CN104560742A - 农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物育种领域，尤其涉及一种农杆菌介导茭白黑粉菌（<i>Ustilago？esculenta</i>）转化子菌株及其制备方法和应用。农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，该转化子菌株的农杆菌感染受体为茭白黑粉菌（<i>Ustilago？esculenta</i>）。上述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的一种制备方法，步骤如下：1）制备真菌表达载体；2）农杆菌感受态的制备；3）电转化农杆菌；4）农杆菌介导的转化获得所述的转化子。本发明不需要制备复杂的原生质体，受体来源简单，真菌的孢子、菌丝都可以直接用于转化；转化效率高；另外，得到的转化子单拷贝比率也比较大，有利于获得标记基因。

Description

农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种生物育种领域，尤其涉及一种农杆菌介导茭白黑粉菌（Ustilago esculenta）转化子菌株及其制备方法和应用。
背景技术
茭白是我国特有的水生蔬菜，在我国的绝大部分省份均有种植，生产经济效益很高。作为蔬菜的茭白主要是受茭白黑粉菌（Ustilago esculenta）侵染而膨大为肉质茎。现有研究表明，自然界中，植物芽变的频率是非常低的，而茭白可以在很小的群体内分离出较多较大的稳定变异，因此，虽然目前对于黑粉菌侵染茭白的机理尚未完全阐明，但可以据此推测茭白的变异主要不是来自茭白植株的芽变，而是来自茭白黑粉菌的遗传变异。
一般认为，黑粉菌是重要的植物病原菌，由黑粉菌引起的植物病害称为黑粉病。危害玉米的黑粉病主要有丝孢堆黑粉菌和玉米黑粉菌（Ustilago maydis），大麦坚黑粉菌（Ustilago hordei）则引起大麦、燕麦、筱麦和青稞黑粉病。但是，茭白黑粉菌则有所不同，在茭白黑粉菌特异性地侵染茭白后，宿主以及真菌本身产生大量的植物激素（吲哚乙酸），使得茎部膨大长出可食用的瘤。因此，茭白黑粉菌的遗传调控是茭白育种的关键之一，由于茭白黑粉菌便于实验室操作，一旦在遗传操作上有所突破，它必将是茭白育种中的一个新的重要突破口，不仅为阐明茭白黑粉菌侵染机理提供技术支撑，从而有利于实现茭白黑粉菌向茭白植株的成功接种，而且可以在此基础上通过黑粉菌的不同菌株和茭白的不同品种植株进行接种组合，可获得所需要的茭白品种类型，从而建立更好的茭白育种平台。
对于真菌中常用的转化方法有基于原生质体制备和再生的PEG-CaC12法、电转化法、基因枪法、限制性内切酶介导整合(REMI)和农杆菌介导法（ATMT）。PEG-CaC12法是目前应用最为广泛的方法，可以将单个质粒转化原生质体，也可以两个质粒同时转化原生质体，即共转化。但是原生质体制备和再生的过程复杂、重复性差，这就造成了PEG-CaC12法操作繁琐、转化效率低。虽然电转化法、基因枪法可以用分生孢子作为受体，但是这类方法的转化效率也很低。REMI是一种将线性化的质粒DNA随机插入到生物体基因组DNA中从而产生插入突变的技术，但该技术产生的突变体有30%-50%不是插入突变引起的，假阳性高。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供一种农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，本发明的第二个目的是提供上述的茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，本发明的第三个目的是提供上述的茭白黑粉菌转化子菌株的应用。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，该转化子菌株的农杆菌感染受体为茭白黑粉菌（Ustilago esculenta）。
