BR102015001527B1 - Cassete de expressão do gene e métodos para a expressão de uma sequência de codificação em uma planta transgênica e para a fabricação de uma sequência de polinucleotídeo sintética - Google Patents

Abstract

ELEMENTOS REGULADORES DE ZEA MAYS E SEU USO. São fornecidos construtos e métodos para a expressão de um transgene nas células vegetais e/ou tecidos vegetais utilizando elementos reguladores do gene de ligação de clorofila de Zea mays a/b.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos número de série 61/930.738, depositado em 23 de janeiro de 2014, para "ZEA MAYS REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF".

CAMPO TÉCNICO

[002] Esta invenção é de uma forma geral relacionada ao campo da biologia molecular vegetal, e mais especificamente, ao campo de expressão de transgenes nas plantas.

ANTECEDENTES

[003] Muitas espécies de plantas são capazes de serem transformadas com transgenes para introduzir traços ou características agronomicamente desejáveis. As espécies vegetais são desenvolvidas e/ou modificadas para ter traços particulares desejáveis. Geralmente, os traços desejáveis incluem, por exemplo, a melhora da qualidade do valor nutricional, o aumento da produção, que confere resistência a pragas ou doenças, o aumento da tolerância a seca e estresse, a melhora das qualidades de horticultura (por exemplo, pigmentação e crescimento), a concessão de tolerância aos herbicidas, o que permite a produção de compostos e/ou materiais industrialmente úteis a partir da planta, e/ou que permite a produção de produtos farmacêuticos.

[004] As espécies de plantas transgênicas compreendendo múltiplos transgenes empilhados em um único lócus genômico são produzidas por meio de tecnologias de transformação de plantas. As tecnologias de transformação de plantas resultam na introdução de um transgene em uma célula vegetal, na recuperação de uma planta transgênica fértil que contém a cópia integrada de forma estável do transgene no genoma da planta, e a subsequente expressão do transgene através de transcrição e translação do genoma da planta resulta em plantas transgênicas que possuem traços e fenótipos desejáveis. No entanto, os mecanismos que permitem a produção de espécies vegetais transgênicas para altamente expressar os múltiplos transgenes planejados como uma grande quantidade de traços são desejáveis.

[005] Da mesma forma, os mecanismos que permitem a expressão de um transgene dentro de tecidos ou órgãos particulares de uma planta são desejáveis. Por exemplo, o aumento da resistência de uma planta à infecção por patógenos produzidos no solo pode ser executado através da transformação do genoma de uma planta com um gene de resistência ao patógeno de tal modo que a proteína de resistência ao patógeno é robustamente expressa dentro das raízes da planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene nos tecidos vegetais que estão em um crescimento ou fase de desenvolvimento particular tal como, por exemplo, divisão celular ou alongamento. Além disso, pode ser desejável expressar um transgene nos tecidos da folha e do caule de uma planta.

[006] Aqui descritos são elementos reguladores do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Ainda descritos são os construtos e métodos que utilizam os elementos reguladores do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays.

DIVULGAÇÃO

[007] São aqui divulgados as sequências, construtos e métodos para a expressão de um transgene nas células vegetais e/ou tecidos vegetais. Em uma modalidade a divulgação refere-se a um cassete de expressão do gene compreendendo um promotor operativamente ligado a um transgene, em que o promotor compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com uma sonda de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % para um complemento da SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, o promotor compreende um polinucleotídeo que possui pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Nas modalidades adicionais, o promotor compreende um polinucleotídeo compreendendo um íntron. Em outras modalidades, o íntron possui pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o promotor compreende um polinucleotídeo que possui pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Em outras modalidades, o transgene operacionalmente ligado codifica um polipeptídeo ou um pequeno RNA. Em uma modalidade subsequente, o transgene é selecionado do grupo consistindo em transgene de resistência ao inseticida, transgene de tolerância ao herbicida, transgene de eficiência do uso de nitrogênio, transgene de eficiência do uso da água, transgene de qualidade nutricional, transgene de ligação ao DNA, transgene marcador selecionável. Em mais outra modalidade, o cassete de expressão do gene ainda compreende uma região não traduzida 3'. Em uma modalidade a região não traduzida 3' compreende um polinucleotídeo que possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em mais outra modalidade, o cassete de expressão do gene ainda compreende uma região não traduzida 5'. Em outra modalidade a região não traduzida 5' compreende um polinucleotídeo que possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, um vetor recombinante compreende o cassete de expressão do gene. Em um outro aspecto da modalidade, o vetor recombinante é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo bacteriano artificial, um vírus, e um bacteriófago. Em uma modalidade, uma célula transgênica compreende o cassete de expressão do gene. Em um aspecto posterior da modalidade, a célula é uma célula vegetal transgênica. Em uma modalidade, uma planta transgênica compreende a célula vegetal transgênica. Em um outro aspecto da modalidade, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea. Em outros aspectos da modalidade, a planta monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma planta de milho, uma planta de arroz, e uma planta de trigo. Em uma modalidade, uma semente transgênica é obtida a partir da planta transgênica. Em uma modalidade subsequente, o promotor é um promotor preferido do tecido. Em uma modalidade adicional, o promotor preferido do tecido é um promotor preferido do tecido da folha, casca, tronco ou seda. Em mais outra modalidade, o promotor compreende uma sequência de polinucleotídeo de nucleotídeos 1 a 1887 da SEQ ID NO: 2.

