KR20160067974A - 제아 메이스 조절 요소 및 그의 용도 - Google Patents

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나빈 엘랑고
카틱 나라이나 무투라만
제프리 베링거
새라 베넷
후이시아 우
섀블 고먼
앤드류 워든
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

제아 메이스로부터 단리된, 프로모터, 5'-UTR, 및/또는 3'-UTR을 포함하는, 유전자 조절 요소를 사용하여 식물 세포 및/또는 식물 조직에서 트랜스진을 발현하기 위한 벡터 구축물 및 방법을 제공한다.

Description

제아 메이스 조절 요소 및 그의 용도 {ZEA MAYS REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. 5 § 119(e) 하에 2013년 10월 15일 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/890,901의 이점을 주장하고, 상기 출원은 그 내용 전문이 본 출원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 자료의 참조에 의한 포함
본원과 동시에 제출되었으며, 하기와 같이 식별되는 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 그 전문이 참조로 포함된다: 2014년 10월 1일 작성된, 파일명이 "74275"인 원 11.4 KB ASCII 텍스트 파일.
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 식물 분자 생물학 분야, 및 더욱 구체적으로, 트랜스제닉 식물에서의 유전자 발현에 관한 것이다.
식물 형질전환은 작물학상 바람직한 특질 또는 특징을 상이한 작물 식물 종 내로 도입하는 데 사용하는 데에 있어 매력적인 기술이다. 식물 종은 특정의 바람직한 특질(trait)을 가지는 것으로 발생되고/거나, 변형된다. 일반적으로, 바람직한 특질로는 예를 들어, 영양적 가치 품질 개선, 수율 증가, 해충 또는 곤충 저항성 부여, 질환 저항성, 가뭄 및 스트레스 내성 증가, 원예학적 품질 (예컨대, 색소화 및 생장) 증가, 제초제 내성 제공, 식물로부터 농업상 유용한 화합물 및/또는 물질이 제조될 수 있도록 지원, 및/또는 제약 제조가 가능하도록 지원을 포함한다.
단일 게놈 유전자좌에 스태킹된 다중 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 식물은 식물 형질전환 기술을 통해 제조된다. 식물 형질전환 기술은 트랜스진의 식물 세포 내로의 도입, 식물 게놈 내에 안정적으로 통합된 트랜스진 카피를 함유하는 수정 능력이 있는 트랜스제닉 식물의 회수, 및 이어서, 트랜스진(들)의 전사 및 번역을 통한 트랜스진 발현을 부여한다. 그렇게 함으로써 바람직한 특질 및 표현형을 가진 트랜스제닉 식물을 생성할 수 있다. 스택 중의 각 트랜스진은 전형적으로는 식물 내에서의 유전자 발현을 위해 독립적인 프로모터를 필요로 하며, 따라서, 트랜스진 스택에서는 다중의 프로모터가 사용된다.
같은 특질을 조절하기 위해 다중 트랜스진의 공동 발현을 필요로 함에 따라 그 결과로 빈번하게는 다중 트랜스진의 발현을 구동시키기 위해 같은 프로모터가 반복 사용된다. 그러나, 고수준의 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함하는 프로모터의 반복 사용은 상동성 기반 유전자 침묵화 (HBGS)를 유도할 수 있다. HBGS는, 한 트랜스진 내에서 반복 DNA 서열이 사용될 때, 트랜스제닉 식물에서 빈번하게 발생하는 것으로 관찰되었다 (Peremarti et al., 2010). 추가로, 트랜스진 구축물에서의 유사한 DNA 서열의 반복 사용은 아그로박테리움(Agrobacterium)에서 플라스미드의 재조합 및 불안정성에 기인하는 도전 과제가 되는 것으로 입증되었다.
본원에서는 옥수수 유전자 조절 요소 (예컨대, 프로모터, 5'-UTR, 및 3'-UTR)를 기술한다. 옥수수 조절 요소를 사용하는 구축물 및 방법을 추가로 기술한다.
요약
본원에서는 식물 세포 및/또는 식물 조직에서 트랜스진을 발현시키기 위한 정제된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 구축물 및 방법을 개시한다. 한 실시양태에서, 클로로필 a/b 유전자의 조절 요소를 제아 메이스(Zea mays) 게놈으로부터 단리시키고, 상기 조절 요소에 천연적으로 연결되지 않은 서열과 재조합하여 클로로필 a/b 조절 서열에 고유한 것이 아닌 트랜스진을 식물 세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 생성한다. 한 실시양태에서, 클로로필 a/b 유전자의 조절 요소가 폴리링커 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 벡터는 유전자, 트랜스진, 또는 유전자 카세트를 클로로필 a/b 유전자 조절 서열과 작동가능하게 연결된 상태로 벡터 내로 삽입하는 것을 용이하게 한다.
한 실시양태에서, 서열 1의 제아 메이스 클로로필 a/b 프로모터 및 5' 비번역 영역 (5'-UTR)을 포함하는 구축물을 제공한다. 한 실시양태에서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 서열 1의 제아 메이스 클로로필 a/b 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공한다. 한 실시양태에서, 구축물은 서열 2 또는 서열 3의 제아 메이스 클로로필 a/b 3' UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 서열 2 또는 서열 3의 제아 메이스 클로로필 a/b 3' UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 적어도 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 트랜스진을 포함한다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 독립적으로 a) 서열 1의 제아 메이스 클로로필 a/b 프로모터, b) 서열 2의 제아 메이스 클로로필 a/b 3'UTR, 및 c) 서열 3의 제아 메이스 클로로필 a/b 3'UTR을 포함한다.
한 실시양태에 따라, 비-클로로필 a/b 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 핵산 벡터이며, 여기서 프로모터는 서열 1, 또는 서열 1과 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 것인 핵산 벡터를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 핵산 벡터는 유전자 카세트를 포함하고, 여기서, 유전자 카세트는 프로모터, 비-클로로필 a/b 트랜스진 및 3' 비번역 영역을 포함하고, 여기서, 프로모터는 트랜스진의 제1 단부에 작동가능하게 연결된 서열 1로 이루어지고, 여기서, 트랜스진의 제2 단부는 서열 2 또는 서열 3으로 이루어진 3' 비번역 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
본원에서는 제아 메이스 클로로필 a/b 프로모터 및 3'-UTR을 이용하여 트랜스진을 발현하는 식물을 생장시키는 방법을 개시한다. 본원에서는 제아 메이스 프로모터 및 3'-UTR을 이용하여 트랜스진을 발현하는 식물 조직 및 세포를 배양하는 방법도 개시한다. 한 실시양태에서, 본원에서 개시된 바와 같은 방법은 식물 줄기, 잎, 속대, 수염, 커넬, 줄기, 껍질 및 화분 조직에서의 조직-특이적 유전자 발현을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본원에서는 제2 유전자 발현 카세트 내에 함유되어 있는 관심 유전자의 과다발현을 증진시키는 방법을 개시한다. 따라서, 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 서열 2 또는 서열 3의 제아 메이스 3'-UTR은 제1 유전자 발현 카세트에 대하여 근위부에 위치하는 제2의 상이한 유전자 발현 카세트에 위치하는 관심 유전자의 발현을 증진시키는 것으로 보인다 (제1 유전자 발현 카세트는 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 서열 2 또는 서열 3의 제아 메이스 3'-UTR을 함유하고, 제2 유전자 발현 카세트는 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 서열 2 또는 서열 3의 제아 메이스 3'-UTR을 함유하지 않는다). 일부 실시양태에서, 제1 유전자 발현 카세트는 제2 유전자 발현 카세트로부터 1,000 bp, 2,000 bp, 3,000 bp, 4,000 bp, 5,000 bp, 6,000 bp, 7,000 bp, 8,000 bp, 9,000 bp, 10,000 bp, 12,000 bp, 또는 15,000 bp인 위치에 근위부에 위치한다. 다른 실시양태에서, 관심 제2 유전자의 발현은 약 1.25배, 1.5배, 1.75배, 2배, 2.5배, 3.0배, 또는 3.5배만큼 증진되고, 여기서, 근위부에 위치하는 제1 유전자 발현 카세트는 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 서열 2 또는 서열 3의 제아 메이스 3'-UTR을 함유한다.
한 실시양태에 따라, 비-클로로필 a/b 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포이며, 여기서 프로모터는 서열 1을 포함하는 것인, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포를 제공한다. 한 실시양태에 따라, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 서열 1, 또는 서열 1과 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 식물 또는 식물 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 식물은 옥수수 품종이다. 한 실시양태에서, 비-클로로필 a/b 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포이며, 여기서 프로모터는 서열 1로 이루어진 것인, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 유전자 카세트를 포함하는 식물 또는 식물 세포이며, 여기서 유전자 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하고, 추가로, 여기서, 프로모터는 서열 1로 이루어진 것인, 식물 또는 식물 세포를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 트랜스진의 제1 단부에 작동가능하게 연결되어 있고, 여기서, 트랜스진의 제2 단부는 서열 2 또는 서열 3으로 이루어진 3' 비번역 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
도 1은 차세대 염기 서열분석(Next Generation Sequencing: NGS)을 이용하는 전사 프로파일링 접근법을 사용하여 옥수수 중의 고발현 유전자를 확인하는 과정을 보여주는 개략적 흐름도이다.
도 2는 cry34Ab1 리포터 유전자의 발현을 제어하는 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 StPinII 3' UTR 조절 요소로 이루어진 pDAB114410 벡터 플라스미드 지도를 보여주는 것이다.
도 3은 PhiYFP 리포터 유전자의 발현을 제어하는 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 3'-UTR of 서열 2 조절 요소로 이루어진 pDAB116008 벡터 플라스미드 지도를 보여주는 것이다.
도 4는 시험 프로모터 구축물, pDAB114410에 존재하는 cry34Ab1 리포터 유전자 대신, YFP 리포터 유전자를 함유하는 pDAB101556 대조군 벡터의 지도를 보여주는 것이다. YFP 유전자 발현은 제아 메이스 유비퀴틴-1 (ZmUbi1) 프로모터 및 제아 메이스 Per5 (ZmPer5) 3'-UTR에 의해 제어되었다.
도 5는 ZmUbi1 프로모터 및 StPinII 3'-UTR에 의해 구동된 cry34Ab1 리포터 유전자를 함유하는 양성 대조군 벡터인 pDAB108746의 지도를 보여주는 것이다.
도 6은 cry34Ab1 리포터 유전자의 발현을 제어하는 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 서열 3의 3'-UTR 버전의 조절 요소로 이루어진 pDAB120167 벡터 플라스미드 지도를 보여주는 것이다.
상세한 설명
정의
본 발명을 기술하고, 주장할 때, 하기 기술되는 정의에 따른 하기 용어가 사용될 것이다.
본원에서 사용되는 바, "약"이라는 용어는 언급된 값 또는 값의 범위보다 10%만큼 크거나 또는 작다는 것을 의미하지만, 값 또는 값의 범위를 오직 상기와 같이 더 넓은 범위의 정의로 지정하고자 하는 것은 아니다. 앞에 "약"이라는 용어가 붙어있는 각각의 값 또는 값의 범위는 또한 언급된 절대 값 또는 값의 범위의 실시양태를 포함하는 것으로 한다.
본원에서 사용되는 바, "역교배"라는 용어는 육종가가 잡종 자손을 모계 중 하나와 다시 교배, 예를 들어, 제1대 잡종 F1을 F1 잡종의 모계의 유전자형 중 하나와 다시 교배시키는 과정을 의미한다.
"프로모터"는 세포에서 RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고, 하류 (3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 전사 인자에 의해 인식된 특이 서열을 함유할 수 있다. 상기 인자는 프로모터 DNA 서열에 결합할 수 있고, 그 결과로 RNA 폴리머라제가 동원된다. 본 발명을 정의하기 위한 목적으로, 프로모터 서열은 그의 3' 말단에 전사 개시 부위 (즉, 리보솜 결합 부위)가 결합하고, 배경보다 큰 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는 데 필요한 최소 개수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류로 (5' 방향으로) 연장된다. 프로모터 서열 내에서 (편리하게는 예를 들어, 뉴클레아제 S1로 지도화함으로써 정의되는) 전사 개시 부위 뿐만 아니라, RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인 (컨센서스 서열)이 발견될 것이다. 프로모터는 인핸서 및 리프레서 서열을 비롯한, 다른 발현 제어 서열과 작동적으로 회합될 수 있다.
본 개시내용의 목적을 위해, "유전자"는 유전자 산물 (하기 참조)을 코딩하는 DNA 영역 뿐만 아니라, 해당 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사되는 서열에 인접해 있는지 여부와 상관없이, 유전자 산물의 제조를 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열, 예컨대, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 사일런서, 절연인자, 경계 요소, 복제 기점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역을 포함하나, 반드시 그러한 것에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "천연" 또는 "자연적"이라는 용어는 자연 상태에서 발견되는 상태를 정의한다. "천연 DNA 서열"은 자연적 수단 또는 전통적 육종 기술에 의해 생산되었지만, (예컨대, 분자 생물학/형질전환 기술을 사용하는) 유전자 조작에 의해서는 생성되지 않은, 자연상 존재하는 DNA 서열이다.
본원에서 사용되는 바, "트랜스진"은 예를 들어, mRNA를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 유전자 산물을 코딩하는 핵산 서열로 정의된다. 한 실시양태에서, 트랜스진은, 보통은 트랜스진이 발견되지 않는 숙주 세포 (또는 그의 자손) 내로 트랜스진 서열이 유전자 조작에 의해 도입되어 있는 외인성 핵산이다. 한 예에서, 트랜스진은 산업상 또는 제약상 유용한 화합물, 또는 바람직한 농업상의 특질을 코딩하는 유전자 (예컨대, 제초제-저항성 유전자)를 코딩한다. 추가의 또 다른 예에서, 트랜스진은 안티센스 핵산 서열이며, 여기서, 안티센스 핵산 서열의 발현은 표적 핵산 서열의 발현을 억제시킨다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 내인성 핵산 (여기서, 내인성 핵산의 추가의 게놈 카피가 요구된다), 또는 숙주 유기체에서 표적 핵산의 서열에 대해 안티센스 배향인 핵산이다.
본원에서 사용되는 바, "비-클로로필 a/b 트랜스진"이라는 용어는 제아 메이스 클로로필 a/b 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질 (서열 17)과 서열 동일성이 90% 미만인 단백질을 코딩하는 임의의 트랜스진이다.
본원에서 정의되는 바, "유전자 발현"이란 유전자에 함유되어 있는 정보의 유전자 산물로의 전환이다.