作为优选，所述的农杆菌采用农杆菌菌株AGL-1，农杆菌菌株GV3101或农杆菌菌株EHA105。最优选，农杆菌为农杆菌菌株EHA105。
作为优选，所述的农杆菌的基因表达载体采用植物pCAMBIA1301表达载体，并用来自构巢曲霉gpda(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,三磷酸甘油醛脱氢酶基因)启动子和hsp70(heat-shock protein 70-encoding gene,热激蛋白基因)启动子中的一种或两种替换植物表达载体中的35S启动子。或者，农杆菌的基因表达载体以pPK2载体为骨架，通过Infusion的同源重组方法插入各种目的片段构建所需表达载体。目前直接能用于真菌的载体很少，所以本发明通过改造植物pCAMBIA1301表达载体来进行茭白黑粉菌的转基因。当然，采用现有的真菌表达载体也可以实现本发明的目的。
作为优选，所述的植物pCAMBIA1301表达载体插入适用于真菌系统的sGFP报告基因或新霉素磷酸转移酶II位点。为了便于后续表达的检测，本发明可以插入适用于真菌系统的sGFP报告基因；另外，本发明的主要有潮霉素抗性基因hyg，可以用潮霉素进行有效筛选，以及新霉素磷酸转移酶II位点，可以用G418（遗传霉素）进行筛选。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的一种制备方法，该方法包括以下的步骤：
1）制备真菌表达载体；
2）农杆菌感受态的制备；
3）电转化农杆菌；
4）农杆菌介导的转化获得所述的转化子。
作为优选，上述的步骤1）包括以下的步骤：
①将gpdA和hsp70启动子序列从现有其它基因载体中PCR扩增出来，在5’加上BstXI位点，在3’加上ApaI位点，克隆至T载体；
②将pCambia1301载体上含AatII的片段PCR扩增出来，在5’加上ApaI位点，在3’加上其他合适的T载体上有的酶切位点，然后克隆至T载体或直接酶切；
③将含有启动子的T载体用ApaI和KpnI酶切，将含有AatII片段的PCR产物或T 载体用ApaI和KpnI酶切，将这两者连接，得到含有启动子和AatII片段的质粒；用BstXI和AatII将启动子和AatII片段切出，连接至用BstXI和AatII酶切过的pCambia1301载体；
④接着要将多克隆位点的EcoRI和SacI位点之间插入真菌Hsp70启动子片段或gpda启动子片段，在HindIII和PstI位点之间插入真菌的终止子trpc片段；在启动子hsp70和pgpda的5’端加上EcoRI酶切位点，在3’端加上SacI酶切位点；在终止子Ttrpc的5’端加上PstI酶切位点，Ttrpc的3’端加上HindIII酶切位点；将phsp70和pgpda启动子，两端酶切位点EcoRI与SacI，扩增连接到pmd19-T simple载体后用EcoRI与SacI双酶切，与第一目标中的载体EcoRI与SacI双酶切片段连接后转化；新得到载体多克隆位点加入了真菌启动子，将gpda启动子和hsp70启动子中的一种或两种，两端酶切位点HindIII与PstI，扩增连接到pmd19-T simple载体后用HindIII与PstI双酶切，与多克隆位点已经插入启动子的载体HindIII与PstI双酶切后的片段连接后，最终转化得到包含真菌启动子并包含潮霉素抗性位点的真菌表达载体。
作为优选，上述的步骤2）包括以下的步骤：
①将-80℃保存的甘油菌株在LB平板上划线，在28℃下过夜培养活化；
②挑选平板上的单克隆，转入5ml的LB管中摇菌过夜；
③转移5ml小摇菌液至100ml LB的摇菌瓶中，28℃下250rpm振荡培养4-5小时,定时测定菌液OD600值，培养2小时后每30min测定一次，当OD600值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上充分冷却；
④)菌液转到预冷的50ml离心管中，4℃4000g以下离心15分钟；小心地倒掉上清，用20ml预冷的无菌水洗涤重悬菌体，此步骤有时可以重复一次；