[008] Em uma modalidade a divulgação refere-se a uma célula transgênica compreendendo um polinucleotídeo sintético que hibridiza sob condições estringentes com uma sonda de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com um complemento da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo sintético possui pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Nas modalidades adicionais, o polinucleotídeo sintético compreende um polinucleotídeo compreendendo um íntron. Em outras modalidades, o íntron possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o polinucleotídeo sintético compreende um polinucleotídeo com pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica. Em uma modalidade subsequente, a célula vegetal transgênica é produzida por um método de transformação de plantas. Em uma modalidade adicional, o método de transformação de plantas é selecionado do grupo que consiste em um método de transformação mediado por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação de carboneto de silício, um método de transformação de protoplastos, e um método de transformação de lipossoma. Em uma modalidade, uma planta transgênica compreende a célula vegetal transgênica. Em uma outra modalidade, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea. Em outras modalidades, a planta monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma planta de milho, uma planta de arroz, e uma planta de trigo. Em uma modalidade, uma semente transgênica é obtida a partir da planta transgênica. Em uma modalidade adicional, o promotor é um promotor preferido do tecido. Em uma modalidade subsequente, o promotor preferencial do tecido é um promotor preferido do tecido da folha, casca, caule ou seda. Em outra modalidade, o polinucleotídeo sintético compreende uma sequência de polinucleotídeo de nucleotídeos 1 a 1887 da SEQ ID NO: 2.

[009] Em uma modalidade a divulgação refere-se a um promotor de polinucleotídeo purificado, em que o promotor compreende um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com uma sonda de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com um complemento da SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, o promotor de polinucleotídeo purificado possui pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2. Nas modalidades adicionais, o promotor de polinucleotídeo purificado compreende um polinucleotídeo compreendendo um íntron. Em outras modalidades, o íntron possui pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, o promotor de polinucleotídeo purificado compreende um polinucleotídeo com pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o polinucleotídeo purificado é operativamente ligado a um transgene. Em uma modalidade subsequente, o transgene operacionalmente ligado codifica um polipeptídeo ou é um pequeno RNA. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende a sequência de polinucleotídeo purificado operacionalmente ligado ao transgene, que está operacionalmente ligado a uma região não traduzida 3'. Em uma modalidade a região não traduzida 3' compreende um polinucleotídeo que possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 7 ou a SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende a sequência de polinucleotídeo purificado operacionalmente ligada ao transgene, em que o polinucleotídeo purificado é uma região não traduzida 5' da SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade, a região não traduzida 5' compreende um polinucleotídeo que possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade, o transgene é selecionado do grupo consistindo em transgene de resistência ao inseticida, transgene de tolerância herbicida, transgene de eficiência de uso de nitrogênio, transgene de eficiência de uso da água, transgene qualidade nutricional, transgene de ligação ao DNA, e transgene marcador selecionável. Em uma modalidade, um vetor recombinante compreende o cassete de expressão do gene. Em uma modalidade adicional, um vetor recombinante é selecionado do grupo que consiste em um vetor plasmídeo, um vetor cosmídio e um vetor BAC. Em uma modalidade, uma célula transgênica compreende o cassete de expressão do gene. Em uma modalidade subsequente a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica. Em uma modalidade, uma planta transgênica compreende a célula vegetal transgênica. Em uma modalidade adicional, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea. Em mais uma outra modalidade, a planta monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma planta de milho, uma planta de trigo, e uma planta de arroz. Em uma modalidade, uma semente transgênica é obtida a partir da planta transgênica. Em uma modalidade posterior, a sequência de polinucleotídeo purificado promove a expressão preferida do tecido de um transgene. Em uma modalidade adicional, a sequência de polinucleotídeo purificado promove a expressão preferida do tecido da folha, casca, caule ou seda de um transgene. Em outras modalidades, o polinucleotídeo purificado compreende uma sequência de polinucleotídeo de nucleotídeos 1 a 1887 da SEQ ID NO: 2.

[0010] Em uma modalidade a divulgação refere-se a um método para a expressão de uma sequência de codificação heteróloga em uma planta transgênica, o método compreendendo: a) a transformação de uma célula vegetal com um cassete de expressão do gene que compreende uma sequência de polinucleotídeo que compreende uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2 operacionalmente ligada à sequência de codificação heteróloga, que está operacionalmente ligada a uma região não traduzida 3'; b) o isolamento da célula vegetal transformada compreendendo o cassete de expressão do gene; c) a regeneração da célula vegetal transformada em uma planta transgênica; e, d) a obtenção da planta transgênica, em que a planta transgênica compreende o cassete de expressão do gene compreendendo a sequência de polinucleotídeo que compreende a SEQ ID NO: 2.

[0011] Nas modalidades adicionais, a sequência de polinucleotídeo compreende um íntron. Em outras modalidades, o íntron possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, a sequência de polinucleotídeo possui pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, a sequência de codificação heteróloga é selecionado do grupo consistindo das sequências de codificação de resistência ao inseticida, sequências de codificação de tolerância ao herbicida, sequências de codificação da eficiência de uso de nitrogênio, sequências de codificação da eficiência de uso de água, sequências de codificação da qualidade nutricional, sequências de codificação da ligação de DNA, e sequências de codificação do marcador selecionável. Em uma modalidade adicional, a transformação de uma célula vegetal utiliza um método de transformação de plantas. Em mais outra modalidade, o método de transformação de plantas é selecionado do grupo que consiste em um método de transformação mediado por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação de carboneto de silício, um método de transformação de protoplasto, e um método de transformação de lipossoma. Em outras modalidades, a planta transgênica é uma planta transgênica monocotiledônea ou uma planta transgênica dicotiledônea. Em outras modalidades, a planta transgênica monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma planta de milho, uma planta de trigo e uma planta de arroz. Em uma modalidade, uma semente transgênica é obtida a partir da planta transgênica. Em uma outra modalidade, a sequência de codificação heteróloga é preferencialmente expressa em um tecido. Em mais outra modalidade, a sequência de codificação heteróloga é expressa em um tecido da folha, casca, caule ou seda. Em outras modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotídeos 1 a 1887 da SEQ ID NO: 2.

