JP2016533179A

JP2016533179A - トウモロコシ調節エレメントおよびその使用

Info

Publication number: JP2016533179A
Application number: JP2016523315A
Authority: JP
Inventors: グプタ，マンジュ; エランゴ，ナヴィン; ムスラマン，カルシック，ナライナ; ベリンガー，ジェフリー; ベネット，サラ; ウー，フイシア; ゴーマン，シャヴェル; ワ−デン，アンドリュー
Original assignee: ダウアグロサイエンシィズエルエルシー
Priority date: 2013-10-15
Filing date: 2014-10-15
Publication date: 2016-10-27
Also published as: EP3058073A1; AU2014337463A1; RU2016118631A; US20150106977A1; US10047367B2; AP2016009215A0; AU2017234672B2; WO2015057788A1; EP3058073A4; AR098032A1; KR20160067974A; IL245134A0; AU2017234672A1; AU2014337463B2; BR102014025574A2; EP3058073B1; UY35783A; CN105814207A; CA2927342A1

Abstract

トウモロコシ（Zea mays）から単離されたプロモーター、５’−ＵＴＲおよび／または３’−ＵＴＲを含む遺伝子調節エレメントを用いて、植物細胞および／または植物組織中で導入遺伝子を発現させるためのベクター構築物および方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本出願に組み込まれる、２０１３年１０月１５日出願の米国仮特許出願第６１／８９０９０１号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものである。

電子的に提出される材料の参照による組み込み
これと同時に提出され、以下のように特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれる：２０１４年１０月１日に作成された１つの１１．４ＫＢの「７４２７５」という名前のＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。

技術分野
本発明は、概して、植物分子生物学の分野、より具体的にはトランスジェニック植物中での遺伝子の発現に関する。

植物の形質転換は、農学的に望ましい形質または特性を異なる作物植物種に導入するのに使用するための魅力的な技術である。特定の望ましい形質を有するよう植物種が開発および／または改変されている。一般的に、望ましい形質には、例えば、栄養価の改善、収量増加、耐有害生物性または耐虫性、耐病性の付与、耐乾燥性およびストレス耐性の増加、園芸品質（例えば、着色および成長）の改善、除草剤耐性の付与、植物からの産業的に有用な化合物および／または材料の製造の可能化、ならびに／あるいは医薬品の製造の可能化が含まれる。

単一ゲノム遺伝子座に積み重なった複数の導入遺伝子を含むトランスジェニック植物は、植物の形質転換技術を介して作製される。植物の形質転換技術によって、導入遺伝子の植物細胞への導入、植物ゲノム中に安定に組み込まれた導入遺伝子のコピーを含む稔性トランスジェニック植物の回収、および導入遺伝子（複数可）の転写および翻訳を介したその後の導入遺伝子発現が付与される。それによって、望ましい形質および表現型を有するトランスジェニック植物が得られる。スタック中の各導入遺伝子は、典型的には植物中での遺伝子発現のために独立したプロモーターを要するので、複数のプロモーターが導入遺伝子スタックに使用される。

同じ形質を調節するために複数の導入遺伝子の同時発現が必要となることにより、しばしば複数の導入遺伝子の発現を駆動するために同じプロモーターを繰り返し使用することになる。しかしながら、高レベルの配列同一性を共有する配列を含むプロモーターを繰り返し使用することは、相同性ベースの遺伝子サイレンシング（homology-based gene silencing）（ＨＢＧＳ）をもたらし得る。反復ＤＮＡ配列を導入遺伝子に使用すると、ＨＢＧＳがトランスジェニック植物で頻繁に起こることが確認された（Peremarti et al., 2010）。さらに、導入遺伝子構築物に類似ＤＮＡ配列を繰り返し使用することは、プラスミドの組換えおよび不安定性のために、アグロバクテリウム（Agrobacterium）では困難と分かった。

トウモロコシ遺伝子調節エレメント（例えば、プロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ）が本明細書で記載される。さらに、トウモロコシ調節エレメントを利用する構築物および方法が記載される。

植物細胞および／または植物組織中で導入遺伝子を発現させるための精製されたポリヌクレオチド、ベクター、構築物および方法が本明細書で開示される。一実施形態では、クロロフィルａ／ｂ遺伝子の調節エレメントを、トウモロコシ（Zea mays）ゲノムから精製し、前記調節エレメントと自然では連結していない配列と組み換えて、クロロフィルａ／ｂ調節配列に生まれつき備わっていない導入遺伝子を植物細胞中で発現させるための発現ベクターを創製する。一実施形態では、クロロフィルａ／ｂ遺伝子の調節エレメントがポリリンカー配列と作動可能に連結している発現ベクターが提供される。このような発現ベクターは、クロロフィルａ／ｂ遺伝子調節配列と作動可能に連結した状態で遺伝子、導入遺伝子または遺伝子カセットをベクターに挿入することを容易にする。

実施形態では、配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂプロモーターおよび５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）を含む構築物が提供される。実施形態では、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂプロモーターを含む遺伝子発現カセットが提供される。実施形態では、構築物が、配列番号２または配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂ３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号２または配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂ３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、少なくとも１、２、３、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上の導入遺伝子を含む。

実施形態では、遺伝子発現カセットが、独立に、ａ）配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂプロモーター、ｂ）配列番号２のトウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂ３’−ＵＴＲ、およびｃ）配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂ３’−ＵＴＲを含む。

一実施形態によると、非クロロフィルａ／ｂ導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む核酸ベクターであって、プロモーターが配列番号１、または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列からなる、核酸ベクターが提供される。さらなる実施形態では、核酸ベクターが遺伝子カセットを含み、遺伝子カセットがプロモーター、非クロロフィルａ／ｂ導入遺伝子および３’非翻訳領域を含み、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結している配列番号１からなり、導入遺伝子の第２の末端が配列番号２または配列番号３からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。

トウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂプロモーターおよび３’−ＵＴＲを用いて導入遺伝子を発現する植物を育てる方法が本明細書で開示される。トウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび３’−ＵＴＲを用いて導入遺伝子を発現する植物組織および細胞を培養する方法も本明細書で開示される。実施形態では、本明細書で開示される方法が、植物茎、葉、穂軸、ひげ、仁、茎、殻および花粉組織中での組織特異的遺伝子発現を含む。

さらなる実施形態では、第２の遺伝子発現カセットに含まれる対象となる遺伝子の過剰発現を増強する方法が本明細書で開示される。したがって配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび配列番号２または配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲが、第１の遺伝子発現カセットと近位に位置する第２の異なる遺伝子発現カセット中に位置する対象となる遺伝子の発現を増強することが示される（第１の遺伝子発現カセットは、配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび配列番号２または配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含み、第２の遺伝子発現カセットは、配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび配列番号２または配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含まない）。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子発現カセットが、第２の遺伝子発現カセットから１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、６０００ｂｐ、７０００ｂｐ、８０００ｂｐ、９０００ｂｐ、１００００ｂｐ、１２０００ｂｐまたは１５０００ｂｐで近位に位置する。他の実施形態では、対象となる第２の遺伝子の発現が、約１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．５倍、３．０倍または３．５倍増強され、近位に位置する第１の遺伝子発現カセットが配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび配列番号２または配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む。

一実施形態によると、非クロロフィルａ／ｂ導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーターが配列番号１を含む、植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態によると、導入遺伝子と作動可能に連結している配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列を含む植物または植物細胞が提供される。一実施形態では、植物がトウモロコシ変種である。一実施形態では、非クロロフィルａ／ｂ導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含む植物、植物組織または植物細胞であって、プロモーターが配列番号１からなる、植物、植物組織または植物細胞が提供される。一実施形態では、遺伝子カセットを含む植物または植物細胞であって、遺伝子カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているプロモーターを含み、さらにプロモーターが配列番号１からなる、植物または植物細胞が提供される。さらなる実施形態では、プロモーターが導入遺伝子の第１の末端と作動可能に連結しており、導入遺伝子の第２の末端が配列番号２または配列番号３からなる３’非翻訳配列と作動可能に連結している。

次世代シーケンシング（ＮＧＳ）による転写プロファイリング手法を用いて、トウモロコシの高発現遺伝子を同定する方法を示す概略フローチャートである。ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子の発現を制御する配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよびＳｔＰｉｎＩＩ３’ＵＴＲ調節エレメントのｐＤＡＢ１１４４１０ベクタープラスミドマップを示す図である。ＰｈｉＹＦＰレポーター遺伝子の発現を制御する配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび配列番号２の３’−ＵＴＲ調節エレメントのｐＤＡＢ１１６００８ベクタープラスミドマップを示す図である。試験プロモーター構築物、ｐＤＡＢ１１４４１０中に存在するｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子の代わりにＹＦＰレポーター遺伝子を含むｐＤＡＢ１０１５５６対照ベクターのマップを示す図である。ＹＦＰ遺伝子発現を、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１（ＺｍＵｂｉ１）プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）Ｐｅｒ５（ＺｍＰｅｒ５）３’−ＵＴＲによって制御した。ＺｍＵｂｉ１プロモーターおよびＳｔＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲによって駆動される、ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子を含むｐＤＡＢ１０８７４６、陽性対照ベクターのマップを示す図である。ｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子の発現を制御する配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび３’−ＵＴＲ配列番号３調節エレメントのバージョンのｐＤＡＢ１２０１６７ベクタープラスミドマップを示す図である。

定義
本発明を記載および主張する際、以下に示される定義にしたがって以下の専門用語を使用する。

本明細書で使用される「約」という用語は、表示されている値または値の範囲より１０％大きいまたは小さいことを意味するが、値または値の範囲をこのより広い定義のみに指定することを意図していない。「約」という用語が前にある各値または値の範囲は、表示されている絶対値または値の範囲の実施形態を包含することも意図している。

本明細書で使用する場合、「戻し交配」という用語は、育種家が雑種子孫を親の片方と交配する、例えば、第一世代雑種Ｆ１をＦ１雑種の親遺伝子型の片方と交配する過程を指す。

「プロモーター」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターは、転写因子によって認識される特異的配列を含み得る。これらの因子は、プロモーターＤＮＡ配列に結合することができ、これによってＲＮＡポリメラーゼの動員がもたらされる。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、その３’末端に、転写開始部位（すなわち、リボソーム結合部位）が結合し、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで転写を開始するために必要な最小数の塩基またはエレメントを含むよう上流（５’方向）に広がる。プロモーター配列中には、（例えば、ヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって好都合に定義される）転写開始部位ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列と作動可能に結合していてもよい。

本開示の目的で、「遺伝子」は、遺伝子産物（下記参照）をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含み、このような調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するかどうかは問わない。したがって、遺伝子は、必ずしもこれに限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位および遺伝子座制御領域を含む。

本明細書で使用する場合、「天然」または「自然」という用語は、自然に見られる状態を定義する。「天然ＤＮＡ配列」は、自然な手段または伝統的な育種技術によって作製され、（例えば、分子生物学／形質転換技術を用いて）遺伝子工学によって生成されていない自然に存在するＤＮＡ配列である。

本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」は、例えば、それだけに限らないが、ｍＲＮＡを含む遺伝子産物をコードする核酸配列と定義される。一実施形態では、導入遺伝子が外因性核酸であり、ここでは導入遺伝子配列が、遺伝子工学によって、導入遺伝子が通常では見られない宿主細胞（またはその子孫）に導入されている。一例では、導入遺伝子が、産業的もしくは薬学的に有用な化合物、または所望の農業形質をコードする遺伝子（例えば、除草剤耐性遺伝子）をコードしている。さらに別の例では、導入遺伝子がアンチセンス核酸配列であり、アンチセンス核酸配列の発現によって標的核酸配列の発現が阻害される。一実施形態では、導入遺伝子が、内因性核酸の追加のゲノムコピーが望まれる内因性核酸、または宿主生物中の標的核酸の配列に対してアンチセンスの配向にある核酸である。

本明細書で使用する場合、「非クロロフィルａ／ｂ導入遺伝子」という用語は、トウモロコシ（Zea mays）クロロフィルａ／ｂコード配列（配列番号１７）によってコードされるタンパク質と９０％未満の配列同一性を有するタンパク質をコードする任意の導入遺伝子である。