본원에서 정의되는 바, "유전자 산물"이란 유전자에 의해 생산된 임의의 생성물이다. 예를 들어, 유전자 산물은 유전자의 직접적인 전사 생성물 (예컨대, mRNA, tRNA, rRNA, 소형 RNA, 안티센스 RNA, 간섭 RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA), 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 산물은 또한 예컨대, 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과 같은 프로세스에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스토일화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다. 유전자 발현은 외부 신호, 예컨대, 세포, 조직, 또는 유기체의, 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에의 노출에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자의 발현은 DNA로부터 RNA로 단백질로의 경로에서 어디에서나 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 예를 들어, 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, 중간 분자, 예컨대, mRNA의 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특정 단백질 분자가 제조된 후에 그에 대한 활성화, 불활성화, 구획화, 또는 분해에 의해, 또는 그의 분해에 의해 이루어진다. 유전자 발현은 제한 없이, 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯, ELISA 검정법, 또는 시험관내, 계내, 또는 생체내 단백질 활성 검정법(들)을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준으로 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "소형 RNA"라는 용어는 여러 부류의 비-코딩 리보핵산 (ncRNA)을 의미한다. 소형 RNA라는 용어는 박테리아 세포, 동물, 식물, 및 진균에서 생산되는 단쇄의 ncRNA를 기술한다. 이러한 단쇄의 ncRNA는 자연적으로 세포 내에서 생산될 수 있거나, 또는 단쇄의 ncRNA를 발현하는 외인성 서열의 도입에 의해 제조될 수 있다. 소형 RNA 서열은 단백질을 직접 코딩하지 않고, 소형 RNA 서열은 오직 전사될 뿐, 번역되지는 않는다는 점에서 다른 RNA와 다른 기능을 한다. 소형 RNA 서열은 유전자 발현 및 변형을 비롯한, 다른 세포 기능에 관여한다. 소형 RNA 분자는 보통 약 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된다. 소형 RNA 서열은 보다 긴 장쇄의 전구체로부터 유래될 수 있다. 전구체는 자기 상보성 영역에서 서로 폴딩 백하는 구조를 형성한다; 이어서, 이는 뉴클레아제인 동물에서는 다이서(Dicer), 식물에서 DCL1, 또는 소형 RNA 분자를 프로세싱하는 다른 효소에 의해 프로세싱된다.
마이크로RNA (miRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 RNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 소형 핵인 RNA (snoRNA)를 비롯한, 많은 유형의 소형 RNA가 자연적으로 존재하거나, 또는 인공적으로 제조된다. 특정 유형의 소형 RNA, 예컨대, 마이크로RNA 및 siRNA는 유전자 침묵화 및 RNA 간섭 (RNAi)에서 중요하다. 유전자 침묵화는 보통은 발현되는 유전자가 세포내 요소에 의해, 이 경우에서는 소형 RNA에 의해 "턴 오프"되는 유전적 조절 과정이다. 보통 이러한 유전자 정보에 의해 형성되는 단백질은 간섭에 기인하여 형성되지 않고, 유전자에서 코딩된 정보는 발현되지 못하게 차단된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "소형 RNA"는 "작은 RNA" (Storz, (2002) Science 296:1260-3; Illangasekare et al., (1999) RNA 5:1482-1489); 원핵성 "소형 RNA" (sRNA) (Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45); 진핵성 "비코딩 RNA (ncRNA)"; "마이크로-RNA (miRNA)"; "소형 비-mRNA (snmRNA)"; "기능성 RNA (fRNA)"; "운반 RNA (tRNA)"; "촉매성 RNA" [예컨대, 리보자임 (자기 아실화 리보자임 포함) (Illangaskare et al., (1999) RNA 5:1482-1489)]; "소형 핵인 RNA (snoRNA)"; "tmRNA" ("10S RNA"로도 알려져 있음, 문헌 [Muto et al., (1998) Trends Biochem Sci . 23:25-29]; 및 [Gillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885]); 제한없이, "소형 간섭 RNA(siRNA)," "엔도리보뉴클레아제 제조된 siRNA (e-siRNA)," "짧은 헤어핀 RNA (shRNA)," 및 "소형의 일시적으로 조절된 RNA (stRNA)"를 비롯한, RNAi 분자; "다이싱된 siRNA (d-siRNA)," 및 압타머, 올리고뉴클레오티드 및 1개 이상의 우라실 염기를 포함하는 다른 합성 핵산으로서 문헌에 기술되어 있는 RNA 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "인트론"이라는 용어는 전사는 되지만, 번역은 되지 않는 유전자 (또는 관심의 발현된 뉴클레오티드 서열)에 포함된 임의의 핵산 서열로서 정의된다. 인트론은 발현된 DNA 서열 내의 비번역 핵산 서열 뿐만 아니라, 그로부터 전사된 RNA 분자 중의 상응하는 서열을 포함한다.
본원에 기술된 구축물은 또한 번역 및/또는 mRNA 안정성을 증진시키는 서열, 예컨대, 인트론을 함유할 수 있다. 상기와 같은 인트론의 한 예로 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 히스톤 H3 변이체의 유전자 II의 제1 인트론 또는 일반적으로 알려져 있는 임의의 다른 인트론 서열이 있다. 인트론은 번역 및/또는 mRNA 안정성을 증진시키기 위해 프로모터 서열과 함께 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "5' 비번역 영역" 또는 "5'-UTR"이라는 용어는 프리-mRNA 또는 성숙한 mRNA의 5' 말단에 있는 비번역 세그먼트로서 정의된다. 예를 들어, 성숙한 mRNA 상의 5'-UTR은 전형적으로 그의 5' 단부에 7-메틸구아노신 캡을 포함하고, 이는 예컨대, 스플라이싱, 폴리아데닐화, 세포질로의 mRNA 외수송, 번역 기구에 의한 mRNA의 5' 단부 식별, 및 분해로부터의 mRNA 보호와 같은 많은 프로세스에 관여한다.
본원에서 사용되는 바, "전사 종결인자"라는 용어는 프리-mRNA 또는 성숙한 mRNA의 3' 말단의 전사된 세그먼트로서 정의된다. 예를 들어, "폴리아데닐화 신호" 부위를 넘어선 DNA의 보다 긴 스트레치는 프리-mRNA로서 전사된다. 이러한 DNA 서열은 보통 프리-mRNA의 성숙한 mRNA로의 적절한 프로세싱을 위한 하나 이상의 전사 종결 신호를 함유한다.
본원에서 사용되는 바, "3' 비번역 영역" 또는 "3'-UTR"이라는 용어는 프리-mRNA 또는 성숙한 mRNA의 3' 말단의 비번역 절편으로서 정의된다. 예를 들어, 성숙한 mRNA 상에서 상기 영역은 폴리-(A) 테일을 보유하고, mRNA 안정성, 번역 개시, 및 mRNA 외수송에서 많은 역할을 하는 것으로 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바, "폴리아데닐화 신호"라는 용어는 폴리-(A) 폴리머라제 존재하에서 전사체가 예를 들어, 폴리-(A) 신호로부터 10 내지 30개 염기만큼 하류에 위치하는 폴리아데닐화 부위에서 폴리아데닐화될 수 있도록 하는, mRNA 전사체에 존재하는 핵산 서열을 나타낸다. 많은 폴리아데닐화 신호가 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명에 유용하다. 예시적인 서열은 문헌 [Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468]에 기술되어 있는 바와 같이, AAUAAA 및 그의 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 그의 자연 환경으로부터 제거되었거나, 또는 화합물이 처음 형성되었을 때 존재하는 다른 화합물로부터 제거된 것을 의미한다. "단리된"이라는 용어는 자연 공급원으로부터 단리된 물질 뿐만 아니라, 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 후 회수된 물질 (예를 들어, 핵산 및 단백질), 또는 화학적으로 합성된 화합물, 예컨대, 핵산 분자, 단백질, 및 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "정제된"이라는 용어는 보통 천연 또는 자연 환경에서 분자 또는 화합물과 회합되어 있는 오염물이 실질적으로 없거나, 또는 화합물이 처음 형성되었을 때 존재하는 다른 화합물과 비교하여 농도가 실질적으로 강화된 형태의 분자 또는 화합물에 관한 것이며, 이는 원래 조성물의 다른 성분으로부터 분리된 결과 순도가 증가된 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, "정제된 핵산"이라는 용어는 성분의 화학적 또는 기능적 변화를 초래하면서, 폴리펩티드, 지질 및 탄수화물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 생물학적 화합물로부터 분리되거나, 그와 별개로 제조된 핵산 서열을 기술한다 (예컨대, 핵산은 단백질 오염물을 제거하고, 핵산을 염색체 중의 나머지 DNA 와 연결시키는 화학 결합을 파괴시킴으로써 염색체로부터 정제될 수 있다).
본원에서 사용되는 바, "상동성-기반 유전자 침묵화(Homology-Based Gene Silencing)" 또는 "HBGS"라는 용어는 전사 유전자 침묵화 및 전사 후 유전자 침묵화, 둘 모두를 포함하는 일반 용어이다. 연결되지 않은 침묵화 유전자좌에 의한 표적 유전자좌의 침묵화는 각각 프로모터 또는 전사된 서열에 상응하는 이중-가닥 RNA (dsRNA)의 제조에 의한 전사 억제 (전사 유전자 침묵화(Transcriptional Gene Silencing); TGS) 또는 mRNA 분해 (전사 후 유전자 침묵화(Post-Transcriptional Gene Silencing); PTGS)로부터 야기될 수 있다. 각 프로세스에서 별개의 세포 성분이 관여한다는 것은 dsRNA-유도된 TGS 및 PTGS가 고전적인 공통 기전의 다양화로부터 야기되었을 가능성이 있다는 것을 시사한다. 그러나, TGS 및 PTGS 비교는 일반적으로 별개의 침묵화 유전자좌의 분석에 의존하기 때문에, 그를 엄격하게 비교하기는 달성하기가 어려웠다. 단일 트랜스진 유전자좌는 상이한 표적 유전자의 프로모터 및 전사된 서열에 상응하는 dsRNA의 제조에 의해 TGS 및 PTGS 둘 모두를 유도하는 것으로 설명될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "핵산 분자," "핵산," 또는 "폴리뉴클레오티드" (3가지 용어는 모두 서로 동의어이다)는 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 형태, 및 그의 혼합된 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥, 둘 모두를 포함할 수 있는, 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. "뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 하나의 뉴클레오티드 유형의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 핵산 분자는 보통 달리 명시되지 않는 한, 길이가 10개 이상의 염기 길이이다. 상기 용어는 불확정한 길이의 RNA 또는 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 상기 용어는 DNA의 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 핵산 분자는 자연적으로 발생된 및/또는 비-자연적으로 발생된 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연적으로 발생된 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다.
핵산 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-자연적 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 표지, 메틸화, 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 중 하나 이상의 것의 유사체에 의한 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비하전된 연결: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 연결: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 팬던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제: 예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형된 연결: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. "핵산 분자"라는 용어는 또한 단일-가닥, 이중-가닥, 부분 이중체형, 삼중체형, 헤어핀형, 고리형, 및 잠금형(padlocked) 입체형태를 비롯한 임의의 위상 입체형태를 포함한다.
전사는 DNA 가닥을 따라 5'에서 3'으로의 방식으로 진행된다. 이는 (피로포스페이트의 제거를 필수 조건으로 하여) RNA가 성장하는 쇄의 3' 말단에의 리보뉴클레오티드-5'-트리포스페이트의 순차적 부가에 의해 제조된다는 것을 의미한다. 선형 또는 고리형 핵산 분자에서, 별개의 요소 (예컨대, 특정한 뉴클레오티드 서열)는 추가의 요소로부터 5' 방향에서 동일한 핵산에 결합되거나, 결합될 경우에, 별개의 요소는 추가의 요소에 대해 "상류"인 것으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 별개의 요소가 추가의 요소로부터 3' 방향에서 동일한 핵산에 결합되거나, 결합될 경우에, 별개의 요소는 추가의 요소에 대해 "하류"일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "염기 위치"라는 용어는 지정된 핵산 내의 주어진 염기 또는 뉴클레오티드 잔기의 위치를 지칭한다. 지정된 핵산은 참조 핵산과의 정렬에 의해 정의될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "하이브리드화"라는 용어는 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체가 상보적 염기 사이에 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합을 비롯한 수소 결합에 의해 하이브리드화하는 과정을 지칭한다. 일반적으로, 핵산 분자는 피리미딘 (시토신 (C), 우라실 (U), 및 티민 (T)) 또는 퓨린 (아데닌 (A) 및 구아닌 (G))인 질소함유 염기로 이루어진다. 이들 질소함유 염기는 피리미딘과 퓨린 사이에서 수소 결합을 형성하고, 퓨린에의 피리민딘의 결합은 "염기쌍 형성"으로 지칭된다. 더욱 구체적으로, A는 T 또는 U에 수소 결합할 것이고, G는 C에 결합할 것이다. "상보적"이라는 것은 별개의 두 핵산 서열 사이 또는 동일한 핵산 서열 중 별개의 두 영역 사이에서 발생하는 염기쌍 형성을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "특이적으로 하이브리드화할 수 있는" 및 "특이적으로 상보적"이라는 용어는 올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA 표적 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 하는 데 충분한 정도의 상보성을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 특이적인 하이브리드화를 위해 그의 표적 서열에 대해 100% 상보적일 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드의 표적 DNA 또는 RNA 분자에의 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 방해하고, 특이적 결합이 요구되는 조건하에서, 예를 들어, 생체내 검정 또는 시스템의 경우에 생리학적 조건하에서 올리고뉴클레오티드의 비-표적 서열에의 비-특이적 결합을 회피시키는 데 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에, 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 하이브리드화할 수 있다. 이러한 결합은 특이적 하이브리드화로서 지칭된다. 특정한 정도의 엄격도를 생성하는 하이브리드화 조건은 선택된 하이브리드화 방법의 성질 및 하이브리드화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 세척 시간도 또한 엄격도에 영향을 미치지만, 일반적으로, 하이브리드화 온도 및 하이브리드화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg2 + 농도)가 하이브리드화의 엄격도에 기여할 것이다. 특정한 정도의 엄격도를 달성하기 위해 필요한 하이브리드화 조건에 관한 고려 사항은 문헌 [Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11]에서 논의된다.
본원에서 사용되는 바, "엄격한 조건"이라는 용어는 하이브리드화 분자와 DNA 표적 사이에 미스매치가 50% 미만으로 존재하는 경우에만 오직 하이브리드화가 발생하게 되는 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 추가의 특정한 수준의 엄격도를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, "중등도의 엄격도" 조건은 50% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자는 하이브리드화되지 않는 조건이고; "높은 엄격도"의 조건은 20% 초과의 미스매치를 갖는 서열은 하이브리드화되지 않는 조건이고; "매우 높은 엄격도"의 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열은 하이브리드화되지 않는 조건이다.
특정한 실시양태에서, 엄격한 조건은 65℃에서의 하이브리드화에 이어서, 65℃에서 40분 동안 0.1x SSC/0.1% SDS에 의한 세척을 포함할 수 있다. 하기는 대표적인, 비-제한적 하이브리드화 조건이다:
매우 높은 엄격도: 65℃에서 16시간 동안 5x SSC 완충제 중에서의 하이브리드화; 각각 실온에서 15분 동안 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 65℃에서 20분 동안 0.5x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
높은 엄격도: 65-70℃에서 16-20시간 동안 5-6 x SSC 완충제 중에서의 하이브리드화; 각각 실온에서 5-20분 동안 2 x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 55-70℃에서 30분 동안 1x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
중등도의 엄격도: 실온 내지 55℃에서 16-20시간 동안 6x SSC 완충제 중에서의 하이브리드화; 각각 실온 내지 55℃에서 20-30분 동안 2x-3x SSC 완충제 중에서의 2회 이상의 세척.
