KR20160111450A - 제아 메이스 조절 요소 및 그의 용도 - Google Patents

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만주 굽타
새라 베넷
나빈 엘랑고
카틱 엔 무투라만
제프리 베링거
후이시아 우
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

제아 메이스 (Zea mays) 클로로필 a/b 결합 유전자 조절 요소를 이용하여 식물 세포 및/또는 식물 조직 내에서 트랜스진 (transgene)을 발현하기 위한 구축물 및 방법을 제공한다.

Description

제아 메이스 조절 요소 및 그의 용도{ZEA MAYS REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF}
우선권 주장
본원은 본원은 2014년 1월 23일 출원된 미국 특허 가출원 61/930,738 (명칭: "ZEA MAYS REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF")의 출원일의 이익을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 식물 분자 생물학 분야, 보다 구체적으로 식물에서 트랜스진 (transgene)의 발현 분야에 관한 것이다.
많은 식물 종은 작물학상 바람직한 형질 또는 특징을 도입하기 위해 트랜스진으로 형질전환될 수 있다. 식물 종은 바람직한 특정 형질을 갖도록 개발 및/또는 변형된다. 일반적으로, 바람직한 형질은 예를 들어 영양적으로 가치있는 품질의 개선, 생산량 증가, 해충 또는 질병 저항성 부여, 가뭄 및 스트레스 내성 증가, 원예 품질 (예를 들어, 착색 및 성장) 개선, 제초제 내성 부여, 식물로부터 산업상 유용한 화합물 및/또는 물질의 생산 가능, 및/또는 제약물질의 생산 가능을 포함한다.
단일 게놈 유전자좌에 집적(stacking)된 다중 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 (transgenic) 식물 종은 식물 형질전환 기술을 통해 생산된다. 식물 형질전환 기술은 트랜스진의 식물 세포 내로의 도입, 트랜스진의 안정적으로 통합된 카피를 식물 게놈 내에 포함하는 수정 능력이 있는 트랜스제닉 식물의 회복을 유도하고, 식물 게놈의 전사 및 번역을 통한 후속적인 트랜스진 발현은 바람직한 형질 및 표현형을 갖는 트랜스제닉 식물을 생성한다. 그러나, 형질 집적으로서 조작된 다중 트랜스진을 고도로 발현하는 트랜스제닉 식물 종의 생산을 허용하는 메카니즘이 바람직하다.
이와 유사하게, 식물의 특정 조직 또는 기관 내의 트랜스진의 발현을 허용하는 메카니즘이 바람직하다. 예를 들어, 토양-매개성 병원체의 감염에 대한 식물의 저항성 증가는 병원체-저항성 단백질이 식물의 뿌리에서 크게 발현되도록 병원체-저항성 유전자로 식물 게놈을 형질전환함으로써 달성될 수 있다. 별법으로, 특정 성장 또는 발생 단계, 예컨대, 예를 들어, 세포 분열 또는 신장 중인 식물 조직에서 트랜스진을 발현하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 식물의 잎 및 줄기 조직에서 트랜스진을 발현하는 것이 바람직할 수 있다.
제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소가 본원에서 설명된다. 또한, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소를 이용하는 구축물 및 방법이 설명된다.
발명의 개요
식물 세포 및/또는 식물 조직에서 트랜스진을 발현하기 위한 서열, 구축물, 및 방법이 본원에서 개시된다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트에 관한 것이고, 여기서 프로모터는 엄격한 조건 하에 서열식별번호 (SEQ ID NO): 2의 상보체에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 인트론은 서열식별번호: 5에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 프로모터는 서열식별번호: 1에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 트랜스진은 폴리펩티드 또는 작은 RNA를 포함한다. 후속 실시양태에서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 및 선택가능 마커 트랜스진로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 3'-비번역 영역을 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 3'-비번역 영역은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 5'-비번역 영역을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 5'-비번역 영역은 서열식별번호: 19에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 벡터는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 실시양태의 추가의 측면에서, 재조합 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스, 및 박테리오파지로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 실시양태의 후속 측면에서, 세포는 트랜스제닉 식물 세포이다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 식물 세포를 포함한다. 실시양태의 추가의 측면에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이다. 실시양태의 다른 측면에서, 단자엽 식물은 옥수수 식물, 벼 식물, 및 밀 식물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 트랜스제닉 식물로부터 얻는다. 후속 실시양태에서, 프로모터는 조직-선호 (tissue-preferred) 프로모터이다. 추가의 실시양태에서, 조직-선호 프로모터는 잎, 껍질, 줄기, 또는 수염 (silk) 조직-선호 프로모터이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 1-1,887의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 2의 상보체에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화하는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 세포에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 인트론은 서열식별번호: 5에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 식물 세포이다. 후속 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포는 식물 형질전환 방법에 의해 생산된다. 추가의 실시양태에서, 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 바이올리스틱 (biolistic) 형질전환 방법, 탄화규소 형질전환 방법, 원형질체 형질전환 방법, 및 리포솜 형질전환 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 식물 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이다. 다른 실시양태에서, 단자엽 식물은 옥수수 식물, 벼 식물, 및 밀 식물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 트랜스제닉 식물로부터 얻는다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 조직-선호 프로모터이다. 후속 실시양태에서, 조직-선호 프로모터는 잎, 껍질, 줄기, 또는 수염 조직-선호 프로모터이다. 또 다른 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 1-1,887의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 2의 상보체에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 정제된 폴리뉴클레오티드 프로모터에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 정제된 폴리뉴클레오티드 프로모터는 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 정제된 폴리뉴클레오티드 프로모터는 인트론을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 인트론은 서열식별번호: 5에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 정제된 폴리뉴클레오티드 프로모터는 서열식별번호: 1에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 정제된 폴리뉴클레오티드는 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 후속 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 트랜스진은 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 작은 RNA이다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 3'-비번역 영역에 작동가능하게 연결된 트랜스진에 작동가능하게 연결된 정제된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 3'-비번역 영역은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 정제된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 정제된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 19의 5'-비번역 영역이다. 또 다른 실시양태에서, 5'-비번역 영역은 서열식별번호: 19에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 및 선택가능 마커 트랜스진으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 재조합 벡터는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 및 BAC 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 후속 실시양태에서 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 식물 세포이다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 식물 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 식물이다. 추가의 실시양태에서, 단자엽 식물은 옥수수 식물, 밀 식물, 및 벼 식물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 트랜스제닉 식물로부터 얻는다. 후속 실시양태에서, 정제된 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스진의 조직-선호 발현을 촉진한다. 추가의 실시양태에서, 정제된 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스진의 잎, 껍질, 줄기, 또는 수염 조직-선호 발현을 촉진한다. 다른 실시양태에서, 정제된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 1-1,887의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 식물에서 이종성 코딩 서열을 발현시키는 방법에 관한 것이고, 이 방법은
a) 3'-비번역 영역에 작동가능하게 연결된 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트로 식물 세포를 형질전환시키고;
b) 유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 단리하고;
c) 형질전환된 식물 세포를 트랜스제닉 식물로 재생하고;
d) 트랜스제닉 식물은 서열식별번호: 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물을 얻는 것
을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인트론은 서열식별번호: 5에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 이종성 코딩 서열은 살곤충제 저항성 코딩 서열, 제초제 내성 코딩 서열, 질소 사용 효율 코딩 서열, 물 사용 효율 코딩 서열, 영양 품질 코딩 서열, DNA 결합 코딩 서열, 및 선택가능 마커 코딩 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 식물 세포의 형질전환은 식물 형질전환 방법을 이용한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움-매개 형질전환 방법, 바이올리스틱 형질전환 방법, 탄화규소 형질전환 방법, 원형질체 형질전환 방법, 및 리포솜 형질전환 방법으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 트랜스제닉 식물 또는 쌍자엽 트랜스제닉 식물이다. 추가의 실시양태에서, 단자엽 트랜스제닉 식물은 옥수수 식물, 밀 식물, 및 벼 식물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 트랜스제닉 식물로부터 얻는다. 추가의 실시양태에서, 이종성 코딩 서열은 조직에서 우선적으로 발현된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 이종성 코딩 서열은 잎, 껍질, 줄기, 또는 수염 조직에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 1-1,887의 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은
a) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하고;
b) 다수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 생산하고, 여기서 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열은 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하고;
c) DNA 샘플로부터의 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 다수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열로 증폭하고;
d) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하는 것
을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인트론은 서열식별번호: 5에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 추가의 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 트랜스진은 폴리펩티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 트랜스진은 3'-비번역 영역에 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 3'-비번역 영역은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 코딩 서열, 제초제 내성 코딩 서열, 질소 사용 효율 코딩 서열, 물 사용 효율 코딩 서열, 영양 품질 코딩 서열, DNA 결합 코딩 서열, 및 선택가능 마커 코딩 서열로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 재조합 벡터는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 및 BAC 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 식물 세포이다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 식물 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이다. 추가의 실시양태에서, 단자엽 식물은 옥수수 식물, 밀 식물, 및 벼 식물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 트랜스제닉 식물로부터 얻는다. 다른 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 1-1,887의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드 서열의 제조 방법에 관한 것이고, 이 방법은
a) 서열식별번호: 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하고;
b) 서열식별번호: 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하고;
c) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 다수의 폴리뉴클레오티드 서열을 규정하고;
d) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하고;
e) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하는 것
을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 합성은
a) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하고;
b) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 다수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 생산하고;
c) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해 다수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 라이게이팅하는 것
을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 합성된 폴리뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함한다. 다른 실시양태에서, 인트론은 서열식별번호: 5에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 합성된 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 합성된 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 작동가능하게 연결된 트랜스진은 폴리펩티드를 코딩한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 3'-비번역 영역에 작동가능하게 연결된 트랜스진에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 합성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 3'-비번역 영역은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 및 선택가능 마커 트랜스진으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 재조합 벡터는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 및 BAC 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 식물 세포이다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 식물 세포를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 식물이다. 다른 실시양태에서, 단자엽 식물은 옥수수 식물, 밀 식물, 및 벼 식물로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 종자는 트랜스제닉 식물로부터 얻는다. 다른 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 1-1,887의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 구축물은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진 또는 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 19의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 19의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 19의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진 또는 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과의 트랜스진을 포함한다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 독립적으로 a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, b) 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론, c) 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR 및 d) 서열식별번호: 19의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함한다.
서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터; 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6의 인트론; 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 3'-UTR; 및 서열식별번호: 19의 5'-UTR을 사용하여 트랜스진을 발현하는 식물의 재배 방법이 본원에서 개시된다. 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터; 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6의 인트론; 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 3'-UTR; 및 서열식별번호: 19의 5'-UTR을 사용하여 트랜스진을 발현하는 식물 조직 및 세포의 배양 방법이 또한 본원에서 개시된다. 한 실시양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 식물 잎 및 줄기에서 조직-특이적 유전자 발현을 포함한다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자로부터 얻은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4의 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
도 1은 차세대 서열결정법 (Next Generation Sequencing; NGS)을 사용한 전사 프로파일링 방법을 사용하여 옥수수에서 고발현 유전자를 확인하는 방법을 보여주는 개략적 흐름도이다.
도 2는 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 3)와 비교한 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 1)의 정렬을 보여주고, 상기 정렬은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 서열을 생산하기 위해 제거된 반복된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
도 3은 cry34Ab1 리포터 유전자의 발현을 제어하는 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소 ("ZmCAB 프로모터"로 표시됨)를 포함하는 유전자 발현 카세트를 보여주는 pDAB114438의 벡터 플라스미드 지도를 보여준다.
도 4는 관심 유전자로서, 시험 프로모터 구축물 pDAB114438에 존재하는 cry34Ab1 리포터 유전자 대신에 yfp 리포터 유전자를 포함하는 pDAB101556 제어 벡터의 지도를 보여준다. yfp 유전자 발현은 제아 메이스 유비퀴틴-1 (ZmUbi1) 프로모터에 의해 유도되고, 제아 메이스 Per5 (ZmPer5) 3'-UTR에 의해 종결되었다.
도 5는 ZmUbi1 프로모터에 의해 유도되고 솔라눔 투페로숨(Solanum tuberosum) PinII (StPinII) 3'-UTR에 의해 종결되는 cry34Ab1 리포터 유전자를 포함하는 양성 대조군 벡터인 pDAB 108746의 지도를 보여준다.
도 6은 cry34Ab1 리포터 유전자의 발현을 제어하는 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소를 포함하는 유전자 발현 카세트를 제시하는 pDAB120165의 벡터 플라스미드 지도이다.
도 7은 cry34Ab1 리포터 유전자의 발현을 제어하는 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 ("ZmCAB 프로모터"로 표시됨) 및 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3' UTR (서열식별번호: 8) 조절 요소를 포함하는 유전자 발현 카세트를 제시하는 pDAB120166의 벡터 플라스미드 지도를 보여준다.
발명의 실시 방식
정의
본원에서 사용되는 바와 같이, 관사 ("a", "an", 및 "the")는 문맥상 분명하고 모호하지 않게 단수를 나타내지 않는 한, 복수 대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "역교배"는 육종인이 교잡종 자손체를 교배친 중의 하나, 예를 들어, F1 교잡종의 모 유전자형 중의 하나를 갖는 제1 세대 교잡종 F1에 다시 교배시키는 과정을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인트론"은 전사되지만 번역되지 않는 유전자 (또는 발현되는 관심 뉴클레오티드 서열)에 포함되는 임의의 핵산 서열을 의미한다. 인트론은 DNA의 발현되는 서열 내의 비번역 핵산 서열, 및 이로부터 전사되는 RNA 분자 내의 대응하는 서열을 포함한다.
본원에서 설명되는 구축물은 또한 번역 및/또는 mRNA 안정성을 향상시키는 서열, 예컨대 인트론을 포함할 수 있다. 상기 인트론의 한 예는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 히스톤 변이체의 유전자 II의 제1 인트론 또는 임의의 다른 통상적으로 알려진 인트론 서열이다. 인트론은 번역 및/또는 mRNA 안정성을 향상시키기 위해 프로모터 서열과 조합하여 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "5' 비번역 영역" 또는 "5'-UTR"은 프리-mRNA 또는 성숙 mRNA의 5' 말단 내의 비번역 절편을 의미한다. 예를 들어, 성숙 mRNA 상에서, 5'-UTR은 일반적으로 그의 5' 말단부 상에 7-메틸구아노신 캡 (cap)을 보유하고, 많은 과정, 예컨대 스플라이싱, 폴리아데닐화, 세포질을 향한 mRNA의 외수송, 번역 기구에 의한 mRNA의 5' 말단부의 확인, 및 분해에 대한 mRNA의 보호에 관여한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "3' 비번역 영역" 또는 "3'-UTR"은 프리-mRNA 또는 성숙 mRNA의 3' 말단 내의 비번역 절편을 의미한다. 예를 들어, 성숙 mRNA 상에서 상기 영역은 폴리-(A) 테일 (tail)을 보유하고, mRNA 안정성, 번역 개시, 및 mRNA 외수송에서 많은 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리아데닐화 신호"는 폴리-(A) 폴리머라제의 존재 하에 전사체가 폴리아데닐화 부위, 예를 들어 폴리-(A) 신호의 10 내지 30개 염기 하류에서 폴리아데닐화되는 것을 허용하는 mRNA 전사체 내에 존재하는 핵산 서열을 의미한다. 많은 폴리아데닐화 신호는 관련 기술 분야에 알려져 있고, 본 발명에 유용하다. 예시적인 서열은 문헌 [Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468]에 기재된 바와 같은 AAUAAA 및 그의 변이체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된"은 해당 성분이 천연적으로 생성되는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA)으로부터 분리된 생물학적 성분 (핵산 또는 단백질 포함)을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 분자와 관련하여 용어 "정제된"은 절대적인 순도 (예컨대 균질한 제제)를 필요로 하지 않고; 대신에, 이 용어는 서열이 그의 천연 세포 환경에서보다 상대적으로 더 높은 순도를 갖는다는 것을 나타낸다 (상기 수준은 예를 들어 농도 또는 유전자 발현 수준의 측면에서 천연 수준에 비해 적어도 2-5배 더 커야 한다). DNA 분자는 총 DNA 또는 총 RNA로부터 직접 얻을 수 있다. 또한, cDNA 클론은 천연적으로 생성되지 않지만, 바람직하게는 부분적으로 정제된 천연 생성 물질 (메신저 RNA)의 조작을 통해 얻는다. mRNA로부터 cDNA 라이브러리의 구축은 합성 물질 (cDNA)의 생성을 수반한다. 개별적인 cDNA 클론은 cDNA 라이브러리를 보유하는 세포의 클론 선택 (clonal selection)에 의해 합성 라이브러리로부터 정제할 수 있다. 따라서, mRNA로부터 cDNA 라이브러리의 구축 및 별개의 cDNA 클론의 정제를 포함하는 과정은 천연 메시지의 약 106배 정제를 유도한다. 이와 유사하게, 프로모터 DNA 서열은 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 상기 클론은 천연적으로 생성되지 않지만, 바람직하게는 부분적으로 정제된 천연 생성 물질, 예컨대 게놈 DNA 라이브러리의 조작을 통해 얻는다. 따라서, 적어도 10배, 일부 실시양태에서 102 또는 103배, 다른 실시양태에서, 104 또는 105배 또는 그 초과의 정제가 상기 기술에서 유리하다.
유사하게, 정제는 성분 DNA 서열의 화학적 또는 기능적 변화가 발생하였음을 나타낸다. "정제된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 용어 "정제된"은 또한 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포)에서 재조합 DNA 방법에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 및 화학적으로-합성된 핵산 분자, 단백질, 및 펩티드를 포함한다.
용어 "재조합"은 유전자 재조합이 발생한 세포 또는 유기체를 의미한다. 이것은 또한 인간 개입에 의해 인공적으로 또는 합성에 의해 (즉, 비-천연적으로) 변경된 분자 (예를 들어, 벡터, 플라스미드, 핵산, 폴리펩티드, 또는 작은 RNA)를 포함한다. 변경은 그의 천연 환경 또는 상태 내에서 분자에 대해 수행되거나 또는 그로부터 제거될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA (작은 RNA 분자 포함)로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA ("전사체"로도 언급됨)가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 유전자 발현은 외부 신호, 예를 들어 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 대한 세포, 조직, 또는 유기체의 노출에 의해 영향받을 수 있다. 유전자의 발현은 또한 DNA에서 RNA로, 다시 단백질로 이어지는 경로의 임의의 지점에서 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 예를 들어 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, 중간 분자, 예컨대 mRNA의 분해에 대한 제어를 통해, 또는 특정 단백질 분자의 생산 후 활성화, 불활성화, 구획화, 또는 분해를 통해 또는 이들의 조합에 의해 이루어진다. 유전자 발현은 비제한적으로 노던 블롯 (Northern blot), RT-PCR, 웨스턴 블롯 (Western blot), 또는 시험관내, 계내 (in situ), 또는 생체내 단백질 활성 검정(들)을 포함하는 관련 기술 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동성-기반 유전자 침묵화 (Homology-Based Gene Silencing)" 또는 "HBGS"는 전사 유전자 침묵화 및 전사 후 유전자 침묵화 둘 모두를 포함하는 일반 용어이다. 연결되지 않은 침묵화 유전자좌에 의한 표적 유전자좌의 침묵화는 각각 프로모터 또는 전사된 서열에 상응하는 이중-가닥 RNA (dsRNA)의 제조에 의한 전사 억제 (전사 유전자 침묵화; TGS) 또는 mRNA 분해 (전사 후 유전자 침묵화; PTGS)로부터 야기될 수 있다. 각각의 과정에서 별개의 세포 성분이 관여한다는 것은 dsRNA-유도 TGS 및 PTGS가 고전적인 통상의 메카니즘의 다양화로부터 야기되었을 가능성이 있음을 시사한다. 그러나, TGS 및 PTGS 비교는 일반적으로 별개의 침묵화 유전자좌의 분석에 의존하기 때문에, 그를 엄격하게 비교하는 것은 달성하기가 어려웠다. 단일 트랜스진 유전자좌는 상이한 표적 유전자의 프로모터 및 전사된 서열에 상응하는 dsRNA의 제조에 의해 TGS 및 PTGS 둘 모두를 촉발하는 것으로 설명될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산 분자", "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" (3가지 용어는 모두 서로 동의어이다)는 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 형태, 및 그의 혼합된 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 모두를 포함할 수 있는 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. "뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 하나의 종류의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 핵산 분자는 보통 달리 명시되지 않는 한, 길이가 10개 이상의 염기이다. 상기 용어는 불확정한 길이의 RNA 또는 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 상기 용어는 DNA의 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 핵산 분자는 천연 생성 및/또는 비-천연 생성 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 천연 생성 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다.