⑤4℃4000g以下离心20分钟后，用10ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；
⑥4℃4000g以下离心20分钟后，用2-3ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；
⑦按100μl等份装入预冷的1.5ml离心管中，于-80℃保存。
作为优选，上述的步骤3）包括以下的步骤：
①于-80℃冰箱中取出电转化感受态细胞100ul，冰浴化冻；
②取2ul纯化好的载体质粒，载体质粒浓度为10pg/ul，加入感受态细胞，冰浴5min，转入预冷的电极杯中，2500V电击；
③加入500ul的LB培养基在28℃摇床中200rpm恢复培养2小时；
④4000g以下离心5分钟，在超净台内将离心管中500ul上清去掉，剩余菌液用枪头吹打均匀，涂在LB平板上，LB平板含有50mg/L Rif以及50-100mg/L待筛选的抗生素；
⑤28℃培养箱放置2天，挑选单克隆菌落PCR验证；
⑥经鉴定后含有目标质粒的农杆菌加20%甘油保存于-80℃。
作为优选，上述的步骤4）包括以下的步骤：
①将-80℃保存的甘油菌株在LB，LB平板含有50mg/LRif和50-200mg/L目标载体的抗生素（hyg或G418），平板上划线，在28℃下过夜培养活化；
②挑单克隆在5ml的LB培养基，LB培养基含有50mg/LRif和50-100mg/L目标载体的抗生素，摇菌；
③离心收集菌体，转入IM培养基中培养6小时至OD6000.5，IM培养基中加AS至 200uM；
④同时取从-80℃保存的黑粉菌甘油菌株在YPD培养基上划线活化，挑选单克隆在5ml的液体YPD培养基上培养3天，转入新的YPD培养基中摇至OD6000.5备用；
⑤以共培养基制备固体平板，其上放置一张混合纤维素膜，将农杆菌OD600稀释到0.2，取100ul的黑粉菌和100ul的农杆菌混合均匀涂布于纤维素膜上，25℃培养2天；
⑥将混合纤维素膜取出放于筛选培养基YPD上，培养基YPD中含有50-200ug/ml hyg或G418加200ug/ml特美汀，28℃培养3-5天，挑选生长的菌落做后续验证，验证其是否为转化子。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述的制备黑粉菌转化子菌株用于茭白育种的应用。
本发明由于采用了上述的技术方案，采用农杆菌介导茭白黑粉菌，不需要制备复杂的原生质体，受体来源简单，真菌的孢子、菌丝都可以直接用于转化；转化效率高；双元载体与受体基因组无同源性时，T-DNA以随机插入的方式整合进基因组，当与受体基因组有同源性时，相当数量的T-DNA以同源整合的方式插入基因组(Michielse and Hooykaas et al.,2005)；另外，得到的转化子单拷贝比率也比较大，有利于获得标记基因。这使得 T-DNA标签法(T-DNA tagging)可以作为研究真菌基因功能和发育分子生物学的有效方法。
进一步，本发明还转入了GFP（绿色荧光蛋白这个外源基因），除了便于作为转基因检测外，可以直接通过追踪绿色荧光蛋白来追踪菌的侵染。也就是说，这个荧光蛋白基因既是作为转基因成功的标记，又是作为菌的标记（在育种研究中用），因为在植物中如果通过显微镜直接观察菌丝是非常困难的，而染色法的步骤又比较繁琐，且由于处理方法的问题带来实验的重复性，如果用GFP标记了菌株后，在激光共聚焦显微镜下，就可以直接观察到菌在植物组织中的分布位置和密度，这在其它黑粉菌的研究中作为病害是有应用的。
附图说明
图1为pCAMBIA1301质粒示意图。
图2为本发明涉及的酶切位点。
图3为利用Infusion技术构建pPK2表达载体流程图。
图4~图9为构建用于茭白黑粉菌转基因的pPK2载体的流程图。
图10为本发明黑粉菌转化子菌株的荧光分析图。
具体实施方式
实施例1载体系统构建