한 실시양태에서, 특이적으로 하이브리드할 수 있는 핵산 분자는 매우 높은 엄격도 하이브리드화 조건하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 특이적으로 하이브리드할 수 있는 핵산 분자는 높은 엄격도 하이브리드화 조건하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 특이적으로 하이브리드할 수 있는 핵산 분자는 중등도의 엄격도 하이브리드화 조건하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 짧은 핵산 중합체를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 더욱 긴 핵산 세그먼트의 절단에 의해, 또는 개별 뉴클레오티드 전구체의 중합화에 의해 형성될 수 있다. 자동 합성기를 통해 최대 수백 개의 염기쌍 길이의 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있기 때문에, 이는 DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA (올리고데옥시리보뉴클레오티드)로 구성된 올리고뉴클레오티드는 소형 DNA 서열의 증폭을 위한 기술인 PCR에서 사용될 수 있다. PCR에서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 "프라이머"로서 지칭되며, 이는 DNA 폴리머라제가 올리고뉴클레오티드를 연장하게 하고, 상보적 가닥을 복제하게 한다.
본원에서 사용되는 바, "중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)" 또는 "PCR"이라는 용어는 미국 특허 번호 4,683,195에 기술된 바와 같이, 극소량의 핵산, RNA 및/또는 DNA를 증폭시키는 절차 또는 기술을 의미한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있도록 관심 영역의 단부 또는 그 너머로부터의 서열 정보가 이용가능하여야 하고; 이들 프라이머는 증폭시키고자 하는 주형의 반대쪽 가닥과 서열이 동일하거나 유사할 것이다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭되는 물질의 단부와 일치할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 전체 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 및 전체 세포성 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌 [Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)]를 참조할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "프라이머"라는 용어는 조건이 프라이머 연장 생성물의 합성을 위해 적합한 경우에 상보적 가닥을 따른 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 합성 조건은 4종의 상이한 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 1개 이상의 중합화 유도 작용제, 예컨대, 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 존재를 포함한다. 이는 보조인자이거나, 또는 다양한 적합한 온도에서 pH 등과 같은 조건에 영향을 미치는 구성 성분을 포함할 수 있는 적합한 완충제 중에 존재한다. 프라이머는 바람직하게는 증폭 효율이 최적화되도록 하는 단일 가닥 서열이지만, 이중 가닥 서열이 사용될 수도 있다.
본원에서 사용되는 바, "프로브"라는 용어는 표적 서열에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 택맨(TaqMan)® 또는 택맨®-스타일 검정 절차에서, 프로브는 두 프라이머의 어닐링 부위 사이에 위치하는 표적 부분에 하이브리드화된다. 프로브는 약 8개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드, 약 20개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드, 약 40개의 뉴클레오티드, 또는 약 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 15개의 뉴클레오티드를 포함한다. 프로브는 추가로 검출가능한 표지, 예컨대, 형광단 (텍사스-레드(Texas-Red)®, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등)을 포함할 수 있다. 검출가능한 표지는 예컨대, 프로브의 5' 단부 또는 프로브의 3' 단부에 위치하는 프로브 올리고뉴클레오티드에 직접 공유적으로 부착될 수 있다. 형광단을 포함하는 프로브는 또한 추가로 소광제, 예컨대, 블랙 홀 켄처(Black Hole Quencher)™, 아이오와 블랙(Iowa Black)™ 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "서열 동일성" 또는 "동일성"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이는 최대로 대응되도록 정렬되었을 때 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 동일한 두 서열의 핵산 잔기 또는 아미노산 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "서열 동일성(%)"이라는 용어는 비교 윈도우에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열 (예컨대, 핵산 서열 또는 아미노산 서열)을 비교함으로써 측정된 값을 지칭하는 것으로, 여기서, 비교 윈도우 내 서열 부분은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율(%)은 둘 모두의 서열에서 동일한 핵산 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 개수를 측정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv . Appl . Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol . Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol . Lett. 174:247-50]에 기술되어 있다.
여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하는 데 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI) 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool: BLAST™; Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol. 215:403-10)이 국립 생물 정보 센터 (미국 메릴랜드주 베데스다)를 비롯한 여러 공급원으로부터, 및 인터넷상에서 이용가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 측정하는 방법에 관한 설명은 인터넷상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션하에 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터를 사용하여 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 함수를 활용할 수 있다. 참조 서열과 훨씬 더 큰 유사성을 가진 핵산 서열은 이러한 방법에 의해 평가되었을 때, 증가하는 동일성(%)을 나타낼 것이다.
본원에서 사용되는 바, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 두 성분이 서로 기능적 관계로 배치되어 있다는 것을 의미한다. 조절 서열 및 코딩 서열과 관련하여 사용될 때, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 조절 서열이 연결된 코딩 서열의 발현에 영향을 미친다는 것을 의미한다. "조절 서열," "조절 요소," 또는 "제어 요소"란 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 회합된 코딩 서열의 번역 시기 및 수준/양에 영향을 미치는 핵산 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터; 번역 리더 서열; 5' 및 3' 비번역 영역, 인트론; 인핸서; 줄기-루프 구조; 리프레서 결합 서열; 종결 서열; 폴리아데닐화 인식 서열 등을 포함할 수 있다. 특정 조절 서열은 그에 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 상류 및/또는 하류에 위치할 수 있다. 또한, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 특정 조절 서열은 이중-가닥 핵산 분자의 회합된 상보적 가닥 상에 위치할 수 있다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 결찰에 의해 달성될 수 있다. 상기 부위가 존재하지 않는 경우, 통상적인 실시에 따라 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 사용된다. 그러나, 요소는 작동하능하게 연결되기 위해 인접하여야 할 필요는 없다.
본원에서 사용되는 바, "형질전환"이라는 용어는 핵산 분자를 세포 내로 도입시킬 수 있는 모든 기술을 포함한다. 예로는 바이러스 벡터에 의한 형질감염; 플라스미드 벡터에 의한 형질전환; 전기천공; 리포펙션; 미세주사 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움-매개 전달; 직접 DNA 흡수; 휘스커스(WHISKERS)®-매개 형질전환; 및 미세발사체 투사법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 형질전환은, 핵산 분자가 식물의 게놈 내로 통합되었을 때 안정적일 수 있고, 이어서, 대대로 전달된다. 비교적, 형질전환은, 핵산 분자가 세포의 세포질 또는 핵 내로 국재화되고, 식물의 게놈 내로 통합되지 않은 경우에는 일시적일 수 있다. 상기와 같은 일시적인 형질전환체는 핵산 분자 상에 존재하는 코딩 서열로부터의 단백질 또는 유전자 산물의 발현을 초래할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "형질도입하다"라는 용어는 바이러스가 핵산을 세포 내로 전달하는 과정을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "폴리링커" 또는 "다중 클로닝 부위"라는 용어는 하나 이상의 유형-2 제한 효소 부위의 클러스터를 정의한다. 인접한 제한 부위는 핵산 서열 상에서 서로로부터 10개의 뉴클레오티드 내에 위치한다. 폴리링커를 포함하는 구축물은 핵산 서열, 예컨대, 유전자 코딩 영역, 리보솜 결합 서열, 인트론, 또는 5'-UTR의 삽입 및/또는 절제에 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"라는 용어는 각각 특정 뉴클레오티드 서열에서 또는 그 근처에서 이중 가닥 DNA를 절단하는 박테리아 효소를 의미한다. 유형-2 제한 효소는 동일한 부위에서 DNA를 인식 및 절단하며, 이는 XbaI, BamHI, HindIII, EcoRI, XhoI, SalI, KpnI, AvaI, PstI 및 SmaI를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"벡터"라는 용어는 "구축물", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"라는 용어와 상호교환가능하게 사용되고, DNA 또는 RNA 서열 (예컨대, 외래 유전자)을 숙주 세포 내로 도입하여 숙주를 형질전환시키고, 도입된 서열의 발현 (예컨대, 전사 및 번역)을 촉진시킬 수 있는 비히클을 의미한다. "비-바이러스 벡터"는 바이러스 또는 레트로바이러스를 포함하지 않는 임의의 벡터를 의미하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, "벡터"는 1개 이상의 DNA 복제 기점 및 1개 이상의 선별가능한 마커 유전자를 포함하는 DNA 서열이다.
예로는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선별가능한 마커 유전자 및 관련 기술분야에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환, 또는 감염시킴으로써 세포가 벡터에 의해 코딩된 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하도록 유발할 수 있다. "플라스미드"라는 용어는 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 상염색체 복제가 가능한 고리형 가닥의 핵산을 정의한다. 상기 용어는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있는 핵산을 포함한다. 정의된 플라스미드는 또한 박테리아 복제 기점에 상응하는 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "선별가능한 마커 유전자"라는 용어는 선별가능한 마커 유전자가 삽입된 세포의 확인을 용이하게 하는, 단백질을 코딩하는 유전자 또는 다른 발현 카세트를 정의한다. 예를 들어, "선별가능한 마커 유전자"는 리포터 유전자 뿐만 아니라, 식물 형질전환에서 예를 들어, 식물 세포를 선별제로부터 보호하거나, 또는 선별제에 대한 저항성/내성을 제공하기 위해 사용되는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 기능적 선별가능한 마커를 제공받은 상기와 같은 세포 또는 식물만이 선별제가 있는 조건하에서 분열 또는 성장할 수 있다. 선별제의 예로는 예를 들어, 스펙티노마이신, 네오마이신, 카나마이신, 파로모마이신, 겐타미신, 및 히그로마이신을 비롯한 항생제를 포함할 수 있다. 이들 선별가능한 마커는 항생제 카나마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (npt II), 및 관련 항생제인 네오마이신, 파로모마이신, 겐타미신, 및 G418에 대한 유전자, 또는 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt)에 대한 유전자를 포함한다. 다른 선별가능한 마커 유전자는 bar 또는 pat (글루포시네이트 암모늄 또는 포스피노트리신에 대한 저항성), 아세토락테이트 신타제 (ALS, 분지쇄 아미노산의 합성의 제1 단계를 방지하는 억제제, 예컨대, 술포닐우레아 (SU), 이미다졸리논 (IMI), 트리아졸로피리미딘 (TP), 피리미디닐 옥시벤조에이트 (POB), 및 술포닐아미노 카르보닐 트리아졸리논에 대한 저항성), 글리포세이트, 2,4-D를 비롯한 제초제 저항성, 및 금속 저항성 또는 감수성을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자로서 사용될 수 있는 "리포터 유전자"의 예로는 발현된 리포터 유전자 단백질, 예컨대, β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼리성 포스파타제 등을 코딩하는 단백질의 시각적 관찰을 포함한다. "마커-양성"이라는 어구는 식물이 형질전환되어 선별가능한 마커 유전자를 포함한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "검출가능한 마커"라는 용어는 검출될 수 있는 표지, 예컨대, 예를 들어, 방사성동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이트화제 또는 효소를 지칭한다. 검출가능한 마커의 예로는 하기: 형광 표지 (예컨대, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소적 표지 (예컨대, 호스래디시 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광체, 비오티닐 기, 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 검출가능한 마커는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "검출하는"이라는 용어는 가장 넓은 의미로 특정 분자의 정성적 및 정량적 측정, 둘 모두, 예를 들어, 특정 폴리펩티드의 측정을 포함하는 것으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "카세트," "발현 카세트" 및 "유전자 발현 카세트"라는 용어는 특정 제한 부위에 또는 상동 재조합에 의해 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있는 DNA 세그먼트를 지칭한다. DNA 세그먼트는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 카세트 및 제한 부위는 전사 및 번역을 위한 적절한 리딩 프레임에의 카세트의 삽입을 보장하도록 디자인된다. 한 실시양태에서, 발현 카세트는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 이외에도, 특정한 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 또한 숙주 세포에서 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증진시킬 수 있는 요소를 포함할 수 있다. 이들 요소로는 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 종결인자 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, "링커" 또는 "스페이서"는 2개의 개별 엔티티를 서로 연결하는 결합, 분자 또는 분자 군이다. 링커 및 스페이서는 두 엔티티를 최적으로 이격화시킬 수 있거나, 또는 추가로 두 엔티티가 분리될 수 있도록 하는 불안정성 연결부를 추가로 공급할 수 있다. 불안정성 연결부는 광절단가능한 기, 산-불안정성 모이어티, 염기-불안정성 모이어티 및 효소-절단가능한 기를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "대조군"이라는 용어는 비교 목적의 분석 절차에서 사용되는 샘플을 의미한다. 대조군은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다. 예를 들어, 분석 절차의 목적이 세포 또는 조직에서 차별적으로 발현되는 전사체 또는 폴리펩티드를 검출하는 것인 경우, 일반적으로 원하는 발현을 보이는 공지된 식물로부터의 샘플과 같은 양성 대조군 및 원하는 발현이 결여된 공지된 식물로부터의 샘플과 같은 음성 대조군을 포함시키는 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 바, "식물"이라는 용어는 전체 식물 및 식물의 임의의 자손, 세포, 조직, 또는 부분을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 식물 부류는 일반적으로 속씨식물 (단자엽 및 쌍자엽 식물), 겉씨식물, 양치식물 및 다세포 조류를 비롯하여, 돌연변이유발에 적용될 수 있는 고등 및 하등 식물 부류로서 광범위하다. 따라서, ""식물"은 쌍자엽 및 단자엽 식물을 포함한다. "식물 부분"이라는 용어는 예를 들어, 및 제한 없이: 종자 (성숙한 종자 및 미성숙 종자 포함); 식물 절단물(cutting); 식물 세포; 식물 세포 배양물; 식물 기관 예컨대, 화분, 배아, 꽃, 열매, 어린싹, 잎, 뿌리, 줄기 및 외식편)을 비롯한 식물의 임의의 부분 (들)을 포함한다. 식물 조직 또는 식물 기관은 종자, 원형질체, 캘러스, 또는 구조적 또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 임의의 다른 군일 수 있다. 식물 세포 또는 조직 배양물은 세포 또는 조직의 수득 기점이 된 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생할 수 있고, 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생할 수 있다. 대조적으로, 일부 식물 세포는 식물을 생산하도록 재생될 수 없다. 식물 세포 또는 조직 배양물에서 재생가능한 세포는 배아, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스, 화분, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 수염, 꽃, 커넬, 이삭, 속대, 껍질, 또는 자루일 수 있다.
식물 부분은 수확가능한 부분 및 자손 식물의 번식에 유용한 부분을 포함한다. 번식에 유용한 식물 부분은, 예를 들어, 및 제한 없이: 종자; 열매; 절단물; 묘목; 괴경; 및 근경을 포함한다. 식물의 수확가능한 부분은, 예를 들어, 및 제한 없이: 꽃; 화분; 묘목; 괴경; 잎; 줄기; 열매; 종자; 및 뿌리를 비롯한 식물의 임의의 유용한 부분일 수 있다.
식물 세포는 원형질체 및 세포벽을 포함하는, 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 단리된 단일 세포, 또는 세포의 응집체 예컨대, 부서지기 쉬운 캘러스 및 배양된 세포)의 형태일 수 있고, 더욱 고차원적으로 조직화된 단위 (예컨대, 식물 조직, 식물 기관, 및 식물)의 일부일 수 있다. 따라서, 식물 세포는 원형질체, 생식자 생산 세포, 또는 전체 식물로 재생될 수 있는 세포 또는 세포의 집단일 수 있다. 이에 따라, 다중 식물 세포를 포함하고, 전체 식물로 재생될 수 있는 종자는 본원의 실시양태에서 "식물 세포"로 간주된다.