本明細書で定義される「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換である。

本明細書で定義される「遺伝子産物」は、遺伝子によって産生される任意の産物である。例えば、遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小型ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などの工程によって修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含む。遺伝子発現は、外部シグナル、例えば、細胞、組織または生物の、遺伝子発現を増加または低下させる因子への曝露によって影響を受け得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡ、タンパク質までの経路のどこでも調節され得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシングに作用する制御、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解、または特定のタンパク質分子が産生された後のその分子の活性化、不活性化、区画化もしくは分解、あるいはこれらの組み合わせによって起こる。遺伝子発現は、限定されないが、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイまたはインビトロ、インサイチュもしくはインビボタンパク質活性アッセイ（複数可）を含む当技術分野で既知の任意の方法によってＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定することができる。

本明細書で使用する場合、「小型ＲＮＡ」という用語は、非コードリボ核酸（ｎｃＲＮＡ）のいくつかのクラスを指す。小型ＲＮＡという用語は、細菌細胞、動物、植物および真菌中で産生されるｎｃＲＮＡの短鎖を記載するものである。ｎｃＲＮＡのこれらの短鎖は、細胞内で自然に産生され得るものである、また短鎖もしくはｎｃＲＮＡを発現する外因性配列の導入によっても産生され得る。小型ＲＮＡ配列は、タンパク質を直接的にはコードせず、小型ＲＮＡは転写されるだけであって、翻訳はされないという点で他のＲＮＡと機能が異なる。小型ＲＮＡ配列は、遺伝子発現および修飾を含む他の細胞機能に関与している。小型ＲＮＡ分子は通常、約２０〜３０個のヌクレオチドから構成される。小型ＲＮＡ配列がより長い前駆体に由来してもよい。前駆体は、自己相補的領域で互いに折り重なった構造を形成し、次いで、これらが動物ではヌクレアーゼダイサー、植物ではＤＣＬ１、または小型ＲＮＡ分子をプロセシングする他の酵素によってプロセシングされる。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）を含む多くの種類の小型ＲＮＡは、天然に存在するまたは人工的に作製される。ある種の小型ＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、遺伝子サイレンシングおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）で重要である。遺伝子サイレンシングは、正常には発現している遺伝子を細胞内エレメント、この場合、小型ＲＮＡによって「止める」遺伝子調節の方法である。正常にはこの遺伝情報によって形成されるタンパク質が干渉によって形成されず、遺伝子にコードされている情報が発現を遮断される。

本明細書で使用する場合、「小型ＲＮＡ」という用語は、「小さいＲＮＡ」（Storz, (2002) Science 296:1260-3；Illangasekare et al., (1999) RNA 5:1482-1489）；原核生物の「小型ＲＮＡ」（ｓＲＮＡ）（Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45）；真核生物の「非コードＲＮＡ」（ｎｃＲＮＡ）」；「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」；「小型非ｍＲＮＡ（ｓｎｍＲＮＡ）」；「機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）」；「転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）」；「触媒ＲＮＡ」［例えば、自己アシル化リボザイムを含むリボザイム（Illangaskare et al., (1999) RNA 5:1482-1489）；「核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）」；「ｔｍＲＮＡ」（a.k.a. “10S RNA”, Muto et al., (1998) Trends Biochem Sci. 23:25-29；およびGillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885）；限定されないが、「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」、「エンドリボヌクレアーゼ調製ｓｉＲＮＡ（ｅ−ｓｉＲＮＡ）」、「短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）」および「低分子一時的調節ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）」を含むＲＮＡｉ分子；「切断ｓｉＲＮＡ（ｄ−ｓｉＲＮＡ）」、ならびにアプタマー、オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１個のウラシル塩基を含む他の合成核酸として文献に記載されているＲＮＡ分子を包含する。

本明細書で使用する場合、「イントロン」という用語は、転写されるが翻訳されない遺伝子（または対象となる発現したヌクレオチド配列）中に含まれる任意の核酸配列と定義される。イントロンは、ＤＮＡの発現した配列中の非翻訳核酸配列、ならびにそこから転写されたＲＮＡ分子の対応する配列を含む。

本明細書に記載される構築物は、イントロンなどの翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強する配列も含むことができる。１つのこのようなイントロンの例には、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のヒストンＨ３変異体の遺伝子ＩＩの第１のイントロンまたは任意の他の一般的に知られているイントロン配列がある。イントロンをプロモーター配列と組み合わせて使用して翻訳および／またはｍＲＮＡ安定性を増強することができる。

本明細書で使用する場合、「５’非翻訳領域」または「５’−ＵＴＲ」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの５’末端の非翻訳セグメントと定義される。例えば、成熟ｍＲＮＡでは、５’−ＵＴＲは、典型的にはその５’末端に７−メチルグアノシンキャップを持ち、スプライシング、ポリアデニル化、細胞質に向けたｍＲＮＡ輸送、翻訳装置によるｍＲＮＡの５’末端の同定、および分解からのｍＲＮＡの保護などの多くの過程に関与している。

本明細書で使用する場合、「転写ターミネーター」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端の転写セグメントと定義される。例えば、「ポリアデニル化シグナル」部位を越えたより長い長さのＤＮＡがプレｍＲＮＡとして転写される。このＤＮＡ配列は通常、プレｍＲＮＡの成熟ｍＲＮＡへの適切なプロセシングのための１つまたは複数の転写終結シグナルを含む。

本明細書で使用する場合、「３’非翻訳領域」または「３’−ＵＴＲ」という用語は、プレｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの３’末端の非翻訳セグメントと定義される。例えば、成熟ｍＲＮＡでは、この領域はポリ（Ａ）テールを持ち、ｍＲＮＡ安定性、翻訳開始およびｍＲＮＡ輸送において多くの役割を有することが知られている。

本明細書で使用する場合、「ポリアデニル化シグナル」という用語は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼが存在する場合、転写産物が、例えば、ポリ（Ａ）シグナルの１０〜３０塩基下流に位置するポリアデニル化部位でポリアデニル化されることを可能にする、ｍＲＮＡ転写産物中に存在する核酸配列を示す。多くのポリアデニル化シグナルが当技術分野で知られており、本発明に有用である。例示的な配列には、Loke J., et al.,(2005) Plant Physiology 138 (3); 1457-1468に記載されているＡＡＵＡＡＡおよびその変異形が含まれる。

本明細書で使用される「単離された」という用語は、自然環境から取り出されたまたは化合物が最初に形成された時に存在する他の化合物から取り出されたことを意味する。「単離された」という用語は、自然源から単離された材料ならびに宿主細胞中での組換え発現による調製後に回収された材料（例えば、核酸およびタンパク質）または核酸分子、タンパク質およびペプチドなどの化学的に合成された化合物を包含する。

本明細書で使用される「精製された」という用語は、天然または自然環境で分子または化合物と通常は会合している汚染物質を実質的に含まない、あるいは化合物が最初に形成された際に存在する他の化合物に対して実質的に高濃度の形態の分子または化合物に関し、元の組成物の他の成分から分離された結果として純度が増加していることを意味する。「精製された核酸」という用語は、本明細書において、成分中の化学的または機能的変化をもたらしながら、それだけに限らないが、ポリペプチド、脂質および炭水化物を含む他の生物学的化合物から分離された、とは別に産生された、またはから精製された核酸配列を記載するために使用される（例えば、核酸は、タンパク質汚染物質を除去し、核酸と染色体中に残っているＤＮＡを結合している化学結合を破壊することによって、染色体から精製され得る）。

本明細書で使用する場合、「相同性ベースの遺伝子サイレンシング」または「ＨＢＧＳ」は、転写型遺伝子サイレンシングと転写後遺伝子サイレンシングの両方を含む総称用語である。非連結サイレンシング遺伝子座による標的遺伝子座のサイレンシングは、それぞれ、プロモーターまたは転写配列に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生による転写阻害（転写型遺伝子サイレンシング；ＴＧＳ）またはｍＲＮＡ分解（転写後遺伝子サイレンシング；ＰＴＧＳ）から生じ得る。各過程への異なる細胞成分の関与は、ｄｓＲＮＡ誘導ＴＧＳおよびＰＴＧＳが古代の共通の機構の多様化から生じていると思われることを示唆している。しかしながら、ＴＧＳとＰＴＧＳの厳密な比較は、一般的に別個のサイレンシング遺伝子座の分析によるので、達成が困難であった。単一の導入遺伝子座が、異なる標的遺伝子のプロモーターおよび転写配列に対応するｄｓＲＮＡの産生により、ＴＧＳとＰＴＧＳの両方を誘因すると記載され得る。

本明細書で使用する場合、「核酸分子」、「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語（全３つの用語は互いに同義である）は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成型ならびにこれらの混合ポリマーのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み得るヌクレオチドのポリマー型を指す。「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの型のヌクレオチドの修飾型を指し得る。核酸分子は、特に指定しない限り、通常少なくとも１０塩基長である。これらの用語は不定の長さのＲＮＡまたはＤＮＡの分子を指し得る。これらの用語はＤＮＡの一本鎖型および二本鎖型を含む。核酸分子は、天然および／または非天然ヌクレオチド連結によって連結した天然および修飾ヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。

核酸分子は、当業者によって容易に認識されるように、化学的もしくは生化学的に修飾されていてもよく、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。このような修飾には、例えば、標識、メチル化、天然ヌクレオチドの１個または複数の類似体による置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電連結：例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホロアミド酸、カルバメート（carbamate）等；荷電連結：例えば、ホスホロチオエート（phosphorothioate）、ホスホロジチオエート（phosphorodithioate）等；ペンダント部分：例えばペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソラレン等；キレート剤；アルキル化剤；および修飾連結：例えば、αアノマー核酸等）が含まれる。「核酸分子」という用語はまた、一本鎖、二本鎖、部分二重鎖、三重鎖、ヘアピン型、円形、およびパドロック型（padlocked）立体配座を含む任意のトポロジー立体配座を含む。

転写はＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行する。これは、（ピロリン酸の必須の除去とともに）リボヌクレオチド−５’−三リン酸が成長している鎖の３’末端に逐次付加することによってＲＮＡが作製されることを意味する。鎖状または円形核酸分子のいずれにおいても、別個のエレメント（例えば、特定のヌクレオチド配列）が、さらなるエレメントから５’方向に同核酸に結合しているまたは結合する場合に、別個のエレメントをさらなるエレメントに対して「上流」と呼ぶことができる。同様に、別個のエレメントが、さらなるエレメントから３’方向に同核酸に結合しているまたは結合する場合に、さらなるエレメントに対して「下流」となり得る。

本明細書で使用する場合、「塩基位置」という用語は、指定された核酸中の所与の塩基またはヌクレオチド残基の場所を指す。指定された核酸は、基準核酸とのアラインメントによって定義され得る。

本明細書で使用する場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合を含む水素結合によってオリゴヌクレオチドおよびその類似体がハイブリダイズする過程を指す。一般的に、核酸分子は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかの窒素塩基からなる。これらの窒素塩基は、ピリミジンとプリンとの間で水素結合を形成し、ピリミジンとプリンの結合を「塩基対形成」と呼ぶ。より具体的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧはＣと結合する。「相補的」とは、２つの別個の核酸配列または同じ核酸配列の２つの別個の領域間で生じる塩基対形成を指す。

本明細書で使用する場合、「特異的にハイブリダイズ可能」および「特異的に相補的」という用語は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で、安定で特異的な結合が起こるような十分な程度の相補性を指す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするためにその標的配列と１００％相補的である必要はない。オリゴヌクレオチドと標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を妨害し、特異的結合が望まれる条件下、例えば、インビボアッセイまたは系の場合に生理学的条件下で、オリゴヌクレオチドと非標的配列の非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合に、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能である。このような結合を特異的ハイブリダイゼーションと呼ぶ。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化する。一般的に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特に、Ｎａ^＋および／またはＭｇ^２＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに寄与するが、洗浄時間もストリンジェンシーに影響を及ぼす。特定の程度のストリンジェンシーを達成するのに要するハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11に論じられている。

本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ハイブリダイゼーション分子とＤＮＡ標的との間でのミスマッチが５０％未満である場合にのみハイブリダイゼーションが起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、さらなる特定のレベルのストリンジェンシーを含む。したがって、本明細書で使用する場合、「中等度のストリンジェンシー」条件とは、５０％超の配列ミスマッチを有する分子がハイブリダイズしない条件であり、「高いストリンジェンシー」の条件とは、２０％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件であり、「極めて高いストリンジェンシー」の条件とは、１０％超のミスマッチを有する配列がハイブリダイズしない条件である。