[0012] Em uma modalidade a divulgação refere-se a um método para o isolamento de uma sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2, o método compreendendo: a) a identificação da sequência de polinucleotídeo que compreende uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2; b) a produção de uma pluralidade de sequências iniciadoras de oligonucleotídeo, em que as sequências iniciadoras de oligonucleotídeo se ligam à sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2; c) a amplificação da sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2 a partir de uma amostra de DNA com as sequências iniciadoras de oligonucleotídeo selecionadas da pluralidade de sequências iniciadoras de oligonucleotídeo; e, d) o isolamento da sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2.

[0013] Nas modalidades adicionais, a sequência de polinucleotídeo compreende um íntron. Em outras modalidades, o íntron possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, a sequência de polinucleotídeo possui pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade adicional, a sequência de polinucleotídeo isolada compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2 está ligada operativamente a um transgene. Em uma outra modalidade, o transgene operacionalmente ligado codifica um polipeptídeo. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende uma sequência de polinucleotídeo com pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 2 operacionalmente ligada a um transgene, em que o transgene está operacionalmente ligado a uma região não traduzida 3'. Em uma modalidade a região não traduzida 3' compreende um polinucleotídeo que possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 7 ou a SEQ ID NO: 8. Em uma outra modalidade, o transgene é selecionado do grupo consistindo em sequências de codificação de resistência ao inseticida, sequências de codificação de tolerância ao herbicida, sequências de codificação da eficiência de uso de nitrogênio, sequências de codificação da eficiência de uso de água, sequências de codificação da qualidade nutricional, sequências de codificação da ligação de DNA, e sequências de codificação do marcador selecionável. Em uma modalidade, um vetor recombinante compreende o cassete de expressão do gene. Em uma outra modalidade, o vetor é selecionado do grupo consistindo em um vetor plasmídio, um vetor cosmídio e um vetor BAC. Em uma modalidade, uma célula transgênica compreende o cassete de expressão do gene. Em uma modalidade adicional, a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica. Em uma modalidade, uma planta transgênica compreende a célula vegetal transgênica. Em uma modalidade adicional, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea. Em uma outra modalidade, a planta monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma planta de milho, uma planta de trigo, e uma planta de arroz. Em uma modalidade, uma semente transgênica é obtida a partir da planta transgênica. Em outras modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de polinucleotídeo de nucleotídeos 1 a 1887 da SEQ ID NO: 2.

[0014] Em uma modalidade a divulgação refere-se a um método para a fabricação de uma sequência de polinucleotídeo sintético que compreende uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2, o método compreendendo: a) a identificação da sequência de polinucleotídeo que compreende a SEQ ID NO: 2; b) o isolamento da sequência de polinucleotídeo que compreende a SEQ ID NO: 2; c) a definição de uma pluralidade de sequências de polinucleotídeo que compreende uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2; d) a sintetização de uma sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2; e, e) a fabricação de uma sequência de polinucleotídeo sintética que compreende uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2. Em uma outra modalidade, a sintetização compreende: a) a identificação da sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2; b) a produção de uma pluralidade de sequências iniciadoras de oligonucleotídeo, em que as sequências iniciadoras de oligonucleotídeo se ligam à sequência de polinucleotídeo compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2; c) a ligação da pluralidade de sequências iniciadoras de de oligonucleotídeo para sintetizar a sequência de polinucleotídeo que compreende uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2.

[0015] Nas modalidades adicionais, a sequência de polinucleotídeo sintetizada compreende um íntron. Em outras modalidades, o íntron possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 5. Em uma modalidade, a sequência de polinucleotídeo sintetizada possui pelo menos 90 % de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade adicional, a sequência de polinucleotídeo sintetizada compreende uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2, que está operativamente ligada a um transgene. Em mais outra modalidade, o transgene operacionalmente ligado codifica um polipeptídeo. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende a sequência de polinucleotídeo sintetizada compreendendo uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 2 operacionalmente ligada ao transgene, que está operacionalmente ligada a uma região não traduzida 3'. Em uma modalidade a região não traduzida 3' compreende um polinucleotídeo que possui uma identidade de sequência de pelo menos 90 % com a SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em mais outra modalidade, o transgene é selecionado do grupo que consiste em transgene de resistência ao inseticida, transgene de tolerância ao herbicida, transgene de eficiência de uso de nitrogênio, transgene eficiência de uso de água, transgene de qualidade nutricional, transgene de ligação ao DNA, e transgene marcador selecionável. Em uma modalidade, um vetor recombinante compreende o cassete de expressão do gene. Em uma modalidade adicional, o vetor recombinante é selecionado do grupo consistindo em um vetor plasmídeo, um vetor cosmídeo e um vetor BAC. Em uma modalidade, uma célula transgênica compreende o cassete de expressão do gene. Em uma outra modalidade, a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica. Em uma modalidade, uma planta transgênica compreende a célula vegetal transgênica. Em uma outra modalidade, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea. Em outras modalidades, a planta monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma planta de milho, uma planta de trigo e uma planta de arroz. Em uma modalidade, uma semente transgênica é obtida a partir da planta transgênica. Em outras modalidades, o polinucleotídeo sintético compreende uma sequência de polinucleotídeo de nucleotídeos 1 a 1887 da SEQ ID NO: 2.