본원에서 사용되는 바, "원형질체"라는 용어는 그의 세포벽이 완전히 또는 부분적으로 제거되어 있고, 그의 지질 이중층 막은 네이키드 상태인인 식물 세포를 의미하며, 그러므로, 그의 세포벽이 완전하게 제거된 원형질체, 및 그의 세포벽이 오직 부분적으로만 제거된 스페로플라스트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전형적으로, 원형질체는 세포 배양물 또는 전체 식물로 재생될 수 있는 효력을 가진, 세포벽이 없는 단리된 식물 세포이다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서 통상적인 용어의 정의는, 예를 들어, 문헌 [Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 살펴볼 수 있다.
실시양태
본원에 개시된 바와 같이, 제아 메이스로부터의 클로로필 a/b 유전자의 조절 서열을 사용하여 비-클로로필 a/b 트랜스진을 발현시키기 위한 신규한 재조합 구축물을 제공한다. 상기 구축물은 식물 세포를 비롯한, 세포를 형질전환시켜, 유기체의 세포에서 트랜스진 유전자 산물을 발현하는 완전한 유기체를 제조하는 데 사용될 수 있다.
기초 연구 또는 생명공학적 적용을 위해 사용되는 식물 프로모터는 일반적으로, 그의 3' 단부 (하류)에 융합된 단 하나의 유전자만을 지시하는 단방향성이다. 대개는 대사 조작 및 특질 스태킹을 위해 다중 유전자를 식물 내로 도입하는 것이 필요하고, 그러므로, 전형적으로는 다중 유전자의 발현을 구동시키기 위해서는 트랜스제닉 작물에 다중 프로모터가 요구된다.
트랜스제닉 생성물 개발은 점점 더 복잡해지고 있으며, 이는 다중 트랜스진을 단일 유전자좌 내로 스태킹하는 것을 필요로 한다. 전통적으로, 각 트랜스진은 보통 발현을 위해 한 프로모터를 필요로 하며, 여기서, 한 유전자 스택 내의 상이한 트랜스진을 발현시키기 위해서는 다중 프로모터가 요구된다. 유전자 스택의 크기가 증가함에 따라, 빈번하게는 단일의 다유전자성 특질의 발현을 위해 상이한 트랜스진을 유사한 발현 패턴 수준으로 수득하기 위해서는 한 트랜스진 스택 내에서 같은 프로모터가 반복 사용되게 된다. 관련 기술분야에는 같은 프로모터에 의해 구동되는 다중 유전자 구축물이 유전자 침묵화를 유발하여 트랜스제닉 생성물을 덜 효과적으로 생성하는 것으로 알려져 있다. 프로모터 반복에 기인하는 과도한 전사 인자 (TF)-결합 부위는 내인성 TF의 결실을 유발할 수 있고, 이로써, 전사는 불활성화될 수 있다. 트랜스진의 침묵화가 가능하게는 트랜스진을 발현하도록 제조된 트랜스제닉 식물의 성능에 바람직하지 못한 영향을 줄 수 있을 것이다. 트랜스진 내의 반복 서열은 유전자 유전자좌내의 상동성 재조합을 유도할 수 있고, 이로써, 폴리뉴클레오티드 재배열이 일어날 수 있다.
또한, 조직 특이적 (즉, 조직-선호) 또는 기관 특이적 프로모터는 특정 조직에서, 예컨대, 식물의 커넬, 뿌리, 잎 또는 융단조직에서 유전자 발현을 구동시킨다. 조직 및 발생 단계 특이적 프로모터는 유전자의 발현을 유도하며, 이 유전자는 특정 조직 또는 식물 발생 동안 특정 시간에 발현된다. 조직 특이적 프로모터는 트랜스제닉 식물 산업에서 특정 적용을 위해 요구되며, 이는 다른 것에서는 그렇지 않지만, 다양한 기관, 조직 및/또는 시점에서의 차별적인 이종성 유전자의 발현을 나타내는 것인 조직 및/또는 발생 단계에 선택적인 방식으로 이종성 유전자가 특이적으로 발현될 수 있도록 허용하는 바, 바람직하다. 예를 들어, 토양 매개 병원체에 의한 감염에 대한 식물의 저항성을 증가시키는 것은 병원체-저항성 단백질이 식물의 뿌리 내에서 강하게 발현되도록 식물 게놈을 병원체-저항성 유전자로 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 별법으로, 특정 생장 또는 발생 단계, 예컨대, 세포 분열 또는 신장 단계에 있는 식물 조직에서 트랜스진을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 적용은 예컨대, 발생 물관부에서 작물학적 특질을 코딩하는 트랜스진의 발현을 국한시키는 것과 같은, 조직 특이적 프로모터를 사용하는 것의 바람직성이다. 조직 특이적 프로모터 확인에 있어 여전히 남아있는 하나의 특정한 문제는 잠재적으로 가장 중요한 유전자 및 그의 상응하는 프로모터를 확인하고, 이를 세포의 특이적인 발생 특성과 연관시키는 방법이다. 또 다른 문제는 클로닝된 DNA 단편이 원하는 특이적인 발현 패턴으로 전사를 구동시킬 수 있도록 모든 관련된 시스 작용성 전사 제어 요소를 클로닝하는 것이다. 특정한 문제는 다른 식물 조직에서는 발현되지 않는, 식물에서 특이적인 세포 유형, 발생 단계 및/또는 기능과 관련된 조직-특이적 프로모터를 확인하는 것이다.
유전자 스택 중의 상이한 트랜스진의 발현을 위해 다양화된 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다. 한 실시양태에서, 클로로필 a/b 프로모터는 트랜스진, RNAi, 인공 miRNA, 또는 헤어핀-루프 RNA 서열을 포함하는, 다중 전사 단위의 전사를 구동시키기 위해 제아 메이스로부터 수득될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 클로로필 a/b 프로모터는 식물의 잎, 속대, 수염, 커넬, 줄기, 껍질 및 화분 조직에서 트랜스진, RNAi, 인공 miRNA, 또는 헤어핀-루프 RNA 서열을 포함하는, 다중 전사 단위의 전사를 구동시키기 위해 제아 메이스로부터 수득될 수 있다.
식물에서 트랜스진을 발현시키기 위하여 제아 메이스로부터 단리된 유전자 조절 요소를 사용하는 방법 및 구축물을 제공한다. 한 실시양태에서, 제아 메이스 프로모터 및 5'-UTR은 서열 1의 단리된 프로모터일 수 있다.
한 실시양태에서, 프로모터를 포함하는 핵산 벡터 (즉, 구축물)를 제공한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 제아 메이스 유전자 프로모터 및 5'-UTR일 수 있다. 한 실시양태에서, 프로모터를 포함하는 핵산 벡터이며, 여기서 프로모터는 서열 1과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 이상 동일한 것인, 핵산 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 폴리링커에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 유전자 프로모터를 포함하는 핵산 벡터를 제공한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 유전자 프로모터를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터를 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선별가능한 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다.
프로모터 이외에도, 전사 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화를 위해 3'-비번역 유전자 영역 (즉, 3'UTR) 또는 종결인자가 요구된다. 적절한 전사 종결 및 mRNA의 폴리아데닐화는 트랜스진의 안정적인 발현을 위해 중요하다. 전사 종결은 다중 유전자 스택이 다음 트랜스진으로의 전사 연속 판독(read-through)을 회피하도록 하는 데 점점 더 중요해지고 있다. 유사하게, 폴리아데닐화되지 않은 비정상적인 RNA (aRNA)는 aRNA를 이중 가닥 RNA (dsRNA)로 전환시켜 소형 RNA 생산 및 트랜스진 침묵화를 유도하는 식물 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (RdRP)에 대한 기질이다. 그러므로, 강한 전사 종결인자는 단일 유전자 및 다중 유전자 스택, 둘 모두에 대해 매우 유용하다. 프로모터는 전사를 구동시키는 데 필요한 반면, 3'-UTR 유전자 영역은 전사를 종결시키고, 번역 및 단백질 합성을 위하여 생성된 mRNA 전사체의 폴리아데닐화를 개시할 수 있다. 3'-UTR 유전자 영역은 트랜스진의 안정적인 발현을 지원한다. 한 실시양태에서, 3'-UTR은 서열 2 또는 서열 3의 제아 메이스 3'-UTR일 수 있다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 3'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 3'-UTR은 제아 메이스 유전자 3'-UTR일 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 3'-UTR을 포함하고, 여기서, 3'-UTR은 서열 2와 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 이상 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 3'-UTR을 포함하고, 여기서, 3'-UTR은 서열 3과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 이상 동일하다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 유전자 3'-UTR을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 3'-UTR을 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선별가능한 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 제아 메이스로부터의 프로모터 및 3'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 a) 서열 1과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 이상 동일한 프로모터; b) 서열 2와 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 이상 동일한 3'-UTR; 또는 c) 서열 3과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 이상 동일한 3'-UTR을 포함한다.
예를 들어, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 3'-UTR, 둘 모두를 포함할 수 있으며, 여기서, 프로모터는 서열 1의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열 2 또는 서열 3의 폴리뉴클레오티드이다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진 또는 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR, 및 제아 메이스 프로모터를 포함한다. 유전자 발현 카세트가 하나 이상의 트랜스진을 포함할 때, 프로모터, 및 3'-UTR은 유전자 발현 카세트 내에 상이한 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터를 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선별가능한 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터 및 3'-UTR을 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선별가능한 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR을 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선별가능한 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다.
제아 메이스 3'-UTR은 유전자 발현 카세트 내에서 상이한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 프로모터는 식물 (예컨대, 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터), 바이러스 (예컨대, 카사바(Cassava) 엽맥 모자이크 바이러스 프로모터) 또는 박테리아 (예컨대, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 델타 매스)로부터 기원한다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR을 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선별가능한 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 벡터는 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 박테리오파지, 바이러스, 형질전환 또는 유전자 표적화에서 사용하기 위한 절제된 폴리뉴클레오티드 단편, 예컨대, 공여 DNA일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함하는 세포 또는 식물을 제공한다. 한 실시양태에서, 세포 또는 식물은 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 박테리오파지, 또는 바이러스일 수 있다. 그에 의해 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함하는 세포 또는 식물은 각각 트랜스제닉 세포 또는 트랜스제닉 식물이다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 식물일 수 있다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 단자엽 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 귀리, 호밀, 바나나, 사탕수수, 및 기장일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 쌍자엽 식물일 수 있다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 쌍자엽 식물은 대두, 목화, 해바라기, 및 카놀라일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태는 또한 본원에 개시된 바와 같이 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자를 포함한다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 2개 이상의 트랜스진을 포함한다. 2개 이상의 트랜스진은 본원에 개시된 프로모터 또는 3'-UTR에 작동가능하게 연결되지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 하나 이상의 트랜스진을 포함한다. 하나 이상의 트랜스진을 포함하는 한 실시양태에서, 1개 이상의 트랜스진은 대상 개시내용의 프로모터 또는 3'-UTR에 작동가능하게 연결된다.
선별가능한 마커
형질전환된 식물 ("형질전환체")이 식별 및 선택될 수 있도록 하기 위해 리포터 유전자로서 기술된 다양한 선별가능한 마커 또한 선택된 발현 벡터 내로 도입될 수 있다. 형질전환된 식물에서의 선별가능한 마커의 발현을 확인하는 데, 예를 들어, DNA 서열분석 및 PCR (중합효소 연쇄 반응), 써던 블롯팅, 노던 블롯팅, 벡터로부터 발현된 단백질, 예컨대, 포스피노트리신 저항성을 매개하는 침전된 단백질의 검출을 위한 면역학적 방법, 또는 다른 단백질, 예컨대, β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 적색 형광 단백질 (RFP), β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제 등을 코딩하는 리포터 유전자의 시각적 관찰을 비롯한, 다수의 방법이 이용가능하다 (문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001] (상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
선별가능한 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직 선별에 사용된다. 선별가능한 마커 유전자로는 항생제 저항성을 코딩하는 유전자, 예컨대, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 유전자 뿐만 아니라, 제초 화합물에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 제초제 저항성 유전자는 일반적으로 제초제에 대해 감수성을 띠지 않는 변형된 표적 단백질, 또는 작용할 수 있기 전에 식물 내에서 제초제를 분해하거나, 해독시키는 효소를 코딩한다. 예를 들어, 글리포세이트에 대한 저항성은 돌연변이체 표적 효소, 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS) 또는 DGT-28을 코딩하는 유전자를 사용함으로써 수득하였다. EPSPS에 대한 유전자 및 돌연변이체는 널리 공지되어 있고, 이는 하기에 추가로 기술된다. 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 저항성은 각각의 제초제를 해독시키는, pat 또는 DSM -2를 코딩하는 박테리아 유전자, 니트릴라제, aad-1 또는 aad-12 유전자를 사용하여 수득하였다.
한 실시양태에서, 이들 제초제에 대한 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 및 아세토락테이트 신타제 (ALS)의 저항성/내성을 위한 유전자는 널리 공지되어 있다. 글리포세이트 저항성 유전자로는 각각 돌연변이체 5-에놀피루빌쉬키메이트 -3-포스페이트 신타제 (EPSP) 및 dgt -28 유전자 (재조합 핵산의 도입 및/또는 천연 EPSP 유전자에 대한 다양한 형태의 생체내 돌연변이유발법을 통함), aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자를 포함한다. 다른 포스포노 화합물에 대한 저항성 유전자로는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 (스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes) 포함)으로부터의 bar 유전자, 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로피온산 및 시클로헥손(ACCase 억제제-코딩 유전자)을 포함한다. 시클로헥산디온 및/또는 아릴옥시페녹시프로판산 (할록시포프(Haloxyfop), 디클로포프(Diclofop), 페녹시프로프(Fenoxyprop), 플루아지포프(Fluazifop), 퀴잘로포프(Quizalofop) 포함)에 대한 저항성을 부여하는 예시적인 유전자로는 아세틸 조효소 A 카르복실라제 (ACCase)--Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3의 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 제초제는 트리아진 (psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)를 비롯한 제초제는 광합성을 억제할 수 있다.
한 실시양태에서, 선별가능한 마커 유전자로는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II; 시안아미드 히드라타제; 아스파르테이트 키나제; 디히드로디피콜리네이트 신타제; 트립토판 데카르복실라제; 디히드로디피콜리네이트 신타제 및 탈감작화 아스파르테이트 키나제; bar 유전자; 트립토판 데카르복실라제; 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NEO); 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT 또는 HYG); 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제; 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제; 아세토히드록시산 신타제; 5-에놀피루빌-쉬키메이트-포스페이트 신타제 (aroA); 할로아릴니트릴라제; 아세틸-조효소 A 카르복실라제; 디히드로프테로에이트 신타제 (sul I); 및 32 kD 광화학계 II 폴리펩티드 (psbA)를 코딩하는 유전자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
한 실시양태는 또한 클로람페니콜; 메토트렉세이트; 히그로마이신; 스펙티노마이신; 브로목시닐; 글리포세이트 및 포스피노트리신에 대한 저항성을 코딩하는 유전자를 포함한다.
선별가능한 마커 유전자의 상기 목록은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 임의의 리포터 또는 선별가능한 마커 유전자가 본 발명에 포함된다.