特定の実施形態では、ストリンジェントな条件が、６５℃でのハイブリダイゼーション、引き続いて６５℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳによる４０分間の洗浄を含むことができる。以下が代表的で、非限定的なハイブリダイゼーション条件である。
極めて高いストリンジェンシー：５×ＳＳＣ緩衝液中６５℃で１６時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中室温でそれぞれ１５分間の２回の洗浄；および０．５×ＳＳＣ緩衝液中６５℃でそれぞれ２０分間の２回の洗浄。
高いストリンジェンシー：５〜６×ＳＳＣ緩衝液中６５〜７０℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ緩衝液中室温でそれぞれ５〜２０分間の２回の洗浄；および１×ＳＳＣ緩衝液中５５〜７０℃でそれぞれ３０分間の２回の洗浄。
中等度のストリンジェンシー：６×ＳＳＣ緩衝液中室温〜５５℃で１６〜２０時間のハイブリダイゼーション；２×〜３×ＳＳＣ緩衝液中室温〜５５℃でそれぞれ２０〜３０分間の少なくとも２回の洗浄。

実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子が、極めて高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で結合したままであることができる。実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子が、高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で結合したままであることができる。実施形態では、特異的にハイブリダイズ可能な核酸分子が、中等度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で結合したままであることができる。

本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い核酸ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、長い核酸セグメントの切断によって、または個々のヌクレオチド前駆体を重合することによって形成され得る。自動化合成装置によって、最大数百塩基対長のオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。オリゴヌクレオチドは相補的ヌクレオチド配列に結合することができるので、ＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる。ＤＮＡで構成されたオリゴヌクレオチド（オリゴデオキシリボヌクレオチド）を、ＰＣＲ、小型ＤＮＡ配列の増幅のための技術に使用することができる。ＰＣＲでは、オリゴヌクレオチドを典型的には「プライマー」と呼び、プライマーによってＤＮＡポリメラーゼがオリゴヌクレオチドを伸長し、相補鎖を複製することが可能になる。

本明細書で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、米国特許第４６８３１９５号に記載されているように、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡを増幅する手順または技術を指す。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、対象となる領域の末端からのまたはこれを超えた配列情報が入手可能である必要があり、これらのプライマーは増幅される鋳型の逆ストランドと配列が同一または類似である。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは増幅される材料の末端と一致し得る。ＰＣＲを使用して特異的ＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特異的ＤＮＡ配列および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列等を増幅することができる。一般的に、Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989) を参照されたい。

本明細書で使用する場合、「プライマー」という用語は、条件がプライマー伸長産物の合成に適している場合に、相補鎖に沿って合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。合成条件は、４つの異なるデオキシリボヌクレオチド三リン酸と逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼなどの少なくとも１種の重合誘導剤の存在を含む。これらは、補助因子であるまたは種々の適当な温度でｐＨなどの条件に影響を及ぼす構成成分を含んでもよい適当な緩衝液中に存在する。プライマーは、好ましくは増幅効率が最適化されるような一本鎖配列であるが、二本鎖配列を利用することもできる。

本明細書で使用する場合、「プローブ」という用語は、標的配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＴａｑＭａｎ（登録商標）−スタイルアッセイ手順では、プローブが２つのプライマーのアニーリング部位間に位置する標的の部分にハイブリダイズする。プローブは、約８個のヌクレオチド、約１０個のヌクレオチド、約１５個のヌクレオチド、約２０個のヌクレオチド、約３０個のヌクレオチド、約４０個のヌクレオチドまたは約５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、プローブが約８個のヌクレオチド〜約１５個のヌクレオチドを含む。プローブは、検出可能な標識、例えば、蛍光体（Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄ（登録商標）、フルオレセインイソチオシアネート等）をさらに含むことができる。検出可能な標識は、例えば、プローブの５’末端またはプローブの３’末端に位置するプローブオリゴヌクレオチドに直接共有結合することができる。蛍光体を含むプローブは、消光剤、例えば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒ（商標）、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（商標）等をさらに含んでもよい。

本明細書で使用する場合、「配列同一性」または「同一性」という用語は、互換的に使用され、指定された比較窓にわたって最大一致で整列させると同じである２つの配列中の核酸残基またはアミノ酸配列を指すことができる。

本明細書で使用する場合、「配列同一性の百分率」という用語は、比較窓にわたって２つの最適に整列された配列（例えば、核酸配列またはアミノ酸配列）を比較することによって決定される値を指し、比較窓中の配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、同一核酸またはアミノ酸残基が両配列中で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を比較窓中の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって計算される。比較のために配列を整列する方法は周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73: 237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8: 155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-50に記載されている。

国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）；Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10）は、いくつかの配列解析プログラムと合わせて使用するために、国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むいくつかの供給源からおよびインターネットで入手可能である。このプログラムを用いてどのように配列同一性を決定するのかについての説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」節においてインターネット上で入手可能である。核酸配列を比較するために、デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「Ｂｌａｓｔ２配列」関数を使用することができる。基準配列とのさらに大きな類似性を有する核酸配列は、この方法で評価すると、増加する同一性百分率を示す。

本明細書で使用する場合、「作動可能に連結している」という用語は、互いに機能的関係になっている２つの成分を指す。調節配列およびコード配列に関して使用する場合、「作動可能に連結している」という用語は、調節配列が、連結しているコード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節配列」、「調節エレメント」または「制御エレメント」は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳のタイミングおよびレベル／量に影響を及ぼす核酸配列を指す。調節配列には、プロモーター；翻訳リーダー配列；５’および３’非翻訳領域、イントロン；エンハンサー；ステム−ループ構造；リプレッサー結合配列；終結配列；ポリアデニル化認識配列等が含まれ得る。特定の調節配列は、これと作動可能に連結しているコード配列の上流および／または下流に位置し得る。また、コード配列と作動可能に連結している特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に位置し得る。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成され得る。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを慣用的実務にしたがって使用する。しかしながら、エレメントが作動可能に連結するように連続している必要はない。

本明細書で使用する場合、「形質転換」という用語は、核酸分子をこのような細胞に導入することができる全ての技術を包含する。例としては、それだけに限らないが、ウイルスベクターによるトランスフェクション；プラスミドベクターによる形質転換；電気穿孔；リポフェクション；微量注入（Mueller et al. (1978) Cell 15: 579-85）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介移入；直接ＤＮＡ取り込み；ＷＨＩＳＫＥＲＳ（登録商標）媒介形質転換；および微粒子銃が挙げられる。核酸分子が植物のゲノムに組み込まれ、その後、世代から世代へと受け継がれる形質転換は安定となり得る。核酸分子が細胞の細胞質または核内に局在化しており、植物のゲノムに組み込まれていない形質転換は、比較的一過性となり得る。このような一過性形質転換は、核酸分子上に存在するコード配列からのタンパク質または遺伝子産物の発現をもたらし得る。

本明細書で使用する場合、「形質導入する」という用語は、ウイルスが核酸を細胞内に移入する過程を指す。

本明細書で使用される「ポリリンカー」または「マルチクローニング部位」という用語は、１つまたは複数の２型制限酵素部位のクラスターを定義する。隣接制限部位が核酸配列上に互いに１０ヌクレオチド以内に位置する。ポリリンカーを含む構築物は、遺伝子のコード領域、リボソーム結合配列、イントロンまたは５’−ＵＴＲなどの核酸配列の挿入および／または切除に利用される。

本明細書で使用する場合、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、その各々が特異的ヌクレオチド配列でまたはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素を指す。２型制限酵素は、同部位でＤＮＡを認識および切断し、これらの酵素には、それだけに限らないが、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩ、ＡｖａＩ、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩが含まれる。

「ベクター」という用語は、「構築物」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語と互換的に使用され、宿主を形質転換し、導入配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができる媒体を意味する。「非ウイルスベクター」は、ウイルスまたはレトロウイルスを含まないベクターを意味することを意図している。いくつかの実施形態では、「ベクター」が、少なくとも１つのＤＮＡ複製起点と少なくとも１つの選択可能なマーカー遺伝子とを含むＤＮＡの配列である。

例としては、それだけに限らないが、外因性ＤＮＡを細胞内に運ぶプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはウイルスが挙げられる。ベクターは１つまたは複数の遺伝子、アンチセンス分子、および／または選択マーカー遺伝子ならびに当技術分野で既知の他の遺伝エレメントを含むこともできる。ベクターは、細胞に形質導入、細胞を形質転換または細胞に感染し、それによって細胞に、ベクターによってコードされた核酸分子および／またはタンパク質を発現させることができる。「プラスミド」という用語は、原核または真核宿主細胞中のいずれかで常染色体複製が可能な核酸の円形鎖を定義する。この用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい核酸を含む。定義のプラスミドは、細菌複製起点に相当する配列も含み得る。

本明細書で使用される「選択マーカー遺伝子」という用語は、選択マーカー遺伝子が挿入された細胞の同定を容易にするタンパク質をコードする遺伝子または他の発現カセットを定義する。例えば、「選択マーカー遺伝子」は、レポーター遺伝子ならびに例えば、植物細胞を選択剤から保護するまたは選択剤に対する耐性／許容性を与えるために植物形質転換に使用される遺伝子を包含する。一実施形態では、機能的な選択マーカーを受容している細胞または植物のみが、選択剤を有する条件下で分裂または成長することができる。選択剤の例としては、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびハイグロマイシンを含む抗生物質が挙げられる。これらの選択マーカーには、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）、ならびに関連抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシンおよびＧ４１８に関する遺伝子、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える酵素を発現するハイグロマイシントランスフェラーゼ（ｈｐｔ）の遺伝子が含まれる。他の選択マーカー遺伝子には、ｂａｒまたはｐａｔを含む除草剤耐性（グルホシネートアンモニウムまたはホスフィノトリシンに対する耐性）、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ、スルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）および分岐鎖アミノ酸の合成の最初のステップを妨げるスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する耐性）、グリホサート、２，４−Ｄおよび金属耐性または感受性をコードする遺伝子が含まれ得る。選択マーカー遺伝子として使用することができる「レポーター遺伝子」の例としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどをコードするタンパク質などの発現したレポーター遺伝子タンパク質の目視観察が挙げられる。「マーカー陽性」という句は、選択マーカー遺伝子を含むよう形質転換された植物を指す。

本明細書で使用する場合、「検出可能なマーカー」という用語は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素などの検出を可能にする標識を指す。検出可能なマーカーの例としては、それだけに限らないが、以下が挙げられる：蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光体、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。実施形態では、検出可能なマーカーを種々の長さのスペーサーアームによって結合して潜在的な立体障害を減少させることができる。

本明細書で使用する場合、「検出する」という用語は、特異的分子の定性的測定と定量的測定の両方、例えば、特異的ポリペプチドの測定を含むよう最も広義に使用される。

本明細書で使用する場合、「カセット」、「発現カセット」および「遺伝子発現カセット」という用語は、特異的制限部位でまたは相同組換えによって核酸またはポリヌクレオチドに挿入することができるＤＮＡのセグメントを指す。本明細書で使用する場合、ＤＮＡのセグメントは、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、カセットおよび制限部位が、確実にカセットを転写および翻訳のための適切な読み枠に挿入するよう設計される。実施形態では、発現カセットが、対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドに加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進するエレメントを有することができる。実施形態では、遺伝子発現カセットが、宿主細胞中での対象となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現増強を可能にするエレメントも含み得る。これらのエレメントには、それだけに限らないが、プロモーター、ミニマルプロモーター、エンハンサー、応答エレメント、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列などが含まれ得る。

本明細書で使用する場合、「リンカー」または「スペーサー」は、２つの別々の実体を互いに結合する結合、分子または分子の群である。リンカーおよびスペーサーは、２つの実態の最適間隔を提供する、または２つの実態が互いに離れていることを可能にする不安定な連結をさらに提供することができる。不安定な連結には、光切断基、酸不安定部分、塩基不安定部分および酵素切断可能な基が含まれる。

本明細書で使用する場合、「対照」という用語は、比較目的で分析手順に使用される試料を指す。対照は「陽性」であっても「陰性」であってもよい。例えば、分析手順の目的が、細胞または組織中で差次的に発現した転写産物またはポリペプチドを検出することである場合、所望の発現を示している既知の植物からの試料などの陽性対照、および所望の発現を欠いている既知の植物からの試料などの陰性対照を含めることが一般的に好ましい。