핵산 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-자연적 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 표지, 메틸화, 천연 생성 뉴클레오티드 중 하나 이상의 유사체에 의한 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비하전된 연결: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 연결: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 매달린 모이어티 (pendent moiety): 예를 들어, 펩티드; 삽입제: 예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형된 연결: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일-가닥, 이중 가닥, 부분 이중체형, 삼중체형, 헤어핀형, 고리형, 및 잠금형 (padlocked) 입체형태를 비롯한 임의의 위상 입체형태를 포함한다.
전사는 DNA 가닥을 따라 5'에서 3'으로의 방식으로 진행된다. 이는 (피로포스페이트의 필수적인 제거와 함께) RNA가 성장하는 사슬의 3' 말단에 대한 리보뉴클레오티드-5'-트리포스페이트의 순차적 부가에 의해 제조된다는 것을 의미한다. 선형 또는 고리형 핵산 분자에서, 별개의 요소 (예컨대, 특정 뉴클레오티드 서열)가 추가의 요소로부터 5' 방향에서 동일한 핵산에 결합되거나 결합될 경우에, 별개의 요소는 추가의 요소에 대해 "상류"인 것으로 지칭될 수 있다. 이와 유사하게, 별개의 요소가 추가의 요소로부터 3' 방향에서 동일한 핵산에 결합되거나 결합될 경우에, 별개의 요소는 추가의 요소에 대해 "하류"일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "염기 위치"는 지정된 핵산 내의 제시된 염기 또는 뉴클레오티드 잔기의 위치를 지칭한다. 지정된 핵산은 참조 핵산과의 정렬에 의해 규정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "혼성화"는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체가 상보성 염기 사이에 왓슨-크릭 (Watson-Crick), 훅스틴 (Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합을 비롯한 수소 결합에 의해 혼성화하는 과정을 지칭한다. 일반적으로, 핵산 분자는 피리미딘 (시토신 (C), 우라실 (U), 및 티민 (T)) 또는 퓨린 (아데닌 (A) 및 구아닌 (G))인 질소 염기로 이루어진다. 이들 질소 염기는 피리미딘과 퓨린 사이에서 수소 결합을 형성하고, 퓨린에 대한 피리민딘의 결합은 "염기쌍 형성"으로 지칭된다. 더욱 구체적으로, A는 T 또는 U에 수소 결합할 것이고, G는 C에 결합할 것이다. "상보성"은 별개의 두 핵산 서열 사이 또는 동일한 핵산 서열의 별개의 두 영역 사이에서 발생하는 염기쌍 형성을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어, "특이적으로 혼성화할 수 있는" 및 "특이적으로 상보성인"은 폴리뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA 표적 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 하는 데 충분한 정도의 상보성을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드는 특이적인 혼성화를 위해 그의 표적 서열에 대해 100% 상보성일 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드의 표적 DNA 또는 RNA 분자에 대한 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 방해하고, 특이적 결합이 요구되는 조건 하에서, 예를 들어, 생체내 검정 또는 시스템의 경우에 생리학적 조건 하에서 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드의 비-표적 서열에 대한 비-특이적 결합을 방지하는 데 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에, 올리고뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화할 수 있다. 이러한 결합은 특이적 혼성화로서 지칭된다. 특정한 정도의 엄격도를 생성하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 세척 시간도 또한 엄격도에 영향을 미치지만, 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg2 + 농도)가 혼성화의 엄격도에 기여할 것이다. 특정 정도의 엄격도를 달성하기 위해 필요한 혼성화 조건에 관한 고려 사항은 문헌 [Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 논의되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 DNA 표적 사이에 50% 미만의 미스매치가 존재하는 경우에만 혼성화가 발생하는 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 추가의 특정한 수준의 엄격도를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "중등도 엄격도" 조건은 50% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자는 혼성화되지 않는 조건이고; "높은 엄격도"의 조건은 20% 초과의 미스매치를 갖는 서열은 혼성화되지 않는 조건이고; "매우 높은 엄격도"의 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열은 혼성화되지 않는 조건이다.
특정 실시양태에서, 엄격한 조건은 65℃에서의 혼성화에 이어서, 65℃에서 40분 동안 0.1x SSC/0.1% SDS에 의한 세척을 포함할 수 있다. 다음은 대표적인 비-제한적 혼성화 조건이다:
· 매우 높은 엄격도: 65℃에서 16시간 동안 5x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 실온에서 15분 동안 2x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 65℃에서 20분 동안 0.5x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
· 높은 엄격도: 65-70℃에서 16-20시간 동안 5-6 x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 실온에서 5-20분 동안 2 x SSC 완충제 중에서의 2회 세척; 및 각각 55-70℃에서 30분 동안 1x SSC 완충제 중에서의 2회 세척.
· 중등도 엄격도: 실온 내지 55℃에서 16-20시간 동안 6x SSC 완충제 중에서의 혼성화; 각각 실온 내지 55℃에서 20-30분 동안 2x-3x SSC 완충제 중에서의 2회 이상의 세척.
한 실시양태에서, 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 매우 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 중등도의 엄격도 혼성화 조건 하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 짧은 핵산 중합체를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 보다 긴 핵산 절편의 절단에 의해, 또는 개별 뉴클레오티드 전구체의 중합에 의해 형성될 수 있다. 자동 합성기를 통해 최대 수백 개의 염기쌍 길이의 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 상보성 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있기 때문에, DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA (올리고데옥시리보뉴클레오티드)로 이루어진 올리고뉴클레오티드는 작은 DNA 서열의 증폭을 위한 기술인 PCR에서 사용될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응에서, 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 "프라이머"로서 지칭되며, 이는 DNA 폴리머라제가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고, 상보성 가닥을 허용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 미국 특허 4,683,195에 기술된 바와 같이, 극소량의 핵산, RNA 및/또는 DNA를 증폭시키는 절차 또는 기술을 의미한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있도록 관심 영역의 단부 또는 그 너머로부터의 서열 정보가 이용가능하여야 하고; 이들 프라이머는 증폭시키고자 하는 주형의 반대쪽 가닥과 서열이 동일하거나 유사할 것이다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭되는 물질의 단부와 일치할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 전체 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 및 전체 세포 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌 [Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987)]; [Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)]를 참조할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머"는 조건이 프라이머 연장 생성물의 합성을 위해 적합한 경우에 상보성 가닥을 따른 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 합성 조건은 4종의 상이한 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 적어도 1개의 중합 유도제, 예컨대, 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 존재를 포함한다. 이는, 보조인자이거나 또는 다양한 적합한 온도에서 pH 등과 같은 조건에 영향을 미치는 구성 성분을 포함할 수 있는 적합한 완충제 중에 존재한다. 프라이머는 바람직하게는 증폭 효율이 최적화되도록 단일 가닥 서열이지만, 이중 가닥 서열이 사용될 수도 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로브"는 표적 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 택맨(TaqMan)® 또는 택맨®-스타일 검정 절차에서, 프로브는 두 프라이머의 어닐링 부위 사이에 위치하는 표적 부분에 혼성화된다. 프로브는 약 8개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드, 약 20개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드, 약 40개의 뉴클레오티드, 또는 약 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 15개의 뉴클레오티드를 포함한다.
서던 (Southern) 블롯 검정 절차에서, 프로브는 막에 부착된 DNA 단편에 혼성화한다. 상기 검정에서, 프로브는 약 10개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드, 약 250개의 뉴클레오티드, 약 500개의 뉴클레오티드, 약 1,000개의 뉴클레오티드, 약 2,500개의 뉴클레오티드, 또는 약 5,000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 약 500개의 뉴클레오티드 내지 약 2,500개의 뉴클레오티드를 포함한다.
프로브는 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 표지, 비오티닐화 표지, 형광단 (텍사스 레드(TEXAS RED)®, 플루오레세인 이소티오시아네이트 등)을 추가로 포함할 수 있다. 검출가능한 표지는 예를 들어 프로브의 5' 단부 또는 프로브의 3' 단부에 위치하는 프로브 올리고뉴클레오티드에 직접 공유 부착될 수 있다. 형광단을 포함하는 프로브는 또한 추가로 소광제, 예컨대, 블랙 홀 켄처(BLACK HOLE QUENCHER)®, 아이오와 블랙(IOWA BLACK)™ 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 교환가능하게 사용될 수 있고, 명시된 비교 윈도우에 걸쳐 최대로 대응되도록 정렬될 때 동일한 두 서열 내의 핵산 잔기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열 동일성 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 최적으로 정렬된 두 서열 (예컨대, 핵산 서열 또는 아미노산 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭하고, 여기서, 비교 윈도우 내의 서열의 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위해 (부가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 두 서열 모두에서 동일한 핵산 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내의 위치의 총수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]; [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]; [Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44]; [Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3]; [Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90]; [Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65]; [Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31]; [Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]에 기재되어 있다.
여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해, 미국 국립 생물 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information: NCBI) 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴 (Basic Local Alignment Search Tool: BLAST™; [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10])이 미국 국립 생물 정보 센터 (미국 메릴랜드주 베데스다)를 비롯한 여러 공급원으로부터, 및 인터넷상에서 이용가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 관한 설명은 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움말" 섹션 하에 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, 디폴트 파라미터를 사용하여 BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능을 활용할 수 있다. 참조 서열과 훨씬 더 큰 유사성을 가진 핵산 서열은 상기 방법에 의해 평가될 때 증가하는 동일성 %를 나타낼 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산이 또 다른 핵산과 기능적 관계로 배치되어 있다는 것을 의미한다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 핵산이 인접함을 의미할 수 있다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성될 수 있다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 핵산에 라이게이션되거나 어닐링되고, 인접한 폴리뉴클레오티드 단편을 연결하기 위해 사용된다. 그러나, 요소는 작동가능하게 연결되기 위해 인접할 필요는 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 일반적으로 유전자의 상류에 (유전자의 5' 영역을 향해) 위치하고 유전자의 전사를 개시 및 유도하기 위해 필요한 DNA의 영역을 의미한다. 프로모터는 그가 제어하는 유전자의 적합한 활성화 또는 억제를 허용할 수 있다. 프로모터는 전사 인자에 의해 인식되는 특이적 서열을 포함할 수 있다. 이들 인자는 프로모터 DNA 서열에 결합하여, 유전자의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소인 RNA 폴리머라제의 동원을 유도할 수 있다. 프로모터는 일반적으로 상류 프로모터, 5'-UTR, 인트론, 및 리더 서열을 비롯하여 유전자의 상류에 위치하는 모든 유전자 조절 요소를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상류-프로모터"는 전사의 개시를 유도하기에 충분한 인접하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 상류-프로모터는 TATA 박스, 개시제 서열, TFIIB 인식 요소 및 다른 프로모터 모티프 (motif)를 포함하는 여러 서열 모티프와 함께 전사 개시 부위를 포함한다 (Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592). 상류 프로모터는 TFIIA, B, D, E, F 및 H와 같은 기본적인 또는 일반적인 전사 인자와 함께 다중-하위단위 효소인 RNA 폴리머라제 II에 대한 작용 부위를 제공한다. 이들 인자는 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 촉매하는 전사 개시전 복합체로 조립된다.
상류-프로모터의 활성화는 다양한 단백질이 결합하고 후속적으로 전사 개시 복합체와 상호작용하여 유전자 발현을 활성화하는 조절 DNA 서열 요소의 추가의 서열에 의해 수행된다. 이들 유전자 조절 요소 서열은 특이적 DNA-결합 인자와 상호작용한다. 이들 서열 모티프는 때때로 시스(cis)-요소로 언급될 수 있다. 조직-특이적 또는 발생-특이적 전사 인자가 개별적으로 또는 조합하여 결합하는 상기 시스-요소는 프로모터의 시공간적 발현 패턴을 전사 수준에서 결정할 수 있다. 이들 시스-요소는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자에 대해 발휘하는 제어의 유형에 따라 크게 다양하다. 일부 요소는 환경 (예를 들어, 온도, 습도, 및 손상)에 반응하여 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 증가시키는 작용을 한다. 다른 시스-요소는 발생 신호 (예를 들어, 발아, 종자 성숙, 및 개화) 또는 공간적 정보 (예를 들어, 조직 특이성)에 반응할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Langridge et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23]을 참조한다. 이들 시스-요소는 전사 출발점으로부터 다양한 거리에 위치하고, 일부의 시스-요소 (근접 요소로 칭함)는 최소 코어 프로모터 영역에 인접하고, 다른 요소는 프로모터로부터 수 킬로염기의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다 (인핸서 (enhancer)).
"DNA 결합 트랜스진"은 DNA 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 코딩 서열이다. DNA 결합 단백질은 후속적으로 또 다른 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 예를 들어, DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질), 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이는 자신에게 결합할 수 있고/있거나 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성), 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 결합 활성의하나 초과의 유형을 가질 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 (zinc finger) 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
DNA 결합 단백질의 예는 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있는 메가뉴클레아제, 아연 핑거, CRISPR, 및 TALE 결합 도메인을 포함한다. 일반적으로, 조작된 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 아연 핑거, CRISPR, 또는 TALE)은 비-천연적으로 생성되는 단백질이다. DNA-결합 단백질의 조작을 위한 방법의 비제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 그의 설계/조성이 주로 합리적인 기준에 의한 것인, 천연 생성되지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준은 존재하는 ZFP, CRISPR, 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이타의 정보를 저장하는 데이타베이스 내의 정보를 처리하기 위한 치환 규칙 및 연산 (computerized) 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261을 참고하고; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 U.S. 특허 공개 20110301073, 20110239315 및 20119145940을 참고한다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이고, 이때 상기 아연 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다. 아연 핑거 결합 도메인은 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 아연 핑거 단백질의 조작을 위한 방법의 비제한적인 예는 설계 및 선택이다. 설계된 아연 핑거 단백질은 그의 설계/조성이 주로 합리적인 기준에 의한 것인, 천연 생성되지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 기준은 존재하는 ZFP 설계 및 결합 데이타의 정보를 저장하는 데이타베이스 내의 정보를 처리하기 위한 치환 규칙 및 연산 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 6,534,261 및 6,794,136을 참고하고; 또한 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496을 참고한다.
다른 예에서, 하나 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 천연 생성 또는 조작된 (비-천연 생성) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20110301073을 참고한다. 크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물 식물에서 많은 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 크산토모나스의 병원성은 보다 많은 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포 내로 주입하는 보존된 타입 III 분비 (T3S) 시스템에 의해 좌우된다. 상기 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성제를 모방하고 식물 총 전사체 (transcriptome)를 처리하는 전사 활성제-유사 (TALEN) 이펙터가 존재한다 (Kay et al., (2007) Science 318:648-651). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 가장 잘 특성화된 TAL-이펙터 중의 하나는 크산토모나스 캄페스트그리스 피브이. 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv . Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (문헌 [Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO2010079430 참조). TAL-이펙터는 탠덤 반복체의 중앙 집중된 도메인을 함유하고, 각각의 반복체는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 핵심적인 대략 34개의 아미노산을 함유한다. 또한, 이들은 핵 국재화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (검토에 대해서는, 문헌 [Schornack S, et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 또한, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서, 알. 솔라나세아룸(R. solanacearum) 생태형 균주 GMI1000 및 생태형 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동성인, brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자가 발견되었다 (문헌 [Heuer et al. (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 서로 뉴클레오티드 서열이 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인 내의 1,575 bp의 결실에서 상이하다. 그러나, 유전자 산물 둘 모두는 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20110301073을 참조한다.
이들 TAL 이펙터의 특이성은 탠덤 반복체에서 발견되는 서열에 의해 결정된다. 반복된 서열은 대략 102 bp를 포함하고, 반복체는 서로 일반적으로 91-100% 상동성이다 (Bonas et al., 상기 문헌). 반복체의 다형성 (polymorphism)은 대체로 위치 12 및 13에 존재하고, TAL-이펙터의 표적 서열 내의 인접하는 뉴클레오티드의 정체(identity)와 위치 12 및 13에 초가변 이잔기의 정체 사이에 1 대 1 대응성이 존재하는 것으로 보인다 (문헌 [Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501] 및 [Boch et al., (2009) Science 326: 1509-1512] 참조). 실험에 의해, 상기 TAL-이펙터의 DNA 인식을 위한 천연 코드는 위치 12 및 13의 HD 서열이 시토신 (C)에 대한 결합을 유도하고, NG는 T에 결합하고, NI는 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN은 A 또는 G에 결합하고, ING는 T에 결합하는 것으로 결정되었다. 이들 DNA 결합 반복체는 새로운 서열과 상호작용하고 식물 세포에서 비-내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화할 수 있는 인공 전사 인자를 만들기 위해 반복체의 새로운 조합 및 수와 함께 단백질로 조립되었다 (Boch et al., 상기 문헌). 조작된 TAL 단백질은 효모 리포터 검정 (플라스미드 기반 표적)에서 활성을 보이는 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제 융합체 (TALEN)를 생성하기 위해 FokI 절단 1/2 도메인에 연결되었다.
CRISPR (군집성의 규칙적인 간격을 갖는 짧은 회문구조 반복체)/Cas (CRISPR-연관) 뉴클레아제 시스템은 게놈 조작을 위해 사용될 수 있는 박테리아 시스템을 기초로 한 최근에 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 이것은 많은 박테리아 및 고세균의 적응 면역 반응의 일부를 기초로 한다. 바이러스 또는 플라스미드가 박테리아를 침범할 때, 침입자의 DNA의 절편은 '면역' 반응에 의해 CRISPR RNA (crRNA)로 전환된다. 상기 crRNA는 이때 Cas9 뉴클레아제를 "프로토스페이서"로 불리는 표적 DNA 내의 crRNA에 상동성인 영역으로 가이드하기 위해 부분적인 상보성 영역을 통해 tracrRNA로 불리는 또 다른 종류의 RNA와 회합한다. Cas9는 crRNA 전사체 내에 함유된 20-뉴클레오티드 가이드 서열에 의해 특정된 부위에서 이중 가닥 파단부 (DSB)의 평활 말단을 생성하기 위해 DNA를 절단한다. Cas9는 부위 특이적 DNA 인식 및 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA를 모두 필요로 한다. 상기 시스템은 이제 crRNA 및 tracrRNA가 하나의 분자 ("단일 가이드 RNA")로 조합될 수 있도록 조작되고, 단일 가이드 RNA의 crRNA 동등부는 임의의 요구되는 서열을 표적화하기 위해 Cas9 뉴클레아제를 가이드하도록 조작될 수 있다 (문헌 [Jinek et al., (2012) Science 337, pp. 816-821], [Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471], 및 [David Segal, (2013) eLife 2:e00563] 참조). 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 게놈 내의 요구되는 표적에 DSB를 생성하도록 조작될 수 있고, DSB의 복구는 오류 빈발 복구 (error prone repair)의 증가를 유도하기 위해 복구 억제제의 사용에 의해 영향받을 수 있다.