植物的表达载体一般不可以直接用于真菌，因为通常植物基因表达所需的启动子在真菌中的启动效率和表达稳定性均存在问题。目前直接能用于真菌的载体很少，所以本发明通过改造植物pCAMBIA1301表达载体来进行茭白黑粉菌的转基因。载体的改造主要有一、用来自构巢曲霉gpda启动子和hsp70启动子替换植物表达载体中的35S启动子；二、便于后续表达的检测，插入适用于真菌系统的sGFP报告基因；三、提供多种抗生素选择，本发明主要有潮霉素抗性基因hyg，可以用潮霉素进行有效筛选，以及新霉素磷酸转移酶II位点，可以用G418（遗传霉素）进行筛选。构建好的质粒经大肠杆菌复制并提取备用。
如图1、图2所示，具体步骤如下：
（1）首先要考虑选择标记（抗生素基因）前的启动子替换，将gpdA和hsp70启动子序列从现有其它基因载体中PCR扩增出来，在5’加上BstXI位点，在3’加上ApaI位点，克隆至T载体；
（2）将pCambia1301载体上含AatII的片段PCR扩增出来，在5’加上ApaI位点，在3’加上其他合适的T载体上有的酶切位点，如KpnI，然后克隆至T载体或直接酶切；
（3)将含有启动子的T载体用ApaI和KpnI酶切，将含有AatII片段的PCR产物或T 载体用ApaI和KpnI酶切，将这两者连接，得到含有启动子和AatII片段的质粒。用BstXI和AatII将启动子和AatII片段切出，连接至用BstXI和AatII酶切过的pCambia1301载体。这样就完成了潮霉素（hygromycin）前的35S启动子被替换，载体转化大肠杆菌菌株后，提取质粒测序验证。
（4）接着要将多克隆位点（这个位点将来是要插入各种目的基因的）的EcoRI和SacI位点之间插入真菌Hsp70启动子片段或gpda启动子片段，在HindIII和PstI位点之间插入真菌的终止子trpc片段。在启动子hsp70和pgpda的5’端加上EcoRI酶切位点，在3’端加上SacI酶切位点。在终止子Ttrpc的5’端加上PstI酶切位点，Ttrpc的3’端加上HindIII酶切位点。将phsp70和pgpda启动子（两端酶切位点EcoRI与SacI）扩增连接到pmd19-T simple载体后用EcoRI与SacI双酶切，与第一目标中的载体EcoRI与SacI双酶切片段连接后转化。新得到载体多克隆位点加入了真菌启动子，将phsp70和pgpda启动子（两端酶切位点HindIII与PstI）扩增连接到pmd19-T simple载体后用HindIII与PstI双酶切，与多克隆位点已经插入启动子的载体HindIII与PstI双酶切后的片段连接后，最终转化得到包含真菌启动子（gpda或hsp70）并包含潮霉素抗性位点的真菌表达载体。
最后，对于绿色荧光蛋白基因sgfp作为目的基因，则在PCR扩增时两头分别加入SacI和PstI双酶切位点后，连接插入到多克隆位点中。而如果要提供别的抗生素作为选择标记，如新霉素磷酸转移酶II位点，则只需按上述方法将该抗性基因加入潮霉素基因两端相同的酶切位点进行替换即可。
实施例2  载体系统构建
我们也利用了不同于pCAMBIA1301的pPK2载体为骨架，通过Infusion的同源重组方法（即Clontech的In-Fusion技术只要插入的DNA片段末端与载体末端具有15个同源碱基序列就可以完成克隆重组）插入各种目的片段构建所需表达载体。具体步骤如下：
1)      利用pCAMBIA1301已构建好的真菌表达载体，用高保真Taq酶将EcoRI-Pgpda-SacI-GFP-PstI-Ttrpc-HindIII片段扩增出来（所用引物为PgpdaF02：GAATTCCGGAGAATATGGAGCTTCATCG，TtrpcR：AAGCTTTCGAGTGGAGATGTGGAGTG），该片段可以结合pmd-19 T simple载体作为中间载体，，标记为T-Pgpda-sgfp；
2)      对于将要替换的真菌启动子，如热激蛋白启动子Phsp70来自质粒质粒pMF2-1c的碳源控制型启动子Pcrg1， 来自质粒pMF2-2c的氮源控制型的启动子Pnar1等，启动子采用In-fusion方法可以不需要考虑酶切位点问题，在启动子两端加上T-Pgpda-sgfp载体EcoRI和SacI两个酶切位点外侧同源的15bp碱基，按照实验方法将PCR扩增的15bpLB-Pcrg1F-15bpRB，15bpLB- PNar1-15bpRB与EcoRI和SacI双酶切获得的大片段连接，构建中间载体，T-Pcrg1-gfp-Ttrpc，T-Pnar1-gfp-Ttrpc。其扩增引物序列如下：