本明細書で使用する場合、「植物」という用語は、全植物および植物の任意の子孫、細胞、組織または部分を含む。本発明に使用することができる植物のクラスは、一般的に被子植物（単子葉および双子葉植物）、裸子植物、シダおよび多細胞藻類を含む突然変異誘発で修正可能な高等および下等植物のクラスと同じくらい広い。したがって、「植物」には双子葉および単子葉植物が含まれる。「植物部分」という用語には、例えば、限定されないが、種子（成熟種子および未成熟種子を含む）；植物挿穂；植物細胞；植物細胞培養物；植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、シュート、葉、根、茎および外植片）を含む植物の任意の部分（複数可）が含まれる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造もしくは機能単位に組織化される植物細胞の任意の他の群であり得る。植物細胞または組織培養物は、細胞または組織を得た植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生することができ、その植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができるだろう。対照的に、いくつかの植物細胞は、植物を作製するために再生することができない。植物細胞または組織培養物に再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、ひげ、花、仁、穂、穂軸、殻または柄であり得る。

植物部分には、収穫可能な部分および子孫植物の繁殖に有用な部分が含まれる。繁殖に有用な植物部分には、例えば、限定されないが、種子；果実；挿穂；実生；塊茎および根茎が含まれる。植物の収穫可能な部分は、例えば、限定されないが、花；花粉；実生；塊茎；葉；茎；果実；種子；および根を含む植物の任意の有用な部分であり得る。

植物細胞は、プロトプラストおよび細胞壁を含む、植物の構造的および生理学的単位である。植物細胞は、単離された単一細胞であってもまたは細胞の集合体（例えば、もろいカルスおよび培養細胞）であってもよく、高次組織単位の一部（例えば、植物組織、植物器官および植物）であってもよい。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または全植物に再生することができる細胞もしくは細胞の集合であり得る。したがって、複数の植物細胞を含み、全植物に再生することができる種子は、本明細書の実施形態では「植物細胞」とみなされる。

本明細書で使用される「プロトプラスト」という用語は、その細胞壁が完全にまたは部分的に除去され、その脂質二重層膜がむき出しになっている植物細胞を指し、したがって、その細胞壁が完全に除去されたプロトプラスト、およびその細胞壁が部分的にのみ除去されたスフェロプラストを含むが、これらに限定されない。典型的には、プロトプラストは、細胞培養物または全植物に再生する能力を有する、細胞壁を有さない単離植物細胞である。

具体的に説明しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学の共通語の定義は、例えば、Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；およびMeyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) に見出すことができる。

実施形態
本明細書で開示されるように、トウモロコシ（Zea mays）のクロロフィルａ／ｂ遺伝子の調節配列を用いて非クロロフィルａ／ｂ導入遺伝子を発現させるための新規な組換え構築物が提供される。これらの構築物を使用して植物細胞を含む細胞を形質転換し、その細胞内で導入遺伝子産物を発現する完全な生物を作製することができる。

基礎研究または生物工学用途に使用される植物プロモーターは、一般的に一方向性であり、融合したただ１つの遺伝子をその３’末端（下流）に向ける。代謝工学および形質スタッキングのためには、通常、複数の遺伝子を植物に導入することが必要であるので、複数の遺伝子の発現を駆動するために、典型的には、複数のプロモーターがトランスジェニック作物に必要である。

トランスジェニック産物の開発は、ますます複雑になっており、複数の導入遺伝子を単一遺伝子座に積み重ねることが要求されている。伝統的には、各導入遺伝子が通常は発現のためのプロモーターを要し、１つの遺伝子スタック内で異なる導入遺伝子を発現させるために複数のプロモーターが要求される。遺伝子スタックのサイズ増加とともに、これはしばしば単一のポリジーン形質の発現のために類似のレベルの異なる導入遺伝子の発現パターンを得るために１つの導入遺伝子スタック内で同じプロモーターを繰り返し使用することにつながる。同じプロモーターによって駆動される多重遺伝子構築物は、この分野であまり有効でないトランスジェニック産物をもたらす遺伝子サイレンシングを引き起こすことが知られている。プロモーター反復による過剰な転写因子（ＴＦ）−結合部位のために、転写不活性化につながる内因性ＴＦの欠乏が引き起こされ得る。導入遺伝子のサイレンシングは、導入遺伝子を発現させるために作製されたトランスジェニック植物の性能におそらく望ましくない影響を及ぼす。導入遺伝子中の反復配列は、ポリヌクレオチド再配列をもたらす遺伝子の遺伝子座内相同組換えにつながり得る。

さらに、組織特異的（すなわち、組織好適）または器官特異的プロモーターは、植物の仁、根、葉またはタペータムなどの一定の組織中での遺伝子発現を駆動する。組織および発達段階特異的プロモーターは、特定の組織または植物発達中の特定の期間に発現する遺伝子の発現を駆動する。組織特異的プロモーターは、種々の器官、組織および／または時間に異なって、ただし順番ではない異種遺伝子の発現を示す組織および／または発達段階選択的様式での異種遺伝子の特異的発現を可能にするので、トランスジェニック植物産業での一定の用途に必要とされ、望ましい。例えば、病原体耐性タンパク質が植物の根で強力に発現するように、植物ゲノムを病原体耐性遺伝子で形質転換することによって、土壌伝染性病原体による感染に対する植物の耐性増加が達成され得る。あるいは、例えば、細胞分裂または伸長などの特定の成長または発達段階にある植物組織中で導入遺伝子を発現させることが望ましいだろう。別の用途は、例えば、発達中の木部で農業的形質をコードする導入遺伝子の発現を制限するように、組織特異的プロモーターを用いることの望ましさである。組織特異的プロモーターの同定において残っている１つの具体的な課題は、潜在的に最も重要な遺伝子およびその対応するプロモーターをどのように同定するか、ならびにこれらを細胞の特異的発達特性とどのように関連付けるかである。別の課題は、クローニングされたＤＮＡフラグメントが求められている特異的発現パターンで転写を駆動するように、全ての関連するシス作用性転写制御エレメントをクローニングすることである。具体的な課題は、他の植物組織で発現していない、植物の特異的細胞型、発達段階および／または機能に関連する組織特異的プロモーターを同定することである。

遺伝子スタック内での異なる導入遺伝子の発現に様々なプロモーターを使用することが望ましい。実施形態では、クロロフィルａ／ｂプロモーターをトウモロコシ（Zea mays）から得て、導入遺伝子、ＲＮＡｉ、人工ｍｉＲＮＡまたはヘアピン−ループＲＮＡ配列を含む複数の転写ユニットの転写を駆動することができる。さらなる実施形態では、クロロフィルａ／ｂプロモーターをトウモロコシ（Zea mays）から得て、植物の葉、穂軸、ひげ、仁、茎、殻および花粉組織中の導入遺伝子、ＲＮＡｉ、人工ｍｉＲＮＡまたはヘアピン−ループＲＮＡ配列を含む複数の転写ユニットの転写を駆動することができる。

トウモロコシ（Zea mays）から単離された遺伝子調節エレメントを用いて植物中で導入遺伝子を発現させるための方法および構築物が提供される。実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび５’−ＵＴＲが配列番号１の単離されたプロモーターであり得る。

実施形態では、プロモーターを含む核酸ベクター（すなわち、構築物）が提供される。実施形態では、プロモーターがトウモロコシ（Zea mays）遺伝子プロモーターおよび５’−ＵＴＲであり得る。実施形態では、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーターを含む核酸ベクターが提供される。実施形態では、ポリリンカーと作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）遺伝子プロモーターを含む核酸ベクターが提供される。実施形態では、遺伝子発現カセットは導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）遺伝子プロモーターを含む。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化のために、プロモーターに加えて、３’−非翻訳遺伝子領域（すなわち、３’ＵＴＲ）またはターミネーターが必要である。適切な転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化が導入遺伝子の安定な発現にとって重要である。多重遺伝子スタックが次の導入遺伝子への転写リードスルーを回避するために、転写終結がより重要となる。同様に、非ポリアデニル化異常ＲＮＡ（ａＲＮＡ）は、小型ＲＮＡ産生および導入遺伝子サイレンシングにつながる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）にａＲＮＡを変換する植物ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）にとっての基質となる。そのため、強い転写ターミネーターが、単一遺伝子と複数遺伝子スタックの両方にとって極めて有用である。転写を駆動するためにプロモーターが必要である一方で、３’−ＵＴＲ遺伝子領域が転写を終結し、翻訳およびタンパク質合成のための得られたｍＲＮＡ転写産物のポリアデニル化を開始することができる。３’−ＵＴＲ遺伝子領域は、導入遺伝子の安定な発現を助ける。実施形態では、３’−ＵＴＲが配列番号２または配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲであり得る。

実施形態では、遺伝子発現カセットが３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、３’−ＵＴＲがトウモロコシ（Zea mays）遺伝子３’−ＵＴＲであり得る。実施形態では、遺伝子発現カセットが、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲを含む。別の実施形態では、遺伝子発現カセットが、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）遺伝子３’−ＵＴＲを含む。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結している３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

実施形態では、遺伝子発現カセットが、トウモロコシ（Zea mays）のプロモーターおよび３’−ＵＴＲを含む。実施形態では、遺伝子発現カセットが、ａ）配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一であるプロモーター；ｂ）配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲ；またはｃ）配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である３’−ＵＴＲを含む。

例えば、遺伝子発現カセットが、配列番号１のポリヌクレオチドであるプロモーターと配列番号２または配列番号３のポリヌクレオチドである３’−ＵＴＲの両方を含んでもよい。

実施形態では、遺伝子発現カセットが、導入遺伝子または異種コード配列と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む。遺伝子発現カセットが１つまたは複数の導入遺伝子を含む場合、プロモーターおよび３’−ＵＴＲが遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子と作動可能に連結していてもよい。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

トウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲが遺伝子発現カセット内の異なるプロモーターと作動可能に連結していてもよい。例示的実施形態では、プロモーターが植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）または細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａｍａｓ）に由来する。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

実施形態では、ベクターが本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージ、ウイルス、またはドナーＤＮＡなどの形質転換もしくは遺伝子標的化に使用するための切除ポリヌクレオチドフラグメントであり得る。

実施形態では、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む細胞または植物が提供される。実施形態では、細胞または植物が本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。実施形態では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。それによって、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含む細胞または植物がそれぞれ、トランスジェニック細胞またはトランスジェニック植物となる。実施形態では、トランスジェニック植物が単子葉植物であり得る。実施形態では、トランスジェニック単子葉植物が、それだけに限らないが、トウモロコシ、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビおよびキビであり得る。実施形態では、トランスジェニック植物が双子葉植物であり得る。実施形態では、トランスジェニック双子葉植物が、それだけに限らないが、ダイズ、ワタ、ヒマワリおよびセイヨウアブラナであり得る。実施形態には、本明細書に開示されるトランスジェニック植物のトランスジェニック種子も含まれる。

実施形態では、遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む。２つ以上の導入遺伝子は、本明細書に開示される同じプロモーターまたは３’−ＵＴＲと作動可能に連結していなくてもよい。実施形態では、遺伝子発現カセットが１つまたは複数の導入遺伝子を含む。１つまたは複数の導入遺伝子の実施形態では、少なくとも１つの導入遺伝子がプロモーターもしくは３’−ＵＴＲまたは本開示と作動可能に連結している。

選択マーカー
レポーター遺伝子としても記載されている種々の選択マーカーを、選択された発現ベクターに組み込んで形質転換した植物（「形質転換体」）の同定および選択を可能にすることができる。例えば、ＤＮＡ配列決定およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ベクターから発現したタンパク質、例えば、ホスフィノトリシン耐性を媒介する沈殿タンパク質を検出するための免疫学的方法、またはβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどをコードするレポーター遺伝子などの他のタンパク質の目視観察を含む多くの方法が、形質転換した植物中の選択マーカーの発現を確認するために利用可能である（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N. Y., 2001参照）。