다른 예에서, DNA 결합 트랜스진은 조작된 (비-천연 생성) 메가뉴클레아제 (호밍 (homing) 엔도뉴클레아제로도 설명됨)를 포함하는 부위 특이적 뉴클레아제이다. 호밍 엔도뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열이 알려져 있다. 또한, 미국 특허 5,420,032; 미국 특허 6,833,252; 문헌 [Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388]; [Dujon et al., (1989) Gene 82: 115-118]; [Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127]; [Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228]; [Gimble et al., (1996) J. Mol Biol 263:163-180]; [Argast et al., (1998) J Mol. Biol. 280:345-353] 및 [New England Biolabs catalogue]를 참고한다. 추가로, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-천연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905]; [Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962]; [Ashworth et al., (2006) Nature 441:656-659]; [Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 20070117128을 참고한다. 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 전체로서 (즉, 뉴클레아제가 동족 (cognate) 절단 도메인을 포함하도록) 뉴클레아제의 측면에서 변경될 수 있거나 또는 이종성 절단 도메인에 융합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환"은 핵산 분자를 세포 내로 도입할 수 있는 모든 기술을 포함한다. 그 예는 바이러스 벡터에 의한 형질감염; 플라스미드 벡터에 의한 형질전환; 전기천공; 리포펙션 (lipofection); 미세주사 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움-매개 전달; 직접 DNA 흡수; 휘스커스(WHISKERS)™-매개 형질전환; 및 미세발사체 투사법 (microprojectile bombardment)을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 이들 기술은 식물 세포의 안정한 형질전환 및 일시적 형질전환을 위해 사용될 수 있다. "적절한 형질전환"은 핵산 단편이 숙주 유기체의 게놈 내로 도입되어 유전적으로 안정하게 유전됨을 의미한다. 안정적으로 형질전환된 후, 핵산 단편은 숙주 유기체 및 임의의 후속 세대의 게놈 내에 안정적으로 통합된다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 유기체로 언급된다. "일시적 형질전환"은 핵산 단편이 숙주 유기체의 핵 또는 DNA-함유 소기관 내로 도입되어, 유전적으로 안정하게 유전되지 않으면서 유전자를 발현함을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질도입"은 바이러스가 핵산을 세포 내로 도입하는 과정을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "트랜스진"은 외인성 핵산 서열을 지칭한다. 한 예에서, 트랜스진은 유전자 서열 (예를 들어, 제초제-내성 유전자), 산업적으로 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자이다. 추가의 예에서, 트랜스진은 작은 RNA, 예컨대 안티센스 핵산 서열이고, 여기서 작은 RNA 서열의 발현은 표적 핵산 서열의 발현을 억제한다. 트랜스진은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인트론, 또는 3'-UTR)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 핵산은 트랜스진이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 관심 핵산은 추가의 게놈 카피가 요구되는 내인성 핵산, 또는 숙주 유기체 내의 표적 핵산의 서열에 대해 안티센스 배향으로 존재하는 핵산이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작은 RNA"는 여러 클래스의 비-코딩 리보핵산 (ncRNA)을 의미한다. 용어 작은 RNA는 박테리아 세포, 동물, 식물, 및 진균에서 생산되는 단쇄의 ncRNA를 설명한다. 이러한 단쇄의 ncRNA는 자연적으로 세포 내에서 생산될 수 있거나, 또는 단쇄 또는 ncRNA를 발현하는 외인성 서열의 도입에 의해 제조될 수 있다. 작은 RNA 서열은 단백질을 직접 코딩하지 않고, 작은 RNA 서열이 오직 전사될 뿐 번역되지는 않는다는 점에서 다른 RNA와 다른 기능을 한다. 작은 RNA 서열은 유전자 발현 및 변형을 비롯한 다른 세포 기능에 관여한다. 작은 RNA 분자는 보통 약 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어진다. 작은 RNA 서열은 보다 긴 전구체로부터 유래될 수 있다. 전구체는 자가 상보성 영역에서 서로 재폴딩하는 구조를 형성하고; 이어서, 이는 동물에서는 뉴클레아제인 다이서 (Dicer), 식물에서는 DCL1에 의해 프로세싱된다.
마이크로RNA (miRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 RNA, 짧은 헤어핀 (hairpin) RNA (shRNA), 및 작은 핵인 RNA (snoRNA)를 비롯한 많은 유형의 작은 RNA가 천연적으로 존재하거나, 또는 인공적으로 제조된다. 특정 유형의 작은 RNA, 예컨대, 마이크로RNA 및 siRNA는 유전자 침묵화 및 RNA 간섭 (RNAi)에서 중요하다. 유전자 침묵화는 통상 발현되는 유전자가 세포내 요소에 의해, 이 경우에서는 작은 RNA에 의해 "턴 오프"되는 유전적 조절 과정이다. 통상 상기 유전자 정보에 의해 형성되는 단백질은 간섭에 기인하여 형성되지 않고, 유전자에서 코딩되는 정보는 발현되지 못하게 차단된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작은 RNA"는 "소형 RNA" ([Storz, (2002) Science 296:1260-3]; [Illangasekare et al., (1999) RNA 5:1482-1489]); 원핵성 "작은 RNA" (sRNA) (Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45); 진핵성 "비코딩 RNA (ncRNA)"; "마이크로-RNA (miRNA)"; "작은 비-mRNA (snmRNA)"; "기능성 RNA (fRNA)"; "운반 RNA (tRNA)"; "촉매성 RNA" [예를 들어, 리보자임 (자가 아실화 리보자임 포함) (Illangaskare et al., (1999) RNA 5:1482-1489)]; "작은 핵인 RNA (snoRNA)"; "tmRNA" ("10S RNA"로도 알려져 있음, 문헌 [Muto et al., (1998) Trends Biochem Sci. 23:25-29]; 및 [Gillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885]); 비제한적으로, "작은 간섭 RNA (siRNA)", "엔도리보뉴클레아제 제조된 siRNA (e-siRNA)", "짧은 헤어핀 RNA (shRNA)", 및 "작은 일시적으로 조절된 RNA (stRNA)"를 비롯한 RNAi 분자; "다이싱된 siRNA (d-siRNA)", 및 앱타머, 올리고뉴클레오티드 및 1개 이상의 우라실 염기를 포함하는 다른 합성 핵산으로서 문헌에 기재되어 있는 RNA 분자를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 세포 내로 도입되어 형질전환된 세포를 생산하는 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 그 예는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 또는 바이러스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선택가능 마커 유전자 및 관련 기술 분야에 알려진 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환, 또는 감염시켜, 세포가 벡터에 의해 코딩되는 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하도록 만들 수 있다. 벡터는 임의로 세포 내로 핵산 분자의 도입의 달성을 돕는 물질 (예를 들어, 리포솜)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "카세트", "발현 카세트", 및 "유전자 발현 카세트"는 특정 제한 부위에 또는 상동 재조합에 의해 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있는 DNA의 절편을 지칭한다. DNA의 절편은 작은 RNA 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 관심 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 카세트 및 제한 부위는 전사 및 번역을 위한 적합한 해독 프레임 내의 카세트의 삽입을 보장하도록 설계된다. 한 실시양태에서, 발현 카세트는 작은 RNA 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 폴리뉴클레오티드 이외에도, 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 또한 숙주 세포에서 작은 RNA 또는 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 향상시킬 수 있는 요소를 포함할 수 있다. 이들 요소는 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 인트론, 5' 비번역, 3' 비번역 영역 서열, 종결자 (terminator) 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종성 코딩 서열"은 정상적으로는 숙주 유기체에 존재하지 않고 적절한 조건 하에서 숙주 세포에서 발현될 수 있는 펩티드 또는 단백질 또는 그의 동등한 아미노산 서열, 예를 들어 효소를 코딩하거나 최종적으로 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, "이종성 코딩 서열"은 세포가 세포에 정상적으로는 존재하지 않는 코딩 서열의 추가의 카피를 발현하도록 숙주 세포에 정상적으로는 존재하지 않는 코딩 서열의 하나 또는 추가의 카피를 포함할 수 있다. 이종성 코딩 서열은 RNA 또는 그의 임의의 종류, 예를 들어, mRNA, DNA 또는 그의 임의의 종류, 예를 들어, cDNA, 또는 RNA/DNA의 혼성체일 수 있다. 코딩 서열의 예는 코딩 서열, 인트론, 프로모터 영역, 5'-UTR, 3'-UTR 및 인핸서 영역과 같은 특징부를 포함하는 전장 전사 단위를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
"이종성 코딩 서열"은 또한 펩티드 또는 효소의 코딩 부분, 즉, 펩티드 또는 효소의 cDNA 또는 mRNA 서열, 및 전장 전사 단위, 즉, 인트론 및 엑손을 포함하는 유전자의 코딩 부분, 및 효소를 코딩하거나 그의 동등한 아미노산 서열을 코딩하는 "코돈 최적화" 서열, 말단절단된 (truncated) 서열 또는 다른 형태의 변경된 서열 (동등한 아미노산 서열이 기능적 단백질을 생산하는 한)을 포함한다. 상기 동등한 아미노산 서열은 하나 이상의 아미노산의 결실을 가질 수 있고, 결실은 N-말단, C-말단, 또는 내부에서의 결실이다. 말단절단된 형태는 본원에서 제시되는 촉매 능력을 갖는다면 고려된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대조군"은 비교 목적의 분석 절차에서 사용되는 샘플을 의미한다. 대조군은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다. 예를 들어, 분석 절차의 목적이 세포 또는 조직에서 차별적으로 발현되는 전사체 또는 폴리펩티드를 검출하는 것인 경우, 일반적으로 요구되는 발현을 보이는 공지의 식물로부터의 샘플과 같은 양성 대조군 및 요구되는 발현이 결여된 공지의 식물로부터의 샘플과 같은 음성 대조군을 포함시키는 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식물"은 식물 및 식물 세포 및 식물 조직, 예컨대 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 화분, 및 종자를 포함하고 이로 제한되지 않는 식물 부분을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 식물의 종류는 일반적으로 속씨식물, 겉씨식물, 양치식물, 및 다세포성 조류를 비롯하여 돌연변이 유발이 가능한 고등 및 하등 식물의 종류만큼 다양하다. 따라서, "식물"은 쌍자엽 및 단자엽 식물을 포함한다. 쌍자엽 식물의 예는 담배, 아라비돕시스, 대두, 토마토, 파파야, 카놀라, 해바라기, 목화, 알팔파, 감자, 포도덩굴, 열대 콩과 관목 (pigeon pea), 완두콩, 브라시카(Brassica), 병아리콩, 사탕무, 평지씨, 수박, 멜론, 후추, 땅콩, 호박, 무, 시금치, 애호박, 브로콜리, 양배추, 당근, 꽃양배추, 셀러리, 배추, 오이, 가지, 및 상추를 포함한다. 단자엽 식물의 예는 옥수수, 벼, 밀, 사탕수수, 보리, 호밀, 수수, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 기장, 및 라이밀을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 물질"은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃의 일부, 과실, 화분, 난세포, 접합체, 종자, 식물 절단물 (cutting), 세포 또는 조직 배양액, 또는 식물의 임의의 다른 부분 또는 산물을 의미한다. 한 실시양태에서, 식물 물질은 자엽 및 잎을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 물질은 뿌리 조직 및 지하에 위치하는 다른 식물 조직을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "선택가능 마커 유전자"는 임의로 식물 형질전환에서, 예를 들어, 식물 세포를 선택제로부터 보호하거나, 또는 선택제에 대한 저항성/내성을 제공하기 위해 사용되는 유전자를 의미한다. 또한, "선택가능 마커 유전자"는 리포터 유전자를 포함하는 의미를 갖는다. 또한, 기능적 선택가능 마커를 제공받은 상기 세포 또는 식물만이 선택제가 있는 조건 하에서 분열 또는 성장할 수 있다. 선택제의 예는 예를 들어, 스펙티노마이신, 네오마이신, 카나마이신, 파로모마이신, 겐타미신, 및 히그로마이신을 비롯한 항생제를 포함할 수 있다. 이들 선택가능 마커는 항생제 카나마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (npt II), 및 관련 항생제인 네오마이신, 파로모마이신, 겐타미신, 및 G418에 대한 유전자, 또는 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt)에 대한 유전자를 포함한다. 다른 선택가능 마커 유전자는 bar 또는 pat (글루포시네이트 암모늄 또는 포스피노트리신에 대한 내성), 아세토락테이트 신타제 (ALS, 분지쇄 아미노산 합성의 제1 단계를 방지하는 억제제, 예컨대, 술포닐우레아 (SU), 이미다졸리논 (IMI), 트리아졸로피리미딘 (TP), 피리미디닐 옥시벤조에이트 (POB), 및 술포닐아미노 카르보닐 트리아졸리논에 대한 내성), 글리포세이트, 2,4-D를 비롯한 제초제 내성, 및 금속 저항성 또는 감수성을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 선택가능 마커 유전자로서 사용될 수 있는 "리포터 유전자"의 예는 발현된 리포터 유전자 단백질, 예컨대, β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼리성 포스파타제 등을 코딩하는 단백질의 시각적 관찰을 포함한다. 문구 "마커-양성"은 식물이 형질전환되어 선택가능 마커 유전자를 포함한다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검출가능 마커"는 검출될 수 있는 표지, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이트화제 또는 효소를 지칭한다. 검출가능 마커의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 형광 표지 (예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소 표지 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광체, 비오티닐 기, 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 한 실시양태에서, 검출가능 마커는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암 (arm)에 의해 부착될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "검출하는"는 특정 분자의 정성적 및 정량적 측정 둘 모두, 예를 들어, 특정 폴리펩티드의 측정을 포함하는 것으로 가장 넓은 의미로 사용된다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서 통상적인 용어의 정의는 예를 들어 문헌 [Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994]; 및 [Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995]에서 살펴볼 수 있다.
조절 요소
기초 연구 또는 생명공학적 적용을 위해 사용되는 식물 프로모터는 대사 조작 및 형질 집적을 위해 식물 내에서 트랜스진을 강력하게 발현하기 위해 그의 3' 단부 (하류)에 융합된 트랜스진의 발현을 유도한다. 그 결과, 트랜스제닉 작물에서 다중 유전자의 발현을 유도할 수 있는 신규한 프로모터에 대한 필요성이 존재한다. 그의 3' 말단부 (하류)에 융합된 제1 유전자의 발현을 유도할 수 있는 프로모터가 본원에 개시된다.
트랜스제닉 생성물 개발은 점점 더 복잡해지고 있고, 이것은 트랜스진을 강력하게 발현하고 다중 트랜스진을 단일 유전자좌 내로 집적하는 것을 필요로 한다. 전통적으로, 각각의 트랜스진은 발현을 위해 특유한 프로모터를 필요로 하고, 여기서 한 유전자 스택 (stack) 내의 상이한 트랜스진을 발현시키기 위해서는 다중 프로모터가 요구된다. 이것은 유전자 스택의 크기 증가와 함께, 단일 다유전자성 형질의 발현을 위해 상이한 트랜스진의 유사한 수준의 발현 패턴을 얻기 위해 같은 프로모터의 반복적인 사용을 빈번하게 유도한다. 관련 기술분야에는 같은 프로모터에 의해 유도되는 다중 유전자 구축물이 유전자 침묵화를 유발하여 트랜스제닉 생성물을 덜 효과적으로 생성하는 것으로 알려져 있다. 프로모터 반복에 기인하는 과도한 전사 인자 (TF)-결합 부위는 내인성 TF의 결실을 유발할 수 있고, 이에 따라 전사가 불활성화될 수 있다. 트랜스진의 침묵화는 트랜스진을 발현하도록 제조된 트랜스제닉 식물의 성능에 바람직하지 않은 영향을 줄 수 있을 것이다. 트랜스진 내의 반복적인 서열은 유전자좌 내의 상동성 재조합을 유도할 수 있고, 이에 의해 폴리뉴클레오티드 재배열이 일어날 수 있다.
조직 특이적 (즉, 조직-선호) 또는 기관 특이적 프로모터는 특정 조직에서, 예컨대, 식물의 커넬 (kernel), 뿌리, 잎 또는 융단조직 (tapetum)에서 유전자 발현을 유도한다. 조직 및 발생 단계 특이적 프로모터는 유전자의 발현을 유도하며, 이 유전자는 특정 조직에서 또는 식물 발생 동안 특정 시간에 발현된다. 조직 특이적 프로모터는 트랜스제닉 식물 산업에서 특정 적용을 위해 요구되며, 조직 및/또는 발생 단계에 선택적인 방식으로 이종성 유전자가 특이적으로 발현될 수 있도록 허용하고, 이것은 다른 것에서는 그렇지 않지만, 다양한 기관, 조직 및/또는 시점에서의 차별적인 이종성 유전자의 발현을 나타내기 때문에 바람직하다. 예를 들어, 토양 매개 병원체 감염에 대한 식물의 저항성을 증가시키는 것은 병원체-저항성 단백질이 식물의 뿌리 내에서 강하게 발현되도록 식물 게놈을 병원체-저항성 유전자로 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 별법으로, 특정 성장 또는 발생 단계, 예컨대, 세포 분열 또는 신장기에 있는 식물 조직에서 트랜스진을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 용도는 예를 들어 발생 물관부에서 작물학적 형질을 코딩하는 트랜스진의 발현을 국한시키기 위해 조직 특이적 프로모터를 바라직하게 사용하는 것이다. 조직 특이적 프로모터 확인에 있어 여전히 남아있는 하나의 특정 문제는 잠재적으로 가장 중요한 유전자 및 그의 대응하는 프로모터를 확인하고, 이를 세포의 특이적인 발생 특성과 연관시키는 방법이다. 또 다른 문제는 클로닝된 DNA 단편이 원하는 특이적인 발현 패턴으로 전사를 유도하도록 모든 관련된 시스 작용성 전사 제어 요소를 클로닝하는 것이다. 상기 제어 요소가 번역 개시 또는 출발 부위로부터의 멀리 위치하는 경우, 프로모터를 포함하도록 선택된 폴리뉴클레오티드의 크기는 프로모터 폴리뉴클레오티드 서열의 발현 수준 및 발현 패턴을 제공하기 위해 중요하다. 특정 문제는 다른 식물 조직에서는 발현되지 않는, 식물에서 특이적인 세포 유형, 발생 단계 및/또는 기능과 관련된 조직-특이적 프로모터를 확인하는 것이다.