3)                                                   
4)    将常用真菌抗生素carboxin,hygromicin,zeocin,Neomycin的抗性基因通过Infusion法在线设计引物工具（http://bioinfo.clontech.com/infusion/ ）设计引物，用这些引物扩增抗性基因的片段，通过infusion反应连接到SacI和PstI双酶切的步骤2中载体中，最终获得以下中间载体，图3为利用Infusion技术构建pPK2表达载体流程图。
4）将以上这些片段左边界和右边界连入PPK2载体的HindIII和KpnI酶切位点的15bp同源序列，这样就就能构建好多种不同类型的启动子和多种不同抗性基因的农杆菌转化载体。
5）通过相同的重复步骤3和步骤4，可以将抗性基因换成需要表达的目的基因,构建T-启动子-目的基因-终止子类型的载体，然后再次通过Infusion方法连入PPK2载体的EcoRI和KpnI酶切位点之间，这样可以构建成兼具表达基因和抗性基因的农杆菌载体，构建过程中不需要考虑酶切位点问题，灵活方便选择余地很大。已构建用于茭白黑粉菌转基因的pPK2载体如图4~图9所示。
实施例3  农杆菌体系制备
1、感受态的制备
（1）将-80℃保存的甘油菌株（GV3101或EHA105）在LB（50mg/LRif）平板上划线，在28℃下过夜培养活化；
(2)挑选平板上的单克隆，转入5ml的LB（50mg/L Rif）管中摇菌过夜；
(3)转移5ml小摇菌液至100ml LB的摇菌瓶中，28℃下250rpm振荡培养4-5小时,定时测定菌液OD600值，培养2小时后每30min测定一次，当OD600值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上充分冷却（通常需30分钟左右）；
(4)菌液转到预冷的50ml离心管中，4℃4000g以下离心15分钟。小心地倒掉上清，用20ml预冷的无菌水洗涤重悬菌体，此步骤有时可以重复一次；
(5)4℃4000g以下离心20分钟后，用10ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；
(6)4℃4000g以下离心20分钟后，用2-3ml预冷的10%甘油重悬浮菌体。
(7)按100μl等份装入预冷的1.5ml离心管中，于-80℃保存。
2、电转化农杆菌
（1）于-80℃冰箱中取出电转化感受态细胞100ul，冰浴化冻；
（2）取2ul纯化好的载体质粒(10pg/ul左右)加入感受态细胞，冰浴5min左右，转入预冷的电极杯中，2500V电击；
（3）加入500ul的LB培养基在28℃摇床中200rpm恢复培养2小时；
（4）4000g以下离心5分钟，在超净台内将离心管中500ul上清去掉，剩余菌液用枪头吹打均匀，涂在LB平板上（50mg/L Rif以及50-100mg/L 左右待筛选的抗生素，主要有hyg和G418）；
（5）28℃培养箱放置2天，挑选单克隆菌落PCR验证；
（6）经鉴定后含有目标质粒的农杆菌加20%甘油保存于-80℃。
实施例4 农杆菌介导茭白黑粉菌的转化
（1）将-80℃保存的甘油菌株（GV3101或EHA105）在LB（50mg/LRif和50-200mg/L目标载体的抗生素，主要包括hyg和G418），平板上划线，在28℃下过夜培养活化；
（2）挑单克隆在5ml的LB培养基（50mg/LRif和50-100mg/L目标载体的抗生素，主要包括hyg和G418）摇菌；
（3）离心收集菌体，转入IM培养基（加AS至 200uM）中培养6小时至OD6000.5；