選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞または組織の選択に利用される。選択マーカー遺伝子には、抗生物質耐性をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）およびハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするもの、ならびに除草剤化合物に対する耐性を付与する遺伝子が含まれる。除草剤耐性遺伝子は、一般的に除草剤に非感受性の修飾標的タンパク質または除草剤が作用し得る前に植物中の除草剤を分解もしくは解毒する酵素をコードする。例えば、グリホサート耐性は、変異標的酵素、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）（ＥＰＳＰＳ）またはＤＧＴ−２８をコードする遺伝子を用いることによって得られた。ＥＰＳＰＳについての遺伝子および変異体は周知であり、以下にさらに記載される。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニルおよび２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）耐性は、それぞれの除草剤を解毒するｐａｔもしくはＤＳＭ−２をコードする細菌遺伝子、ニトリラーゼ、ａａｄ−１またはａａｄ−１２遺伝子を用いることによって得られた。

実施形態では、イミダゾリノンまたはスルホニル尿素を含む除草剤が成長点または分裂組織を阻害することができ、これらの除草剤のためのアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）およびアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）の耐性／許容性の遺伝子は周知である。グリホサート耐性遺伝子には、変異５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）（ＥＰＳＰ）およびｄｇｔ−２８遺伝子（組換え核酸の導入および／または天然ＥＰＳＰ遺伝子のインビボ突然変異誘発の種々の形態を介して）、ａｒｏＡ遺伝子およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子がそれぞれ含まれる。他のホスホノ化合物の耐性遺伝子には、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）およびストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）を含むストレプトマイセス属（Streptomyces）の種のｂａｒ遺伝子、ならびにピリジノキシまたはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤コード遺伝子）が含まれる。シクロヘキサンジオンおよび／またはアリールオキシフェノキシプロパン酸（Ｈａｌｏｘｙｆｏｐ、Ｄｉｃｌｏｆｏｐ、Ｆｅｎｏｘｙｐｒｏｐ、Ｆｌｕａｚｉｆｏｐ、Ｑｕｉｚａｌｏｆｏｐを含む）に対する耐性を付与する例示的な遺伝子には、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）−−Ａｃｃ１−Ｓ１、Ａｃｃ１−Ｓ２およびＡｃｃ１−Ｓ３の遺伝子が含まれる。実施形態では、トリアジン（ｐｓｂＡおよび１ｓ＋遺伝子）またはベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む除草剤が光合成を阻害することができる。

実施形態では、選択マーカー遺伝子には、それだけに限らないが、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ；シアナミドヒドラターゼ；アスパラギン酸キナーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼ；トリプロファンデカルボキシラーゼ；ジヒドロジピコリン酸シンターゼおよび脱感作アスパラギン酸キナーゼ；ｂａｒ遺伝子；トリプトファンデカルボキシラーゼ；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）；ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴまたはＨＹＧ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）；ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ；アセトヒドロキシ酸シンターゼ；５−エノールピルビル−シキメート−ホスフェートシンターゼ（ａｒｏＡ）；ハロアリールニトリラーゼ；アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ；ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ｓｕｌＩ）；および３２ｋＤ光化学系ＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）をコードする遺伝子が含まれる。

実施形態には、クロラムフェニコール；メトトレキサート；ハイグロマイシン；スペクチノマイシン；ブロモキシニル；グリホサート；およびホスフィノトリシンに対する耐性をコードする遺伝子も含まれる。

選択マーカー遺伝子の上記リストは限定的であることを意図していない。いずれのレポーターまたは選択マーカー遺伝子も本発明に包含される。

選択マーカー遺伝子は、植物中での最適発現のために合成される。例えば、実施形態では、遺伝子のコード配列が、植物中での発現を増強するためのコドン最適化によって修飾されている。選択マーカー遺伝子を、特定の植物種中での発現のために最適化することができる、あるいは双子葉または単子葉植物中での最適発現のために修飾することができる。植物に好ましいコドンは、対象となる特定の植物種中で、最大量で発現しているタンパク質中の最高頻度のコドンから決定することができる。実施形態では、選択マーカー遺伝子を、植物中最高レベルで発現してより高い形質転換効率をもたらすよう設計する。植物遺伝子最適化の方法は周知である。合成ＤＮＡ配列の最適化および作製に関する手引きは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３０１６５４６、ＷＯ２０１１１４６５２４、ＷＯ１９９７０１３４０２、米国特許第６１６６３０２号および米国特許第５３８０８３１号に見出すことができる。

形質転換
適当な植物の形質転換方法には、ＤＮＡを細胞に導入することができる任意の方法、例えば、限定されないが、電気穿孔（例えば、米国特許第５３８４２５３号参照）；微粒子銃（例えば、米国特許第５０１５５８０号、第５５５０３１８号、第５５３８８８０号、第６１６０２０８号、第６３９９８６１号および第６４０３８６５号参照）；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換（例えば、米国特許第５６３５０５５号、第５８２４８７７号、第５５９１６１６号、第５９８１８４０号および第６３８４３０１号参照）；およびプロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第５５０８１８４号参照）が含まれる。これらの方法を使用して植物を安定に形質転換または一過的に形質転換することができる。

ＤＮＡ構築物を、炭化ケイ素繊維による攪拌などの技術を用いて植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入することができる（例えば、米国特許第５３０２５２３号および第５４６４７６５号参照）、またはＤＮＡ構築物を、ＤＮＡ粒子銃などの微粒子銃法を用いて植物組織に直接導入することができる（例えば、Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73参照）。あるいは、ＤＮＡ構築物を、ナノ粒子形質転換を介して植物に導入することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９０１０４７００号参照）。

さらに、根粒菌属（Rhizobium）の種ＮＧＲ２３４、アルファルファ根粒菌（Sinorhizoboium meliloti）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ジャガイモウイルスＸ、カリフラワーモザイクウイルスおよびキャッサバ葉脈モザイクウイルスおよび／またはタバコモザイクウイルスなどの非アグロバクテリウム属（Agrobacterium）細菌またはウイルスを用いて遺伝子導入を達成することができる。例えば、Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11 (1): 1-4を参照されたい。

形質転換技術の適用を通して、事実上いかなる植物種の細胞も安定に形質転換することができ、これらの細胞を周知の技術によってトランスジェニック植物に発達させることができる。例えば、ワタ形質転換の文脈で特に有用となり得る技術は、米国特許第５８４６７９７号、第５１５９１３５号、第５００４８６３号；および第６６２４３４４号に記載されており；アブラナ属（Brassica）植物を形質転換するための技術は特に、例えば、米国特許第５７５０８７１号に記載されており；ダイズを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第６３８４３０１号に記載されており；トウモロコシを形質転換するための技術は、例えば、米国特許第７０６０８７６号および第５５９１６１６号ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９５／０６７２２に記載されている。

外因性核酸のレシピエント細胞への送達を行った後、一般的には形質転換細胞をさらなる培養および植物再生のために同定する。形質転換を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するために使用した形質転換ベクターと共に選択マーカー遺伝子を使用することが望ましいだろう。例示的実施形態では、形質転換細胞集団を選択剤（複数可）に曝露することによってアッセイすることができる、または細胞を所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングすることができる。

選択剤への曝露に生き延びた細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性とスコア化された細胞を、植物の再生を支持する培地で培養することができる。実施形態では、成長調節剤などのさらなる物質を含めることによって任意の適当な植物組織培養培地を修飾することができる。組織を、植物再生の努力を開始するために十分な組織が利用可能となるまで成長調節剤を含めた基礎培地で維持し、または組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）の繰り返しの手動選択後、シュート形成を招く培地に移すことができる。十分なシュート形成が起こるまで、培養物を定期的に移す。いったんシュートが形成したら、これらを、根形成を招く培地に移す。いったん十分な根が形成したら、植物をさらなる成長および成熟のために土壌に移すことができる。

再生植物中に提供される構築物を含む所望の核酸の存在を確認するために、種々のアッセイを行うことができる。このようなアッセイには、分子生物学的アッセイ、例えば、サザンブロットおよびノーザンブロット法ならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法および／またはＬＣ−ＭＳＭＳ分光光度法）または酵素機能によって、タンパク質産物の存在を検出する；植物部分アッセイ、例えば、葉または根アッセイ；ならびに／あるいは全再生植物の表現型の分析が含まれ得る。

トランスジェニックイベントを、例えば、対象となる核酸分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ増幅によってスクリーニングすることができる。ＰＣＲ遺伝子型判定は、それだけに限らないが、ゲノムに組み込まれる対象となる核酸分子を含むことが予想される単離宿主細胞カルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、引き続いて標準的なクローニングおよびＰＣＲ増幅産物の配列解析を含むと理解される。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法は十分に記載されており（例えば、Rios et al. (2002) Plant J. 32: 243-53参照）、細胞培養物を含む、任意の植物種または組織型に由来するゲノムＤＮＡに適用することができる。標的配列と導入配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを順次使用する、またはＰＣＲ増幅反応で多重化することができる。標的部位、導入された核酸配列および／または２つの組み合わせにアニーリングするよう設計したオリゴヌクレオチドプライマーを作製することができる。したがって、ＰＣＲ遺伝子型判定戦略は、例えば、限定されないが、植物ゲノム中の特異的配列の増幅；植物ゲノム中の複数の特異的配列の増幅；植物ゲノム中の非特異的配列の増幅；および前記のいずれかの組み合わせを含み得る。当業者であれば、ゲノムを調べるためのプライマーおよび増幅反応のさらなる組み合わせを考案することができるだろう。例えば、順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーのセットを、導入された核酸配列の境界の外側の標的に特異的な核酸配列（複数可能）にアニーリングするように設計することができる。

順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーを、導入された核酸分子に、例えば、そこに含まれる対象となるヌクレオチド配列中のコード領域に相当する配列で、または核酸分子の他の部分に特異的にアニーリングするよう設計することができる。プライマーを本明細書に記載されるプライマーと合わせて使用することができる。オリゴヌクレオチドプライマーは、所望の配列にしたがって合成することができ、商業的に入手可能である（例えば、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ製）。増幅に、クローニングもしくは配列決定、または増幅産物の直接配列解析が続くことができる。実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅に使用する。

導入遺伝子を発現させる方法
実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび／またはトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む植物を成長させるステップを含む。

実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。

実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。実施形態では、植物中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結している３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物を成長させるステップを含む。

実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを持つ遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを持つ遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを持つ遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で少なくとも１つの導入遺伝子を発現させる方法が、少なくとも１つの導入遺伝子と作動可能に連結している３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む植物組織または植物細胞を培養するステップを含む。

実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを含む。実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）プロモーターが、配列番号１であり得る。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞がプロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、プロモーターが配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、トウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲが配列番号２のポリヌクレオチドである。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、３’−ＵＴＲが配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。実施形態では、トウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲが配列番号３のポリヌクレオチドである。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、３’−ＵＴＲが配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．８％または１００％同一である。実施形態では、遺伝子発現カセットがプロモーターと作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含み、プロモーターがトウモロコシ（Zea mays）プロモーター、または植物（例えば、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター）、ウイルス（例えば、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター）もしくは細菌（例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ｄｅｌｔａｍａｓ）に由来するプロモーターである。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。例示的実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよびトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含む遺伝子発現カセットを含む。遺伝子発現カセットが２つ以上の導入遺伝子を含む場合、プロモーターおよび３’−ＵＴＲが遺伝子発現カセット内の異なる導入遺伝子と作動可能に連結していてもよい。例示的実施形態では、遺伝子発現カセットが導入遺伝子と作動可能に連結しているトウモロコシ（Zea mays）プロモーターを含み、導入遺伝子が殺虫剤耐性導入遺伝子、除草剤耐性導入遺伝子、窒素利用効率導入遺伝子、水利用効率導入遺伝子、栄養価導入遺伝子、ＤＮＡ結合導入遺伝子、選択マーカー導入遺伝子またはこれらの組み合わせであり得る。

実施形態では、本明細書に記載される方法を用いた導入遺伝子発現が、植物の葉組織に特異的である。実施形態では、導入遺伝子発現が、植物の葉の組織中で発現している２つ以上の導入遺伝子を含む。実施形態では、本明細書に記載されるトランスジェニック植物を成長させる方法が、葉特異的導入遺伝子発現を含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で導入遺伝子を発現させる方法が、葉特異的組織および根特異的細胞を含む。実施形態では、葉特異的発現がトウモロコシ葉特異的発現を含む。