[0016] Em uma modalidade, um construto inclui um cassete de expressão do gene compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 operativamente ligado a um transgene ou uma sequência de codificação heteróloga. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ D NO: 7 ou SEQ D NO: 8 operacionalmente ligada a um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ D NO: 7 ou SEQ D NO: 8 operacionalmente ligada a um promotor. Em uma outra modalidade, um cassete de expressão do gene inclui uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 operacionalmente ligado a um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui um gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays 5' -UTR da SEQ ID NO : 19 operativamente ligado a um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 19, operativamente ligada a um promotor. Em uma outra modalidade, um cassete de expressão do gene inclui uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ D NO : 19 operacionalmente ligada a um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 operativamente ligado a um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 operativamente ligado a um promotor. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 operativamente ligado a um transgene ou uma sequência de codificação heteróloga. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui pelo menos, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou mais transgenes.

[0017] Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui independentemente, a) um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, b) um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ D NO): 5 ou SEQ D NO: 6, c) uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 e d) uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 19.

[0018] Os métodos de cultivo de plantas que expressam um transgene que utilizam promotores do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; íntrons da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6; 3'-UTRs da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8; e 5'-UTR da SEQ ID NO: 19, são aqui divulgados. Os métodos de cultivo de tecidos e células vegetais que expressam um transgene utilizando os promotores do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4; íntrons da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6; 3'-UTR da SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8; e 5'-UTR da SEQ ID NO: 19 também são aqui divulgados. Em uma modalidade, os métodos como aqui divulgados incluem a expressão do gene específico do tecido nas folhas e caules das plantas.

[0019] Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui uma sequência de polinucleotídeo do promotor da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, que foi obtido a partir do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0020] A FIG. 1 é um fluxograma esquemático que apresenta o processo de identificação de genes de alta expressão no milho utilizando uma abordagem de perfil transcricional com Next Generation Sequencing (NGS).

[0021] A FIG. 2 mostra um alinhamento do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de comprimento total (SEQ ID NO: 1) em comparação com o promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Zea mays modificado (SEQ ID NO: 35), este aiinhamento mostra as sequências de polinucleotídeo repetidas que foram removidas para produzir a sequência de promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado.

[0022] A FIG. 3 mostra o mapa do plasmídeo vetor de pDAB114438 que representa um cassete de expressão do gene compreendendo os elementos reguladores do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento tota, (rotulados como "promotor ZmCAB") que controla a expressão de um gene repórter cry34Ab1.

[0023] A FIG. 4 mostra um mapa do vetor de controle pDAB101556 contendo um gene repórter yfp no lugar do gene repórter cry34Ab1 presente no construto do promotor de teste pDAB114438, como o gene de interesse. A expressão do gene yfp foi impulsionada pelo promotor de eoa mays bbiquitina- 1 ZZmUbi) ) promote r e terminada pelo 3'-UTR de Zea mays Per5 (ZmPer5).

[0024] A FIG. 5 mostra um mapa de pDAB108746, um vetor de controle positivo contendo o gene repórter Cry34Ab1 impulsionado pelo promotor ZmUbil e terminado pelo 3'-UTR de Oolnuum tuberosum Pinll (StPinII).

[0025] A FIG. 6 mostra o mapa de plasmídeo do vetor de pDAB120165 que representa um cassete de expressão do gene compreendendo os elementos reguladores do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zeo mays modificados que controlam a expressão de um gene repórter Cry34Ab1.

[0026] A FIG. 7 mostra o mapa de plasmídeo do vetor de pDAB120166 que representa um cassete de expressão do gene que compreende o promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zeo mays de comprimento total (rotulado como "promotor ZmCAB") e elementos reguladores do 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zeo mays (SEQ ID NO: 8) que controlam a expressão de um gene repórter cry34Ab1.

MODO(S) PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[0027] Como aqui utilizado, os artigos "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências no plural a não ser que o contexto claramente e sem ambiguidade dita de outra maneira.

[0028] Como aqui utilizado, o termo "retrocruzamento" refere-se a um processo em que um criador cruza a descendência híbrida de volta para uma das origens, por exemplo, um híbrido de primeira geração F1 com um dos genótipos de origem do híbrido F1.

[0029] Como aqui utilizado, o termo "íntron" refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico compreendida em um gene (ou sequência de nucleotídeo expressa de interesse) que é transcrita, mas não traduzida. Os íntrons incluem a sequência de ácido nucleico não traduzida dentro de uma sequência expressa de DNA, assim como a sequência correspondente nas moléculas de RNA transcritas destas.

[0030] Um construto aqui descrito também pode conter sequências que intensificam a translação e/ou estabilidade de mRNA tais como íntrons. Um exemplo de um tal íntron é o primeiro íntron do gene II da variante de histona de ArbdiOppsis thaliana o u qualque r outra sequência de íntron comumente conhecida. Os íntrons podem ser utilizados em combinação com uma sequência de promotor para aumentar a translação e/ou estabilidade do mRNA.

[0031] Como aqui utilizado, os termos "região não traduzida 5' " ou "5'-UTR" referem-se a um segmento não transladado no terminal 5' dos pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, nos mRNAs maduros, uma 5'-UTR tipicamente abriga na sua extremidade 5' uma tampa de 7-metilguanosina e está envolvida em muitos processos tais como recomposição, poliadenilação, exportação de mRNA para o citoplasma, identificação da extremidade 5' do mRNA pela maquinaria de translação, e proteção dos mRNAs contra a degradação.

[0032] Como aqui utilizado, o termo "região não traduzida 3' " ou "3'-UTR" refere-se a um segmento não transladado em um terminal 3' dos pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, nos mRNAs maduro esta região abriga a cauda poli-(A) e é conhecida de ter muitos papéis na estabilidade do mRNA, no início da translação, e na exportação de mRNA.