（4）同时取从-80℃保存的黑粉菌甘油菌株在YPD培养基上划线活化，挑选单克隆在5ml的液体YPD培养基上培养3天，转入新的YPD培养基中摇至OD6000.5备用；
（5）以共培养基制备固体平板（AS 200uM），其上放置一张混合纤维素膜，将农杆菌OD600稀释到0.2，取100ul的黑粉菌和100ul的农杆菌混合均匀涂布于纤维素膜上，25℃培养2天；
（6）将混合纤维素膜取出放于筛选培养基YPD（50-200ug/ml hyg或G418加200ug/ml特美汀）上,28℃培养3-5天，挑选生长的菌落做后续验证，验证其是否为转化子。
实施例5 黑粉菌转化子核酸提取
本发明专门设计针对黑粉菌（包括茭白黑粉菌、玉米黑粉菌和大麦黑粉菌及其类似细胞形状和大小的真菌），无需液氮研磨处理，便可以同时进行批量样品的DNA和RNA提取，提取的DNA用于基因插入的pcr检测模板，提取的RNA主要用于基因表达的RT-pcr检测。核酸提取的主要步骤：
（1）预先准备国产30目-100目玻璃珠一批，用浓盐酸酸洗处理过夜，多次冲洗后干燥备用。
（2）将1.5ml菌液转入1.5ml 离心管中，室温2000g离心5min收集菌体，倒掉上清，重复一次，共收集3ml黑粉菌菌液，最后短暂离心，用枪头吸去培养基残液；
（3）用天平称取500mg的酸洗玻璃珠，加入每个1.5ml管中；
（4) DNA提取，每一管中加入500ul的CTAB提取液。RNA提取，每管加入800ulTrizol，震荡混匀菌体；
(5) Retsch MM400破碎机20-30Hz破碎8-10min，RNA提取，每研磨1-2min进行一次液氮冷却，防止过热引起RNA降解；
(6)DNA提取，离心管转到65℃金属浴中处理30min-1h，RNA提取，离心管常温处理10min即可；
(7)吸取上清至新管，每管加入200-500ul的酚氯仿异戊醇剧烈混匀，静置5min，然后12000g离心10min，将上清转入新1.5ml离心管中；
(8)加入等体积的异戊醇-20℃沉淀15min，4℃12000g离心10min，倒掉上清；
(9)70%无水乙醇洗涤沉淀1-2次，每次4℃12000g离心5min，倒掉上清，用枪头吸去残留的乙醇；
(10)待沉淀干燥之后加入适量的TE中，DNA在-20℃保存，RNA在-80℃保存。
注意RNA提取的所有用具要进行去除RNA酶的处理。
实施例6  黑粉菌转化子基因插入PCR验证
    对于转化子的鉴定，通常先检测农杆菌中的质粒片段是否插入基因组中，本方案选择检测抗性基因（hyg和G418），所用引物序列为：
PCR体系（20ul体系），PCR体系配制根据所用的PCR试剂调整。
PCR程序
PCR产物以电泳检测。
实施例7  黑粉菌转化子插入基因表达RT-PCR检测
（1）从-80℃中取出RNA样品，用DNA酶将其中残留的DNA去除干净
（2）1.5ml管中配制下列模板RNA/ 引物混合液，全量12 μl。
（3） 70℃保温10min 后迅速在冰上急冷2min 以上。
（4） 离心数秒钟使模板RNA/ 引物的变性溶液聚集于Microtube 管底部。
（5） 在上述Microtube 管中配制下列反转录反应液。
上述模板RNA/ 引物变性溶液12μl
5×M-MLVBuffer 4μl
dNTPMixture（各10mM） 1μl
RNaseInhibitor（40U/μl） 0.5μl
RTaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl） 0.5μl
RNasefreedH2O upto20μl
（6）42℃保温1h。
（7）70℃保温15min 后冰上冷却，加入等体积的ddH2O 稀释，得到的cDNA 溶液可直
接用于PCR 扩增。
（8）吸取1μl RT 产物做模板，PCR检测，PCR程序及检测方法与上面方法相同。
实施例8  黑粉菌转化子功能检测
本方案由于转入GFP基因，故可以通过观察荧光标记，快速了解基因的表达情况。检测可以用荧光显微镜进行定性检测，也可以用荧光分析仪进行定量检测。
1.黑粉菌转化子荧光显微镜观察
（1）挑取转化子，在5ml液体YPD培养基28℃过夜培养；