식물에서 트랜스진을 발현시키기 위하여 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소를 사용하는 방법 및 구축물을 제공한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 다음과 같은 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터일 수 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
한 실시양태에서, 프로모터는 다음과 같은 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 상류-프로모터일 수 있다:
Figure pct00004
Figure pct00005
한 실시양태에서, 프로모터는 다음과 같은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터일 수 있다:
Figure pct00006
Figure pct00007
한 실시양태에서, 프로모터는 다음과 같은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 상류-프로모터일 수 있다:
Figure pct00008
Figure pct00009
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 본 개시내용의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터일 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터를 포함하고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일하다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트는 2개 이상의 트랜스진의 발현을 유도할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
트랜스진 발현은 또한 프로모터 서열의 하류에 위치하는 인트론 영역에 의해 조절될 수 있다. 프로모터 및 인트론 둘 모두가 트랜스진 발현을 조절할 수 있다. 프로모터는 전사를 유도하는 데 필요한 반면, 인트론의 존재는 발현 수준을 증가시켜 번역 및 단백질 합성을 위한 mRNA 전사체를 생성할 수 있다. 인트론 유전자 영역은 트랜스진의 안정적인 발현을 돕는다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 인트론을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자로부터 인트론을 포함한다. 한 실시양태에서, 인트론은 다음과 같은 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론 (1)일 수 있다:
Figure pct00010
한 실시양태에서, 인트론은 다음과 같은 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론 (2)일 수 있다:
Figure pct00011
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 인트론을 포함하고, 여기서 인트론은 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일하다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자로부터의 인트론을 포함하고, 여기서, 프로모터는 제아 메이스 유전자 프로모터, 또는 식물 (예를 들어, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 또는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터), 바이러스 (예를 들어, 카사바 (Cassava) 엽맥 모자이크 바이러스 프로모터) 또는 박테리아 (예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 델타 매스)로부터 기원하는 프로모터이다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자로부터의 인트론을 포함하고, 여기서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 그의 조합일 수 있다.
트랜스진 발현은 또한 유전자의 코딩 서열의 하류에 위치하는 3'-비번역 유전자 영역 (즉, 3'-UTR)에 의해 조절될 수 있다. 프로모터 및 3'-UTR 둘 모두가 트랜스진 발현을 조절할 수 있다. 프로모터가 전사를 유도하기 위해 필요한 반면, 3'-UTR 유전자 영역은 전사를 종결하고, 번역 및 단백질 합성을 위해 생성되는 mRNA 전사체의 폴리아데닐화를 개시시킨다. 3'-UTR 유전자 영역은 트랜스진의 안정한 발현을 돕는다. 한 실시양태에서, 3'-UTR은 다음과 같은 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR일 수 있다:
Figure pct00012
한 실시양태에서, 3'-UTR은 다음과 같은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR일 수 있다:
Figure pct00013
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 3'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 3'-UTR은 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR일 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 3'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 3'-UTR을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자로부터 정제된 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 다음을 포함한다: a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터; b) 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 인트론; 및/또는 c) 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 3'-UTR.
예를 들어, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 3'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 7의 폴리뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 3'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드이다. 후속 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 3'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 7의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 3'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드이다.
추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 3'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 7의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 3'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 3'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 4의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 7의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 3'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 4의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 7의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 7의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 7의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 4의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 7의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 4의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 3'-UTR은 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드이다.
한 실시양태에서, 5'-UTR은 다음과 같은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR일 수 있다:
Figure pct00014
한 실시양태에서, 서열식별번호: 19에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 5'-UTR을 포함하는 핵산 구축물이 제공된다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 5'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 5'-UTR은 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR일 수 있다. 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 서열식별번호: 19에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 5'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 5'-UTR을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자로부터 정제된 프로모터, 인트론, 및 5'-UTR을 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 다음을 포함한다: a) 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 프로모터; b) 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 인트론; 및/또는 c) 서열식별번호: 19에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일한 5'-UTR.
예를 들어, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 5'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드이고, 5'-UTR은 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드이다. 후속 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 5'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드이고, 5'-UTR은 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드이다.
추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 5'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드이고, 5'-UTR은 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터 및 5'-UTR 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 4의 폴리뉴클레오티드이고, 5'-UTR은 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드이다.
또 다른 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 5'-UTR은 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드이다. 추가의 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터, 인트론, 및 5'-UTR을 포함할 수 있고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 4의 폴리뉴클레오티드이고, 인트론은 서열식별번호: 5의 폴리뉴클레오티드이고, 5'-UTR은 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드이다.
프로모터, 인트론, 3'-UTR, 및/또는 5'-UTR은 유전자 발현 카세트가 하나 이상의 트랜스진을 포함할 때 유전자 발현 카세트 내의 상이한 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 유전자 프로모터 (서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4)를 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 유전자 프로모터 (서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4), 인트론 (서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6), 및 5'-UTR (서열식별번호: 19)을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 유전자 3'-UTR (서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8)을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 유전자 5'-UTR (서열식별번호: 19)을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 벡터는 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 박테리오파지, 바이러스, 또는 형질전환 또는 유전자 표적화에 사용하기 위한 절제된 폴리뉴클레오티드 단편, 예컨대 공여자 DNA일 수 있다.
한 실시양태에서, 세포 또는 식물은 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 또는 식물은 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 박테리오파지, 또는 바이러스일 수 있다. 이에 의해, 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함하는 세포 또는 식물은 각각 트랜스제닉 세포 또는 트랜스제닉 식물이다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 식물일 수 있다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 단자엽 식물은 옥수수, 밀, 벼, 수수, 귀리, 호밀, 바나나, 사탕수수, 및 기장일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 쌍자엽 식물일 수 있다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 쌍자엽 식물은 대두, 목화, 해바라기, 및 카놀라일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 실시양태는 또한 본원에 개시된 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자를 포함한다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 2 이상의 트랜스진을 포함한다. 2 이상의 트랜스진은 본원에 개시된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 또는 3'-UTR에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 하나 이상의 트랜스진을 포함한다. 하나 이상의 트랜스진을 사용하는 한 실시양태에서, 적어도 하나의 트랜스진은 본원에 개시된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 또는 3'-UTR에 작동가능하게 연결된다.
선택가능 마커
형질전환된 식물 ("형질전환체")의 확인 및 선택이 가능하도록 하기 위해 리포터 유전자로서 설명되는 다양한 선택가능 마커가 또한 선택된 발현 벡터 내로 도입될 수 있다. 형질전환된 식물에서의 선택가능 마커의 발현을 확인하기 위해, 예를 들어, DNA 서열결정 및 PCR (폴리머라제 연쇄 반응), 서던 블로팅, RNA 블로팅, 벡터로부터 발현된 단백질, 예컨대, 포스피노트리신 저항성을 매개하는 침전된 단백질의 검출을 위한 면역학적 방법, 또는 다른 단백질, 예컨대, β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼리성 포스파타제 등을 코딩하는 리포터 유전자의 시각적 관찰을 비롯한 다수의 방법이 이용가능하다 (문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001] 참조).
선택가능 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선택에 사용된다. 선택가능 마커 유전자는 항생제 저항성을 코딩하는 유전자, 예컨대, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 유전자 및 제초 화합물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 제초제 내성 유전자는 일반적으로 제초제에 대해 감수성을 보이지 않는 변형된 표적 단백질, 또는 작용할 수 있기 전에 식물 내에서 제초제를 분해하거나 해독하는 효소를 코딩한다. 예를 들어, 글리포세이트에 대한 내성은 돌연변이체 표적 효소, 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS)를 코딩하는 유전자를 사용함으로써 수득하였다. EPSPS에 대한 유전자 및 돌연변이체는 널리 공지되어 있고, 이는 아래에서 추가로 설명된다. 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 내성은 각각의 제초제를 해독하는, pat 또는 DSM-2를 코딩하는 박테리아 유전자, 니트릴라제, aad-1 또는 aad-12 유전자를 사용하여 수득하였다.
한 실시양태에서, 이미다졸리논 또는 술포닐우레아를 포함하는 제초제는 생장점 또는 분열조직을 억제할 수 있고, 이들 제초제에 대한 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 및 아세토락테이트 신타제 (ALS)의 저항성/내성을 위한 유전자는 공지되어 있다. 글리포세이트 내성 유전자는 각각 돌연변이체 5-에놀피루빌쉬키메이트 -3-포스페이트 신타제 (EPSP) 및 dgt-28 유전자 (재조합 핵산의 도입 및/또는 천연 EPSP 유전자에 대한 다양한 형태의 생체내 돌연변이유발을 통함), aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자를 포함한다. 다른 포스포노 화합물에 대한 저항성 유전자는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 (스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 비리디크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes) 포함)으로부터의 bar 유전자, 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로피온산 및 시클로헥손 (ACCase 억제제-코딩 유전자)을 포함한다. 시클로헥산디온 및/또는 아릴옥시페녹시프로판산 (할록시포프 (Haloxyfop), 디클로포프 (Diclofop), 페녹시프로프 (Fenoxyprop), 플루아지포프 (Fluazifop), 퀴잘로포프 (Quizalofop) 포함)에 대한 저항성을 부여하는 예시적인 유전자는 아세틸 조효소 A 카르복실라제 (ACCase)-Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3의 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 트리아진 (psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)를 비롯한 제초제는 광합성을 억제할 수 있다.
한 실시양태에서, 선택가능 마커 유전자는 다음을 코딩하는 유전자를 포함하고 이로 제한되지 않는다: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II; 시안아미드 히드라타제; 아스파르테이트 키나제; 디히드로디피콜리네이트 신타제; 트립토판 데카르복실라제; 디히드로디피콜리네이트 신타제 및 탈감작화 아스파르테이트 키나제; bar 유전자; 트립토판 데카르복실라제; 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NEO); 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT 또는 HYG); 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제; 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제; 아세토히드록시산 신타제; 5-에놀피루빌-쉬키메이트-포스페이트 신타제 (aroA); 할로아릴니트릴라제; 아세틸-조효소 A 카르복실라제; 디히드로프테로에이트 신타제 (sul I); 및 32 kD 광화학계 II 폴리펩티드 (psbA).
한 실시양태는 또한 클로람페니콜; 메토트렉세이트; 히그로마이신; 스펙티노마이신; 브로목시닐; 글리포세이트 및 포스피노트리신에 대한 저항성을 코딩하는 유전자를 포함한다.
선택가능 마커 유전자의 상기 목록은 제한적인 의미를 갖지 않는다. 임의의 리포터 또는 선택가능 마커 유전자가 본 발명에 포함된다.
식물에서의 최적 발현을 위해 선택가능 마커 유전자가 합성된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 식물에서의 발현을 향상시키기 위해 유전자의 코딩 서열은 코돈 최적화에 의해 변형된다. 선택가능 마커 유전자는 특정 식물 종에서의 발현을 위해 최적화될 수 있거나, 또는 별법으로, 쌍자엽 또는 단자엽 식물에서의 최적 발현을 위해 변형될 수 있다. 식물에서 바람직한 코돈은 특정 관심 식물 종에서 최다량으로 발현된 단백질에서 최고 빈도의 코돈으로부터 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 선택가능 마커 유전자는 식물에서 더 높은 수준으로 발현되어 더 높은 형질전환 효율을 얻도록 설계된다. 식물 유전자의 최적화 방법은 공지되어 있다. 합성 폴리뉴클레오티드 서열의 최적화 및 제조에 관한 지침은 예를 들어, WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, 미국 특허 6166302, 및 미국 특허 5,380,831에서 볼 수 있다
트랜스진
개시된 방법 및 조성물은 식물 게놈 내의 폴리뉴클레오티드 유전자 서열을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 제초제 내성, 곤충 저항성, 영양소, 항생제, 또는 치료 분자를 코딩하는 유전자의 발현은 식물 프로모터에 의해 유도될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 조절 요소는 글리포세이트 또는 또 다른 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하고/하거나 선택된 곤충 또는 질병에 대한 저항성 및/또는 영양소 향상, 및/또는 개선된 작물학적 특징, 및/또는 사료, 식품, 산업, 제약, 또는 다른 용도에 유용한 단백질 또는 다른 생성물을 제공하는 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 유전자와 조합되거나 작동가능하게 연결된다. 트랜스진은 식물 게놈 내의 2 이상의 관심 핵산 서열과 집적될 수 있다. 집적은 예를 들어 2 이상의 이벤트 (event)를 사용한 통상적인 식물 육종, 관심 서열을 함유하는 구축물에 의한 식물의 형질전환, 트랜스제닉 식물의 재-형질전환, 또는 상동성 재조합을 통한 표적화된 통합을 통한 새로운 형질의 부가를 통해 달성될 수 있다.
그러한 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 아래에서 제시되는 예를 포함하고 이로 제한되지 않는다:
1. 해충 또는 질병에 대한 저항성을 부여하는 유전자 또는 코딩 서열 (예를 들어, iRNA)
(A) 식물 질병 저항성 유전자. 식물 방어는 종종 식물 내의 질병 저항성 유전자 (R)의 생성물과 병원체 내의 대응하는 비병원성 (Avr) 유전자 사이의 특이적 상호작용에 의해 활성화된다. 특이적 병원체 균주에 대해 저항성인 식물을 조작하기 위해 식물 품종을 클로닝된 내성 유전자로 형질전환시킬 수 있다. 상기 유전자의 예는 클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 저항성에 대한 토마토 Cf-9 유전자 (Jones et al., 1994 Science 266:789), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae pv .) 토마토에 대한 저항성에 대한 단백질 키나제를 코딩하는 토마토 Pto 유전자 (Martin et al., 1993 Science 262:1432), 및 슈도모나스 시린가에에 대한 저항성에 대한 아라비돕시스 RSSP2 유전자 (Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089)를 포함한다.
(B) 바실루스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체, 또는 그에 대해 모델링된 합성 폴리펩티드, 예컨대 Bt δ-내독소 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Geiser et al., 1986 Gene 48:109), 및 영양 살곤충 (VIP) 유전자 (예를 들어, 문헌 [Estruch et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94] 참조). 또한, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection; 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 ATCC 수탁 번호 40098; 67136; 31995 및 31998 하에 구입할 수 있다.
(C) 렉틴, 예컨대 몇몇의 클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Van Damme et al. (1994) Plant Molec. Biol. 24:825).
(D) 비타민 결합 단백질, 예를 들어 곤충 해충에 대한 유충구충제로서 유용한 아비딘 및 아비딘 상동체. 미국 특허 5,659,026을 참고한다.
(E) 효소 억제제, 예를 들어, 프로테아제 억제제 또는 아밀라제 억제제. 상기 유전자의 예는 벼 시스테인 프로테이나제 억제제 (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793); 담배 프로테이나제 억제제 I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985) 및 α-아밀라제 억제제 (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243)을 포함한다.
(F) 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 엑디스테로이드 또는 유충 호르몬, 그의 변이체, 그를 기초로 한 모방체, 또는 그의 길항제 또는 효능제, 예컨대 클로닝된 유충 호르몬 에스테라제 (유충 호르몬의 불활성화제)의 바큘로바이러스 발현 (Hammock et al. 1990 Nature 344:458).
(G) 발현시 이환된 해충을 생리학상 붕괴시키는 곤충-특이적 펩티드 또는 신경펩티드 (J. Biol. Chem. 269:9). 상기 유전자의 예는 곤충 이뇨 호르몬 수용체 (Regan, 1994), 디플로프테라 푼크타타(Diploptera punctata)에서 확인된 알로스타틴 (Pratt, 1989); 및 곤충-특이적, 마비성 신경독소 (미국 특허 5,266,361)를 포함한다.
(H) 자연에서 뱀, 말벌 등에 의해 생산되는 곤충-특이적 독, 예컨대 전갈 곤충독성 펩티드 (Pang, 1992 Gene 116:165).
(I) 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살곤충 활성을 갖는 또 다른 비-단백질 분자의 과다축적을 담당하는 효소.
(J) 생물학적 활성 분자의 번역후 변형을 비롯한 변형에 관여하는 효소; 예를 들어 당분해 효소, 단백질분해 효소, 지질분해 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스테라제, 히드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 및 글루카나제 (천연이든 합성이든). 상기 유전자의 예는 칼라제 유전자 (PCT 국제 출원 공개 WO 93/02197), 키티나제-코딩 서열 (예를 들어 ATCC로부터 수탁 번호 3999637 및 67152 하에 얻을 수 있음), 담배 박각시나방 키티나제 (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691] 및 파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자 (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673)를 포함한다.
(K) 신호 전달을 자극하는 분자. 상기 분자의 예는 녹두 칼모둘린 cDNA 클론에 대한 뉴클레오티드 서열 (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757]) 및 옥수수 칼모둘린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467)을 포함한다.
(L) 소수성 모멘트 펩티드. 미국 특허 5,659,026 및 5,607,914를 참고한다. 두 번째 특허는 질병 저항성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드를 개시하고 있다.
(M) 막 퍼미아제 (permease), 채널 형성제, 또는 채널 차단제, 예컨대 트랜스제닉 담배 식물을 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대해 저항성으로 만드는 세크로핀-β 용해성 펩티드 유사체 (Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43).
(N) 바이러스-침습 단백질 또는 그로부터 유래하는 복합 독소. 예를 들어, 형질전환된 식물 세포에서 바이러스 코트 단백질의 축적은 코트 단백질 유전자가 유래되는 바이러스 및 관련 바이러스에 의해 유발되는 바이러스 감염 및/또는 질병 발병에 대한 저항성을 부여한다. 코트 단백질-매개 저항성은 형질전환된 식물에서 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 줄무늬 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 식각 (etch) 바이러스, 담배 얼룩 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대해 부여되었다. 예를 들어, 문헌 [Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451]을 참고한다.
(O) 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래하는 면역독소. 따라서, 곤충 내장에서 핵심 대사 기능을 표적으로 하는 항체는 영향받은 효소를 불활성화하고 곤충을 죽일 것이다. 예를 들어, 문헌 [Taylor et al., (1994) Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions]은 단일쇄 항체 단편의 생산을 통해 트랜스제닉 담배 내에서 효소 불활성화를 보여준다.
(P) 바이러스-특이적 항체. 예를 들어, 재조합 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 바이러스 공격으로부터 보호됨을 보여주는 문헌 [Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469]을 참고한다.
(Q) 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생산되는 발달 억제 단백질. 따라서, 진균 엔도 α-1,4-D-폴리갈락토우로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화함으로써 진균 콜리니화 및 식물 영양소 방출을 촉진한다 (Lamb et al., 1992 Bio/Technology 10:1436). 콩 엔도폴리갈락투로나제-억제 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성화는 문헌 [Toubart et al., 1992 Plant J. 2:367]에 기재되어 있다.
(R) 식물에 의해 자연에서 생산되는 발달-정지 단백질, 예컨대 진균 질병에 대한 증가된 저항성을 제공하는 보리 리보솜-불활성화 유전자 (Longemann et al., 1992 Bio/Technology 10:3305).
(S) RNA 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용되는 RNA 간섭. 한 예에서 RNA 분자는 부분적으로 또는 완전히 이중 가닥이고, 이것은 침묵화 반응을 촉발하여, dsRNA를 작은 간섭 RNA로 절단하고, 이것은 이어서 상동성 mRNA를 파괴하는 표적화 복합체 내로 도입된다. 예를 들어, 파이어 (Fire) 등의 미국 특허 6,506,559; 그레이엄 (Graham) 등의 6,573,099를 참고한다.