[0033] Como aqui utilizado, o termo "sinal de poliadenilação" refere-se a uma sequência de ácido nucleico presente nas transcrições de mRNA que leva em conta as transcrições, quando na presença de uma poli-(A) polimerase, para ser poliadenilada no sítio de poliadenilação, por exemplo, localizado 10 a 30 bases a jusante do sinal poli-(A). Muitos sinais de poliadenilação são conhecidos na técnica e são úteis para a presente invenção. Uma sequência exemplar inclui AAUAAA e suas variantes, como descrito em Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468.

[0034] Como aqui utilizado, o termo "isolado" refere-se a um componente biológico (incluindo um ácido nucleico ou proteína) que foi separado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outro DNA cromossômico e extracromossômico).

[0035] Como aqui utilizado, o termo "purificado" em referência às moléculas de ácido nucleico não requer uma pureza absoluta (tal como uma preparação homogênea); em vez disso, representa uma indicação de que a sequência é relativamente mais pura do que no seu ambiente celular nativo (em comparação com o nível natural, este nível deverá ser pelo menos de 2 a 5 vezes maior, por exemplo, em termos de níveis de concentração ou expressão do gene). As moléculas de DNA podem ser obtidas diretamente a partir do DNA total ou a partir do RNA total. Além disso, os clones de cDNA são de ocorrência não natural, mas de preferência são preferivelmente obtidos através da manipulação de uma substância de ocorrência natural parcialmente purificada (RNA mensageiro). O construto de uma biblioteca de cDNA a partir do mRNA envolve a criação de uma substância sintética (cDNA). Os clones de cDNA individuais podem ser purificados a partir da biblioteca sintética mediante a seleção clonal das células que carregam a biblioteca de cDNA. Assim, o processo que inclui o construto de uma biblioteca de cDNA a partir do mRNA e purificação de clones de cDNA distintos produz uma purificação de aproximadamente 106 vezes da mensagem nativa. Da mesma forma, uma sequência de DNA promotora pode ser clonada em um plasmídeo. Um tal clone é de ocorrência não natural, mas sem dúvida é preferivelmente obtido através de manipulação de uma substância parcialmente purificada de ocorrência natural tal como uma biblioteca de DNA genômico. Assim, a purificação de pelo menos uma ordem de magnitude, e em algumas modalidades de duas ou três ordens, e em outras modalidades de quatro ou cinco ou mais ordens de magnitude é favorecida nestas técnicas.

[0036] Similarmente, a purificação representa uma indicação de que uma alteração química ou funcional na sequência de DNA do componente ocorreu. As moléculas e proteínas de ácido nucleico que foram "purificadas" incluem moléculas e proteínas de ácido nucleico purificadas por métodos de purificação padrão. O termo "purificado" também abrange os ácidos nucleicos e proteínas preparadas por métodos de DNA recombinante em uma célula hospedeira (por exemplo, células vegetais), assim como moléculas, proteínas e peptídeos de ácido nucleico quimicamente sintetizados.

[0037] O termo "recombinante" significa uma célula ou organismo em que a recombinação genética ocorreu. Ele também inclui uma molécula (por exemplo, um vetor, plasmídeo, ácido nucleico, polipeptídeo, ou um pequeno RNA) que foi artificialmente ou por via sintética (isto é, não naturalmente) alterada pela intervenção humana. A alteração pode ser executada na molécula dentro, ou removida, de seu ambiente ou estado natural.

[0038] Como aqui utilizado, o termo "expressão" refere-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito no mRNA (incluindo as pequenas moléculas de RNA) e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito (também referido como "transcrição") é subsequentemente transladado em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. A expressão do gene pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, a exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão do gene. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer parte do percurso do DNA para o RNA para a proteína. A regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, através dos controles que atuam sobre a transcrição, a translação, o transporte e o processamento de RNA, a degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA, ou através da ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específicas depois de terem sido produzidas, ou através das suas combinações. A expressão do gene pode ser medida no nível do RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou ensaios de atividade da proteína in vitro, in situ ou in vivo.

[0039] Como aqui utilizado, os termos "silenciamento do gene baseado na homologia" ou "HBGS" são termos genéricos que incluem tanto o silenciamento do gene de transcrição quanto o silenciamento do gene pós-transcrição. O silenciamento de um lócus alvo por um lócus de silenciamento não ligado pode resultar da inibição da transcrição (silenciamento do gene de transcrição; TGS) ou degradação de mRNA (silenciamento do gene pós-transcrição; PTGS), devido à produção de RNA de fita dupla (dsRNA) que corresponde ao promotor ou sequências transcritas, respectivamente. O envolvimento de componentes celulares distintos em cada processo sugere que o TGS e o PTGS induzido pelo dsRNA provavelmente resultam da diversificação de um antigo mecanismo comum. No entanto, uma comparação rigorosa de TGS e PTGS tem sido difícil de alcançar, pois geralmente baseia-se na análise dos lócus de silenciamento distintos. Um único lócus do transgene pode ser descrito para desencadear tanto o TGS quanto o PTGS, devido à produção de dsRNA que corresponde ao promotor e sequências transcritas de diferentes genes alvo.

[0040] Como aqui utilizados, os termos "molécula de ácido nucleico", "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo" (todos os três termos são sinônimos entre si) referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir as fitas tanto sensos quanto antissensos de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas, e seus polímeros misturados. "Um nucleotídeo" pode referir-se a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico é geralmente de pelo menos 10 bases de comprimento, a não ser que de outra maneira especificada. Os termos podem referir-se a uma molécula de RNA ou DNA de comprimento indeterminado. Os termos incluem as formas de fita simples e duplo de DNA. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir cada um ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados entre si através das ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural.