（2）取5ul菌液放于载玻片，先在普通1000倍光学显微镜中观察茭白黑粉菌，然后转入荧光模式，以蓝色波长激发黑粉菌，观察转化后的茭白黑粉菌绿色荧光强度。不同的转化子其转入外源基因的表达强度不同，在同样显微荧光拍摄参数下，单个黑粉菌细胞绿光越强，表明该基因表达越强，如图10显示六个不同的表达株系。
2.黑粉菌转化子的荧光分析仪检测
将转基因黑粉菌株系直接在微孔板中摇菌，然后将微孔板转移到酶标板上以顶读方式测定OD600和绿色荧光信号（需要蓝色光激发）,将荧光值除OD600值，利用所得数据估计各株系的荧光表达强度，注意为了使测定较为准确，务必使黑粉菌的OD600处于0.20-0.50之间。
从显微观察6个株系的对照来看，基本上酶标板的荧光值/OD600的比值很好的反应了显微镜下Ue的荧光观察情况，比值大，荧光强。
本发明涉及的IM培养基和共培养基的配方如下：
母液配方（母液最终体积定容至100ml，FeSO4·7H2O母液除外，用1ml ddH2O溶解即可）
Medium

Claims (10)

1.农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，其特征在于：该转化子菌株的农杆菌感染受体为茭白黑粉菌（Ustilago esculenta）。
2.根据权利要求1所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，其特征在于：农杆菌采用农杆菌菌株AGL-1，农杆菌菌株GV3101或农杆菌菌株EHA105。
3.根据权利要求2所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，其特征在于：农杆菌的基因表达载体采用植物pCAMBIA1301表达载体，并用来自构巢曲霉gpda启动子和hsp70启动子中的一种或两种替换植物表达载体中的35S启动子；或者，农杆菌的基因表达载体以pPK2载体为骨架，通过Infusion的同源重组方法插入各种目的片段构建所需表达载体。
4.根据权利要求3所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株，其特征在于：植物pCAMBIA1301表达载体插入适用于真菌系统的sGFP报告基因或新霉素磷酸转移酶II位点。
5.一种制备权利要求1所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1）制备真菌表达载体；
2）农杆菌感受态的制备；
3）电转化农杆菌；
4）农杆菌介导的转化获得所述的转化子。
6.根据权利要求4所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤1）包括以下的步骤：
①将gpdA和hsp70启动子序列从现有其它基因载体中PCR扩增出来，在5’加上BstXI位点，在3’加上ApaI位点，克隆至T载体；
②将pCambia1301载体上含AatII的片段PCR扩增出来，在5’加上ApaI位点，在3’加上其他合适的T载体上有的酶切位点，然后克隆至T载体或直接酶切；
③将含有启动子的T载体用ApaI和KpnI酶切，将含有AatII片段的PCR产物或T 载体用ApaI和KpnI酶切，将这两者连接，得到含有启动子和AatII片段的质粒；用BstXI和AatII将启动子和AatII片段切出，连接至用BstXI和AatII酶切过的pCambia1301载体；
④接着要将多克隆位点的EcoRI和SacI位点之间插入真菌Hsp70启动子片段或gpda启动子片段，在HindIII和PstI位点之间插入真菌的终止子trpc片段；在启动子hsp70和pgpda的5’端加上EcoRI酶切位点，在3’端加上SacI酶切位点；在终止子Ttrpc的5’端加上PstI酶切位点，Ttrpc的3’端加上HindIII酶切位点；将phsp70和pgpda启动子，两端酶切位点EcoRI与SacI，扩增连接到pmd19-T simple载体后用EcoRI与SacI双酶切，与第一目标中的载体EcoRI与SacI双酶切片段连接后转化；新得到载体多克隆位点加入了真菌启动子，将gpda启动子和hsp70启动子中的一种或两种，两端酶切位点HindIII与PstI，扩增连接到pmd19-T simple载体后用HindIII与PstI双酶切，与多克隆位点已经插入启动子的载体HindIII与PstI双酶切后的片段连接后，最终转化得到包含真菌启动子并包含潮霉素抗性位点的真菌表达载体。