2. 제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자
(A) 생장점 또는 분열조직을 억제하는 제초제, 예컨대 이미다졸리논, 술폰아닐리드, 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 본 카테고리에서 예시적인 유전자는 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 효소 (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449)로도 알려진 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (ALS) (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241)를 코딩한다.
(B) 돌연변이체 EPSP 신타제 및 aroA 유전자에 의해, 또는 DGT-28, 2mEPSPS, GAT (글리포세이트 아세틸트랜스퍼라제) 또는 GOX (글리포세이트 옥시다제) 및 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 (pat, bar, 및 dsm-2 유전자), 및 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온 (ACCase 억제제 코딩 유전자)와 같은 유전자에 의한 대사 불활성화를 통해 글리포세이트에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 하나 이상의 추가의 유전자. 예를 들어, 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP의 한 형태의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있는 미국 특허 4,940,835를 참고한다. 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 39256 하에 얻을 수 있고, 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 4,769,061에 개시되어 있다. 유럽 특허 출원 0 333 033 및 미국 특허 4,975,374에는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여하는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있다. 포스피노트리신아세틸-트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 특허 출원 0 242 246에 제시되어 있다. 문헌 [De Greef et al., 1989 Bio/Technology 7:61]에는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산이 기재되어 있다. 아릴옥시페녹시 프로피온산 및 시클로헥산디온, 예컨대 세톡시딤 및 할록시포프에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 예는 Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3 유전자이다 (Marshall et al., 1992 Theor. Appl. Genet. 83:435).
(C) 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 및 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 문헌 [Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169]은 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 사용한 클라미도모나스(Chlamydomonas)의 형질전환을 설명하고 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 수탁 번호 53435, 67441 및 67442 하에 이용가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌 [Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285: 173]에 기재되어 있다.
(D) 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)가 호모젠티세이트로 전환되는 반응을 촉매하는 효소인 히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD)에 결합하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이것은 제초제, 예컨대 이속사졸 (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, 미국 특허 5,424,276), 특히 이속사플루톨 (옥수수에 대한 선택적 제초제), 디케토니트릴 (EP496630, EP496631), 특히 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-CF3 페닐)프로판-1,3-디온 및 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-2,3C12페닐)프로판-1,3-디온, 트리케톤 (EP625505, EP625508, 미국 특허 5,506,195), 특히 술코트리온, 및 피라졸리네이트를 포함한다. 예를 들어 미국 특허 6,268,549 및 6,245,968 및 미국 특허 출원 공개 20030066102에 기재된 유전자를 비롯하여 식물에서 과잉의 HPPD를 생산하는 유전자는 상기 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공할 수 있다.
(E) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하고 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 또한 부여할 수 있는 유전자. 상기 유전자의 예는 미국 특허 7,838,733에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 (aad-1) 유전자를 포함한다.
(F) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하고 또한 피리딜옥시 옥신 제초제, 예컨대 플루옥시피르 또는 트리클로피르에 대한 저항성 또는 내성을 부여할 수 있는 유전자. 상기 유전자의 예는 WO 2007/053482 A2에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 유전자 (aad-12)를 포함한다.
(G) 디캄바에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030135879 참조).
(H) 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 억제하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (미국 특허 5,767,373 참조).
(I) 광화학계 II 반응 중심 (PS II)의 코어 단백질에 결합하는 트리아진 제초제 (예컨대 아트라진) 및 우레아 유도체 (예컨대 디우론) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 ([Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245] 참조).
3. 부가가치 형질을 부여하거나 기여하는 유전자
(A) 예를 들어 식물의 스테아르산 함량을 증가시키기 위해 안티센스 유전자 또는 스테아릴-ACP 탈포화효소로 옥수수 또는 브라시카를 형질전환함으로써 변형된 지방산 대사 ([Knultzon et al., 1992 Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624] 참조).
(B) 감소된 피테이트 함량
(1) 피타제 (phytase)-코딩 유전자, 예컨대 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger) 피타제 유전자의 도입 (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)은 피테이트의 파괴를 향상시켜, 보다 자유로운 포스페이트를 형질전환된 식물에 부가할 수 있다.
(2) 피테이트 함량을 감소시키는 유전자가 도입될 수 있다. 예를 들어, 옥수수에서, 이것은 낮은 수준의 피트산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체를 책임지는 단일 대립유전자와 연관된 DNA를 클로닝한 후 재도입함으로써 달성할 수 있다 (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).
C) 예를 들어 식물을 전분의 분지 패턴을 변경하는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환함으로써 변형된 탄수화물 조성. 그러한 효소의 예는 다음을 포함한다: 스트렙토코커스 무쿠스(Streptococcus mucus) 프럭토실트랜스퍼라제 유전자 (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810), 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자 (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), 바실루스 리케니포르미스(licheniformis) α-아밀라제 (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), 토마토 인버타제 유전자 (Elliot et al., 1993 Plant Mol. Biol. 21:515-524), 보리 아밀라제 유전자 (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480), 및 옥수수 배젖 전분 분지 효소 II (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450).
형질전환
식물의 형질전환에 적합한 방법은 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 방법, 비제한적인 예를 들어 전기천공 (예를 들어, 미국 특허 5,384,253 참조); 미세발사체 투사법 (예를 들어, 미국 특허 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; 및 6,403,865 참조); 아그로박테리움-매개 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 5,635,055; 5,824,877; 5,591,616; 5,981,840; 및 6,384,301 참조); 및 원형질체 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 5,508,184 참조)을 포함한다. 이들 방법은 식물을 안정적으로 또는 일시적으로 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
DNA 구축물은 탄화규소 섬유와의 교반 (예를 들어, 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765 참조)과 같은 기술을 이용하여 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입될 수 있거나, DNA 구축물은 바이올리스틱스 방법, 예컨대, DNA 입자 투사법 (예를 들어, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73])을 이용하여 식물 조직에 직접 도입될 수 있다. 별법으로, DNA 구축물은 나노입자 형질전환 (예컨대, 미국 특허 공개 2009/0104700 참조)을 통해 식물 세포 내로 도입될 수 있다.
추가로, 유전자 전달은 비-아그로박테리움 박테리아 또는 바이러스, 예컨대, 리조븀(Rhizobium) 종 NGR234, 시노리조븀 멜리로티(Sinorhizoboium meliloti), 메소리조븀 로티(Mesorhizobium loti), 감자 바이러스 X, 꽃양배추 모자이크 바이러스 및 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 이용하여 달성할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Chung et al., (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4] 참조).
형질전환 기술의 적용을 통해, 사실상 임의의 식물 종의 세포를 안정적으로 형질전환시킬 수 있고, 이들 세포는 공지된 기술에 의해 트랜스제닉 식물로 발생될 수 있다. 예를 들어, 목화 형질전환과 관련하여 특히 유용할 수 있는 기술은 미국 특허 5,846,797, 5,159,135, 5,004,863, 및 6,624,344에 기술되어 있고; 특히 브라시카 식물을 형질전환시키는 기술은 예를 들어, 미국 특허 5,750,871에 기술되어 있고; 대두를 형질전환시키는 기술은 예를 들어, 미국 특허 6,384,301에 기술되어 있고; 옥수수를 형질전환시키는 기술은 예를 들어, 미국 특허 7,060,876 및 5,591,616, 및 국제 PCT 공개 WO 95/06722에 기술되어 있다.
외인성 핵산의 수용 세포로의 전달을 수행한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로는 추후 배양 및 식물 재생을 위해 확인한다. 형질전환체를 확인할 수 있는 능력을 개선하기 위해, 형질전환체를 생성하는 데 사용된 형질전환 벡터와 함께 선택가능 마커 유전자를 사용하는 것을 요구할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 형질전환된 세포 집단은 세포를 선택제(들)에 노출시킴으로써 검정될 수 있거나, 세포를 요구되는 마커 유전자 형질에 대하여 스크리닝할 수 있다.
선택제에 대한 노출로부터 생존한 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 평가된 세포를 식물 재생을 지지하는 배지 중에서 배양할 수 있다. 한 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지는 추가 물질, 예컨대, 생장 조절제를 포함함으로써 변형될 수 있다. 식물 재생 노력을 시작하는 데 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 수동 선택을 수회 반복 수행한 후, 조직의 형태가 재생에 적합한 상태가 될 때까지 (예를 들어, 2주 이상) 조직을 성장 조절제를 포함하는 기초 배지에서 유지시킬 수 있고, 이어서, 이를 싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 싹이 충분히 형성될 때까지 주기적으로 배양액을 옮겨준다. 일단 싹이 형성되고 나면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 충분한 뿌리가 형성된 후, 식물을 추가 성장 및 성숙을 위해 토양으로 이식할 수 있다.
요구되는 핵산 포함 구축물이 재생 식물에 존재하는지 확인하기 위해, 다양한 검정을 수행할 수 있다. 상기 검정은 다음을 포함한다: 분자생물학적 검정, 예컨대, 서던 및 노던 블로팅 및 PCR; 생화학적 검정, 예컨대, 면역학적 수단 (ELISA, 웨스턴 블롯, 및/또는 LC-MS MS 분광광도법)에 의한 또는 효소 작용에 의한 단백질 생성물의 존재 검출; 식물 부분 검정, 예컨대, 잎 또는 뿌리 검정; 및/또는 재생된 전체 식물의 표현형 분석.
트랜스제닉 이벤트는 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 스크리닝될 수 있다. PCR 유전자형 분석은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서, PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 분석 방법은 잘 기술되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53] 참조), 세포 배양물을 비롯한 임의의 식물 종 또는 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 표적 서열 및 도입된 서열 둘 모두에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합은 PCR 증폭 반응에서 순차적으로 사용되거나, 또는 다중 사용될 수 있다. 표적 부위, 도입된 핵산 서열, 및/또는 그 둘의 조합에 어닐링하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용될 수 있다. 따라서, PCR 유전자형 분석 전략법은 비제한적인 예를 들어, 식물 게놈 내의 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 내의 다중 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 내의 비-특이적 서열의 증폭; 및 상기 중 임의 것의 조합을 포함할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 게놈 정보를 얻기 위해 프라이머 및 증폭 반응의 추가의 조합을 고안할 수 있다. 예를 들어, 도입된 핵산 서열의 경계 외부의 표적에 특이적인 핵산 서열(들)에 어닐링하도록 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 설계될 수 있다.
정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들어, 도입된 핵산 분자에 포함된 관심 뉴클레오티드 서열 내의 코딩 영역, 또는 핵산 분자의 다른 부분에 대응하는 서열에서, 도입된 핵산 분자에 특이적으로 어닐링하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 본원에 기술된 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 요구되는 서열에 따라 합성될 수 있고, (예컨대, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스, 인크. (Integrated DNA Technologies, Inc.: 미국 아이오와주 코랄빌)로부터) 상업적으로 이용가능하다. 증폭 후에 클로닝 및 서열결정, 또는 증폭 생성물의 직접 서열 분석을 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 표적에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 증폭에 사용된다.
트랜스진의 발현 방법
한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 인트론을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 및 5'-UTR을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 인트론을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 인트론을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론 및 3'-UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 및 5'-UTR을 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 인트론을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 및 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 인트론을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 하나의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 하나의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 및 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (또한 상류-프로모터를 포함)를 포함한다. 한 실시양태에서, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4일 수 있다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 또는 서열식별번호: 4에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일하다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포은 인트론을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론은 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6의 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 인트론을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서 인트론은 서열식별번호: 5 또는 서열식별번호: 6에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일하다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하고, 여기서 프로모터는 제아 메이스 프로모터, 또는 식물 (예를 들어, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 또는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터), 바이러스 (예를 들어, 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 프로모터), 또는 박테리아 (예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스 델타 매스)로부터 기원하는 프로모터이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR은 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일하다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하고, 여기서 프로모터는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 또는 식물 (예를 들어, 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터), 바이러스 (예를 들어, 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 프로모터), 또는 박테리아 (예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스 델타 매스)로부터 기원하는 프로모터이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR은 서열식별번호: 19의 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR은 서열식별번호: 19에 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, 또는 100% 동일하다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하고, 여기서 프로모터는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 또는 식물 (예를 들어, 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터), 바이러스 (예를 들어, 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 프로모터), 또는 박테리아 (예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스 델타 매스)로부터 기원하는 프로모터이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 예시적인 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 프로모터, 인트론, 3'-UTR, 및 5'-UTR은 유전자 발현 카세트가 2 이상의 트랜스진을 포함할 때 유전자 발현 카세트 내의 상이한 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론, 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 프로모터, 인트론, 및 3'-UTR은 유전자 발현 카세트가 2 이상의 트랜스진을 포함할 때 유전자 발현 카세트 내의 상이한 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR, 및 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 프로모터, 인트론, 3'-UTR, 및 5'-UTR은 유전자 발현 카세트가 2 이상의 트랜스진을 포함할 때 유전자 발현 카세트 내의 상이한 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR을 포함하고, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택가능 마커 트랜스진, 또는 이들의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법을 사용한 트랜스진 발현은 식물의 잎 및 줄기 조직 내에서의 발현이다. 한 실시양태에서, 트랜스진 발현은 식물의 잎 및 줄기 조직에서 발현되는 하나 초과의 트랜스진을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 트랜스제닉 식물을 성장시키는 방법은 잎 및 줄기-선호 트랜스진 발현을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 트랜스진을 발현시키는 방법은 잎 및 줄기-선호 조직 및 잎 및 줄기-선호 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 잎 및 줄기-선호 발현은 옥수수 잎 및 줄기-선호 발현을 포함한다.
추가의 실시양태에서, 본원에서 설명되는 방법을 사용한 트랜스진 발현은 지상 식물 조직 (예를 들어, 지상 식물 조직은 잎, 껍질, 줄기, 및 수염을 포함한다) 내의 발현이다. 한 실시양태에서, 트랜스진 발현은 지상 식물 조직에서 발현되는 하나 초과의 트랜스진을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에서 설명되는 트랜스제닉 식물을 성장시키는 방법은 지상 식물 조직 트랜스진 발현을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 트랜스진을 발현시키는 방법은 지상 식물 조직 및 지상 식물 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 지상 식물 조직 발현은 옥수수 지상 식물 조직 발현을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 본원에 개시된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 3'-UTR, 또는 5'-UTR 조절 요소를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 본원에 개시된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터, 인트론, 3'-UTR, 또는 5'-UTR 조절 요소를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 본원에 개시된 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 박테리오파지, 또는 바이러스 단편일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 단자엽성일 수 있다. 단자엽 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 옥수수, 벼, 밀, 사탕수수, 보리, 호밀, 수수, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 기장, 및 라이밀일 수 있고, 이로 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 쌍자엽성일 수 있다. 쌍자엽 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포는 평지씨, 카놀라, 갓, 에티오피아 겨자, 대두, 해바라기, 및 목화일 수 있고, 이로 제한되지 않는다.
유전적으로 변형된 식물 생산과 관련하여, 식물의 유전자 조작 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물에 대한 생물학적 및 물리적 형질전환 프로토콜을 비롯한 많은 식물 형질전환 방법이 개발되었다 (예를 들어, 문헌 [Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999)]; [Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)] 참고). 추가로, 벡터 및 식물 세포의 시험관내 배양 방법 또는 식물의 조직 형질전환 및 재생은 예를 들어, 문헌 [Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)]에서 이용가능하다.
통상의 기술자는 외인성 서열이 트랜스제닉 식물에 안정적으로 통합되고, 작동가능한 것으로 확인된 후, 유성 교배에 의해 다른 식물 내로 도입될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 교배되는 종에 따라, 임의의 많은 표준 육종 기술이 사용될 수 있다.
형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물은 형질전환 DNA 상에 존재하는 마커 유전자에 의해 코딩되는 형질에 대해 조작된 식물 물질을 선택 또는 스크리닝함으로써 확인 및 단리될 수 있다. 예를 들어, 선택은 형질전환 유전자 구축물이 그에 대한 저항성을 부여하는 억제량의 항생제 또는 제초제를 함유하는 배지 상에서 조작된 식물 물질을 성장시킴으로써 수행될 수 있다. 추가로, 형질전환된 세포는 또한 재조합 핵산 구축물 상에 존재할 수 있는 임의의 시각적 마커 유전자 (예를 들어, yfp, gfp, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, B 또는 C1 유전자)의 활성에 대하여 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 상기와 같은 선택 및 스크리닝 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
삽입된 유전자 구축물을 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체를 확인하기 위해 물리적 및 생화학적 방법이 또한 사용될 수 있다. 이러한 방법은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 1) 재조합 DNA 삽입체의 구조를 검출하고, 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구축물의 RNA 전사체를 검출 및 조사하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-연장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소적 검정 (상기 유전자 산물은 유전자 구축물에 의해 코딩되는 경우); 4) 차세대 서열결정 (NGS) 분석; 5) 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전, 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) (유전자 구축물 생성물이 단백질인 경우). 추가의 기술, 예컨대, 계내 혼성화, 효소 염색 및 면역염색이 또한 특이적인 식물 기관 및 조직에서 재조합 구축물의 존재 또는 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 상기의 모든 검정의 수행 방법은 통상의 기술자에 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하는 유전자 조작의 효과는 예를 들어, 관심 조직으로부터 단리된 RNA (예컨대, mRNA)의 노던 블롯에 의해 관찰할 수 있다. 전형적으로, mRNA가 존재하거나, 또는 mRNA의 양이 증가한 경우, 이는 대응하는 트랜스진이 발현된다고 추정할 수 있다. 유전자 및/또는 코딩된 폴리펩티드 활성을 측정하는 다른 방법도 사용될 수 있다. 사용되는 기질, 및 반응 생성물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라, 상이한 종류의 효소적 검정이 사용될 수 있다. 또한, 발현된 폴리펩티드의 수준은 면역화학적으로, 즉, ELISA, RIA, EIA 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 항체 기반 검정에 의해, 예컨대 (염색 또는 웨스턴 블로팅과 함께) 전기영동 검출 검정에 의해 측정될 수 있다. 비-제한적인 한 예로서, ELISA 검정을 이용하여 AAD-1 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; WO 2005/107437 참조) 및 PAT (포스피노트리신-N-아세틸-트랜스퍼라제) 단백질을 검출하는 것이 미국 특허 공개 20090093366에 기재되어 있다. 트랜스진은 식물의 일부 세포 종류 또는 조직에서, 또는 일부 발생 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 트랜스진은 실질적으로 모든 식물 조직에서 실질적으로 그의 전체 생활 주기를 따라 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합 발현 방식도 적용가능하다.
본 개시내용은 또한 트랜스진 또는 유전자 발현 카세트를 포함하는, 상기 설명된 트랜스제닉 식물의 종자를 포함한다. 본 개시내용은 트랜스진 또는 유전자 구축물을 갖는, 상기 설명된 트랜스제닉 식물의 자손체, 클론, 세포주 또는 세포를 추가로 포함한다.