さらなる実施形態では、本明細書に記載される方法を用いた導入遺伝子発現が、地上の植物組織（例えば、地上の植物組織には、葉、殻、茎およびひげが含まれる）中で発現される。実施形態では、導入遺伝子発現が、地上の植物組織中で発現している２つ以上の導入遺伝子を含む。実施形態では、本明細書に記載されるトランスジェニック植物を成長させる方法が、地上の植物組織導入遺伝子発現を含む。実施形態では、植物組織または植物細胞中で導入遺伝子を発現させる方法が、地上の植物組織および地上の植物細胞を含む。実施形態では、地上の植物組織発現が、トウモロコシの地上の植物組織発現を含む。

実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、本明細書に開示されるトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび／またはトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含むベクターを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、導入遺伝子と作動可能に連結している本明細書に開示されるトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび／またはトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを含むベクターを含む。実施形態では、植物、植物組織または植物細胞が、本明細書に開示される遺伝子発現カセットを含むベクターを含む。実施形態では、ベクターがプラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、バクテリオファージまたはウイルスであり得る。

実施形態では、本明細書に開示される方法による植物、植物組織または植物細胞が単子葉植物であり得る。単子葉植物、植物組織または植物細胞は、それだけに限らないが、トウモロコシ、イネ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、エンバク、タマネギ、キビおよびライコムギであり得る。

実施形態では、本明細書に開示される方法による植物、植物組織または植物細胞が双子葉植物であり得る。双子葉植物、植物組織または植物細胞は、それだけに限らないが、ナタネ、セイヨウアブラナ、カラシナ、エチオピアマスタード（Ethiopian mustard）、ダイズ、ヒマワリおよびワタであり得る。

遺伝子組換え植物の作製に関しては、植物の遺伝子工学の方法が当技術分野で周知である。例えば、双子葉植物ならびに単子葉植物のための生物学的および物理学的形質転換プロトコルを含む多数の植物形質転換方法が開発されている（例えば、Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17: 282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993) 参照）。さらに、植物細胞もしくは組織の形質転換および植物の再生のためのベクターおよびインビトロ培養法は、例えば、Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993) で入手可能である。

当業者であれば、外因性配列がトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、作動可能であることが確認された後、これを有性交雑によって他の植物に導入することができることを認識するだろう。交雑する種に応じて、いくつかの標準的な育種技術のいずれかを使用することができる。

形質転換した植物細胞、カルス、組織または植物は、形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質について操作した植物材料を選択またはスクリーニングすることによって同定および単離することができる。例えば、操作した植物材料を、形質転換遺伝子構築物が耐性を付与する阻害量の抗生物質または除草剤を含む培地で成長させることによって、選択を行うことができる。さらに、組換え核酸ベクター上に存在し得る任意の目に見えるマーカー遺伝子（例えば、ｙｆｐ、ｇｆｐ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼまたはＢもしくはＣ１遺伝子）の活性についてスクリーニングすることによって、形質転換細胞を同定することもできる。このような選択およびスクリーニング方法論は当業者に周知である。

物理的および生化学的方法を使用して挿入された遺伝子構築物を含む植物または植物細胞形質転換体を同定することもできる。これらの方法には、それだけに限らないが、１）組換えＤＮＡインサートの構造を検出および決定するためのサザン解析またはＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写産物を検出および調査するためのノーザンブロット法、Ｓ１ＲＮアーゼ保護、プライマー伸長または逆転写酵素ＰＣＲ増幅；３）酵素またはリボザイム活性（このような遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされている）を検出するための酵素的アッセイ；４）次世代シーケンシング（ＮＧＳ）解析；５）遺伝子構築物産物がタンパク質である、タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット技術、免疫沈降法または酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。インサイチュハイブリダイゼーション、酵素染色および免疫染色などのさらなる技術を使用して、特定の植物器官および組織中の組換え構築物の存在または発現を検出することもできる。これら全てのアッセイを行う方法は当業者に周知である。

本明細書に開示される方法を用いた遺伝子操作の効果は、例えば、対象となる組織から単離したＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のノーザンブロット法によって観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在するまたはｍＲＮＡの量が増加した場合、対応する導入遺伝子が発現していると仮定することができる。遺伝子および／またはコードされるポリペプチド活性を測定する他の方法を使用することができる。使用する基質、および反応産物もしくは副産物の増加もしくは減少を検出する方法に応じて、異なる種類の酵素的アッセイを使用することができる。さらに、発現しているポリペプチドのレベルを、免疫化学的に、すなわち、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび当業者に周知の他の抗体ベースのアッセイ、例えば、電気泳動検出アッセイ（染色またはウエスタンブロット法のいずれかを用いる）によって測定することができる。１つの非限定的な例として、ＥＬＩＳＡアッセイを用いたＡＡＤ−１（アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ；ＷＯ２００５／１０７４３７参照）およびＰＡＴ（ホスフィノトリシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ）タンパク質の検出が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９００９３３６６号に記載されている。導入遺伝子は植物のいくつかの細胞型もしくは組織中でまたはいくつかの発育段階で選択的に発現され得る、または導入遺伝子は実質的にその全ての生活環に沿って実質的に全ての植物組織中で発現され得る。しかしながら、いずれの組み合わせ発現様式も適用可能である。

本開示は、上記トランスジェニック植物の種子であって、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する種子も包含する。本開示は、上記トランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞であって、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する子孫、クローン、細胞株または細胞をさらに包含する。

本発明を具体的な方法および実施形態を参照して記載してきたが、本発明から逸脱することなく種々の修正および変更を行うことができることが認識されるだろう。

［実施例１］
高発現調節エレメントの同定
新規なトウモロコシ（Zea mays）調節エレメントを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を用いる転写プロファイリング手法を介して同定した。次いで、これらの調節エレメントを単離およびクローニングして、トランスジェニック植物に使用するための調節エレメントの発現プロファイルを特徴付けた。バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）から単離したｃｒｙ３４Ａｂ１レポーター遺伝子およびＡＡＤ−１選択マーカー遺伝子で安定に形質転換したトランスジェニックトウモロコシ系統を作製し、導入遺伝子発現レベルおよび組織特異性を評価した。こうして、新規なトウモロコシ（Zea mays）調節エレメントを同定し、特徴付けた。遺伝子発現構築物に使用するためのプロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ調節エレメントを初めて開示する。

遺伝子発現カセットに使用するために望ましい発現プロファイルを有する天然トウモロコシ遺伝子の調節エレメントを同定および選択するために、転写プロファイリング用に植物成長および発達の異なる段階に成長させた植物からトウモロコシ組織を得た。例えば、３つの発達段階の葉（Ｖ４（２連）、Ｖ１２およびＲ３）および根（Ｖ４およびＶ１２結節および繊維組織）発達、花粉、ひげ、穂軸、未成熟仁、殻および茎（Ｖ４およびＲ１）からの組織試料を回収した。全ｍＲＮＡを上記組織の全てから単離し、所望の量の高品質ｍＲＮＡを得た。

ｍＲＮＡ試料の各々からｃＤＮＡライブラリーを調製し、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ（登録商標）２０００（ＩｌｌｕｍｉｎａＩｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてハイスループットシーケンシングを完了した。さらに、ＩｌｌｕｍｉｎａＴｒｕＳｅｑ（登録商標）ＲＮＡ試料調製キットをＲＮＡｓｅｑ試料調製のための製造業者の推奨プロトコルにしたがって使用した。要するに、全ＲＮＡ５μｇを、ポリＴオリゴ結合磁気ビーズを用いて精製し、引き続いて高温下で二価カチオンを用いて小さな断片（約２００ｂｐ平均長）に断片化した。次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素およびランダムプライマーを用いて断片化ｍＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡにコピーした。ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮアーゼＨを用いて、ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）にさらに変換した。次いで、二本鎖ｃＤＮＡフラグメントに末端修復、Ａテール化、次いでインデックスＩｌｌｕｍｉｎａペア末端（ＰＥ）アダプターとのライゲーションを行った。最後に、ライブラリー産物を浄化し、１５サイクルのＰＣＲで濃縮し、精製した。濃縮ライブラリーを２ｎＭの濃度に正規化し、水酸化ナトリウムで変性し、ＨｉＳｅｑ（登録商標）フローセルの単一レーンにロードするためにハイブリダイゼーションバッファ中１２ｐＭに希釈した。Ｉｌｌｕｍｉｎａの推奨プロトコルにしたがって、クラスター生成、プライマーハイブリダイゼーションおよびシーケンシング反応を行った。

次いで、シーケンシングリードをフィルタ処理して低品質のリードを除去した。フィルタ処理後、シーケンシングリードの約９９．９％が残った。シーケンシングリードを、ｍａｉｚｅＧＤＢで入手可能なアノテーション付きトウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ７３ゲノムに整列した。２つ以上の遺伝子座でトウモロコシゲノム上にマッピングされたシーケンシングリードを捨てて、高発現遺伝子の同定およびそのさらなる特徴付けにおける混乱を回避した。このステップにより、試料の各々からの７０％超のシーケンシングリードのトウモロコシゲノムとのアラインメントが得られた。フラグメント／エクソン１キロベース／マッピングされた１００万個のフラグメントまたはＦＰＫＭ値の定量的遺伝子発現単位を用いて、遺伝子発現構築物に使用するのに望ましい発現パターンに一致する安定な形質転換試験のための遺伝子を順位付けした。トウモロコシ中の高発現遺伝子を、安定なトランスジェニック系統での試験のために優先した（図１）。

［実施例２］
トウモロコシ（Zea mays）配列からの新規な調節エレメントの選択
プロモーター、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲ配列を、転写プロファイリング手法を通して発現に関して高く順位付けされたトウモロコシ（Zea mays）遺伝子配列から抽出した。トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ７３ゲノムからのトウモロコシ（Zea mays）遺伝子の天然配列を配列番号４として提供する。配列番号２および配列番号３の１０００ｂｐ３’−ＵＴＲ配列に加えて、配列番号１の６３７ｂｐプロモーターおよび５’−ＵＴＲ配列が配列番号４に含まれる。

［実施例３］
構築物設計
ＤＮＡエレメントを合成し、エントリーベクターにクローニングした。プロモーターは６３７ｂｐ長であり、３’−ＵＴＲはそれぞれ１０００ｂｐ長であった。配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーター、ｃｒｙ３４Ａｂ１（バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）のレポーター遺伝子）、ならびに配列番号２および配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを、構築物隣接ＤＮＡエレメントと最小１５ｂｐの重複相同性を含むプライマーを用いて増幅した。全てのフラグメントをゲル精製した。全３つのフラグメントを、エントリーベクター骨格、ｐＥＮＴＲ１１と一緒に、Ｇｅｎｅａｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を通して指向性順序で組み立てた。次いで、得られたエントリープラスミド、ｐＤＡＢ１１４４９４およびデスティネーションベクター、ｐＤＡＢ１０４１５３を用いて、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲＣｌｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応を行うと、最終的な発現ベクター、ｐＤＡＢ１１４４１０が得られた。デスティネーションベクターは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーター（Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689）によって駆動され、トウモロコシリパーゼ３’−ＵＴＲ（米国特許第７１７９９０２号）によって終結するＡＡＤ−１遺伝子で構成された選択マーカーカセットを含んでいた。

上記戦略を用いて、ｐＤＡＢ１１４４１０構築物を設計および構築した。このベクターは、ＡＡＤ−１遺伝子発現カセットと、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子発現カセットを駆動する配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび５’−ＵＴＲとを含む異種遺伝子発現構築物である（図２）。

ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子をｐｈｉＹＦＰレポーター遺伝子（Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21; 841-50）で置き換え、ＳｔＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲをトウモロコシ（Zea mays）から得た配列番号２の新規な１，０００ｂｐ３’−ＵＴＲ配列で置き換えることによって、第２のエントリーベクター、ｐＤＡＢ１１４４９４をＧｅｎｅａｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応を用いて組み立てた。プロモーター（配列番号１）および３’−ＵＴＲ（配列番号２）エレメントのいずれもトウモロコシ（Zea mays）の同じ天然遺伝子に由来していた。デスティネーションベクター、ｐＤＡＢ１０４１５３を用いたＧａｔｅｗａｙ（登録商標）反応後、最終ベクター構築物、ｐＤＡＢ１１６００８を組み立てた。デスティネーションベクターは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーター（Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689）によって駆動され、トウモロコシリパーゼ３’−ＵＴＲ（米国特許第７１７９９０２号）によって終結するＡＡＤ−１遺伝子で構成された選択マーカーカセットを含んでいた。ｐＤＡＢ１１６００８ベクター構築物は、ＡＡＤ−１遺伝子発現カセットおよびＰｈｉＹＦＰ遺伝子発現カセットを含む異種発現構築物である（図３）。

ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子の代わりに、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）レポーター遺伝子およびｐＤＡＢ１１４４１０中に存在するのと同じＡＡＤ−１発現カセットを含む陰性対照構築物、ｐＤＡＢ１０１５５６（図４）を組み立てた。ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子の発現を制御するトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーターおよびジャガイモ（Solanum tuberosum）プロテアーゼ阻害剤遺伝子ＩＩ３’−ＵＴＲ（ＳｔＰｉｎＩＩ３’−ＵＴＲｖ２；An et al., (1989) Plant Cell 1; 115-22）で構成された陽性対照構築物、ｐＤＡＢ１０８７４６（図５）を構築した。ＡＡＤ−１カセットはｐＤＡＢ１１４４１０中に存在するものと同じであった。

代わりの３’ＵＴＲを含む構築物ｐＤＡＢ１２０１６７のためのＤＮＡエレメントを合成し、エントリーベクターにクローニングした。プロモーター（配列番号１）および３’−ＵＴＲ（配列番号３）の長さはそれぞれ６３７ｂｐおよび１０００ｂｐであった。配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーター、ｃｒｙ３４Ａｂ１（バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）のレポーター遺伝子）、および配列番号３のトウモロコシ（Zea mays）３’−ＵＴＲを、構築物中その隣接ＤＮＡエレメントと最小１５ｂｐの重複相同性を含むプライマーを用いて増幅した。全てのフラグメントをゲル精製した。全３つのフラグメントを、エントリーベクター骨格、ｐＥＮＴＲ１１と一緒に、Ｇｅｎｅａｒｔ（登録商標）Ｓｅａｍｌｅｓｓクローニング反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を通して指向性順序で組み立てた。次いで、得られたエントリープラスミド、ｐＤＡＢ１２０１５８およびデスティネーションベクター、ｐＤＡＢ１０４１５３を用いて、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲＣｌｏｎａｓｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応を行うと、最終的な発現ベクター、ｐＤＡＢ１２０１６７が得られた。デスティネーションベクターは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン−１プロモーター（Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689）によって駆動され、トウモロコシリパーゼ３’−ＵＴＲ（米国特許第７１７９９０２号）によって終結するＡＡＤ−１遺伝子で構成された選択マーカーカセットを含んでいた。得られた構築物、ｐＤＡＢ１２０１６７は、ＡＡＤ−１遺伝子発現カセットおよびｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子発現カセットを含む異種発現構築物である（図５）。

［実施例４］
植物形質転換および分子的確認：
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換：
バイナリー発現ベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）菌株ＤＡｔ１３１９２（ＲｅｃＡ欠損三元菌株（ternary strain））（国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２０１６２２２）に形質転換した。細菌コロニーを選択し、バイナリープラスミドＤＮＡを制限酵素消化を介して単離および確認した。

アグロバクテリウム培養開始：
アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養液をグリセロールストックからＡＢ最少培地（Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79；スクロースを用いず、５ｇ／Ｌグルコースおよび１５ｇ／ＬＢａｃｔｏ（商標）Ａｇａｒを用いて作製）上に面線接種し、暗所中２０℃で３日間インキュベートした。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）培養液をＹＥＰ培地（Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79）のプレート上に面線接種し、暗所中２０℃で１日間インキュベートした。

実験日に、接種培地（２．２ｇ／ＬＭＳ塩、６８．４ｇ／Ｌスクロース、３６ｇ／Ｌグルコース、１１５ｍｇ／ＬＬ−プロリン、２ｍｇ／Ｌグリシン、１００ｍｇ／Ｌミオ−イノシトール、０．０５ｍｇ／Ｌニコチン酸、０．５ｍｇ／ＬピリドキシンＨＣｌ、０．５ｍｇ／ＬチアミンＨＣｌ）とアセトシリンゴンの混合物を実験のサイズに適した体積で調製した。次に、アセトシリンゴンの１００％ジメチルスルホキシド中１Ｍストック溶液を、２００μＭの最終アセトシリンゴン濃度を作るのに接種培地を含むフラスコに添加した。

各構築物について、ＹＥＰプレートからの１〜２ループのアグロバクテリウム（Agrobacterium）を滅菌使い捨て５０ｍｌ遠心管の内側の接種培地／アセトシリンゴン混合物１５ｍｌに懸濁し、６００ｎｍでの溶液の光学濃度（Ｏ．Ｄ．_６００）を分光光度計で測定した。次いで、追加の接種培地／アセトシリンゴン混合物を用いて、懸濁液を０．２５〜０．３５Ｏ．Ｄ．_６００に希釈した。次いで、アグロバクテリウム（Agrobacterium）懸濁液の管を室温で約７５ｒｐｍに設定したプラットホームシェーカー上に水平に置き、使用前に１〜４時間の間インキュベートした。

トウモロコシの形質転換：
実験構築物を、近交系トウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４から単離した未成熟胚のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換を介してトウモロコシに形質転換した。使用した方法は、Ishida et al., (1996) Nature Biotechnol 14:745-750およびFrame et al., (2006) Plant Cell Rep 25: 1024-1034によって公開されているものと類似であるが、その方法がハイスループット形質転換を受け入れられるようにするよういくつかの修正および改善をした。トウモロコシ中にいくつかのトランスジェニックイベントを生成するために使用される方法の例は、胚感染および共培養ステップで始める、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１３／０１５７３６９Ａ１に示される。

温室内でのＴ_０植物の移動および確立：
トランスジェニック植物を温室に定期的に移した。植物を、Ｐｈｙｔａｔｒａｙｓ（商標）から成長培地（ＰｒｅｍｉｅｒＴｅｃｈＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、ＰｒｏＭｉｘＢＸ）を充填した小型ポット（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ、３．５’’ＳＶＤ、７０００２２Ｃ）へ移植し、ヒュミドーム（humidome）で覆って植物を順応させるのを助けた。植物を、Ｖ３〜Ｖ４期に達するまで、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（商標）生育チャンバー（２８℃／２４℃、１６時間光周期、５０〜７０％相対湿度、２００μｍｏｌｍ^−２ｓ^−１光強度）に入れた。これは、植物を土壌およびより厳しい温度に順応させるのを助けた。次いで、植物を温室（露光型：光または同化；ハイライト限界：１２００μｍｏｌｍ^−２ｓ^−１光合成有効放射（ＰＡＲ）；１６時間日長；２７℃昼／２４℃夜）に移動させ、小型ポットから５．５インチのポットへ移植した。大きなポットに移植した約１〜２週間後、植物をバイオアッセイのためにサンプリングした。１イベント当たり１つの植物を分析した。

［実施例５］
トランスジェニック植物／イベントの分子的確認
ｃｒｙ３４Ａｂ１およびＡＡＤ−１定量的ＰＣＲアッセイを用いて、導入遺伝子の存在のためにＶ２〜３葉期で推定上のトランスジェニックトウモロコシ植物をサンプリングした。製造業者の指示通りに、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔ（登録商標）ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、全ＤＮＡを葉試料から抽出した。

目的の遺伝子を検出するために、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子のＦＡＭ標識蛍光プローブおよび内因性インベルターゼ参照遺伝子対照のＨＥＸ標識蛍光プローブを含むＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー／プローブセットを用いて、遺伝子特異的ＤＮＡフラグメントを増幅した。以下のプライマーを、ｃｒｙ３４Ａｂ１およびインベルターゼ内因性参照遺伝子増幅に使用した。

Ｃｒｙ３４Ａｂ１プライマー／プローブ：

順方向プライマー：ＴＱ．８ｖ６．１．Ｆ：ＧＣＣＡＴＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧ（配列番号５）

逆方向プライマー：ＴＱ．８ｖ６．１．Ｒ：ＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＧＡＴＧＧ（配列番号６）

プローブ：ＴＱ．８ｖ６．１．ＭＧＢ．Ｐ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＣＧＡＡＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴＴＣＡ／ＭＧＢ（配列番号７）

インベルターゼプライマー：

順方向プライマー：インベルターゼＦ：ＴＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＧＡＣＴＴＧＴ（配列番号８）

逆方向プライマー：インベルターゼＲ：ＡＡＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＴ（配列番号９）

インベルターゼプローブ：５’−／５ＨＥＸ／ＣＧＡＧＣＡＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＴ／３ＢＨＱ＿１／−３’（配列番号１０）

次に、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＰｒｏｂｅＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）５μｌ；１０μＭストック〜最終濃度４００ｎＭのＴＱ．８ｖ６．１．Ｆ、ＴＱ．８ｖ６．１．Ｒ、インベルターゼＦおよびインベルターゼＲプライマーそれぞれ０．４μｌ；５μＭストック〜最終濃度２００ｎＭのＴＱ．８ｖ６．１．ＭＧＢ．Ｐおよびインベルターゼプローブそれぞれ０．４μｌ、１０％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）〜最終濃度０．１％０．１μｌ；１０ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡ２μｌおよび水０．５μｌを含む最終体積１０μｌの反応液でＰＣＲ反応を行った。ＤＮＡを以下の条件下、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０Ｓｙｓｔｅｍで増幅した：１サイクルの９５℃１０分間；４０サイクルの以下の３つのステップ：９５℃１０秒間；５８℃３５秒間および７２℃１秒間、ならびに最終サイクルの４℃１０秒間。未知の試料についての標的（目的の遺伝子）／参照（インベルターゼ遺伝子）値（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０による出力）とｃｒｙ３４Ａｂ１コピー数対照の標的／参照値を比較することによって、ｃｒｙ３４Ａｂ１コピー数を決定した。

インベルターゼ内因性参照遺伝子を用いて、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子について上記のように、ＡＡＤ−１遺伝子の検出を行った。ＡＡＤ−１プライマー配列は以下の通りであった；

ＡＡＤ１順方向プライマー：ＴＧＴＴＣＧＧＴＴＣＣＣＴＣＴＡＣＣＡＡ（配列番号１１）

ＡＡＤ１逆方向プライマー：ＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＴＧＡＣＴＧＡ（配列番号１２）

ＡＡＤ１プローブ：５’−ＦＡＭ／ＣＡＣＡＧＡＡＣＣＧＴＣＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡ−ＭＧＢ／ＢＨＱ−３’（配列番号１３）

インベルターゼ内因性参照遺伝子を用いて、ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子について上記のように、ＰｈｉＹＦＰ遺伝子の検出を行った。ＰｈｉＹＦＰプライマー配列は以下の通りであった；

ＰｈｉＹＦＰｖ３順方向プライマー：ＣＧＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＴＧＧＡ（配列番号１４）

ＰｈｉＹＦＰｖ３逆方向プライマー：ＣＣＧＴＧＧＴＴＧＧＣＴＴＧＧＴＣＴ（配列番号１５）

ＰｈｉＹＦＰｖ３プローブ：５’ＦＡＭ／ＣＡＣＴＣＣＣＣＡＣＴＧＣＣＴ／ＭＧＢ＿ＢＨＱ＿１／３’（配列番号１６）

最後に、目的の遺伝子を含むＴ_０植物を、Ｃｒｙ３４Ａｂ１、ＰｈｉＹＦＰおよびＡＡＤ−１葉ＥＬＩＳＡアッセイのためにＶ４〜５でサンプリングした。４枚の葉パンチをサンプリングした。共にタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイのために全根の質量のために別のセットの植物をＶ４〜５でサンプリングした。葉および根のＣｒｙ３４Ａｂ１（Ａｇｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｅｌｋａｒｔ、ＩＮ）およびＡＡＤ−１（ＡｃａｄｉａＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）ＥＬＩＳＡアッセイを製造業者の指示通りに行った。