7.根据权利要求4所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤2）包括以下的步骤：
①将-80℃保存的甘油菌株在LB平板上划线，在28℃下过夜培养活化；
②挑选平板上的单克隆，转入5ml的LB管中摇菌过夜；
③转移5ml小摇菌液至100ml LB的摇菌瓶中，28℃下250rpm振荡培养4-5小时,定时测定菌液OD600值，培养2小时后每30min测定一次，当OD600值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上充分冷却；
④)菌液转到预冷的50ml离心管中，4℃4000g以下离心15分钟；小心地倒掉上清，用20ml预冷的无菌水洗涤重悬菌体，此步骤有时可以重复一次；
⑤4℃4000g以下离心20分钟后，用10ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；
⑥4℃4000g以下离心20分钟后，用2-3ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；
⑦按100μl等份装入预冷的1.5ml离心管中，于-80℃保存。
8.根据权利要求4所述的根据权利要求1所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤3）包括以下的步骤：
①于-80℃冰箱中取出电转化感受态细胞100ul，冰浴化冻；
②取2ul纯化好的载体质粒，载体质粒浓度为10pg/ul，加入感受态细胞，冰浴5min，转入预冷的电极杯中，2500V电击；
③加入500ul的LB培养基在28℃摇床中200rpm恢复培养2小时；
④4000g以下离心5分钟，在超净台内将离心管中500ul上清去掉，剩余菌液用枪头吹打均匀，涂在LB平板上，LB平板含有50mg/L Rif以及50-100mg/L待筛选的抗生素；
⑤28℃培养箱放置2天，挑选单克隆菌落PCR验证；
⑥经鉴定后含有目标质粒的农杆菌加20%甘油保存于-80℃。
9.根据权利要求4所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤4）包括以下的步骤：
①将-80℃保存的甘油菌株在LB，LB平板含有50mg/LRif和50-200mg/L目标载体的抗生素，平板上划线，在28℃下过夜培养活化；
②挑单克隆在5ml的LB培养基，LB培养基含有50mg/LRif和50-100mg/L目标载体的抗生素，摇菌；
③离心收集菌体，转入IM培养基中培养6小时至OD6000.5，IM培养基中加AS至 200uM；
④同时取从-80℃保存的黑粉菌甘油菌株在YPD培养基上划线活化，挑选单克隆在5ml的液体YPD培养基上培养3天，转入新的YPD培养基中摇至OD6000.5备用；
⑤以共培养基制备固体平板，其上放置一张混合纤维素膜，将农杆菌OD600稀释到0.2，取100ul的黑粉菌和100ul的农杆菌混合均匀涂布于纤维素膜上，25℃培养2天；
⑥将混合纤维素膜取出放于筛选培养基YPD上，培养基YPD中含有50-200ug/ml hyg或G418加200ug/ml特美汀，28℃培养3-5天，挑选生长的菌落做后续验证，验证其是否为转化子。
10.权利要求1~4任一权利要求所述的农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株用于茭白育种的应用。
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