식물에서의 최적의 발현을 위해 선별가능한 마커 유전자가 합성된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 식물에서의 발현을 증진시키기 위해 유전자의 코딩 서열은 코돈 최적화에 의해 변형될 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 특정 식물 종에서의 발현을 위해 최적화될 수 있거나, 또는 별법으로, 쌍자엽 또는 단자엽 식물에서의 최적의 발현을 위해 변형될 수 있다. 식물에서 바람직한 코돈은 관심의 특정 식물 종에서 최다량으로 발현된 단백질에서 최고 빈도의 코돈으로부터 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 선별가능한 마커 유전자는 식물에서 더 높은 수준으로 발현되어 더 높은 형질전환 효율을 얻도록 디자인된다. 식물에서의 유전자의 최적화 방법은 널리 공지되어 있다. 합성 DNA 서열의 최적화 및 제조에 관한 가이던스는 예를 들어, WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, 미국 특허 번호 6166302, 및 미국 특허 번호 5380831 (상기 문헌들은 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.
형질전환
식물의 형질전환에 적합한 방법으로는 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 방법을 포함하고, 예를 들어, 및 제한 없이, 전기천공 (예컨대, 미국 특허 5384253 참조); 미세발사체 투사법 (예컨대, 미국 특허 5015580, 5550318, 5538880, 6160208, 6399861, 및 6403865 참조); 아그로박테리움-매개 형질전환 (예컨대, 미국 특허 5635055, 5824877, 5591616, 5981840, 및 6384301 참조); 및 원형질체 형질전환 (예컨대, 미국 특허 5508184 참조)을 포함한다. 이 방법들은 식물을 안정적으로 형질전환시키는 데, 또는 일시적으로 형질전환시키는 데 사용될 수 있다.
DNA 구축물은 기술, 예컨대, 탄화규소 섬유와의 교반 (예컨대, 미국 특허 5302523 및 5464765 참조)을 이용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접적으로 도입될 수 있거나, DNA 구축물은 바이오리스틱스 방법, 예컨대, DNA 입자 투사법 (예컨대, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73])을 이용하여 식물 조직으로 직접적으로 도입될 수 있다. 별법으로, DNA 구축물은 나노입자 형질전환 (예컨대, 미국 특허 공개 번호 20090104700 (이 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다) 참조)을 통해 식물 세포 내로 도입될 수 있다.
추가로, 유전자 전달은 비-아그로박테리움 박테리아 또는 바이러스, 예컨대, 리조비움 종(Rhizobium sp.) NGR234, 시노리조보이움 멜리로티(Sinorhizoboium meliloti), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 이용하여 달성할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4] 참조).
형질전환 기술의 적용을 위해, 사실상 임의의 식물 종의 세포를 안정적으로 형질전환시킬 수 있고, 이들 세포는 널리 공지된 기술에 의해 트랜스제닉 식물로 발생될 수 있다. 예를 들어, 목화 형질전환과 관련하여 특히 유용할 수 있는 기술은 미국 특허 5846797, 5159135, 5004863; 및 6624344에 기술되어 있고; 특히 브라시카(Brassica) 식물을 형질전환시키는 기술은 예를 들어, 미국 특허 5750871에 기술되어 있고; 대두를 형질전환시키는 기술은 예를 들어, 미국 특허 6384301에 기술되어 있고; 옥수수를 형질전환시키는 기술은 예를 들어, 미국 특허 7060876 및 5591616, 및 국제 PCT 공보 WO 95/06722에 기술되어 있다.
외인성 핵산의 수용 세포로의 전달을 수행한 후, 일반적으로는 형질전환된 세포를 추후 배양 및 식물 재생을 위해 확인한다. 형질전환체를 확인할 수 있는 능력을 개선시키기 위해, 형질전환체를 생성하는 데 사용된 형질전환 벡터와 함께 선별가능한 마커 유전자를 사용하는 것을 요구할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 세포를 선별제 또는 선별제들에 노출시킴으로써 형질전환된 세포 집단을 검정할 수 있거나, 세포를 원하는 마커 유전자 특질에 대하여 스크리닝할 수 있다.
선별제에의 노출로부터 생존한 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양으로 스코어링된 세포를 식물 재생을 지원하는 배지 중에서 배양하였다. 한 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지는 추가 물질, 예컨대, 생장 조절인자를 포함함으로써 변형될 수 있다. 식물 재생 노력을 시작하는 데 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 수동식 선별을 수회에 걸쳐 반복 수행한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 상태가 될 때까지 (예컨대, 2주 이상) 식물을 생장 조절인자를 포함하는 기초 배지 상에서 유지시킬 수 있고, 이어서, 이를 어린싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 어린싹이 충분히 형성될 때까지 주기적으로 배양물을 옮겨준다. 일단 어린싹이 형성되고 나면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 일단 충분한 뿌리가 형성되고 나면, 식물을 추가 생장 및 성숙을 위해 토양으로 옮겨 놓을 수 있다.
제공받은 원하는 핵산 포함 구축물이 재생 식물에 존재하는지 확인하기 위해, 다양한 검정법을 수행할 수 있다. 예컨대, 검정법으로는 분자생물학적 검정법, 예컨대, 써던 및 노던 블롯팅 및 PCR; 생화학적 검정법, 예컨대, 면역학적 수단 (ELISA, 웨스턴 블롯, 및/또는 LC-MS MS 분광 광도법)에 의한 또는 효소 작용에 의한 단백질 생성물의 존재 검출; 식물 부분 검정법, 예컨대, 잎 또는 뿌리 검정법; 및/또는 재생된 전체 식물의 표현형 분석을 포함할 수 있다
트랜스제닉 이벤트는 예를 들어, 예컨대, 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 스크리닝될 수 있다. PCR 유전자형 분석은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서, PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 분석 방법은 잘 기술되어 있고 (예컨대, 문헌 [Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53] 참조), 세포 배양물을 비롯한, 임의의 식물 종 또는 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 표적 서열 및 도입된 서열, 둘 모두에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합은 PCR 증폭 반응에서 순차적으로 사용되거나, 또는 다중화될 수 있다. 표적 부위, 도입된 핵산 서열, 및/또는 그 둘의 조합에 어닐링하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용될 수 있다. 따라서, PCR 유전자형 분석 전략법은 예를 들어, 및 제한 없이, 식물 게놈 내의 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 내의 다중 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 내의 비-특이적 서열의 증폭; 및 상기 중 임의 것의 조합을 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 게놈 정보를 얻기 위해 프라이머 및 증폭 반응의 추가의 조합을 고안할 수 있다. 예를 들어, 도입된 핵산 서열의 경계 바깥쪽 표적에 특이적인 핵산 서열(들)에 어닐링하도록 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 디자인될 수 있다.
정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들어, 도입된 핵산 분자에 포함된 관심 뉴클레오티드 서열 내의 코딩 영역, 또는 핵산 분자의 다른 부분에 상응하는 서열에서 도입된 핵산 분자에 특이적으로 어닐링하도록 디자인될 수 있다. 프라이머는 본원에 기술된 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 원하는 서열에 따라 합성될 수 있고, (예컨대, 인터그레이티드 DNA 테크놀로지즈, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.: 미국 아이오와주 코랄빌)로부터) 상업적으로 이용가능하다. 증폭 후에 클로닝 및 서열분석, 또는 증폭 생성물의 직접적 서열 분석을 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 표적에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 증폭에 사용된다.
트랜스진 발현 방법
한 실시양태에서, 식물에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터를 포함하는 식물을 생장시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 식물을 생장시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터 및/또는 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 식물을 생장시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터 및 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 식물에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 생장시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 생장시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터, 및 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 생장시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 생장시키는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 연결된 제아 메이스 프로모터 및 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 1개 이상의 트랜스진을 발현시키는 방법은 1개 이상의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제아 메이스 프로모터는 서열 1일 수 있다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서, 프로모터는 서열 1과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 이상 동일하다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선별가능한 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 제아 메이스 3'-UTR은 서열 2의 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서, 3'-UTR은 서열 2와 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 이상 동일하다. 한 실시양태에서, 제아 메이스 3'-UTR은 서열 3의 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서, 3'-UTR은 서열 3과 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 이상 동일하다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR을 포함하고, 여기서, 프로모터는 제아 메이스 프로모터, 식물 (예컨대, 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터), 바이러스 (예컨대, 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 프로모터) 또는 박테리아 (예컨대, 아그로박테리움 투메파시엔스 델타 매스)로부터 기원한 프로모터이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선별가능한 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터, 및 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 프로모터 및 3'-UTR은 유전자 발현 카세트가 2개 이상의 트랜스진을 포함할 때, 유전자 발현 카세트 내의 상이한 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 프로모터를 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선별가능한 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 사용한 트랜스진 발현은 식물의 잎 조직에 특이적이다. 한 실시양태에서, 트랜스진 발현은 식물의 잎 조직에서 발현된 1개 초과의 트랜스진을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 트랜스제닉 식물을 생장시키는 방법은 잎-특이적 트랜스진 발현을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 트랜스진을 발현시키는 방법은 잎-특이적 조직 및 뿌리-특이적 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 잎-특이적 발현은 옥수수 잎-특이적 발현을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본원에 기술된 방법을 사용하는 트랜스진 발현은 지상 식물 조직 (예컨대, 지상 식물 조직은 잎, 껍질, 줄기, 및 수염을 포함한다) 내에서 발현된다. 한 실시양태에서, 트랜스진 발현은 지상 식물 조직에서 발현된 1개 초과의 트랜스진을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 트랜스제닉 식물을 생장시키는 방법은 지상 식물 조직 트랜스진 발현을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 트랜스진을 발현시키는 방법은 지상 식물 조직 및 지상 식물 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 지상 식물 조직 발현은 옥수수 지상 식물 조직 발현을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 본원에 개시된 바와 같은 제아 메이스 프로모터 및/또는 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 본원에 개시된 바와 같은 제아 메이스 프로모터 및/또는 제아 메이스 3'-UTR을 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 박테리오파지, 또는 바이러스일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따라 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 단자엽일 수 있다. 단자엽 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 옥수수, 벼, 밀, 사탕수수, 보리, 호밀, 수수, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 기장, 및 트리티케일일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 쌍자엽일 수 있다. 쌍자엽 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 평지씨, 카놀라, 갓(Indian mustard), 에티오피아 겨자(Ethiopian mustard), 대두, 해바라기, 및 목화일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
유전적으로 조작된 식물 제조와 관련하여, 식물의 유전자 조작 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 쌍자엽 식물 뿐만 아니라, 단자엽 식물에 대한 생물학적 및 물리학적 형질전환 프로토콜을 비롯한 다수의 식물 형질전환 방법이 개발되었다 (예컨대, 문헌 [Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999)]; [Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)]). 추가로, 벡터 및 식물 세포의 시험관내 배양 방법 또는 식물의 조직 형질전환 및 재생은 예를 들어, 문헌 [Gruber et al., Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)]에서 이용가능하다.
통상의 기술자는 외인성 서열이 트랜스제닉 식물에 안정적으로 도입되고, 작동가능하지 여부에 대해 확인된 후, 유성 교배에 의해 다른 식물 내로 도입될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 교배 종에 따라 다수의 표준 육종 기술들 중 임의의 것이 사용될 수 있다.
형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물은 형질전환 DNA 상에 존재하는 마커 유전자에 의해 코딩된 특질에 대하여 조작된 식물 물질을 선별 또는 스크리닝함으로써 확인되고, 단리될 수 있다. 예를 들어, 선별은 형질전환 유전자 구축물의 부여하는 저항성의 대상이 되는 억제량의 항생제 또는 제초제를 함유하는 배지 상에서 조작된 식물 물질을 생장시킴으로써 수행될 수 있다. 추가로, 형질전환된 세포는 또한 재조합 핵산 벡터 상에 존재할 수 있는 임의의 시각적 마커 유전자 (예컨대, yfp, gfp, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, B 또는 C1 유전자)의 활성에 대하여 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 상기와 같은 선별 및 스크리닝 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
삽입된 유전자 구축물을 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체를 확인하는 데에는 물리학적 및 생화학적 방법 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법으로는 1) 재조합 DNA 삽입체의 구조를 검출하고, 측정하기 위한 써던 분석법 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구축물의 RNA 전사체를 검출 및 조사하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-연장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소적 검정법 (해당 유전자 산물은 유전자 구축물에 의해 코딩된 것인 경우); 4) 차세대 염기 서열분석 (NGS) 분석법; 5) 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침강, 또는 효소-결합된 면역검정법 (ELISA) (유전자 구축물 생성물이 단백질인 경우)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가 기술, 예컨대, 계내 하이브리드화, 효소 염색법 및 면역염색법 또한 특이적인 식물 기관 및 조직에서 재조합 구축물의 존재 또는 발현을 검출하는 데 사용될 수 있다. 상기의 모든 검정법의 수행 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 널리 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하는 유전자 조작이 미치는 효과는 예를 들어, 관심 조직으로부터 단리된, RNA (예컨대, mRNA)의 노던 블롯에 의해 관찰할 수 있다. 전형적으로, mRNA가 존재하거나, 또는 mRNA의 양이 증가한 경우, 이는 상응하는 트랜스진이 발현된다고 추정할 수 있다. 유전자 및/또는 코딩된 폴리펩티드 활성을 측정하는 다른 방법도 사용될 수 있다. 사용되는 기질, 및 반응 생성물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라 다른 유형의 효소적 검정법이 사용될 수 있다. 추가로, 발현된 폴리펩티드의 수준은 면역화학적으로, 즉, ELISA, RIA, EIA 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 항체 기반 검정법에 의해, 예컨대, (염색법 또는 웨스턴 블롯팅과 함께) 전기영동 검출 검정법에 의해 측정될 수 있다. 비-제한적인 한 예로서, ELISA 검정법을 이용하여 AAD-1 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; WO 2005/107437 참조) 및 PAT (포스피노트리신-N-아세틸-트랜스퍼라제) 단백질을 검출하는 것이 미국 특허 공개 번호 20090093366 (이 특허는 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 기술되어 있다. 트랜스진은 식물의 일부 세포 유형 또는 조직에서, 또는 일부 발생 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 트랜스진은 실질적으로 모든 식물 조직에서 실질적으로 그의 전체 생명환을 따라 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합 발현 모드 또한 적용가능하다.
본 개시내용은 또한 트랜스진 또는 유전자 구축물을 가지는 것인, 상기 기술된 트랜스제닉 식물의 종자도 포함한다. 본 개시내용은 트랜스진 또는 유전자 구축물을 가지는 것인, 상기 기술된 트랜스제닉 식물의 자손, 클론, 세포주 또는 세포도 추가로 포함한다.
본 발명은 구체적인 방법 및 실시양태를 참조로 하여 기술되었지만, 본 발명으로부터 벗어남 없이 다양하게 수정 및 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예
실시예 1: 고발현 조절 요소 확인
차세대 염기 서열분석 (NGS)을 사용하여 전사 프로파일링 접근법을 통해 신규한 제아 메이스 조절 요소를 확인하였다. 이어서, 트랜스제닉 식물에서 사용하기 위한 상기 조절 요소를 단리시키고, 클로닝시켜 조절 요소의 발현 프로파일을 특징 규명하였다. 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터 단리된 cry34Ab1 리포터 유전자 및 AAD-1 선별가능한 마커 유전자로 안정적으로 형질전환된 트랜스제닉 옥수수 계통을 제조하고, 트랜스진 발현 수준 및 조직 특이성을 평가하였다. 이에 따라, 신규한 제아 메이스 조절 요소가 확인되었고, 특징 규명되었다. 유전자 발현 구축물에서 사용하기 위한 프로모터, 5'-UTR, 및 3'-UTR 조절 요소를 최초로 개시한다.