본 발명은 구체적인 방법 및 실시양태에 관련하여 설명하였지만, 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 고발현 조절 요소의 확인
신규한 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 조절 요소를 차세대 서열결정법 (NGS)을 이용하여 전사 프로파일링 방식을 통해 확인하였다. 이어서, 트랜스제닉 식물에서 사용하기 위한 조절 요소의 발현 프로파일을 특성화하기 위해 이들 조절 요소를 확인하고 단리하고 클로닝하였다. 바실루스 투링기엔시스로부터 단리된 cry34Ab1 유전자 및 aad-1 선택가능 마커 유전자를 사용하여 안정하게 형질전환된 트랜스제닉 옥수수 식물주를 생산하고, 트랜스진 발현 수준 및 조직 특이성을 평가하였다. 그 자체로서 신규한 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 조절 요소를 확인하고 특성화하였다. 유전자 발현 구축물에서 사용하기 위한 프로모터, 인트론, 5' UTR, 및 3'-UTR 조절 요소를 최초로 개시한다.
전사 프로파일링 방식:
유전자 발현 카세트에서 사용하기 위한 요구되는 발현 프로파일을 갖는 천연 옥수수 유전자의 조절 요소를 확인하고 선택하기 위해 전사 프로파일링을 위한 상이한 식물 성장 및 발생 단계로 성장시킨 식물로부터 옥수수 조직을 얻었다. 예를 들어, 잎의 4개의 발생 단계 (V4 (이중), V12 및 R3) 및 뿌리의 4개의 발생 단계 (V4 및 V12 마디 조직 및 섬유 조직), 화분, 수염, 속대 (cob), 미성숙 커넬 (수분 20일 후), 껍질 및 줄기 (V4 및 R1)로부터 조직 샘플을 수집하였다. 상기 설명된 조직 전부로부터 총 mRNA를 단리하고, 목적하는 양의 고품질 mRNA를 얻었다.
이어서, 각각의 mRNA 샘플로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, 일루미나 (ILLUMINA) HISEQ® 2000 (일루미나 인크. (Illumina Inc.: 미국 캘리포니아주 샌디에고))을 이용하여 고-처리량 서열결정을 완료하였다. 또한, RNAseq 샘플 제조를 위해 제조사의 권장 프로토콜에 따라 일루미나 TRUSEQ® RNA 샘플 제조용 키트를 사용하였다. 간략하게 설명하면, 폴리-T 올리고-부착 자기 비드를 사용하여 5 ㎍의 총 RNA를 정제한 후, 고온 하에서 2가 양이온을 이용하여 더 작은 조각 (평균 길이 약 200 bp)으로 단편화하였다. 이어서, 슈퍼스크립트(SUPERSCRIPT)® II 역전사효소 및 무작위 프라이머를 이용하여 단편화된 mRNA를 제1 가닥 cDNA로 복사하였다. DNA 폴리머라제 I 및 RNase H를 이용하여 cDNA를 이중 가닥 cDNA (ds cDNA)로 추가로 전환하였다. 이어서, 이중 가닥 cDNA 단편에 대해 단부 복구, A-테일링, 이어서, 인덱싱된 일루미나 쌍형성-단부 (PE) 앱타머에 대한 라이게이션을 진행하였다. 마지막으로, 라이브러리 생성물을 세정하고, 15주기의 PCR 사이클을 수행하여 강화하고, 정제하였다. 강화된 라이브러리를 2 nM 농도로 정규화하고, 수산화나트륨으로 변성시키고, HISEQ® 유동 셀의 단일 레인 상에 로딩하기 위해 혼성화 완충제 중에서 12 pM으로 희석하였다. 일루미나 제조자의 권장 프로토콜에 따라 클러스터 생성, 프라이머 혼성화 및 서열결정 반응을 수행하였다.
이어서, 서열결정 리드 (read)를 여과하여 저품질 리드를 제거하였다. 여과 후, 서열결정 리드 중 약 99.9%가 유지되었다. 옥수수 GDB에서 이용가능한 주석이 달린 제아 메이스 c.v. B73 게놈에 대하여 서열결정 리드를 정렬하였다. 하나 초과의 유전자좌에서 옥수수 게놈 상에 지도화된 서열결정 리드는 폐기하여 고발현 유전자의 확인 및 그의 추가의 특징 규명에서의 혼선을 방지하였다. 본 단계를 거쳐 각 샘플로부터의 70% 초과의 서열결정 리드를 옥수수 게놈에 대하여 정렬할 수 있었다. 지도화된 100만 개의 단편당 엑손 1 킬로베이스당 단편의 정량적 유발자 발현 단위 (또는 FPKM 값)을 사용하여 유전자 발현 구축물에서 사용하기 위한 바람직한 발현 패턴에 매칭되는 유전자를 안정한 형질전환 시험에 대해 등급을 평가하였다. 옥수수에서 ~0.1%의 가장 고도로 발현된 유전자를 나타낸, 약 15-20개의 고발현 유전자를 안정한 트랜스제닉 계통에서 시험하기 위해 우선적으로 처리하였다 (도 1).
실시예 2: 유전자 조절 요소 확인
앞서 설명된 생물정보학 및 전사 프로파일링 방식으로부터 확인된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 서열로부터 프로모터, 인트론, 5'-UTR, 및 3'-UTR 서열을 추출하였다. 제아 메이스 c.v. B73 게놈으로부터 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자의 단리되고 정제된 서열을 서열식별번호: 9로서 제공한다. 전장 2,006 bp 프로모터 서열 (서열식별번호: 1)은 서열식별번호: 9의 염기쌍 1-2006을 포함한다. 1,887 bp 상류 프로모터 서열 (서열식별번호: 2)은 서열식별번호: 9의 염기쌍 1-1,887을 포함한다. 59 bp 인트론 서열 (서열식별번호: 5)은 서열식별번호: 9의 염기쌍 1,888-1,946을 포함한다. 60 bp 5'-UTR 서열 (서열식별번호: 19)은 서열식별번호: 9의 염기쌍 1,947-2,006을 포함한다. 코딩 서열에 측면이 접하는 ATG 및 TGA 번역 개시 및 중지 코돈은 각각 서열식별번호: 9의 염기쌍 2,007-2,009 및 2,802-2,804를 포함한다. 1,000 bp 3'-UTR 서열 (서열식별번호: 7)은 서열식별번호: 9의 염기쌍 2,805-3,804를 포함한다. 제2의 43 bp 인트론 (서열식별번호: 6)은 3'UTR 내에서 확인되고, 서열식별번호: 9의 염기쌍 2,809-2,851을 포함한다.
DNA 요소를 증폭 또는 합성하고, 도입 (entry) 벡터 내로 클로닝하였다. 전장 프로모터 및 전장 3'-UTR 크기는 각각 2,006 bp 및 1,000 bp이었다.
실시예 3: 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 및 3'-UTR 서열의 변형
제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 서열을 변형하였다. 반복된 서열을 확인하고 제거하여, 다음과 같은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 서열을 얻었다:
Figure pct00015
Figure pct00016
도 2는 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 3)와 비교한 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 1)의 정렬을 보여주고, 상기 정렬은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 서열을 생산하기 위해 제거된 반복된 폴리뉴클레오티드 서열을 보여준다.
이어서, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR 서열 (서열식별번호: 7)을 변형하였다. 3'-UTR을 400 bp 폴리뉴클레오티드 서열로 말단절단하여, 다음과 같은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR 서열 (서열식별번호: 8)을 얻었다:
Figure pct00017
DNA 요소를 증폭 또는 합성하고, 도입 벡터 내로 클로닝하였다. 변형된 프로모터 및 변형된 3'-UTR 길이는 각각 1,442 bp 및 400 bp이었다.
실시예 4: 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 구축물
서열식별번호: 5의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론 및 5' UTR 서열 (서열식별번호: 19)과 연결된 서열식별번호: 2의 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 상류 프로모터는 서열식별번호: 1의 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 생성하였다. cry34Ab1 (비. 투링기엔시스로부터의 리포터 유전자)의 발현은 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 1)에 의해 유도되었고, 솔라눔 투페로숨 PinII 3'-UTR (StPinII 3'-UTR v2; [An et al., (1989) Plant Cell 1; 115-22)에 의해 종결되었다. 각각의 유전자 요소는 그들의 측면 DNA 요소에 대해 최소 15 bp 중첩 상동성을 갖는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 모든 단편을 겔 정제하였다. 이어서, 진아트® 심리스(GENEART® Seamless) 클로닝 반응 (인비트로겐 (Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼스바드))을 통해 도입 벡터 골격 pENTR11을 따라 3개의 단편 모두를 한 방향 순서로 조립하였다. 이어서, 생성된 도입 플라스미드, 및 목적 벡터를 이용하여 게이트웨이® LR 클로나제® (GATEWAY® LR CLONASE®) (인비트로겐) 반응을 수행하여, 최종 발현 벡터 pDAB114438을 얻었다. 목적 벡터는 전장 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689)에 의해 유도되고 옥수수 리파제 3'-UTR (미국 특허 7,179,902)에 의해 종결되는 aad-1 유전자로 이루어진 선택가능 마커 카세트를 함유하였다. 생성된 구축물인 pDAB114438은 aad-1 유전자 발현 카세트 및 cry34Ab1 유전자 발현 구축물을 함유하는 이종성 발현 구축물 (도 3)이다.
제2 구축물에서, cry34Ab1 (비. 투링기엔시스로부터의 리포터 유전자)의 발현은 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 1)에 의해 유도되었고, 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR (서열식별번호: 8)에 의해 종결되었다. 각각의 유전자 요소는 그들의 측면 DNA 요소에 대해 최소 15 bp 중첩 상동성을 갖는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 모든 단편을 겔 정제하였다. 이어서, 진아트® 심리스 클로닝 반응 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드))을 통해 도입 벡터 골격 pENTR11을 따라 3개의 단편 모두를 한 방향 순서로 조립하였다. 이어서, 생성된 도입 플라스미드, 및 목적 벡터를 이용하여 게이트웨이® LR 클로나제® (인비트로겐) 반응을 수행하여, 최종 발현 벡터 pDAB120166을 얻었다. 목적 벡터는 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689)에 의해 유도되고 옥수수 리파제 3'-UTR (미국 특허 7,179,902)에 의해 종결되는 aad-1 유전자로 이루어진 선택가능 마커 카세트를 함유하였다. 생성된 구축물인 pDAB120166은 aad-1 유전자 발현 카세트 및 cry34Ab1 유전자 발현 구축물을 함유하는 이종성 발현 구축물 (도 7)이다.
제3 구축물에서, cry34Ab1 (비. 투링기엔시스로부터의 리포터 유전자)의 발현은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터에 의해 유도되었다. 서열식별번호: 5의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론 및 5' UTR 서열 (서열식별번호: 19)과 연결된 서열식별번호: 4의 변형된 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 상류 프로모터는 서열식별번호: 3의 변형된 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터를 생성하였다. cry34Ab1 (비. 투링기엔시스로부터의 리포터 유전자)의 발현은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 3)에 의해 유도되었고, 솔라눔 투페로숨 PinII 3'-UTR (StPinII 3'-UTR v2; [An et al., (1989) Plant Cell 1; 115-22])에 의해 종결되었다. 각각의 유전자 요소는 그들의 측면 DNA 요소에 대해 최소 15 bp 중첩 상동성을 갖는 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 모든 단편을 겔 정제하였다. 이어서, 진아트® 심리스 클로닝 반응 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드))을 통해 도입 벡터 골격 pENTR11을 따라 3개의 단편 모두를 한 방향 순서로 조립하였다. 이어서, 생성된 도입 플라스미드, 및 목적 벡터를 이용하여 게이트웨이® LR 클로나제® (인비트로겐) 반응을 수행하여, 최종 발현 벡터 pDAB120165를 얻었다. 목적 벡터는 변형된 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689)에 의해 유도되고 옥수수 리파제 3'-UTR (미국 특허 7,179,902)에 의해 종결되는 aad-1 유전자로 이루어진 선택가능 마커 카세트를 함유하였다. 생성된 구축물인 pDAB120165는 aad-1 유전자 발현 카세트 및 cry34Ab1 유전자 발현 구축물을 함유하는 이종성 발현 구축물 (도 6)이다.
cry34Ab1 유전자 대신 황색 형광 단백질 (YFP; Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21; 841-50) 리포터 유전자 및 pDAB114438에 존재하는 것과 동일한 aad-1 발현 카세트를 함유하는 음성 대조군 구축물 pDAB101556 (도 4)을 조립하였다. cry34Ab1 유전자의 발현을 제어하는 제아 메이스 유비퀴틴-1 프로모터 및 솔라눔 투베로숨 프로테아제 억제제 유전자 II 3' UTR (StPinII 3'-UTR v2; [An et al., (1989) Plant Cell 1; 115-22])로 이루어진 양성 대조군 구축물 pDAB108746 (도 5)을 구축하였다. aad-1 카세트는 pDAB114438에 존재하는 것과 동일하였다.
실시예 5: 식물 형질전환 및 분자적 확인
아그로박테리움 투메파시엔스의 형질전환:
2원 발현 벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 DAt13192 (RecA 결핍 3원 균주) (국제 특허 공개 WO2012016222)를 형질전환시켰다. 박테리아 콜로니를 선택하고, 2원 플라스미드 DNA를 단리하고, 제한 효소 소화를 통해 확인하였다.
아그로박테리움 배양 개시:
아그로박테리움 배양물을 AB 최소 배지 ([Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79]; 수크로스를 첨가하지 않고, 5 g/L 글루코스 및 15 g/L 박토™ 아가(BACTO™ Agar)를 첨가하여 제조) 상의 글리세롤 원액으로부터 스트리킹하고, 암소에서 3일 동안 20℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 아그로박테리움 배양액을 YEP 배지 (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79)의 플레이트 상에서 스트리킹하고, 암소에서 1일 동안 20℃에서 인큐베이팅하였다.
실험 당일, 접종 배지 (2.2 g/L MS 염, 68.4 g/L 수크로스, 36 g/L 글루코스, 115 mg/L L-프롤린, 2 mg/L 글라이신, 100 mg/L 미오-이노시톨, 0.05 mg/L 니코틴산, 0.5 mg/L 피리독신 HCl, 0.5 mg/L 티아민 HCl) 및 아세토시린곤의 혼합물을 실험 크기에 적절한 부피로 제조하였다. 100% 디메틸 술폭시드 중 아세토시린곤의 1 M 원액을 접종 배지에 첨가하여 아세토시린곤의 최종 농도가 200 μM이 되도록 만들었다.
각각의 구축물에 대해, YEP 플레이트로부터의 1-2 루프의 아그로박테리움을 멸균, 일회용 50 ml 원심분리관 내의 15 ml의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물 내에 현탁하고, 600 nm에서 용액의 광학 밀도 (O.D.600)를 분광광도계로 측정하였다. 이어서, 추가의 접종 배지/아세토시린곤 혼합물을 사용하여 현탁액을 0.25-0.35 O.D.600 미만으로 희석하였다. 이어서, 사용 전에 1 내지 4시간 동안 실온에서 아그로박테리움 현탁액의 튜브를 약 75 rpm으로 설정한 플랫폼 진탕기 상에 수평으로 놓았다.
옥수수 형질전환:
실험적 구축물을, 근교계 제아 메이스 c.v. B104로부터 단리된 미성숙 배아의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 옥수수 내로 형질전환시켰다. 사용된 방법은 문헌 [Ishida et al., (1996) Nature Biotechnol 14:745-750] 및 [Frame et al., (2006) Plant Cell Rep 25: 1024-1034]에 공개된 것과 유사하지만, 방법이 고-처리량 형질전환을 할 수 있도록 몇몇 변형 및 개선을 포함하였다. 옥수수에서 많은 트랜스제닉 이벤트를 생산하기 위해 사용된 방법의 예는 미국 특허 출원 공개 US 2013/0157369 A1에 제공되어 있고, 여기에서는 배아 감염 및 동시-배양 단계로 출발한다.
분자 확인:
cry34Ab1 및 aad-1 정량적 PCR 검정을 이용하여 트랜스진 존재에 대해 추정 트랜스제닉 옥수수 식물을 V2-3 잎 기에서 샘플링하였다. 제조자의 지시에 따라 맥어트렉트(MAGATTRACT)® DNA 추출 키트 (퀴아젠(Qiagen))을 사용하여 4개의 잎 펀치 (punch)로부터 총 DNA를 추출하였다.
관심 유전자를 검출하기 위해, cry34Ab1 유전자에 대해 FAM-표지된 형광 프로브 및 내인성 인버타제 참조 유전자 대조군에 대해 HEX-표지된 형광 프로브를 함유하는 택맨® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 유전자-특이적 DNA 단편을 증폭시켰다. cry34Ab1 및 인버타제 내인성 인버타제 유전자 증폭을 위해 다음 프라이머를 사용하였다. 프라이머 서열은 다음과 같았다;
Cry34Ab1 프라이머/프로브:
정방향 프라이머: TQ.8v6.1.F: GCCATACCCTCCAGTTG (서열식별번호: 10)
역방향 프라이머: TQ.8v6.1.R: GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG (서열식별번호: 11)
프로브: TQ.8v6.1.MGB.P: 5'-/56-FAM/ CCGAATCCAACGGCTTCA / MGB (서열식별번호: 12)
인버타제 프라이머:
정방향 프라이머: 인버타제F: TGGCGGACGACGACTTGT (서열식별번호: 13)
역방향 프라이머: 인버타제R: AAAGTTTGGAGGCTGCCGT (서열식별번호: 14)
인버타제 프로브: 5'-/5HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTACTT/3BHQ_1/-3' (서열식별번호: 15)
이어서, 5 ㎕의 로슈 (Roche) 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)® 480 프로브 마스터 믹스 (Master Mix) (로슈 어플라이드 사이언시즈 (Roche Applied Sciences, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)); 10 μΜ 원액으로부터 400 nM의 최종 농도까지 0.4 ㎕의 각각의 TQ.8v6.1.F, TQ.8v6.1.R, 인버타제F, 및 인버타제R 프라이머; 5 μΜ 원액으로부터 200 nM의 최종 농도까지 0.4 ㎕의 각각의 TQ.8v6.1.MGB.P 및 인버타제 프로브, 0.1 ㎕의 0.1%의 최종 농도까지 10% 폴리비닐피롤리돈 (PVP); 2 ㎕의 10 ng/㎕ 게놈 DNA 및 0.5 ㎕의 물을 함유하는 10 ㎕ 반응액의 최종 부피에서 PCR 반응을 수행하였다. DNA를 다음 조건 하에 로슈 라이트사이클러® 480 시스템 내에서 증폭시켰다: 95℃에서 10 min 동안 1 사이클; 다음 3-단계의 40 사이클: 95℃에서 10초; 58℃에서 35초 및 72℃에서 1초, 및 4℃에서 10초의 최종 사이클. Cry34Ab1 카피수(copy number)는 미지의 샘플에 대한 표적 (관심 유전자)/참조 (인버타제 유전자) 값 (라이트사이클러® 480에 의해 출력된)을 cry34Ab1 카피수 대조군의 표적/참조 값에 비교하여 결정하였다.
aad-1 유전자의 검출은 인버타제 내인성 참조 유전자를 사용하여 cry34Ab1 유전자에 대해 상기 설명된 바와 같이 수행하였다. aad-1 프라이머 서열은 다음과 같았다;
AAD1 정방향 프라이머: TGTTCGGTTCCCTCTACCAA (서열식별번호: 16)
AAD1 역방향 프라이머: CAACATCCATCACCTTGACTGA (서열식별번호: 17)
AAD1 프로브: 5'-FAM/CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA-MGB/BHQ-3' (서열식별번호: 18)
마지막으로, 관심 유전자를 함유하는 T0 식물을 cry34Ab1 및 AAD-1 잎 ELISA 검정을 위해 V4-5에 샘플링하였다. 4개의 잎 펀치를 샘플링하였다. 또 다른 세트의 식물을 두 단백질 ELISA 검정을 위해 전체 뿌리 질량에 대해 V4-5에 샘플링하였다. 잎 및 뿌리 Cry34Ab1 (애그디아, 인크. (Agdia, Inc., 미국 인디애나주 엘하르트)) 및 AAD-1 (아카디아 바이오사이언스(Acadia Bioscience)) ELISA 검정을 제조자의 지시에 따라 수행하였다. Cry34Ab1 잎 ELISA 검정은 ng/㎠로서 또는 백만부 (ppm, 또는 ng 단백질/mg 총 식물 단백질)로서 표현한 한편, 뿌리 ELISA 결과는 ppm으로서 표현하였다. 총 뿌리 단백질 검정은 제조자의 지시에 따라 브래드포드 (Bradford) 검출 방법으로 수행하였다.