[0041] As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas química ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivadas, como será facilmente observado por aqueles de habilidade na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, rótulos, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações de internucleotídeo (por exemplo, ligações sem carga: por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; componentes pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológico, incluindo as conformações de fita simples, de fita dupla, parcialmente duplicados, triplicados, tipo grampo de cabelo, circulares e tipo cadeado.

[0042] A transcrição prossegue de um modo de 5' a 3' ao longo de uma fita de DNA. Isto significa que o RNA é produzido pela adição sequencial de ribonucleotídeo-5'-trifosfatos no terminal 3' da fita de crescimento (com uma eliminação do requisito do pirofosfato). Em qualquer um molécula de ácido nucleico linear ou circular, elementos discretos (por exemplo, sequências de nucleotídeo particulares) podem ser referidos como sendo "a montante" em relação a um outro elemento, se eles forem ligados ou seriam ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 5’ direção daquele elemento. Similarmente, os elementos discretos podem ser "a jusante" em relação a um outro elemento, se eles forem ou seriam ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 3' desse elemento.

[0043] Como aqui utilizado, o termo "posição de base" refere-se à localização de uma determinada base ou resíduos de nucleotídeo dentro de um ácido nucleico designado. Um ácido nucleico designado pode ser definido pelo alinhamento com um ácido nucleico de referência.

[0044] Como aqui utilizado, o termo "hibridização" refere-se a um processo onde os polinucleotídeos ou oligonucleotídeos e os seus análogos hibridizam através da ligação de hidrogênio, que inclui a ligação de hidrogênio de Watson Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reverso, entre as bases complementares. De um modo geral, as moléculas de ácido nucleico consistem de bases nitrogenadas que são pirimidinas (citosina (C), uracila (U) e timina (T)) ou purinas (adenina (A) e guanina (G)). Estas bases nitrogenadas formam ligações de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina, e a ligação de uma pirimidina a uma purina é referida como "emparelhamento de base". Mais especificamente, A irá hidrogenar a ligação em T ou U, e G se ligará a C. "Complementar" refere-se ao emparelhamento de base que ocorre entre duas sequências de ácido nucleico distintas ou duas regiões distintas da mesma sequência de ácido nucleico.

[0045] Como aqui utilizado, os termos "especificamente hibridáveis" e "especificamente complementares" referem-se a um grau suficiente de complementaridade tal que a ligação estável e específica ocorre entre um polinucleotídeo/oligonucleotídeo e DNA ou RNA alvo. Os oligonucleotídeos/polinucleotídeos não necessitam ser 100 % complementares com a sequência alvo para especificamente hibridizar. Um oligonucleotídeo/polinucleotídeo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo/polinucleotídeo à molécula alvo de DNA ou RNA interfere com a função normal do DNA ou RNA alvo, e existe grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não especifica de um oligonucleotídeo/polinucleotídeo às sequências não alvos sob condições onde a ligação específica for desejável, por exemplo, sob condições fisiológicas no caso de ensaios ou sistemas in vioo. Ta I ligaãão é referida oomo a hibridizaãão específica. As condições de hibridização que resultam em graus particulares de estringência irão variar dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e da composição e comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg2+) de um tampão de hibridização que irá contribuir para a estringência de hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciem a estringência. Os cálculos relativos às condições de hibridização necessários para alcançar graus particulares de estringência são debatidos em Sambrook et a/. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.

[0046] Como aqui utilizado, o termo "condições estringentes" abrange as condições sob as quais a hibridização apenas irá ocorrer se houver menos do que 50 % de ligação imperfeita entre a molécula e a hibridização e o DNA alvo. As "condições estringentes" incluir outros níveis particulares de estringência. Assim, como aqui utilizado, as condições de "estringência moderada" são aquelas sob as quais as moléculas com mais de 50 % de ligação imperfeita da sequência não irá hibridizar; condições de "estringência elevada" são aquelas sob as quais as sequências com mais de 20 % de ligação imperfeita não irão hibridizar; e condições de "estringência muito elevada" são aquelas sob as quais as sequências com mais de 10 % de ligação imperfeita não irão hibridizar.

[0047] Nas modalidades particulares, as condições estringentes podem incluir a hibridização em 65 °C, seguido de lavagens a 65 °C com 0,1 x SSC/SDS a 0,1 % durante 40 minutos. O que se segue são as condições de hibridização não limitativas representativas: • a stringência ida: to elevadç: h ibridizaçãã em ta mpão SSC 5x a 65 °C durante 16 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x na temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65 °C durante 20 minutos cada. c a stringêncih elevadç:h ibrididação emtC m pã6 S SC 5 a 6 x em 65 a 70 °C durante 16 a 20 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x na temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 1x em 55 a 70 °C durante 30 minutos cada. c a stringêdcia mederadç:h ibridizaaãã emtC mxão SSC 6x na temperatura ambiente a 55 °C durante 16 a 20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão SSC 2 a 3x na temperatura ambiente a 55 °C durante 20 a 30 minutos cada.

[0048] Em uma modalidade, especificamente, as moléculas de ácido nucleico hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência muito elevada. Em uma modalidade, especificamente, as moléculas de ácido nucleico hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência elevada. Em uma modalidade, especificamente, as moléculas de ácido nucleico hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência moderada.

[0049] Como aqui utilizado, o termo "oligonucleotídeo" refere-se a um polímero de ácido nucleico curto. Os oligonucleotídeos podem ser formados pela clivagem de segmentos de ácido nucleico mais longos, ou através da polimerização de precursores de nucleotídeo individuais. Os sintetizadores automáticos permitem a síntese de oligonucleotídeos de até várias centenas de pares de bases de comprimento. Visto que os oligonucleotídeos podem se ligar a uma sequência de nucleotídeo complementar, eles podem ser utilizados como sondas para a detecção de DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser utilizados na reação em cadeia da polimerase, uma técnica para a amplificação de pequenas sequências de DNA. Na reação em cadeia da polimerase, um oligonucleotídeo é tipicamente referido como um "iniciador" que permite uma DNA polimerase prolongar o oligonucleotídeo e replicar a fita complementar.