유전자 발현 구축물에서 사용하기 위한 원하는 발현 프로파일을 가진 천연 옥수수 유전자의 조절 요소를 확인하고, 선택하기 위하여 전사 프로파일링을 위해 상이한 식물 생장 및 발생 단계로 생장된 식물로부터 옥수수 조직을 수득하였다. 예를 들어, 잎 (V4 (이중), V12 및 R3) 및 뿌리 (V4 및 V12 마디 조직 및 섬유 조직)의 3개의 발생 단계, 화분, 수염, 속대, 미성숙 커넬, 껍질 및 줄기 (V4 및 R1)로부터 조직 샘플을 수집하였다. 상기 기술된 조직 모두로부터 전체 mRNA를 단리시키고, 원하는 양의 고품질 mRNA를 수득하였다.
각 mRNA 샘플로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, 일루미나(Illumina) HiSeq® 2000 (일루미나 인크.(Illumina Inc.: 미국 캘리포니아주 샌디에고))을 이용하여 고처리량 서열분석을 완료하였다. 추가로, RNAseq 샘플 제조를 위해 제조사의 권고된 프로토콜에 따라 일루미나 TruSeq® RNA 샘플 제조용 키트를 사용하였다. 간략하면, 폴리-T 올리고-부착된 자기 비드를 사용하여 5 ㎍의 전체 RNA를 정제한 후, 고온하에서 2가 양이온을 이용하여 더 작은 조각 (평균 길이 약 200 bp)으로 단편화하였다. 이어서, 슈퍼스크립트(SuperScript)® II 역전사효소 및 무작위 프라이머를 이용하여 단편화된 mRNA를 제1 가닥 cDNA로 복사하였다. DNA 폴리머라제 I 및 RNase H를 이용하여 cDNA를 이중 가닥 cDNA (ds cDNA)로 추가로 전환시켰다. 이어서, 이중 가닥 cDNA 단편에 대해 단부 수복, A-테일링, 이어서, 인덱싱된 일루미나 쌍을 이룬-단부 (PE) 압타머에의 결찰을 진행하였다. 마지막으로, 라이브러리 생성물을 세정하고, 15회에 걸쳐 PCR 사이클을 수행하여 강화시키고, 정제하였다. 강화된 라이브러리를 2 nM 농도로 정규화하고, 수산화나트륨으로 변성시키고, HiSeq® 유동 셀의 단일 레인 상에 로딩하기 위하여 하이브리드화 완충제 중에서 12 pM으로 희석하였다. 일루미나의 권고된 프로토콜에 따라 클러스터 생성, 프라이머 하이브리드화 및 서열분석 반응을 수행하였다.
이어서, 서열분석 리드를 여과하여 저품질 리드를 제거하였다. 여과 후, 서열분석 리드 중 약 99.9%가 유지되었다. 옥수수GDB에서 이용가능한 주석이 달린 제아 메이스 c.v. B73 게놈에 대하여 서열분석 리드를 정렬하였다. 1개 초과의 유전자좌에서 옥수수 게놈 상에 지도화된 서열분석 리드는 폐기하여 고발현 유전자의 확인 및 그의 추가 특징 규명에서의 혼선을 피하였다. 본 단계를 거쳐 각 샘플로부터의 >70%의 서열분석 리드를 옥수수 게놈에 대하여 정렬할 수 있었다. 지도화된 100만 개의 단편당 엑손 킬로베이스당 단편의 정량적 유발자 발현 단위 또는 FPKM 값을 사용하여 유전자 발현 구축물에서 사용하는 데 바람직한 발현 패턴에 매칭되는 유전자를 안정적인 형질전환 시험에 대해 등급을 순위화하였다. 옥수수에서 고도로 발현된 유전자는 안정적인 트랜스제닉 계통에서 시험하는 데 우선적으로 처리하였다 (도 1).
실시예 2: 제아 메이스 서열로부터 신규한 조절 요소의 선택
전사 프로파일링 접근법을 거쳐 발현에 대하여 높은 등급으로 순위화된 제아 메이스 유전자 서열로부터 프로모터, 5'-UTR, 및 3'-UTR 서열을 추출하였다. 제아 메이 c.v. B73 게놈으로부터의 제아 메이스 유전자의 천연 서열은 서열 4로서 제공한다. 서열 2 및 서열 3의 1,000 bp 3'-UTR 서열 이외에도, 서열 1의 637 bp 프로모터 및 5'-UTR 서열도 서열 4에 포함되어 있다.
실시예 3: 구축물 디자인
DNA 요소를 합성하고, 진입 벡터 내로 클로닝하였다. 프로모터의 길이는 637 bp였고, 3'-UTR의 길이는 각각 1,000 bp였다. 구축물에서 측면에 위치하는 DNA 요소에 대하여 상동성인 최소 15 bp의 중복부를 함유하는 프라이머로 서열 1의 제아 메이스 프로모터, cry34Ab1 (B. 투린기엔시스(B. thuringiensis)로부터의 리포터 유전자), 및 서열 2 및 서열 3의 제아 메이스 3'-UTR을 증폭시켰다. 모든 단편을 겔 정제하였다. 진아트® 심리스(Geneart® Seamless) 클로닝 반응 (인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))을 거쳐 3개의 단편 모두를 진입 벡터 골격 pENTR11을 따라 한 방향 순서로 조립하였다. 이어서, 생성된 진입 플라스미드, pDAB114494, 및 목적 벡터, pDAB104153을 이용하여 게이트웨이® LR 클로나제®(Gateway® LR Clonase®) (인비트로겐) 반응을 수행함으로써 최종 발현 벡터, pDAB114410을 얻었다. 목적 벡터는 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689)에 의해 구동되고, 옥수수 리파제 3'-UTR (미국 특허 번호 7,179,902)에 의해 종결되는 AAD-1 유전자로 구성된 선별가능한 마커 카세트를 함유하였다.
상기 기술된 전략법을 사용하여 pDAB114410 구축물을 디자인하고, 구축하였다. 상기 벡터는 AAD-1 유전자 발현 카세트, 및 cry34Ab1 유전자 발현 카세트을 구동시키는 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 5'-UTR을 함유하는 이종성 유전자 발현 구축물이다 (도 2).
cry34Ab1 유전자를 PhiYFP 리포터 유전자 (Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21; 841-50)로 대체하고, StPinII 3'-UTR을 제아 메이스로부터 수득된, 신규한 서열 2의 1,000 bp 3'-UTR 서열로 대체함으로써 진아트® 심리스 클로닝 반응을 이용하여 제2 진입 벡터, pDAB114494를 조립하였다. 프로모터 (서열 1) 및 3'-UTR (서열 2) 요소, 둘 모두 제아 메이스의 동일한 천연 유전자로부터 유래된 것이었다. 목적 벡터, pDAB104153을 이용하여 게이트웨이® 반응을 수행한 후, 최종 발현 구축물, pDAB116008을 조립하였다. 목적 벡터는 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689)에 의해 구동되고, 옥수수 리파제 3'-UTR (미국 특허 번호 7,179,902)에 의해 종결되는 AAD-1 유전자로 구성된 선별가능한 마커 카세트를 함유하였다. pDAB116008 벡터 구축물은 AAD-1 유전자 발현 카세트 및 PhiYFP 유전자 발현 카세트를 함유하는 이종성 발현 구축물 (도 3)이다.
cry34Ab1 유전자 대신 황색 형광 단백질 (YFP) 리포터 유전자 및 pDAB114410에 존재하는 것과 동일한 AAD-1 발현 카세트를 함유하는 음성 대조군 구축물, pDAB101556 (도 4)을 조립하였다. cry34Ab1 유전자의 발현을 제어하는 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 및 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 프로테아제 억제제 유전자 II 3' UTR (StPinII 3'-UTR v2; An et al., (1989) Plant Cell 1; 115-22)로 구성된 양성 대조군 구축물, pDAB108746 (도 5)을 구축하였다. AAD -1 카세트는 pDAB114410에 존재하는 것과 동일하였다.
대안적 3' UTR을 함유하는 구축물 pDAB120167에 대한 DNA 요소를 합성하고, 진입 벡터 내로 클로닝하였다. 프로모터 (서열 1) 및 3'-UTR (서열 3) 길이는 각각 637 bp 및 1,000 bp였다. 구축물 중 그의 측면에 위치하는 DNA 요소에 대하여 상동성인 최소 15 bp의 중복부를 함유하는 프라이머로 서열 1의 제아 메이스 프로모터, cry34Ab1 (B. 투린기엔시스로부터의 리포터 유전자, 및 서열 3의 제아 메이스 3'-UTR을 증폭시켰다. 모든 단편을 겔 정제하였다. 진아트® 심리스 클로닝 반응 (인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼즈배드)을 거쳐 3개의 단편 모두를 진입 벡터 골격 pENTR11을 따라 한 방향 순서로 조립하였다. 이어서, 생성된 진입 플라스미드, pDAB120158, 및 목적 벡터, pDAB104153을 이용하여 게이트웨이® LR 클로나제® (인비트로겐) 반응을 수행함으로써 최종 발현 벡터, pDAB120167을 얻었다. 목적 벡터는 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689)에 의해 구동되고, 옥수수 리파제 3'-UTR (미국 특허 번호 7,179,902)에 의해 종결되는 AAD-1 유전자로 구성된 선별가능한 마커 카세트를 함유하였다. 생성된 구축물, pDAB120167은 AAD-1 유전자 발현 카세트 및 cry34Ab1 유전자 발현 카세트를 함유하는 이종성 발현 구축물 (도 5)이다.
실시예 4: 식물 형질전환 및 분자적 확인
아그로박테리움 투메파시엔스의 형질전환:
2원 발현 벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 DAt13192 (RecA 결핍 3원 균주) (국제 특허 공개 번호 WO2012016222)를 형질전환시켰다. 박테리아 콜로니를 선택하고, 2원 플라스미드 DNA를 단리시키고, 제한 효소 분해를 통해 확인하였다.
아그로박테리움 배양 개시:
아그로박테리움 배양물을 AB 최소 배지 (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79; 수크로스 없이, 및 5 g/L 글루코스 및 15 g/L 박토™ 아가(Bacto™ Agar)를 포함하여 제조) 상의 글리세롤 스톡으로부터 스트리킹하고, 암실에서 3일 동안 20℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 아그로박테리움 배양물을 YEP 배지 (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79)의 플레이트 상에서 스트리킹하고, 암실에서 1일 동안 20℃에서 인큐베이션하였다.
실험 당일, 실험 크기에 적절한 부피로 접종 배지 (2.2 g/L MS 염, 68.4 g/L 수크로스, 36 g/L 글루코스, 115 mg/L L-프롤린, 2 mg/L 글리신, 100 mg/L 미오-이노시톨, 0.05 mg/L 니코틴산, 0.5 mg/L 피리독신 HCl, 0.5 mg/L 티아민 HCl) 및 아세토시린곤의 혼합물을 제조하였다. 100% 디메틸 술폭시드 중 1 M의 아세토시린곤 스톡 용액을 접종 배지에 첨가하여 아세토시린곤의 최종 농도가 200 μM이 되도록 만들었다.
각각의 구축물에 대해, YEP 플레이트로부터의 1-2 루프의 아그로박테리움을 멸균, 일회용 50 ml 원심분리 튜브 내의 15 ml의, 접종 배지/아세토시린곤 혼합물 중에 현탁시키고, 600 nm (O.D.600)에서의 용액의 광학 밀도를 분광광도계로 측정하였다. 이어서, 추가의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물을 사용하여 현탁액을 0.25-0.35 O.D.600 미만으로 희석시켰다. 이어서, 사용하기 전 1 내지 4시간 동안 실온에서 아그로박테리움 현탁액의 튜브를 약 75 rpm으로 설정한 플랫폼 진탕기 상에 수평으로 놓았다.
옥수수 형질전환:
근교계, 제아 메이스 c.v. B104로부터 단리된 미성숙 배아의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 옥수수를 실험 구축물로 형질전환시켰다. 사용된 방법은 문헌 [Ishida et al., (1996) Nature Biotechnol 14:745-750] 및 [Frame et al., (2006) Plant Cell Rep 25: 1024-1034]에 공개된 것과 유사한 방법이지만, 이는 본 방법이 고처리량 형질전환을 쉽게 수행할 수 있도록 만드는 여러 변형 및 개선안을 가지고 있다. 옥수수에서 다수의 트랜스제닉 이벤트를 제조하는 데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2013/0157369 A1에 제공되어 있는데, 이는 배아 감염 및 공동 배양 단계로 시작된다.
T0 식물의 온실내 전달 및 확립:
트랜스제닉 식물을 정기적으로 온실로 옮겼다. 식물을 피타트레이스(Phytatrays)™로부터 성장 배지 (프리미어 테크 홀티컬쳐(Premier Tech Horticulture), 프로믹스(ProMix) BX)로 채워진 작은 화분 (T. O. 플라스틱스(T. O. Plastics), 3.5" SVD, 700022C)으로 이식하고, 휴미돔으로 덮어 식물이 순응하도록 도왔다. V3-V4 단계에 도달할 때까지 식물을 콘비론(Conviron)™ 생장 챔버 (28℃/24℃, 16시간 광주기, 50-70% RH, 200 μmol m-2 s-1 광 강도) 내에 놓아두었다. 이는 식물이 토양 및 보다 가혹한 온도에 순응하는 것을 도왔다. 이어서, 식물을 온실 (광 노출 유형: 광 또는 동화; 광 상한: 1200 μmol m-2 s-1 광합성 활성 방사선 (PAR); 16시간 낮 길이; 27℃ 낮/24℃ 밤)로 이동시키고, 작은 화분으로부터 5.5 인치 화분으로 이식하였다. 더 큰 화분으로 이식한 후 대략 1-2주 경과하였을 때, 생물검정을 위해 식물을 샘플링하였다. 이벤트당 1 그루의 식물을 검정하였다.
실시예 5: 트랜스제닉 식물/이벤트의 분자적 확인
cry34Ab1 및 AAD-1 정량적 PCR 검정법을 이용하여 추정 트랜스제닉 옥수수 식물을 V2-3 잎 단계에서 트랜스진 존재에 대하여 샘플링하였다. 맥어트랙트(MagAttract)® DNA 추출용 키트 (퀴아젠(Qiagen))을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 잎 샘플로부터 전체 DNA를 추출하였다.
관심 유전자를 검출하기 위해, cry34Ab1 유전자에 대한 FAM-표지된 형광 프로브 및 내인성 인버타제 참조 유전자 대조군에 대한 HEX-표지된 형광 프로브를 함유하는 택맨® 프라이머/프로브 세트로 유전자 특이적 DNA 단편을 증폭시켰다. cry34Ab1 및 인버타제 내인성 참조 유전자 증폭을 위해 하기 프라이머를 사용하였다.