T0 식물을 제아 메이스 c.v. B104 비-트랜스제닉 형질전환 식물주에 교배하여 T1 종자를 얻었다. 3개의 트랜스제닉 식물주 또는 각각의 시험 조절 요소 구축물의 이벤트를 T1 단백질 및 RNA 유전자 발현 연구를 위해, 이어서 T2 종자 생산까지 진행시켰다. 따라서, 각각의 이벤트의 30-40개의 T1 종자를 심고; 모종에 발생의 V2-V3 기에 ASSUREII®를 분무하여 비-트랜스제닉 분리개체 (segregant)를 치사시켰다. 트랜스제닉 식물을 cry34Ab1 및 AAD-1 ELISA를 위해 다음과 같이 다수의 식물 발생 기에 샘플링하였다: 잎(V4, V12 및 R3); 뿌리 (V4 및 R1); 줄기 (R1); 화분 (R1); 수염 (R1); 껍질 (R3); 커넬 (R3); 및 속대 (R3). 모든 조직을 단리하고, 드라이아이스 내에 묻은 튜브 내에 넣은 후; 이것을 -80℃로 옮겼다. 동결된 조직을 ELISA를 위한 단백질 추출에 앞서 동결건조시켰다.
cry34Ab1, yfp 및 aad-1 트랜스진을 함유하는 추정 트랜스제닉 T1 식물을 잎 ELISA 검정을 위해 V4-5에서 샘플링하였다. 4개의 잎 펀치를 샘플링하였다. 잎 펀치를 튜브 내에 넣고, 단일 1/8" 스테인레스 스틸 비드 (후버 프리시전 프로덕츠 (Hoover Precision Products, 미국 조지아주 커밍))를, 300 ㎕의 추출 완충제 (0.05% Tween 20 및 0.5% BSA를 보충한 1 X PBST)을 담은 각각의 1.2 ml 튜브에 첨가하였다. 샘플을 제노그라인더(GENOGRINDER)™ (스펙스 샘플프렙 (SPEX SamplePrep, 미국 뉴저지주 메투첸)) 내에서 1,500 rpm에서 4분 동안 처리하였다. 샘플을 소르볼 레젠드 엑스에프알(Sorvall Legend XFR)™ 원심분리기 내에서 4,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 이어서, 추가의 300 ㎕의 추출 완충제를 첨가하고, 샘플을 제노그라인더™ 내에서 1,500 rpm에서 2분 동안 1회 더 처리하였다. 샘플을 4,000 rpm에서 7분 동안 1회 더 원심분리하였다. 마지막으로, 상청액을 수집하고, 제조자의 지시에 따라 상업상 이용가능한 Cry34Ab1 (애그디아, 인크.) 및 AAD-1 (아카디아 바이오사이언스, 엘엘씨 (Acadia BioScience, LLC) ELISA 검정 키트를 사용하여 단백질 표준물과 함께 상이한 희석액에서 ELISA 검정을 완료하였다. 다양한 조직 종류 ELISA를 위한 단백질 추출은 동결건조된 조직을 페인트 (paint) 진탕기 내에서 30초 동안 연마함으로써 수행하였다. 추가의 연마를 필요로 하는 조직에 대해, 연마 단계를 추가로 30초 동안 반복하였다. 가넷(Garnet) 분말을 첨가하여 튜브 바닥의 만곡 부분을 덮었다. 굵게 연마된 조직을 2 ml 튜브에 옮기고, 0.5 ml 표시까지 채웠다. 1개의 세라믹 공을 각각의 튜브에 첨가하고, 또한 0.6 ml의 부분 추출 완충제 (200 ㎕의 프로테아제 억제제 칵테일, 200 ㎕의 500 mM EDTA, 15.5 mg DTT 분말 및 PBST를 20 ml로)를 첨가하였다. 모든 튜브를 얼음 상에 10분 동안 유지하였다. 냉각 튜브를 제노그라인더™의 2 ml 홀더에 옮겼다. 샘플을 그 사이에 얼음 상에서 5분 냉각하면서 30초 동안 2회 연마하였다. 이어서, 40 ㎕의 10% TWEEN®-20 및 300 ㎕ 추출 완충제를 샘플에 첨가하였다. 샘플을 그 사이에 5분 냉각하면서 추가로 30초 동안 연마하였다. 마지막으로, 각각의 샘플을 13,000 rpm에서 7분 동안 원심분리하고, 상청액을 추출물을 수집하기 위해 새로운 튜브에 조심스럽게 옮겼다. 추출물을 추출 완충제 내에 재현탁하고, ELISA 검정 잎 조직을 위해 필요한 만큼 희석하였다.
실시예 6: T0 트랜스제닉 식물 발현
Cry34Ab1 ELISA 결과는 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소 (서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2)가 구축물 pDAB114438로 형질전환시킨 T0 이벤트에서 Cry34Ab1의 잎 선호 발현을 유도함을 나타내었다. 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소에 의한 Cry34Ab1의 사소한 발현이 이들 이벤트의 뿌리 조직에서 관찰되었다 (표 1 및 2). 양성 대조군 구축물 pDAB108746으로부터 생산된 이벤트는 잎 및 뿌리 조직 모두에서 Cry34Ab1을 발현하였다. cry34Ab1 유전자를 함유하지 않은 음성 대조군 구축물, pDAB101556로 형질전환시킨 식물 이벤트에서 Cry34Ab1 잎 발현은 관찰되거나 검출되지 않았다. 모든 구축물은 뿌리 및 잎 조직 모두에서 aad-1 유전자를 발현하였다.
추가로, 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소 (서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4)는 T0 트랜스제닉 식물에서 ELISA에 의해 측정할 때 잎(V4)에서 Cry34Ab1 및 AAD-1 단백질의 발현을 유도하였다 (표 3). pDAB120165를 사용하여 형질전환시킨 T0 트랜스제닉 식물은 St. PinII 3'-UTR과 조합하여 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 3 및 4)의 발현을 나타내는 반면, pDAB120166로 형질전환시킨 T0 트랜스제닉 식물은 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR (서열식별번호: 8)와 조합하여 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 1 및 2)의 발현을 나타낸다. 이들 결과는 본 개시내용의 프로모터 (서열식별번호: 1-4) 및 3'-UTR (서열식별번호: 7-8) 서열이 트랜스제닉 T0 옥수수 식물 이벤트 내에서 유전자 발현 카세트 내의 트랜스진의 발현을 유도하기 위해 기능적임을 나타낸다.
<표 1>
다양한 구축물 이벤트의 V4-V6 옥수수 잎에서 cry34Ab1 및 AAD-1 트랜스진 발현을 보여주는 ELISA 결과. STD는 표준 편차에 대한 약어이다.
Figure pct00018
<표 2>
다양한 구축물 이벤트의 V4-6 옥수수 뿌리에서 cry34 및 AAD-1 트랜스진 발현을 보여주는 ELISA 검정 결과. STD는 표준 편차에 대한 약어이다.
Figure pct00019
<표 3>
전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터에 의해 유도되고 pDAB120166에 대해 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR에 의해, 및 pDAB120165에 대해 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR에 의해 종결된 잎(V4)에서 Cry34Ab1 단백질 발현을 T0 트랜스제닉 식물에서 ELISA에 의해 측정하였다. AAD-1에 대한 잎(V4)에서 단백질 발현이 또한 포함된다. STD는 표준 편차에 대한 약어이다.
Figure pct00020
실시예 7: T1 트랜스제닉 식물 발현
T1 트랜스제닉 식물 이벤트의 Cry34 ELISA 결과는 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소 (서열식별번호: 1)가 Cry34Ab1의, 구체적으로 잎, 줄기 및 껍질 조직에서 지상 선호 발현을 유도함을 나타내었다. 상기 데이타는 구축물 pDAB114438로 형질전환시킨 T1 이벤트로부터 생성되었다. 추가로, 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 조절 요소 (서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2)에 의한 Cry34Ab1의 사소한 발현이 이들 이벤트의 뿌리, 커넬, 및 화분 조직에서 관찰되었다 (표 4). 흥미롭게도, 속대 조직 내에서 Cry34Ab1의 발현은 분석된 이벤트의 수염 조직 내에서 Cry34Ab1의 발현보다 10배 더 낮은 발현을 나타냈다. 음성 대조군 구축물, pDAB101556로 형질전환시킨 식물 이벤트 내에서 Cry34Ab1 잎 발현은 관찰되거나 검출되지 않았다. 상기 구축물, pDAB101556은 cry34Ab1 트랜스진을 함유하지 않는다. 모든 구축물은 뿌리 및 잎 조직 모두에서 aad-1 유전자를 발현하였다.
<표 4>
T1 트랜스제닉 식물에서 ELISA에 의해 측정할 때 상이한 조직 종류 내에서 Cry34Ab1 및 AAD-1 단백질 발현. STD는 표준 편차에 대한 약어이다.
Figure pct00021
잎(V4)의 T1 Cry34Ab1 ELISA 결과는 cry34ab1 유전자에 대한 조절 요소로서 상이한 3'-UTR을 갖는 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 1 및 2)를 함유하는 pDAB120166 및 pDAB114438 트랜스제닉 이벤트에서 유사한 발현 범위를 보여주었다. 전자의 구축물, pDAB120166은 프로모터와 동일한 유전자로부터 유래된 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR (서열식별번호: 8)을 함유한 반면, 후자의 구축물, pDAB114438은 St PinII 3'-UTR을 함유하였다. T1 잎(V4) Cry34Ab1 (표 5). 잎(V4) 조직의 T1 Cry34Ab1 ELISA 결과 내에, cry34ab1 유전자에 대한 조절 요소로서 St PinII 3'-UTR을 갖는 변형된 길이의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 3 및 4)를 함유한 pDAB120165 트랜스제닉 이벤트가 추가로 포함되었다. pDAB120165 트랜스제닉 이벤트의 ELISA 결과는 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터 (서열식별번호: 1 및 2)를 함유하는 pDAB120166 또는 pDAB114438에 비해 약 50%-60% 더 적은 발현을 보였다. 구축물 pDAB120165는 변형된 프로모터 (서열식별번호: 3 및 4) 및 PinII 3'-UTR을 함유하였다. 이들 결과는 본 개시내용의 프로모터 (서열식별번호: 1-4) 및 3'-UTR (서열식별번호: 7-8) 서열이 트랜스제닉 T1 옥수수 식물 이벤트 내에서 유전자 발현 카세트 내의 트랜스진의 발현을 유도하기 위해 기능적임을 나타낸다.
<표 5>
상이한 구축물의 T1 트랜스제닉 식물에서 ELISA에 의해 측정된 잎(V4)에서 Cry34Ab1 및 AAD-1 단백질 발현. STD는 표준 편차에 대한 약어이다.
Figure pct00022
NA = 적용되지 않음.
따라서, 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2의 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터; 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4의 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 프로모터; 서열식별번호: 5의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 인트론; 서열식별번호: 19의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR; 서열식별번호: 19의 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 5'-UTR; 서열식별번호: 7의 전장 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR; 및 서열식별번호: 8의 변형된 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 3'-UTR을 포함하는 신규한 제아 메이스 클로로필 a/b 결합 유전자 조절 요소를 확인하고 특성화하였다. 유전자 발현 구축물에서 사용하기 위한신규한 프로모터 조절 요소를 최초로 개시한다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences, LLC Gupta, Manju Bennett, Sara Elango, Navin Muthuraman, Karthik Beringer, Jeffrey Wu, Huxia <120> ZEA MAYS REGULATORY ELEMENTS <130> 74485 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2006 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Zea mays chlorophyll a/b binding gene promoter <400> 1 gcacaaaata cataaaacta gattagaaaa ggaagagaat acgccaaatt gcagcttaat 60 caattagacg atttagtcct gtttttacga aacaattgtt taagataaca ttaggacatg 120 tacaatatgt gtctttggat gtgtttaagg agtaaatgta aaaaaaatag atacgtctct 180 taacgaagtc attgtgtctt ggctctatgc tcgagacgga gaaatagcta attgattaat 240 ttaatttatt gaatgttctt attggtgtaa tgaatatagt aaggcactgg ccttatactt 300 ggagtttggc atgtcttatg ctatgttgca aacaggcccg gtcttgacat ttcgggggcc 360 ctaagagaaa atttatatag aggtcctata cgaaaatttg agtctgttat tttttcaact 420 tttaaataat atatgaaaaa taaaaaattg atgatttaca taattttatt caaaatgata 480 tgactggaaa tattgttaca gtattttatg agtcgtaaaa ttatataaat tatgtaatat 540 acatttgttt tgacttttga gagagtattt ttacttttaa tttgtcaaac tagcctaaac 600 cttaaaatac acagtaaacc aaatctaaat acattagatc aaattttctg aaaataaagt 660 tcagcaaact aaactaggat taatcaatgt aggttattag ggtcgaccct tcggtaggct 720 agaattaagc aacgcgatag gcacaggtgt acaacacctt tcgtccttcc cacgtcaatt 780 ttagggcctg tttggttcac ggctaattat gccacacttt gcctaaggtt agtcgtccga 840 attgaagaac taaccttatg cagaaaagtt aggcaaagta tggcaagtta ggtagtaaac 900 caaacaggcc aaagtatttg tcatcaagca gacggttgcg cgacctcaaa gagatgattg 960 ctagaaaata aagagacgca acaaaagaat gaaaatatag atttatctat aacttatatg 1020 catttgatat aagatagata aatgggagcc ctacgaacct tgaggctctg agcagtcgca 1080 tatcctgcac acccttggcg ccggccctgg ttgcaaatat gcaattgtgt ccttatccgc 1140 gactggtcac gaggctagga ttgatcgaaa gctgccgatg agaaatggca agggcggcat 1200 gctgtggcct tttttttacg gtctgtcagg acaactgaaa agttacaaat ttatagtggt 1260 tgtaaacagc aacacgttaa aaagtcgatt atcagtttca cagaaagagg tcgttaaaac 1320 cgccagcaag cttgtttcac tatcagtctg tcgctaagac aatctctttc accaaaaata 1380 caatttgctt tcttgccgtt gcttcaagtg aaaatcttaa tgttttaaat taaaatatgt 1440 ggctctacgt aggaaaaaat aattcaatcg agtctcattt cataaaaaaa atttggtcaa 1500 aaaattatac accatctcgc tcaagtgact caaatatact aaacggtact gagctgtctt 1560 ataatataaa tttgatttac tgttagaata tgatgtttta tgagtgcact aaattctata 1620 aaatatattt atttttaaat tataagatat ttttataggt ctgctcttag agagagctaa 1680 aaaagagaga ggctgtctga agaaaaatcc ataaccaacg caaaatcccg ggcgcccaat 1740 cagccttctc cgcggagatt cctagcctca gccagagcta cctcatctgc gtgaggctcc 1800 ggtggcgcca agtgttccgg catcccggac gcaccaatgg catccgagca acagatcttt 1860 tctgcaacaa cgcttcgcgt cgcggcggtg tttccctcca tctgctctgc tctttaaata 1920 cctccgtcgt ctcctcgtct ccacagcatc tcaagtcttc acactcctcg ccatcacata 1980 aaaccagtgc aagcagaagc agcgca 2006 <210> 2 <211> 1887 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Zea mays chlorophyll a/b binding gene upstream-promoter <400> 2 gcacaaaata cataaaacta gattagaaaa ggaagagaat acgccaaatt gcagcttaat 60 caattagacg atttagtcct gtttttacga aacaattgtt taagataaca ttaggacatg 120 tacaatatgt gtctttggat gtgtttaagg agtaaatgta aaaaaaatag atacgtctct 180 taacgaagtc attgtgtctt ggctctatgc tcgagacgga gaaatagcta attgattaat 240 ttaatttatt gaatgttctt attggtgtaa tgaatatagt aaggcactgg ccttatactt 300 ggagtttggc atgtcttatg ctatgttgca aacaggcccg gtcttgacat ttcgggggcc 360 ctaagagaaa atttatatag aggtcctata cgaaaatttg agtctgttat tttttcaact 420 tttaaataat atatgaaaaa taaaaaattg atgatttaca taattttatt caaaatgata 480 tgactggaaa tattgttaca gtattttatg agtcgtaaaa ttatataaat tatgtaatat 540 acatttgttt tgacttttga gagagtattt ttacttttaa tttgtcaaac tagcctaaac 600 cttaaaatac acagtaaacc aaatctaaat acattagatc aaattttctg aaaataaagt 660 tcagcaaact aaactaggat taatcaatgt aggttattag ggtcgaccct tcggtaggct 720 agaattaagc aacgcgatag gcacaggtgt acaacacctt tcgtccttcc cacgtcaatt 780 ttagggcctg tttggttcac ggctaattat gccacacttt gcctaaggtt agtcgtccga 840 attgaagaac taaccttatg cagaaaagtt aggcaaagta tggcaagtta ggtagtaaac 900 caaacaggcc aaagtatttg tcatcaagca gacggttgcg cgacctcaaa gagatgattg 960 ctagaaaata aagagacgca acaaaagaat gaaaatatag atttatctat aacttatatg 1020 catttgatat aagatagata aatgggagcc ctacgaacct tgaggctctg agcagtcgca 1080 tatcctgcac acccttggcg ccggccctgg ttgcaaatat gcaattgtgt ccttatccgc 1140 gactggtcac gaggctagga ttgatcgaaa gctgccgatg agaaatggca agggcggcat 1200 gctgtggcct tttttttacg gtctgtcagg acaactgaaa agttacaaat ttatagtggt 1260 tgtaaacagc aacacgttaa aaagtcgatt atcagtttca cagaaagagg tcgttaaaac 1320 cgccagcaag cttgtttcac tatcagtctg tcgctaagac aatctctttc accaaaaata 1380 caatttgctt tcttgccgtt gcttcaagtg aaaatcttaa tgttttaaat taaaatatgt 1440 ggctctacgt aggaaaaaat aattcaatcg agtctcattt cataaaaaaa atttggtcaa 1500 aaaattatac accatctcgc tcaagtgact caaatatact aaacggtact gagctgtctt 1560 ataatataaa tttgatttac tgttagaata tgatgtttta tgagtgcact aaattctata 1620 aaatatattt atttttaaat tataagatat ttttataggt ctgctcttag agagagctaa 1680 aaaagagaga ggctgtctga agaaaaatcc ataaccaacg caaaatcccg ggcgcccaat 1740 cagccttctc cgcggagatt cctagcctca gccagagcta cctcatctgc gtgaggctcc 1800 ggtggcgcca agtgttccgg catcccggac gcaccaatgg catccgagca acagatcttt 1860 tctgcaacaa cgcttcgcgt cgcggcg 1887 <210> 3 <211> 1442 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> modified Zea mays chlorophyll a/b binding gene promoter <400> 3 gcacaaaata cataaaacta gattagaaaa ggaagagaat acgccaaatt gcagcttaat 60 caattagacg atttagtcct gtttttacga aacaattgtt taagataaca tggccttata 120 cttggagttt ggcatgtctt atgctatgtt gcaaacaggc ccggtcttga catttcgggg 180 gccctaagag aaaatttata tagaggtcct atacgaaaat ttgagtctgt tattttttca 240 acttttaaat aatatatgaa aaataaaaaa ttgatgattt acataatttt attcaaaatg 300 atatgactgg aaatattgtt acagtatttt atgagtcgta aaattatata aattatgtaa 360 tatacatttg ttttgacttt tgagagagta tttttacttt taatttgtca aactagccta 420 aaccttaaaa tacacagtaa accaaatcta aatacattag atcaaatttt ctgaaaataa 480 agttcagcaa actaaactag gattaatcaa tgtaggttat tagggtcgac ccttcggtag 540 gctagaatta agcaacgcga taggcacagg tgtacaacac ctttcgtcct tcccacgtca 600 ataaagtatt tgtcatcaag cagacggttg cgcgacctca aagagatgat tgctagaaaa 660 taaagagacg caacaaaaga atgaaaatat agatttatct ataacttata tgcatttgat 720 ataagataga taaatgggag ccctacgaac cttgaggctc tgagcagtcg catatcctgc 780 acacccttgg cgccggccct ggttgcaaat atgcaattgt gtccttatcc gcgactggtc 840 acgaggctag gattgatcga aagctgccga tgagaaatgg caagggcggc atgctgtggc 900 ctttttttta cggtctgtca ggacaactga aaagttacaa atttatagtg gttgtaaaca 960 gcaacacgtt aaaaagtcga ttatcagttt cacagaaaga ggtcgttaaa accgccagca 1020 agcttgtttc actatcagtc tgtcgctaag acaatctctt tcaccaaaaa tacaatttgc 1080 tttcttgccg ttgcttcaag tgaaaatctg agctaaaaaa gagagaggct gtctgaagaa 1140 aaatccataa ccaacgcaaa atcccgggcg cccaatcagc cttctccgcg gagattccta 1200 