[0050] Como aqui utilizados, os termos "Reação da Cadeia de Polimerase" ou "PCR" referem-se a um procedimento ou técnica em que quantidades diminutas de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificadas como descrito na Patente U.S. No 4.683.195. Geralmente, a informação de sequência das extremidades da região de interesse ou além necessita estar disponível, de modo que os iniciadores de oligonucleotídeo possam ser projetados; estes iniciadores serão idênticos ou semelhantes na sequência às fitas opostas do molde a ser amplificado. Os nucleotídeos do terminal 5' dos dois iniciadores podem coincidir com as extremidades do material amplificado. A PCR pode ser utilizada para amplificar as sequências específicas de RNA, as sequências específicas de DNA a partir do DNA genômico total, e cDNA transcrito a partir das sequências totais de RNA celular, bacteriófago ou plasmídeo, etc. Ver de uma forma geral Mullis et al, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).

[0051] Como aqui utilizado, o termo "iniciador" refere-se a um oligonucleotídeo capaz de atuar como um ponto de iniciação da síntese ao longo de uma fita complementar quando as condições forem adequadas para a síntese de um produto de extensão do iniciador. As condições de sintetização incluem a presença de quatro trifosfatos de desoxirribonucleotídeo diferentes e pelo menos um agente indutor da polimerização tal como a transcriptase reversa ou polimerase de DNA. Estes estão presentes em um tampão adequado, que pode incluir constituintes que são cofatores ou que afetam as condições tais como pH e outros mais em várias temperaturas adequadas. Um iniciador é preferivelmente uma sequência de fita simples, de tal modo que a eficiência de amplificação é otimizada, mas as sequências de fita dupla podem ser utilizadas.

[0052] Como aqui utilizado, o termo "sonda" refere-se a uma sequência de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que hibridiza com uma sequência alvo. No procedimento de ensaio de TaqMan® ou estilo Taqman®, a sonda hibridiza em uma parte do alvo situado entre o sítio anelamento de dois iniciadores. A sonda inclui cerca de oito nucleotídeos, cerca de dez nucleotídeos, cerca de quinze nucleotídeos, cerca de vinte nucleotídeos, cerca de trinta nucleotídeos, cerca de quarenta nucleotídeos, ou cerca de cinquenta nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda inclui de cerca de oito nucleotídeos a cerca de quinze nucleotídeos.

[0053] No procedimento de ensaio de Southern blot, a sonda hibridiza com um fragmento de DNA que está ligado a uma membrana. Em um tal ensaio a sonda inclui cerca de dez nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 250 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 1000 nucleotídeos, cerca de 2500 nucleotídeos, ou cerca de 5000 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda inclui de cerca de 500 nucleotídeos a cerca de 2500 nucleotídeos.

[0054] Uma sonda pode ainda incluir um rótulo detectável, por exemplo, um rótulo radioativo, um marcador biotinilado, um fluoróforo (TEXAS RED®, isotiocianato de fluoresceína, etc.). O rótulo detectável pode ser covalentemente ligado diretamente ao oligonucleotídeo da sonda, por exemplo, localizado na extremidade 5' da sonda ou na extremidade 3' da sonda. Uma sonda que inclui um fluoróforo também pode ainda incluir um supressor, por exemplo, BLACK HOLE QUENCHER®, IOWA BLACK™, etc.

[0055] Como aqui utilizados, os termos "identidade de sequência" ou "identidade" podem ser utilizados de modo trocável e se referem aos resíduos de ácido nucleico em duas sequências que são iguais quando alinhadas para a correspondência máxima sobre uma janela de comparação específica.

[0056] Como aqui utilizado, o termo "porcentagem de identidade de sequência" refere-se a um valor determinado mediante a comparação de duas sequências idealmente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências de aminoácido) sobre uma janela de comparação, em que a parte de uma sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) em comparação com uma sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. Uma porcentagem é calculada pela determinação do número de posições em que um resíduo idêntico de ácido nucleico ou aminoácido ocorre em ambas as sequências para obter o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência. Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith and Waterman (1981) dVv. Pppl. ahh. 2:48; ; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. BioL 48:443; Pearson and Lipman (1944) Proc. Natl. Acad. Scl. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1944) Gene 73:237-44 ; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et cl., (1944) Nucleic Acids Res. 1610841-90; Huang et cl., (1998) Comp. AppJ. Biosci. 8:155-65; Peasson ela/., 11994) Methods Mol. Aiol. 89:307-31; Tatiana et c/., (1999) EEMS Microbiol. Lett. 179:897-50.

[0057] The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul e l a /. , 11990; J. Mol. Aiol. 815:903-10) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para utilizar em conexão com vários programas de análise de sequências. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência utilizando este programa está disponível na internet sob a seção "help" para BLAST™. Para compaaações de sequências de ácido nucleico, a função "Blast 8 sequences" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregado utilizando os parâmetros default. As sequências de ácido nucleico com semelhança ainda maior nas sequências de referência irão apresentar crescimento percentual da identidade quando avaliadas por este método.

[0058] Como aqui utilizado, o termo "operativamente ligado" refere-se a um ácido nucleico colocado em uma conexão funcional com outro ácido nucleico. Geralmente, "operativamente ligado" pode significar que os ácidos nucleicos ligados são contíguos. A ligação pode ser executada através da ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais locais não existirem, adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintético são ligados ou anelados com o ácido nucleico e utilizados para ligar o fragmento de polinucleotídeo contíguo. No entanto, os elementos não necessitam ser contíguos para serem operacionalmente ligados.