Cry34Ab1 프라이머/프로브:
정방향 프라이머: TQ.8v6.1.F: GCCATACCCTCCAGTTG (서열 5)
역방향 프라이머: TQ.8v6.1.R: GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG (서열 6)
프로브: TQ.8v6.1.MGB.P: 5'-/56-FAM/CCGAATCCAACGGCTTCA/ MGB (서열 7)
인버타제 프라이머:
정방향 프라이머: 인버타제F: TGGCGGACGACGACTTGT (서열 8)
역방향 프라이머: 인버타제R: AAAGTTTGGAGGCTGCCGT (서열 9)
인버타제프로브: 5'-/5HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTACTT /3BHQ_1/-3' (서열 10)
이어서, 최종 부피 10 ㎕의, 5 ㎕의 로슈 라이트사이클러® 480 프로브스 마스터 믹스(Roche LightCycler® 480 Probes Master Mix) (로슈 어플라이드 사이언시즈(Roche Applied Sciences: 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를 함유하는 반응물; 10 μM 스톡으로부터 최종 농도 400 nM까지의 0.4 ㎕씩의 각 TQ.8v6.1.F, TQ.8v6.1.R, 인버타제F, 및 인버타제R 프라이머; 5 μM 스톡으로부터 최종 농도 200 nM까지의 0.4 ㎕씩의 각 TQ.8v6.1.MGB.P 및 인버타제 프로브, 최종 농도 0.1%까지의 0.1 ㎕의 10% 폴리비닐피롤리돈 (PVP); 2 ㎕의 10 ng/㎕ 게놈 DNA 및 0.5 ㎕ 물에서 PCR 반응을 수행하였다. DNA를 하기 조건하에서 로슈 라이트사이클러® 480 시스템에서 증폭시켰다: 95℃에서 10 min 동안으로 1 사이클; 하기 3-단계를 40 사이클: 95℃에서 10초 동안; 58℃에서 35초 동안 및 72℃에서 1초 동안, 및 4℃에서 10초 동안으로 최종 사이클. (라이트사이클러® 480에 의해 생산된) 알려지지 않은 샘플에 대한 표적 (관심 유전자)/참조 (인버타제 유전자) 값을 cry34Ab1 카피수 대조군의 표적/참조 값을 비교함으로써 cry34Ab1 카피수를 측정하였다.
인버타제 내인성 참조 유전자를 사용하여 cry34Ab1 유전자에 대해 상기 기술된 바와 같이 AAD-1 유전자 검출을 수행하였다. AAD -1 프라이머 서열은 하기와 같았다;
AAD1 정방향 프라이머: TGTTCGGTTCCCTCTACCAA (서열 11)
AAD1 역방향 프라이머: CAACATCCATCACCTTGACTGA (서열 12)
AAD1 프로브: 5'-FAM/CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA-MGB/BHQ-3' (서열 13).
인버타제 내인성 참조 유전자를 사용하여 cry34Ab1 유전자에 대해 상기 기술된 바와 같이 PhiYFP 유전자 검출을 수행하였다. PhiYFP 프라이머 서열은 하기와 같았다;
PhiYFP v3 정방향 프라이머: CGTGTTGGGAAAGAACTTGGA (서열 14)
PhiYFP v3 역방향 프라이머: CCGTGGTTGGCTTGGTCT (서열 15)
PhiYFP v3 프로브: 5'FAM/CACTCCCCACTGCCT /MGB_BHQ_1/3'(서열 16).
최종적으로, 관심 유전자를 함유하는 T0 식물을 V4-5에서 Cry34Ab1, PhiYFP, 및 AAD-1 잎 ELISA 검정을 위해 샘플링하였다. 4개의 잎 펀치를 샘플링하였다. 또다른 식물 세트는 V4-5에서 두 단백질 ELISA 검정 모두를 위해 전체 뿌리 매스에 대하여 샘플링하였다. 제조사의 설명서에 따라 잎 및 뿌리 Cry34Ab1 (아그디아, 인크.(Agdia, Inc.: 미국 인디애나주 엘칼트)) 및 AAD-1 (아카디아 바이오사이언시즈(Acadia BioScience)) ELISA 검정법을 수행하였다.
하기와 같이 PhiYFP ELISA를 완료하였다. 플레이트를 모노클로날 항-YFP 포획 항체 (오리진(Origene: 미국 메릴랜드주 록빌)로 코팅하였다. 모노클로날 항-YFP 포획 항체를 PBS 중에서 1 ㎍/ml의 농도로 희석하고, 150 ㎕의 용액을 플레이트의 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 20 내지 30분 동안 실온으로 가온시켰다. 플레이트를 350 ㎕의 세척용 완충제 (1X PBS 및 0.5% 트윈(Tween) 20)로 4회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 200 ㎕의 차단 완충제를 플레이트에 분취하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 이상 인큐베이션시켰다. 플레이트를 350 ㎕의 세척용 완충제 (1X PBS 및 0.5% 트윈 20)로 4회에 걸쳐 세척하였다.
재조합적으로 발현된 PhiYFP (에브로겐(Evrogen: 러시아 모스크바)) 표준물을 일련으로 희석된 희석액으로 웰에 첨가하였다. 표준물을 먼저 0.0313 ng/ml 내지 2 ng/ml의 농도로 제공하였다. 이어서, 플레이트를 진탕기 상에 놓고, 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 350 ㎕의 세척용 완충제 (1X PBS 및 0.5% 트윈 20)로 4회에 걸쳐 세척하였다. 1차 토끼 항-PhiYFP 폴리클로날 항체 (에브로겐: 러시아 모스크바) 농도를 1 ㎍/ml로 감소시키고, 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 진탕기 상에 놓고, 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 350 ㎕의 세척용 완충제 (1X PBS 및 0.5% 트윈 20)로 4회에 걸쳐 세척하였다. 2차 항-토끼 항체 호스래디시 퍼옥시다제 (피어스(Pierce; 미국 일리노이주 록퍼드))를 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 진탕기 상에 놓고, 실온에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 350 ㎕의 세척용 완충제 (1X PBS 및 0.5% 트윈 20)로 4회에 걸쳐 세척하였다. 최종적으로, 호스래디시 퍼옥시다제 표지된 항체에 대한 기질인 피어스 1 스텝 울트라(Pierce 1 Step Ultra) TMB ELISA를 웰에 첨가하고, 완만하게 진탕시켰다. 분광광도계로 결과를 정량하였다.
Cry34Ab1 잎 ELISA 검정은 ng/㎠로 표시한 반면, 뿌리 ELISA 결과는 백만분율 (또는 전체 식물 단백질 1 mg당 단백질의 ng 수)로 표시하였다. 브래드포드(Bradford) 검출 방법을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 전체 뿌리 단백질 검정을 수행하였다.
T0 식물을 자가 수분시키고, 제아 메이스 c.v. B104 비-트랜스제닉 형질전환 계통과 교배시켜 T1 종자를 수득하였다. 각 시험 조절 요소 구축물의 5-6개의 트랜스제닉 계통 또는 이벤트는 T1 단백질 및 RNA 유전자 발현 연구에 비해서 빠르게 진행되었고, 이어서, T2 종자 생산으로까지 이어졌다. 따라서, 각 이벤트의 30-40개의 T1 종자를 파종하고; 비-트랜스제닉 분리 개체를 사멸시키기 위하여 V2-3 발생 단계에서 묘목에 어슈어II(AssureII)®를 분무하였다. 트랜스제닉 식물을 다중의 식물 발생 단계에서 하기와 같이 Cry34Ab1, PhiYFP, 및 AAD-1 ELISA를 위해 샘플링하였다: 잎 (V4, V12 및 R3); 뿌리 (V4 및 R1); 줄기 (R1); 화분 (R1); 수염 (R1); 껍질 (R3); 미성숙 커넬 (R3); 및 속대 (R3). 모든 조직을 단리시키고, 드라이아이스에 포매된 튜브에 놓았고; 이어서, 이를 -80℃로 옮겨 놓았다. 냉동된 조직을 ELISA를 위하여 단백질을 추출하기 전까지 동결시켰다.
cry34Ab1 , PhiYFP 및 AAD-1 트랜스진을 함유하는 추정 트랜스제닉 T1 식물을 V4-5에서 잎 ELISA 검정법을 위해 샘플링하였다. 4개의 잎 펀치를 샘플링했다. 잎 펀치를 튜브에 놓고, 단일 1/8" 스테인레스 스틸 비드 (후버 프레시전 프로덕츠(Hoover Precision Products: 미국 조지아주 커밍))를, 300 ㎕ 추출용 완충제 (0.05% 트윈 20 및 0.5% BSA로 보충된 1X PBST)를 함유하는 각 1.2 ml 튜브에 첨가하였다. 샘플을 4분 동안 1,500 rpm으로 게노그라인더(Genogrinder)™ (SPEX 샘플프렙(SPEX SamplePrep: 미국 뉴저지주 메투첸))에서 프로세싱하였다. 샘플을 소르발 레전드 XFR(Sorvall Legend XFR)™ 원심분리기에서 2분 동안 4,000 rpm으로 원심분리하였다. 이어서, 추가의 300 ㎕의 추출용 완충제를 첨가하고, 샘플을 2분 동안 1,500 rpm으로 게노그라인더™에서 한번더 프로세싱하였다. 샘플을 7분 동안 4,000 rpm으로 한번더 원심분리하였다. 최종적으로, 상청액을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 Cry34Ab1 (아그디아, 인크.) 및 AAD-1 (아카디아 바이오사이언스, LLC(Acadia BioScience, LLC)) ELISA 검정용 키트를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 단백질 표준물과 함께 상이한 희석률의 희석액에 대해 ELISA 검정을 완료하였다.
동결된 조직을 페인트 진탕기에서 30초 동안 분쇄하여 다양한 조직 유형의 ELISA를 위한 단백질 추출을 수행하였다. 추가 분쇄가 필요한 조직의 경우, 추가로 30초 동안 분쇄 단계를 반복하였다. 가넷 분말을 첨가하여 튜브 바닥의 곡선 부분을 커버하였다. 굵게 분쇄된 조직을 2 ml 튜브로 옮겨 0.5 ml 마크까지 채웠다. 0.6 ml의 부분 추출용 완충제 (200 ㎕의 프로테아제 억제제 칵테일, 200 ㎕의 500 mM EDTA, 15.5 mg DTT 분말 및 20 ml가 될 때까지 첨가되는 PBST)와 같이, 한 세라믹 볼을 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 모두 10분 동안 얼음 상에서 유지시켰다. 냉 튜브를 게노그라인더®의 2 ml 홀더로 옮겨 놓았다. 샘플을 30초 동안 2회에 걸쳐 분쇄시켰고, 그 사이에는 5분 동안 얼음 상에서 냉각시켰다. 이어서, 40 ㎕의 10% 트윈®-20 및 300 ㎕ 추출용 완충제를 샘플에 첨가하였다. 샘플을 추가로 30초 동안 분쇄하였고, 그 사이에는 5분 동안 냉각시켰다. 최종적으로, 각 샘플을 7분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하고, 상청액을 조심하여 새 튜브로 옮겨 추출물을 수집하였다. 추출물을 추출용 완충제 중에서 재현탁시키고, ELISA 검정법을 위해 필요에 따라 희석하였다.
실시예 6: T0 트랜스제닉 식물 발현 스크리닝
ELISA 결과, 제아 메이스로부터 단리된 조절 요소가 구축물, pDAB114410로 형질전환된 T0 이벤트에서 Cry34Ab1의 잎 조직-선호 발현을 구동시킨 것으로 나타났다. 상기 이벤트의 뿌리에서는 제아 메이스 조절 요소에 의해 Cry34Ab1의 발현이 더 적게 일어난 것으로 관찰되었다 (하기 표 1-5). 대조군 구축물 pDAB108746으로부터 제조된 이벤트는 잎 및 뿌리 조직, 둘 모두에서 Cry34Ab1을 발현하였다. cry34Ab1 유전자를 함유하지 않는 대조군 구축물, pDAB101556으로 형질전환된 식물 이벤트에서는 어떤 Cry34Ab1 잎 발현도 관찰되지 않았다. 모든 구축물은 뿌리 및 잎 조직, 둘 모두에서 AAD-1 단백질을 발현하였다. 신규한 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 서열 2 및 서열 3의 3' UTR을 함유하는 트랜스제닉 옥수수 식물로부터 샘플링된 속대, 껍질, 커넬, 화분, 수염을 비롯한 상이한 조직 유형에서 높은 phiYFP 단백질 발현이 발견되었다. 이러한 데이터는 본원에서 주장하는 신규한 프로모터 및 3'UTR이 식물에서 트랜스진의 높은 구성적 발현을 구동시키고, 이는 생명공학적 적용에 유용할 것이라는 것을 입증한다. 추가로, pDAB114410 프로모터가 하류 유전자에 대하여 증진된 영향을 미치며, 이는 결과적으로는 구축물 pDAB101556과 비교하였을 때, 잎, 속대, 수염, 커넬, 줄기, 껍질 및 화분에서 AAD-1 트랜스진을 유의적으로 상향조절시켰다는 것이 관찰되었다.
<표 1> T0 세대의 다양한 구축물 이벤트의 V4-V6 옥수수 잎에서의 cry34Ab1 및 AAD-1 트랜스진 발현을 보여주는 ELISA 결과.
Figure pct00001
<표 2> T0 세대의 다양한 구축물 이벤트의 V4-6 옥수수 뿌리에서의 cry34Ab1 및 AAD-1 트랜스진 발현을 보여주는 ELISA 검정 결과.
Figure pct00002
<표 3> T0 잎 (V4) 잎 샘플에서의 cry34Ab1 및 AAD-1 트랜스진 발현을 보여주는 ELISA 검정 결과.
Figure pct00003
<표 4> 다양한 구축물 이벤트의 T1 V4-6 옥수수 뿌리에서의 cry34Ab1 및 AAD-1 트랜스진 발현을 보여주는 ELISA 검정 결과.
Figure pct00004
<표 5> 다양한 구축물 이벤트의 T1 잎에서의 yfp 및 AAD-1 트랜스진 발현을 보여주는 ELISA 검정 결과.
Figure pct00005
이에 따라, 제아 메이스로부터 단리된 신규한 옥수수 조절 요소가 확인되고, 특징 규명되었다. 유전자 발현 구축물에서 사용하기 위한 서열 1의 제아 메이스 프로모터 및 5'-UTR 및 서열 2 및 서열 3의 3'-UTR 조절 요소를 최초로 개시한다.
