGTCTAAAGAAGAAGAAT(spacer)TGTCGGTG
TCATTCACTCTCCTGAT(targetmimic)ACTAGT(SpeI)TCTAGAGAGCTC(SacI)GAATTTCCCCGATCGTTCAAACATT
TGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA
TTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATG
AGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAA
ATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGG(NOS)
GAATTC(EcoRI)（见SEQIDNO.2）。
实施例3
表达载体pCAMBIA1301-miR1432_STTM转化农杆菌EHA105，包括以下步骤：
（1）取1ugpCAMBIA1301-miR1432_STTMDNA加到200ul冰上溶化的感受态细胞中，轻混，冰浴30min，液氮中速冻5min，37℃水浴5min，再迅速冰浴2min；
（2）加入800ulLB液体培养基（不含抗生素），28℃轻摇4～6h（5h）；
（3）菌体离心，除去上清液，剩余菌体重悬后涂布于YM选择平板上（Kan50mg/L，Rif50mg/L，见表9），28℃倒置培养2天。
实施例4
浸染水稻愈伤组织，转基因阳性植株筛选、分化和鉴定方法：
（1）去壳水稻种子用70%乙醇表面消毒2-4min，灭菌水清洗2次，剧烈摇动；
（2）用有效氯浓度1.5%次氯酸钠(加1滴吐温)消毒30min，消毒后用灭菌水清洗5～6次（5次）；
（3）种子置于2N6培养基上，28度暗培养4～5周（4周半）；
（4）挑取淡黄色、颗粒状的愈伤组织，转移到新的2N6培养基（见表6）上预培养5～7天（6天）后侵染；
（5）挑取含目的质粒的农杆菌单菌落，500ulYM液体培养基（50mg/LKan，50mg/LRif）摇菌24～48h（36h）至菌体浑浊，即用或置于4度保存；
（6）将第一次摇菌保存的农杆菌接种于YM液体培养基（50mg/LKan，50mg/LRif，见表9）中，三角瓶中摇菌过夜，培养至OD600达到0.8～1.0（0.9），加入30ulAS（100mM）后室温放置2～3h（2h）后直接用于愈伤侵染；
（7）将预培养后的愈伤浸入上述农杆菌菌液中，室温条件下放置15min，并不时摇动。取出愈伤组织，在无菌纸上吸去多余的菌液，吹干，随即将愈伤组织转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基2N6-As（见表7），23度暗培养3天；
（8）共培养后的愈伤先用灭菌水清洗，洗至上清液澄清，然后再用500mg/L羧苄青霉素溶液浸泡10min，而后除去上清液，将愈伤置于灭菌干燥滤纸上吸干水分，更换滤纸，超净台上继续风干30～60min（45min），愈伤干燥后转移至2N6-S培养基（见表8）上，28度暗培养，每2周继代一次，连续筛选3次；
（9）将抗性愈伤转移至三角瓶中分化培养基N6-R（见表10）上，28度暗培养一周后光照培养（16h光照/8h黑暗），待分化小苗长至2～3厘米时将小苗转至1/2MS（见表11）生根培养基上生根；
（10）待再生苗长出根系后，打开封口膜加入少量水（～1cm深），炼苗3～5天（4天）以后载入土钵中；
（11）将水稻幼苗叶片提取DNA，使用miR1432靶基因串联模拟物两侧引物进行PCR阳性鉴定（见图2，图中M为DL2000DNAmarker，pc为质粒阳性对照，1-6为受检转基因植株，7为阴性对照），引物序列为：
Gt13a_VF：5’-TATCCATCCACCTTCCGTGT-3’（见SEQIDNO.7），
Gt13a_VR：5’-GCAACAGGATTCAATCTTAA-3’（见SEQIDNO.8）。
各培养基成分如下表所示。
表62N6培养基成分
pH5.8,Phytagel2.5g/L.
表72N6-AS培养基成分
pH5.2,Phytagel3.5g/L,灭菌后加1ml100uMAS.
表82N6-S筛选培养基成分
pH5.2,Phytagel3.5g/L,灭菌后加1ml50mg/ml潮霉素
和1ml500mg/ml羧苄青霉素.
表9YM培养基成分
pH6.8,固体培养基加15g/L琼脂.
表10N6-R分化培养基成分
pH5.8,Phytagel6g/L.
表111/2MS培养基成分
pH5.8,Phytagel2.5g/L.
实施例5
转基因植株miR1432表达量的检测方法：
转基因植株花后10天的籽粒总RNA提取用RNA提取试剂盒进行，然后使用
HiFi-MMLVcDNAKit反转录成cDNA，取5μl按1:20稀释的cDNA做模板，配置20ul含有10μlUltraSYBRmixture反应体系，以β-actin为内参基因，在BioRadIq5仪器上进行实时荧光定量PCR，反应程序：95℃预保温10min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。所有PCR均设置3次重复，相对表达量用2-△△Ct方法计算，结果见图3（图中WT为野生型籽粒，STTM1432-26-5、STTM1432-32-2、STTM1432-5-1为三个独立转基因株系）。从图3可以看出，转基因植株miR1432的表达量与未转基因野生型植株相比明显下降。
实施例6
转基因植株籽粒表型分析：
选取三个miR1432表达量降低的独立转基因株系，对表达量降低的转基因株系籽粒的粒长、粒宽、粒厚及粒重进行考种，平均值和标准误通过20个重复实验获得，结果见图4（图中WT为野生型籽粒，Vector为转空载体植株籽粒，STTM1432-26-5、STTM1432-32-2、STTM1432-5-1为三个独立转基因株系）。从图4可以看出，三个转基因系的籽粒长度和粒重均比对照明显增加。
Claims (4)
1.miR1432靶基因串联模拟物在提高水稻籽粒产量中的应用，其特征在于：miR1432靶基因串联模拟物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体在提高水稻籽粒产量中的应用，其特征在于：表达载体含有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列或者如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体在提高水稻籽粒产量中的应用，其特征在于：包括以下步骤：取表达载体pCAMBIA1301-miR1432_STTM转化农杆菌，浸染水稻愈伤组织，经含潮霉素筛选培养基的筛选和分化，得到转基因阳性植株，PCR鉴定即可；
表达载体pCAMBIA1301-miR1432_STTM的构建方法包括以下步骤：
(1)从日本晴基因组DNA中扩增Gt13a启动子，连接到载体pCAMBIA1301中构建载体pCAMBIA1301-Gt13a；
(2)从pCAMBIA1301中扩增NOS终止子，连接到载体pCAMBIA1301-Gt13a中构建载体pCAMBIA1301-Gt13a-NOS；
(3)将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列连接到载体pCAMBIA1301-Gt13a-NOS中构建表达载体pCAMBIA1301-miR1432_STTM。
4.根据权利要求3所述的基于miR1432靶基因串联模拟物的表达载体在提高水稻籽粒产量中的应用，其特征在于：所述的鉴定采用的引物序列为：
Gt13a_VF：5’-TATCCATCCACCTTCCGTGT-3’，
Gt13a_VR：5’-GCAACAGGATTCAATCTTAA-3’。
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