ＰｈｉＹＦＰＥＬＩＳＡを以下の通り完了した。植物をモノクローナル抗ＹＦＰ捕捉抗体（Ｏｒｉｇｅｎｅ；Ｒｏｃｋｖｉｌｅ、ＭＤ）で被覆した。モノクローナル抗ＹＦＰ捕捉抗体を１μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに希釈し、溶液１５０μｌをプレートのウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを２０〜３０分間室温に加温した。プレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）３５０μｌで４回洗浄した。次いで、ブロッキング緩衝液２００μｌをプレートに分注し、プレートを３７℃で少なくとも１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）３５０μｌで４回洗浄した。

組換え発現ＰｈｉＹＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ；Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）の標準を、段階希釈でウェルに添加した。標準を最初に０．０３１３ｎｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの濃度で提供した。次に、プレートをシェーカーに置き、室温でインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）３５０μｌで４回洗浄した。一次ウサギ抗ＰｈｉＹＦＰポリクローナル抗体（Ｅｖｒｏｇｅｎ；Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）を、１μｇ／ｍｌまで濃度を低下させ、プレートに添加した。次に、プレートをシェーカーに置き、室温でインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）３５０μｌで４回洗浄した。二次抗ウサギ抗体西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をプレートに添加した。次に、プレートをシェーカーに置き、室温でインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）３５０μｌで４回洗浄した。最後に、Ｐｉｅｒｃｅ１ステップＵｌｔｒａＴＭＢＥＬＩＳＡ、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体の基質をウェルに添加し、穏やかに振盪した。結果を、分光光度計を用いて定量化した。

Ｃｒｙ３４Ａｂ１葉ＥＬＩＳＡアッセイをｎｇ／ｃｍ^２として表し、根ＥＬＩＳＡ結果を百万分率（またはタンパク質ｎｇ／全植物タンパク質ｍｇ）として表した。全根タンパク質アッセイを、製造業者の指示通りにＢｒａｄｆｏｒｄ検出法によって行った。

Ｔ_０植物をトウモロコシ（Zea mays）栽培品種Ｂ１０４非トランスジェニック形質転換系統に自殖および他殖してＴ_１種子を得た。試験調節エレメント構築物の各々の５〜６個のトランスジェニック系統またはイベントをＴ_１タンパク質およびＲＮＡ遺伝子発現試験、次いで、Ｔ_２種子産生に進めた。したがって、イベントの各々の３０〜４０個のＴ_１種子を蒔いた。実生にＶ２〜Ｖ３の発達段階でＡｓｓｕｒｅＩＩ（登録商標）を噴霧して非トランスジェニック分離個体を死滅させた。トランスジェニック植物を、以下の通りＣｒｙ３４Ａｂ１、ＰｈｉＹＦＰおよびＡＡＤ−１ＥＬＩＳＡのために複数の植物発達段階でサンプリングした：葉（Ｖ４、Ｖ１２およびＲ３）；根（Ｖ４およびＲ１）；茎（Ｒ１）；花粉（Ｒ１）；ひげ（Ｒ１）；殻（Ｒ３）；未成熟仁（Ｒ３）；および穂軸（Ｒ３）。全ての組織を単離し、ドライアイスに埋め込まれたチューブに入れ、次いで、これを−８０℃に移した。ＥＬＩＳＡのためにタンパク質抽出する前に、凍結組織を凍結乾燥した。

ｃｒｙ３４Ａｂ１、ＰｈｉＹＦＰおよびＡＡＤ−１導入遺伝子を含む推定上のトランスジェニックＴ_１植物を、葉ＥＬＩＳＡアッセイのためにＶ４〜５でサンプリングした。４枚の葉パンチをサンプリングした。葉パンチをチューブに入れ、単一１／８’’ステンレス鋼ビーズ（ＨｏｏｖｅｒＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｕｍｍｉｎｇ、ＧＡ、米国）を、３００μｌ抽出緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および０．５％ＢＳＡを補足した１×ＰＢＳＴ）を含むそれぞれの１．２ｍｌチューブに添加した。試料をＧｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ（商標）（ＳＰＥＸＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ、Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ）において１５００ｒｐｍで４分間処理した。試料をＳｏｒｖａｌｌＬｅｇｅｎｄＸＦＲ（商標）遠心分離機において４０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。次に、さらに抽出緩衝液３００μｌを添加し、試料をＧｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ（商標）においてもう一度１５００ｒｐｍで２分間処理した。試料をもう一度４０００ｒｐｍで７分間遠心分離した。最後に、上清を回収し、製造業者の指示通りに、商業的に入手可能なＣｒｙ３４Ａｂ１（Ａｇｄｉａ，Ｉｎｃ．）およびＡＡＤ−１（ＡｃａｄｉａＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、ＬＬＣ）ＥＬＩＳＡアッセイキットを用いて、タンパク質標準と一緒に異なる希釈でＥＬＩＳＡアッセイを完了した。

凍結乾燥組織をペイントシェーカー中で３０秒間粉砕することによって、種々の組織型のＥＬＩＳＡのためのタンパク質抽出を行った。さらなる粉砕を必要とする組織については、粉砕ステップをさらに３０秒間繰り返した。ガーネット粉末を添加してチューブの底の曲線部分を覆った。粗く粉砕した組織を２ｍｌチューブに移し、０．５ｍｌの印まで満たした。１個のセラミックボールを各チューブに添加し、部分抽出緩衝液（プロテアーゼ阻害剤カクテル２００μｌ、５００ｍＭＥＤＴＡ２００μｌ、ＤＴＴ粉末１５．５ｍｇおよび２０ｍｌまでのＰＢＳＴ）０．６ｍｌも添加した。チューブの全てを氷上で１０分間保持した。冷チューブをＧｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒ（登録商標）の２ｍｌホルダーに移した。試料を、間に５分間氷上で冷却しながら２回、３０秒間粉砕した。次に、１０％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０４０μｌおよび抽出緩衝液３００μｌを試料に添加した。試料を、間に５分間冷却しながら、さらに３０秒間粉砕した。最後に、各試料を１３０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、上清を新しいチューブに慎重に移して抽出物を回収した。抽出物を抽出緩衝液に再懸濁し、ＥＬＩＳＡアッセイに必要とされるように希釈した。

［実施例６］
Ｔ_０トランスジェニック植物の発現スクリーニング
ＥＬＩＳＡの結果は、トウモロコシ（Zea mays）から単離した調節エレメントが、構築物、ｐＤＡＢ１１４４１０で形質転換されたＴ_０イベントにおいて、Ｃｒｙ３４Ａｂ１の葉組織好適発現を駆動することを示した。これらのイベントの、低いトウモロコシ（Zea mays）調節エレメントによるＣｒｙ３４Ａｂ１の発現が根で観察された（表１〜５）。対照構築物ｐＤＡＢ１０８７４６から産生されたイベントは、葉組織と根組織の両方でＣｒｙ３４Ａｂ１を発現した。ｃｒｙ３４Ａｂ１遺伝子を含まない対照構築物、ｐＤＡＢ１０１５５６で形質転換された植物イベントにおいては、Ｃｒｙ３４Ａｂ１の葉発現が観察されなかった。全ての構築物が、根組織と葉組織の両方でＡＡＤ−１タンパク質を発現した。配列番号１の新規なトウモロコシ（Zea mays）プロモーターと配列番号２および配列番号３の３’ＵＴＲとを含むトランスジェニックトウモロコシ植物からサンプリングした穂軸、殻、仁、花粉、ひげおよび茎を含む異なる組織型で、高いｐｈｉＹＦＰタンパク質発現が見られた。これらのデータは、ここで請求されている新規なプロモーターおよび３’ＵＴＲが、植物中で導入遺伝子の高い構成的発現を駆動し、生物工学用途に有用となることを証明している。さらに、ｐＤＡＢ１１４４１０プロモーターが下流遺伝子に対する増強効果を有し、これが構築物ｐＤＡＢ１０１５５６と比べて、葉、穂軸、ひげ、仁、茎、殻および花粉におけるＡＡＤ−１導入遺伝子の有意な上方制御をもたらすことが認められた。

こうして、トウモロコシ（Zea mays）から単離した新規なトウモロコシ調節エレメントを同定し、特徴付けた。遺伝子発現構築物に使用するための配列番号１のトウモロコシ（Zea mays）プロモーターおよび５’−ＵＴＲならびに配列番号２および配列番号３の３’−ＵＴＲ調節エレメントを初めて開示している。

本明細書で引用される刊行物、特許および特許出願を含む全ての参考文献は、本開示の明示的詳細と矛盾しない程度に参照により本明細書に組み込まれ、そのため、あたかも各参考文献が個別的かつ具体的に参照により組み込まれることが示されており、本明細書に全体が示されているのと同程度に組み込まれる。本明細書に論じられる参考文献は、本出願の出願日前より前のその開示についてのみ提供される。本明細書中のいずれも、本発明者らが先行発明によってこのような開示に先立つ権利がないことの自認と解釈すべきでない。以下の実施例は、特定の特徴および／または実施形態を例示するために提供されるものである。実施例は、本開示を例示される特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきでない。

Claims

ｉ）ポリリンカー配列；
ｉｉ）非クロロフィルａ／ｂ導入遺伝子または
ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）の組み合わせ
と作動可能に連結しているプロモーターを含む核酸ベクターであって、前記プロモーターは配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸ベクター。
前記プロモーターが長さ７００ｂｐ未満である、請求項１に記載の核酸ベクター。
前記プロモーターが配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列からなる、請求項１に記載の核酸ベクター。
選択マーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸ベクター。
前記プロモーターが導入遺伝子または小型ＲＮＡと作動可能に連結している、請求項４に記載の核酸ベクター。
前記導入遺伝子が殺虫剤耐性、除草剤耐性、窒素利用効率、水利用効率または栄養価を付与する選択マーカーまたは遺伝子産物をコードする、請求項５に記載の核酸ベクター。
配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、前記３’非翻訳配列が前記ポリリンカー、前記導入遺伝子または前記小型ＲＮＡと作動可能に連結している、請求項１から３または５のいずれかに記載の核酸ベクター。
配列番号３または配列番号３と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、前記３’非翻訳配列が前記ポリリンカー、前記導入遺伝子または前記小型ＲＮＡと作動可能に連結している、請求項１から３または５のいずれかに記載の核酸ベクター。
５’非翻訳配列またはイントロン配列をさらに含む、請求項１から３または５のいずれかに記載の核酸ベクター。
導入遺伝子または小型ＲＮＡと作動可能に連結している配列番号１または配列番号１と９０％の配列同一性を有する配列を含む植物。
トウモロコシ（Zea mays）、コムギ、イネ、ソルガム、エンバク、ライムギ、バナナ、サトウキビ、ダイズ、ワタ、ヒマワリ、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、タバコおよびセイヨウアブラナからなる群から選択される、請求項１０に記載の植物。
トウモロコシ（Zea mays）である、請求項１０に記載の植物。
前記導入遺伝子が前記植物のゲノムに挿入されている、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の植物。
配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、前記３’非翻訳配列が前記導入遺伝子または前記小型ＲＮＡと作動可能に連結している、請求項１０に記載の植物。
配列番号３または配列番号３と９０％の配列同一性を有する配列を含む３’非翻訳配列をさらに含み、前記３’非翻訳配列が前記導入遺伝子または前記小型ＲＮＡと作動可能に連結している、請求項１０に記載の植物。
ｉ）ポリリンカー配列；
ｉｉ）非クロロフィルａ／ｂ導入遺伝子または
ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）の組み合わせ
と作動可能に連結している転写ターミネーターを含む核酸ベクターであって、前記転写ターミネーターは配列番号２または配列番号２と９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸ベクター。
前記転写ターミネーターが長さ１．１ｋｂ未満である、請求項１６に記載の核酸ベクター。
前記転写ターミネーターが配列番号２の３’ＵＴＲ配列からなる、請求項１６に記載の核酸ベクター。
ｉ）ポリリンカー配列；
ｉｉ）非クロロフィルａ／ｂ導入遺伝子または
ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）の組み合わせ
と作動可能に連結している転写ターミネーターを含む核酸ベクターであって、前記転写ターミネーターは配列番号３または配列番号３と９０％の配列同一性を有する配列を含む、核酸ベクター。
前記転写ターミネーターが長さ１．１ｋｂ未満である、請求項１９に記載の核酸ベクター。
前記転写ターミネーターが配列番号３の３’ＵＴＲ配列からなる、請求項１９に記載の核酸ベクター。