본원에 인용된 공개 문헌, 특허 및 특허 출원을 비롯한 모든 참고문헌은 이들이 본 개시내용의 명시적 세부사항과 불일치하지 않는 정도까지 본원에서 참조로 포함되고, 각각의 참고문헌은 개별적으로 및 구체적으로 참조로 포함되는 것으로 명시되고, 그 전문이 본원에 기술된 것과 같은 정도로 포함된다. 본원에서 논의된 참고문헌은 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 이러한 개시내용을 앞서는 자격을 갖지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 하기 실시예는 특정의 특별한 특성 및/또는 실시양태를 예시하기 위해 제공된다. 실시예는 본 개시내용을 예시된 특정한 특성 또는 실시양태로 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
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cacacaccaa 600 cctcagcaca ccaaggagag tacgtggagg agcagcc 637 <210> 2 <211> 1000 <212> DNA <213> zea mays <400> 2 cacatataca tatctacctt gcagattgag atgaccgagg atacatgatg cactatggtt 60 agtttttgtt agatcgtgcg tgcgtgtgtg gcctaaatga atgcacgtag tgacgatggg 120 agtttttagt caatcattta tcaaatactc ctaggtccta cctagcaaat ctgcaaatgt 180 gttcgaatgc caaagggacg cgcatgaaac ggagaaattt ttcgtgcaga gcatcctcct 240 tctcgtagtg ttgcaaagtg agagtgcgat gattttatca tctcgaacaa agactttgcc 300 cctgagccct cttggtttcg gtttgtgccg ttggcctgtg tagctgcaaa attgtaactc 360 acgggccctg cgttattgct gttgctggtc ttcgtatata tcctctcccc tgtagtttcc 420 ctgaaaaaca ttgcaacggg acttaatatc tgttcaagtg ggatttcata ctatcgctga 480 agtgcgttct aactcatatg agcatatgaa catgacgtga gtccaagtta catatattga 540 aacactaatt agatggttca cgaaggtaga acttatttaa ataggatcaa acatatttta 600 aacttttata atgagcatct gaaagtccta agcggcttgc gagaatggtg acagtggatc 660 ctgcacgtgt cctcgtgact tccctcataa gcgtggagga cgacagaatg tagcgccacg 720 acgagtgcct gcatcgacat ttattcccta cccaatcaaa taactacaat cttgaaccga 780 acctaaccaa tcctaaatgt accaaattga aaacctatgt atctcaatca acgacctgac 840 aggtctactg cgctgacaac ttatagcccc gtctgcacgg accatcatct tgattgcgtc 900 gctggctgcc tacgcggatg tatcacgtgt gtacatatat acatgttcaa atgggctgga 960 tctcttagac agcatatggc cagcacggtt tagcctgatc 1000 <210> 3 <211> 1000 <212> DNA <213> zea mays <400> 3 gcccgccatt gctccgcccc gtccatcgac cggaacgtgt tcttggatta attaactacg 60 atctctatga gcctggggat ggatcaaccc gtcgtgcgtg gtctcgtttt gtgatgagtg 120 ggagagagag gatgacaaga tcgatccttt gttaatggag atctcgttaa ttaggagagc 180 taccgctggg acttggtggt ttgtaatata tgatccaacc agtgatgaat caatgcattc 240 acttgtgtac acatatacat atctaccttg cagattgaga tgaccgagga tacatgatgc 300 actatggtta gtttttgtta gatcgtgcgt gcgtgtgtgg cctaaatgaa tgcacgtagt 360 gacgatggga gtttttagtc aatcatttat caaatactcc taggtcctac ctagcaaatc 420 tgcaaatgtg ttcgaatgcc aaagggacgc gcatgaaacg gagaaatttt tcgtgcagag 480 catcctcctt ctcgtagtgt tgcaaagtga gagtgcgatg attttatcat ctcgaacaaa 540 gactttgccc ctgagccctc ttggtttcgg tttgtgccgt tggcctgtgt agctgcaaaa 600 ttgtaactca cgggccctgc gttattgctg ttgctggtct tcgtatatat cctctcccct 660 gtagtttccc tgaaaaacat tgcaacggga cttaatatct gttcaagtgg gatttcatac 720 tatcgctgaa gtgcgttcta actcatatga gcatatgaac atgacgtgag tccaagttac 780 atatattgaa acactaatta gatggttcac gaaggtagaa cttatttaaa taggatcaaa 840 catattttaa acttttataa tgagcatctg aaagtcctaa gcggcttgcg agaatggtga 900 cagtggatcc tgcacgtgtc ctcgtgactt ccctcataag cgtggaggac gacagaatgt 960 agcgccacga cgagtgcctg catcgacatt tattccctac 1000 <210> 4 <211> 2886 <212> DNA <213> zea mays <400> 4 ccggctttaa ttcgtaacga gcagtttata ccgttttgcg ctgcattcac cttcgtgagt 60 ccggaccccg gaagacagga actgtagcct ttttcccttt gctagcatga atatgaatag 120 aataacacga atttaacatc aattcagctc atattggaac aatctacgcc taaaatttag 180 tggaacacgt tttgctcatt ttccttgaaa agcaacagtg aagcaacatc ggtaaaggtt 240 cttttggttg cctctaacgg tctaacctga ggattcagtt ataatctgga acatgacaga 300 aacagagcct cgcacccgtt ttgggaccaa aaccacatga tcgatctcca agaagattat 360 tttggacaat atttttccag ccacaggcaa tccgaagacc acaaatcaga ggcactccaa 420 atgcagccca tccattggac catacagata agacccggat aaggcagagc ccatcgtgac 480 cgtcaaatag atcacgtccg gtctacggcc gtccgatctg ccacccagag atagcaccgg 540 gatttcctat aagcactttt cctatttgta gcccgtgacg agcccagcgc cacacaccaa 600 cctcagcaca ccaaggagag tacgtggagg agcagccatg gcttcatcgg tggccgccgc 660 ggcgagcaca ttcctgggca cccgcctggc ggacccggcg ccacagaacg ggcgcatcgt 720 ggcccggttc gggttcgggt tgggcggcaa ggcgaagcct gctccgaaga aggtggcgaa 780 gacatcgacc tcctctgacc ggccgctgtg gttccccggc gccgtggcgc ccgactacct 840 ggacggctcg ctggtcggcg actacgggtt cgacccgttc ggtctcggga agcccgtgga 900 gtacctgcag ttcgagttgg actcgctgga ccagaacctg gccaagaatg aggccggcgg 960 catcatcggc acccggttcg agtcctccga agtcaagtcc accccgttgc agccctacag 1020 cgaggtgttc ggcctccagc ggttccgcga gtgcgagctc atccacggcc gctgggccat 1080 gctcgccacc ctcggcgccc tctccgtcga gtggctcacc ggcgtcacct ggcaggacgc 1140 cggcaaggta cgtgaatagc tagctattaa gctatgcatg catgaatcca tggagttcgt 1200 tctcgatctg ctctcagacg atctaaccaa cctgcgaatt aatgtgacgg ccggcgtaca 1260 cgtacgtgca ggtggagctg gtggacgggt cctcctacct gggccagccg ctgccgttct 1320 ccatctcgac gctcatctgg atcgaggtgc tcgtgatcgg ctacatcgag ttccagcgca 1380 acgccgagct cgacccggag aagaggctgt accccggcgg ctcctacttc gacccgctcg 1440 gcctggcggc cgaccctgag aagaaggagc ggctgcagct ggcggagatc aagcacgcgc 1500 gcctcgccat ggtcgccttc ctcggcttcg ccgtgcaggc cgccgccacc ggcaaggggc 1560 cgctcaacaa ctgggccacc cacctgagcg acccgctcca cactaccatc ttcgacacgt 1620 tcggagggtc ctcttaagcc cgccattgct ccgccccgtc catcgaccgg aacgtgttct 1680 tggattaatt aactacgatc tctatgagcc tggggatgga tcaacccgtc gtgcgtggtc 1740 tcgttttgtg atgagtggga gagagaggat gacaagatcg atcctttgtt aatggagatc 1800 tcgttaatta ggagagctac cgctgggact tggtggtttg taatatatga tccaaccagt 1860 gatgaatcaa tgcattcact tgtgtacaca tatacatatc taccttgcag attgagatga 1920 ccgaggatac atgatgcact atggttagtt tttgttagat cgtgcgtgcg tgtgtggcct 1980 aaatgaatgc acgtagtgac gatgggagtt tttagtcaat catttatcaa atactcctag 2040 gtcctaccta gcaaatctgc aaatgtgttc gaatgccaaa gggacgcgca tgaaacggag 2100 aaatttttcg tgcagagcat cctccttctc gtagtgttgc aaagtgagag tgcgatgatt 2160 ttatcatctc gaacaaagac tttgcccctg agccctcttg gtttcggttt gtgccgttgg 2220 cctgtgtagc tgcaaaattg taactcacgg gccctgcgtt attgctgttg ctggtcttcg 2280 tatatatcct ctcccctgta gtttccctga aaaacattgc aacgggactt aatatctgtt 2340 caagtgggat ttcatactat cgctgaagtg cgttctaact catatgagca tatgaacatg 2400 acgtgagtcc aagttacata tattgaaaca ctaattagat ggttcacgaa ggtagaactt 2460 atttaaatag gatcaaacat attttaaact tttataatga gcatctgaaa gtcctaagcg 2520 gcttgcgaga atggtgacag tggatcctgc acgtgtcctc gtgacttccc tcataagcgt 2580 ggaggacgac agaatgtagc gccacgacga gtgcctgcat cgacatttat tccctaccca 2640 atcaaataac tacaatcttg aaccgaacct aaccaatcct aaatgtacca aattgaaaac 2700 ctatgtatct caatcaacga cctgacaggt ctactgcgct gacaacttat agccccgtct 2760 gcacggacca tcatcttgat tgcgtcgctg gctgcctacg cggatgtatc acgtgtgtac 2820 atatatacat gttcaaatgg gctggatctc ttagacagca tatggccagc acggtttagc 2880 ctgatc 2886 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward Primer: TQ.8v6.1.F <400> 5 gccataccct ccagttg 17 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse Primer: TQ.8v6.1.R <400> 6 gccgttgatg gagtagtaga tgg 23 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Probe: TQ.8v6.1.MGB.P <400> 7 ccgaatccaa cggcttca 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Forward Primer: InvertaseF <400> 8 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Reverse Primer: InvertaseR <400> 9 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> InvertaseProbe <400> 10 cgagcagacc gccgtgtact t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> AAD1 Forward Primer <400> 11 tgttcggttc cctctaccaa 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> AAD1 Reverse Primer <400> 12 caacatccat caccttgact ga 22 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> AAD1 Probe <400> 13 cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PhiYFP v3 Forward Primer <400> 14 cgtgttggga aagaacttgg a 21 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PhiYFP v3 Reverse Primer <400> 15 ccgtggttgg cttggtct 18 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PhiYFP v3 Probe <400> 16 cactccccac tgcct 15 <210> 17 <211> 1000 <212> DNA <213> Zea mays <400> 17 atggcttcat cggtggccgc cgcggcgagc acattcctgg gcacccgcct ggcggacccg 60 gcgccacaga acgggcgcat cgtggcccgg ttcgggttcg ggttgggcgg caaggcgaag 120 cctgctccga agaaggtggc gaagacatcg acctcctctg accggccgct gtggttcccc 180 ggcgccgtgg cgcccgacta cctggacggc tcgctggtcg gcgactacgg gttcgacccg 240 ttcggtctcg ggaagcccgt ggagtacctg cagttcgagt tggactcgct ggaccagaac 300 ctggccaaga atgaggccgg cggcatcatc ggcacccggt tcgagtcctc cgaagtcaag 360 tccaccccgt tgcagcccta cagcgaggtg ttcggcctcc agcggttccg cgagtgcgag 420 ctcatccacg gccgctgggc catgctcgcc accctcggcg ccctctccgt cgagtggctc 480 accggcgtca cctggcagga cgccggcaag gtacgtgaat agctagctat taagctatgc 540 atgcatgaat ccatggagtt cgttctcgat ctgctctcag acgatctaac caacctgcga 600 attaatgtga cggccggcgt acacgtacgt gcaggtggag ctggtggacg ggtcctccta 660 cctgggccag ccgctgccgt tctccatctc gacgctcatc tggatcgagg tgctcgtgat 720 cggctacatc gagttccagc gcaacgccga gctcgacccg gagaagaggc tgtaccccgg 780 cggctcctac ttcgacccgc tcggcctggc ggccgaccct gagaagaagg agcggctgca 840 gctggcggag atcaagcacg cgcgcctcgc catggtcgcc ttcctcggct tcgccgtgca 900 ggccgccgcc accggcaagg ggccgctcaa caactgggcc acccacctga gcgacccgct 960 ccacactacc atcttcgaca cgttcggagg gtcctcttaa 1000

Claims (21)

  1. i) 폴리링커 서열;
    ii) 비-클로로필 a/b 트랜스진 또는
    iii) i) 및 ii)의 조합
    에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 여기서 상기 프로모터는 서열 1, 또는 서열 1과 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 핵산 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로모터 길이가 700 bp 미만인 핵산 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로모터가 서열 1, 또는 서열 1과 90%의 서열 동일성을 갖는 서열로 이루어진 것인 핵산 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 선별가능한 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 핵산 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프로모터가 트랜스진 또는 소형 RNA에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 트랜스진이 선별가능한 마커, 또는 살곤충제 저항성, 제초제 내성, 질소 사용 효율, 물 사용 효율, 또는 영양 품질을 부여하는 유전자 산물을 코딩하는 것인 핵산 벡터.
  7. 제1항 내지 제3항, 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 2, 또는 서열 2와 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 3' 비번역 서열을 추가로 포함하며, 여기서 3' 비번역 서열은 상기 폴리링커, 상기 트랜스진 또는 상기 소형 RNA에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 벡터.
  8. 제1항 내지 제3항, 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 3, 또는 서열 3과 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 3' 비번역 서열을 추가로 포함하며, 여기서 3' 비번역 서열은 상기 폴리링커, 상기 트랜스진 또는 상기 소형 RNA에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 벡터.
  9. 제1항 내지 제3항, 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 비번역 서열 또는 인트론 서열을 추가로 포함하는 핵산 벡터.
  10. 트랜스진 또는 소형 RNA에 작동가능하게 연결된, 서열 1, 또는 서열 1과 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 식물.
  11. 제10항에 있어서, 제아 메이스(Zea mays), 밀, 벼, 수수, 귀리, 호밀, 바나나, 사탕수수, 대두, 목화, 해바라기, 아라비돕시스(Arabidopsis), 담배, 및 카놀라로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물.
  12. 제10항에 있어서, 제아 메이스인 식물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진이 상기 식물의 게놈 내로 삽입된 것인 식물.
  14. 제10항에 있어서, 서열 2, 또는 서열 2와 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 3' 비번역 서열을 추가로 포함하며, 여기서 3' 비번역 서열은 상기 트랜스진 또는 상기 소형 RNA에 작동가능하게 연결된 것인 식물.
  15. 제10항에 있어서, 서열 3, 또는 서열 3과 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 3' 비번역 서열을 추가로 포함하며, 여기서 3' 비번역 서열은 상기 트랜스진 또는 상기 소형 RNA에 작동가능하게 연결된 것인 식물.
  16. i) 폴리링커 서열;
    ii) 비-클로로필 a/b 트랜스진 또는
    iii) i) 및 ii)의 조합
    에 작동가능하게 연결된 전사 종결인자를 포함하며, 여기서 상기 전사 종결인자는 서열 2, 또는 서열 2와 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 핵산 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 상기 전사 종결인자 길이가 1.1 kb 미만인 핵산 벡터.
  18. 제16항에 있어서, 상기 전사 종결인자가 서열 2의 3'UTR 서열로 이루어진 것인 핵산 벡터.
  19. i) 폴리링커 서열;
    ii) 비-클로로필 a/b 트랜스진 또는
    iii) i) 및 ii)의 조합
    에 작동가능하게 연결된 전사 종결인자를 포함하며, 여기서 상기 전사 종결인자는 서열 3, 또는 서열 3과 90%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 핵산 벡터.
  20. 제19항에 있어서, 상기 전사 종결인자 길이가 1.1 kb 미만인 핵산 벡터.
  21. 제19항에 있어서, 상기 전사 종결인자가 서열 3의 3'UTR 서열로 이루어진 것인 핵산 벡터.
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