gcctcagcca gagctacctc atctgcgtga ggctccggtg gcgccaagtg ttccggcatc 1260 ccggacgcac caatggcatc cgagcaacag atcttttctg caacaacgct tcgcgtcgcg 1320 gcggtgtttc cctccatctg ctctgctctt taaatacctc cgtcgtctcc tcgtctccac 1380 agcatctcaa gtcttcacac tcctcgccat cacataaaac cagtgcaagc agaagcagcg 1440 ca 1442 <210> 4 <211> 1323 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> modified Zea mays chlorophyll a/b binding gene upstream-promoter <400> 4 gcacaaaata cataaaacta gattagaaaa ggaagagaat acgccaaatt gcagcttaat 60 caattagacg atttagtcct gtttttacga aacaattgtt taagataaca tggccttata 120 cttggagttt ggcatgtctt atgctatgtt gcaaacaggc ccggtcttga catttcgggg 180 gccctaagag aaaatttata tagaggtcct atacgaaaat ttgagtctgt tattttttca 240 acttttaaat aatatatgaa aaataaaaaa ttgatgattt acataatttt attcaaaatg 300 atatgactgg aaatattgtt acagtatttt atgagtcgta aaattatata aattatgtaa 360 tatacatttg ttttgacttt tgagagagta tttttacttt taatttgtca aactagccta 420 aaccttaaaa tacacagtaa accaaatcta aatacattag atcaaatttt ctgaaaataa 480 agttcagcaa actaaactag gattaatcaa tgtaggttat tagggtcgac ccttcggtag 540 gctagaatta agcaacgcga taggcacagg tgtacaacac ctttcgtcct tcccacgtca 600 ataaagtatt tgtcatcaag cagacggttg cgcgacctca aagagatgat tgctagaaaa 660 taaagagacg caacaaaaga atgaaaatat agatttatct ataacttata tgcatttgat 720 ataagataga taaatgggag ccctacgaac cttgaggctc tgagcagtcg catatcctgc 780 acacccttgg cgccggccct ggttgcaaat atgcaattgt gtccttatcc gcgactggtc 840 acgaggctag gattgatcga aagctgccga tgagaaatgg caagggcggc atgctgtggc 900 ctttttttta cggtctgtca ggacaactga aaagttacaa atttatagtg gttgtaaaca 960 gcaacacgtt aaaaagtcga ttatcagttt cacagaaaga ggtcgttaaa accgccagca 1020 agcttgtttc actatcagtc tgtcgctaag acaatctctt tcaccaaaaa tacaatttgc 1080 tttcttgccg ttgcttcaag tgaaaatctg agctaaaaaa gagagaggct gtctgaagaa 1140 aaatccataa ccaacgcaaa atcccgggcg cccaatcagc cttctccgcg gagattccta 1200 gcctcagcca gagctacctc atctgcgtga ggctccggtg gcgccaagtg ttccggcatc 1260 ccggacgcac caatggcatc cgagcaacag atcttttctg caacaacgct tcgcgtcgcg 1320 gcg 1323 <210> 5 <211> 59 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Zea mays chlorophyll a/b binding gene intron (1) <400> 5 gtgtttccct ccatctgctc tgctctttaa atacctccgt cgtctcctcg tctccacag 59 <210> 6 <211> 43 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Zea mays chlorophyll a/b binding gene intron (2) <400> 6 gtggaggcgc caccgcccac cggccaccgc tgcggatatc tag 43 <210> 7 <211> 1000 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Zea mays chlorophyll a/b binding gene 3'-UTR <400> 7 gggggtggag gcgccaccgc ccaccggcca ccgctgcgga tatctaggtg ttcggatgca 60 cgtgagcgcg cactggttcc agtttgtacc atgatgtaaa ttacttaccg taccagggtt 120 caatcggcaa ggaagaattg ttgtgttcac tgtcttgggc agtctcttgg tccaatatga 180 atcaacttac acagcatctc caaaaacttc taaaattact agctgaatgc ccgtgcgttg 240 caacgggaat atataatacc agtatactac gataacttat atacaaaatg tatgttatat 300 cgttatgaga aaatgtttca taaccaattt atgattctgg tcatacataa attttgttat 360 ttatagtcta tctgtttcac cactacattg caaccatcag tatcatgcag acttcgatat 420 atgttacgat ttgtatggtc tcattattgg agagcacgtt ccacacatac cggaagaaat 480 tttctcgtac atcgttagtc atcagacacg taccaccata cacttttgct taaacaaaaa 540 tgcaagtgtg tgtttgcgaa gagaattaaa ggcaagtcga cacaaaagct accccaacgg 600 tggcgaggat gacgaactgg tcatttttgt cggtcctccc ctgcgtcacc tctggcgcca 660 agatgacgcc atagtcctcg atatagtaat cgtcgaacgc gcgcgacata ccgagtactg 720 atgactcttg gctgggctgt aaaacgaagt gcaccccggg ctcatcagca aggtagtacc 780 cctggtcgtt gcactaccgg atgcgctact actctacatg catcgtgttc gaggatactc 840 atacaacgtc agcaacggct atcgtctcag tgcacaagaa ttcatgccta gtcagtagcg 900 acttacgtgg ctggttgggc ttcaggtgaa cgatgagctg gacaacgtga tggcgtcgtc 960 gtcgaatgca gtgcccagaa caacccgaaa gtcgccgacg 1000 <210> 8 <211> 400 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> modified Zea mays chlorophyll a/b binding gene 3'-UTR <400> 8 gggggtggag gcgccaccgc ccaccggcca ccgctgcgga tatctaggtg ttcggatgca 60 cgtgagcgcg cactggttcc agtttgtacc atgatgtaaa ttacttaccg taccagggtt 120 caatcggcaa ggaagaattg ttgtgttcac tgtcttgggc agtctcttgg tccaatatga 180 atcaacttac acagcatctc caaaaacttc taaaattact agctgaatgc ccgtgcgttg 240 caacgggaat atataatacc agtatactac gataacttat atacaaaatg tatgttatat 300 cgttatgaga aaatgtttca taaccaattt atgattctgg tcatacataa attttgttat 360 ttatagtcta tctgtttcac cactacattg caaccatcag 400 <210> 9 <211> 3804 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Zea mays chlorophyll a/b binding gene sequence and regulatory elements <400> 9 gcacaaaata cataaaacta gattagaaaa ggaagagaat acgccaaatt gcagcttaat 60 caattagacg atttagtcct gtttttacga aacaattgtt taagataaca ttaggacatg 120 tacaatatgt gtctttggat gtgtttaagg agtaaatgta aaaaaaatag atacgtctct 180 taacgaagtc attgtgtctt ggctctatgc tcgagacgga gaaatagcta attgattaat 240 ttaatttatt gaatgttctt attggtgtaa tgaatatagt aaggcactgg ccttatactt 300 ggagtttggc atgtcttatg ctatgttgca aacaggcccg gtcttgacat ttcgggggcc 360 ctaagagaaa atttatatag aggtcctata cgaaaatttg agtctgttat tttttcaact 420 tttaaataat atatgaaaaa taaaaaattg atgatttaca taattttatt caaaatgata 480 tgactggaaa tattgttaca gtattttatg agtcgtaaaa ttatataaat tatgtaatat 540 acatttgttt tgacttttga gagagtattt ttacttttaa tttgtcaaac tagcctaaac 600 cttaaaatac acagtaaacc aaatctaaat acattagatc aaattttctg aaaataaagt 660 tcagcaaact aaactaggat taatcaatgt aggttattag ggtcgaccct tcggtaggct 720 agaattaagc aacgcgatag gcacaggtgt acaacacctt tcgtccttcc cacgtcaatt 780 ttagggcctg tttggttcac ggctaattat gccacacttt gcctaaggtt agtcgtccga 840 attgaagaac taaccttatg cagaaaagtt aggcaaagta tggcaagtta ggtagtaaac 900 caaacaggcc aaagtatttg tcatcaagca gacggttgcg cgacctcaaa gagatgattg 960 ctagaaaata aagagacgca acaaaagaat gaaaatatag atttatctat aacttatatg 1020 catttgatat aagatagata aatgggagcc ctacgaacct tgaggctctg agcagtcgca 1080 tatcctgcac acccttggcg ccggccctgg ttgcaaatat gcaattgtgt ccttatccgc 1140 gactggtcac gaggctagga ttgatcgaaa gctgccgatg agaaatggca agggcggcat 1200 gctgtggcct tttttttacg gtctgtcagg acaactgaaa agttacaaat ttatagtggt 1260 tgtaaacagc aacacgttaa aaagtcgatt atcagtttca cagaaagagg tcgttaaaac 1320 cgccagcaag cttgtttcac tatcagtctg tcgctaagac aatctctttc accaaaaata 1380 caatttgctt tcttgccgtt gcttcaagtg aaaatcttaa tgttttaaat taaaatatgt 1440 ggctctacgt aggaaaaaat aattcaatcg agtctcattt cataaaaaaa atttggtcaa 1500 aaaattatac accatctcgc tcaagtgact caaatatact aaacggtact gagctgtctt 1560 ataatataaa tttgatttac tgttagaata tgatgtttta tgagtgcact aaattctata 1620 aaatatattt atttttaaat tataagatat ttttataggt ctgctcttag agagagctaa 1680 aaaagagaga ggctgtctga agaaaaatcc ataaccaacg caaaatcccg ggcgcccaat 1740 cagccttctc cgcggagatt cctagcctca gccagagcta cctcatctgc gtgaggctcc 1800 ggtggcgcca agtgttccgg catcccggac gcaccaatgg catccgagca acagatcttt 1860 tctgcaacaa cgcttcgcgt cgcggcggtg tttccctcca tctgctctgc tctttaaata 1920 cctccgtcgt ctcctcgtct ccacagcatc tcaagtcttc acactcctcg ccatcacata 1980 aaaccagtgc aagcagaagc agcgcaatgg cgagcagcac catggccctc tcctccacag 2040 ccttcgccgg caaggcagtg aacgtgccgt cgtctctctt cggcgaggcc cgcgtgacga 2100 tgcgcaagac ggcggcgaag gcaaagccgg cggcgagctc cggcagcccg tggtacggcc 2160 ccgaccgcgt gctctacctg ggcccgctgt ccggcgcgcc cccgagctac ctgacgggcg 2220 agttcccggg cgactacggc tgggacaccg cggggctgtc ggcggacccg gagacgttcg 2280 ccaagaaccg ggagctggag gtcatccact cccgctgggc catgctgggc gcgttgggct 2340 gcgtgttccc ggagctgctc gcccgcaacg gcgtcaagtt cggcgaggcc gtgtggttca 2400 aggccgggtc gcagatcttc agcgagggtg ggctggacta cctcggcaac ccgagcctga 2460 tccacgcgca gagcatcctc gccatctggg cctgccaggt cgtgctcatg ggcgccatcg 2520 aggggtaccg cgtcgccggc ggcccgctcg gagaggtcgt cgacccgctc taccccggcg 2580 gcagcttcga cccgctcggc ctcgccgacg accctgaggc cttcgcggag ctcaaggtga 2640 aggagctcaa gaacggccgc ctcgccatgt tctccatgtt cgggttcttc gtccaggcca 2700 tcgtcaccgg caagggcccg ctcgagaacc tcgccgacca cctcgccgac cccgtcaaca 2760 acaacgcatg ggcctatgcc accaactttg tgcccggcaa gtgagggggt ggaggcgcca 2820 ccgcccaccg gccaccgctg cggatatcta ggtgttcgga tgcacgtgag cgcgcactgg 2880 ttccagtttg taccatgatg taaattactt accgtaccag ggttcaatcg gcaaggaaga 2940 attgttgtgt tcactgtctt gggcagtctc ttggtccaat atgaatcaac ttacacagca 3000 tctccaaaaa cttctaaaat tactagctga atgcccgtgc gttgcaacgg gaatatataa 3060 taccagtata ctacgataac ttatatacaa aatgtatgtt atatcgttat gagaaaatgt 3120 ttcataacca atttatgatt ctggtcatac ataaattttg ttatttatag tctatctgtt 3180 tcaccactac attgcaacca tcagtatcat gcagacttcg atatatgtta cgatttgtat 3240 ggtctcatta ttggagagca cgttccacac ataccggaag aaattttctc gtacatcgtt 3300 agtcatcaga cacgtaccac catacacttt tgcttaaaca aaaatgcaag tgtgtgtttg 3360 cgaagagaat taaaggcaag tcgacacaaa agctacccca acggtggcga ggatgacgaa 3420 ctggtcattt ttgtcggtcc tcccctgcgt cacctctggc gccaagatga cgccatagtc 3480 ctcgatatag taatcgtcga acgcgcgcga cataccgagt actgatgact cttggctggg 3540 ctgtaaaacg aagtgcaccc cgggctcatc agcaaggtag tacccctggt cgttgcacta 3600 ccggatgcgc tactactcta catgcatcgt gttcgaggat actcatacaa cgtcagcaac 3660 ggctatcgtc tcagtgcaca agaattcatg cctagtcagt agcgacttac gtggctggtt 3720 gggcttcagg tgaacgatga gctggacaac gtgatggcgt cgtcgtcgaa tgcagtgccc 3780 agaacaaccc gaaagtcgcc gacg 3804 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 10 gccataccct ccagttg 17 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 11 gccgttgatg gagtagtaga tgg 23 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 12 ccgaatccaa cggcttca 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 13 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 14 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 15 cgagcagacc gccgtgtact t 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 16 tgttcggttc cctctaccaa 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 17 caacatccat caccttgact ga 22 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 18 cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Zea mays chlorophyll a/b binding gene 5'-UTR <400> 19 catctcaagt cttcacactc ctcgccatca cataaaacca gtgcaagcag aagcagcgca 60

Claims (23)

  1. 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하고, 여기서 프로모터는 엄격한 조건 하에 서열식별번호: 2의 상보체에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것인 유전자 발현 카세트.
  3. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 인트론을 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
  4. 제3항에 있어서, 인트론이 서열식별번호: 5에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것인 유전자 발현 카세트.
  5. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것인 유전자 발현 카세트.
  6. 제1항에 있어서, 작동가능하게 연결된 트랜스진이 폴리펩티드 또는 작은 RNA 유전자를 코딩하는 것인 유전자 발현 카세트.
  7. 제1항에 있어서, 트랜스진이 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 단백질 트랜스진, 및 선택가능 마커 트랜스진으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 유전자 발현 카세트.
  8. 제1항에 있어서, 3'-비번역 영역을 추가로 포함하는 유전자 발현 카세트.
  9. 제8항에 있어서, 3'-비번역 영역이 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것인 유전자 발현 카세트.
  10. 제1항에 있어서, 3'-비번역 영역을 추가로 포함하고, 5'-UTR이 서열식별번호: 19에 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 것인 유전자 발현 카세트.
  11. 제1항에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하고, 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스, 및 박테리오파지로 이루어지는 군으로부터 선택되는 재조합 벡터.
  12. 제1항에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 세포.
  13. 제12항에 있어서, 트랜스제닉 세포가 트랜스제닉 식물 세포인 트랜스제닉 세포.
  14. 제13항에 따른 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물.
  15. 제14항에 있어서, 트랜스제닉 식물이 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물인 트랜스제닉 식물.
  16. 제15항에 있어서, 단자엽 식물이 옥수수 식물, 벼 식물, 및 밀 식물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물.
  17. 제14항에 따른 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자.
  18. 제1항에 있어서, 프로모터가 조직-선호 프로모터인 유전자 발현 카세트.
  19. 제1항에 있어서, 조직-선호 프로모터가 잎, 껍질, 줄기 또는 수염 조직-선호 프로모터인 유전자 발현 카세트.
  20. 제1항에 있어서, 프로모터가 서열식별번호: 2의 뉴클레오티드 1-1,887의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
  21. a) 3'-비번역 영역에 작동가능하게 연결된 이종성 코딩 서열에 작동가능하게 연결된, 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트로 식물 세포를 형질전환시키고;
    b) 유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 단리하고;
    c) 형질전환된 식물 세포를 트랜스제닉 식물로 재생하고;
    d) 서열식별번호: 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물을 얻는 것
    을 포함하는, 트랜스제닉 식물에서 이종성 코딩 서열을 발현시키는 방법.
  22. a) 서열식별번호: 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하고;
    b) 서열식별번호: 2를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하고;
    c) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 다수의 폴리뉴클레오티드 서열을 규정하고;
    d) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하고;
    e) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드 서열을 제조하는 것
    을 포함하는, 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드 서열의 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 합성이
    a) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하고;
    b) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 다수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 생산하고;
    c) 서열식별번호: 2에 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해 다수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 라이게이팅하는 것
    을 포함하는 것인 방법.
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