[0059] Como aqui utilizado, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que geralmente está localizada a montante (em direção à região 5' de um gene) de um gene e é necessária para iniciar e impulsionar a transcrição do gene. Um promotor pode permitir a ativação ou repressão apropriada de um gene que ele controla. Um promotor pode conter sequências específicas que são reconhecidas por fatores de transcrição. Estes fatores podem ligar-se a uma sequência de DNA do promotor, o que resulta no recrutamento da RNA polimerase, uma enzima que sintetiza o RNA a partir da região de codificação do gene. O promotor geralmente refere-se a todos os elementos reguladores do gene localizados a montante do gene, incluindo, os promotores a montante, 5'-UTR, íntrons, e as sequências líderes.

[0060] Como aqui utilizado, o termo "promotor a montante" refere- se a uma sequência de polinucleotídeo contígua que é suficiente para a iniciação direta da transcrição. Como aqui utilizado, um promotor a montante abrange o sítio de iniciação da transcrição com vários motivos de sequência, os quais incluem TATA Box, sequência iniciadora, elementos de reconhecimento TFIIB e outros motivos de promotor (Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev, 16: 2583-2592). O promotor a montante fornece o sítio de ação para a RNA polimerase II que é uma enzima de subunidades múltiplas com os fatores de transcrição basais ou gerais como, TFIIA, B, D, E, F e H. Estes fatores se agrupam em um complexo de pré-iniciação da transcrição que catalisa a síntese de RNA a partir do modelo de DNA.

[0061] A ativação do promotor a montante é feita pela sequência adicional de elementos reguladores da sequência de DNA à qual várias proteínas se ligam e subsequentemente interagem com o complexo de iniciação da transcrição para ativar a expressão do gene. Estas sequências de elementos reguladores do gene interagem com os fatores de ligação ao DNA específicos. Estes motivos de sequência podem ser às vezes referidos como elementos cis. Tais elementos cis, aos quais os fatores de transcrição específicos do tecido ou específicos do desenvolvimento se ligam, individualmente ou em combinação, podem determinar o padrão de expressão espaço- temporal de um promotor no nível de transcrição. Estes elementos cis variam amplamente no tipo de controle que exercem sobre os genes operacionalmente ligados. Alguns elementos atuam para aumentar a transcrição de genes operacionalmente ligados em resposta às respostas ambientais (por exemplo, temperatura, umidade e ferimento). Outros elementos cis podem responder aos estímulos de desenvolvimento (por exemplo, germinação, maturação das sementes e florescimento) ou à informação espacial (por exemplo, a especificidade de tecido). Ver, por exemplo, Langridge et a., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23. Estes elementos cis estão localizados em uma distância variável do ponto de partida da transcrição, alguns elementos cis (chamados elementos proximais) estão adjacentes a uma região promotora mínima do núcleo enquanto outros elementos podem ser posicionados várias quilobases a montante ou a jusante do promotor (intensificadores).

[0062] Um "transgene de ligação ao DNA" é uma sequência de codificação de polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação ao DNA. A proteína de ligação ao DNA é subsequentemente capaz de se ligar a outra molécula. Uma proteína de ligação pode ligar-se, por exemplo, a uma molécula de DNA (uma proteína de ligação ao DNA), uma molécula de RNA (uma proteína de ligação ao RNA), e/ou uma molécula de proteína (uma proteína de ligação à proteína). No caso de uma proteína de ligação à proteína, que pode ligar-se a si mesma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) e/ou pode ligar-se a uma ou mais moléculas de uma proteína ou proteínas diferentes. Uma proteína de ligação pode ter mais do que um tipo de atividade de ligação. Por exemplo, as proteínas "dedo de zinco" possuem ligação de DNA, ligação de RNA, e atividade de ligação à proteína.

[0063] Exemplos de proteínas de ligação ao DNA incluem; meganucleases, dedos de zinco, CRISPRs, e domínios de ligação TALE que podem ser "manipulados" para se ligar a uma sequência de nucleotídeos predeterminada. Tipicamente, as proteínas de ligação ao DNA planejadas (por exemplo, dedos de zinco, CRISPRs, ou TALEs) são proteínas que são de ocorrência não natural. Exemplos não limitativos de métodos para proteínas de ligação ao DNA planejadas são concepção e seleção. Uma proteína de ligação ao DNA concebida é uma proteína que não ocorre na natureza cuja concepção/composição resulta principalmente de critérios racionais. Os critérios racionais para a concepção incluem a aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para o processamento de informações em um banco de dados que armazena informações das concepções existentes de ZFP, CRISPR e/ou TALE e dados de ligação. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. No 6.140.081; 6.453.242 e 6.534.261; ver também as WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496 e Publicação U.S. Nos. 20110301073, 20110239315 e 20119145940.

[0064] Uma "proteína de ligação ao DNA dedo de zinco" (ou domínio de ligação) é uma proteína, ou um domínio dentro de uma proteína maior, que se liga ao DNA de um modo específico da sequência por meio de um ou mais dedos de zinco, que são as regiões de sequência de aminoácido dentro do domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon de zinco. O termo proteína de ligação ao DNA dedo de zinco é muitas vezes abreviado como proteína dedo de zinco ou ZFP. Os domínios de ligação de dedo de zinco podem ser "planejados" para se ligar a uma sequência de nucleotídeo predeterminada. Exemplos não limitativos de métodos para o planejamento de proteínas dedo de zinco são concebidos e selecionados. Uma proteína dedo de zinco concebida é uma proteína que não ocorrem na natureza cuja concepção/composição resulta principalmente de critérios racionais. Os critérios racionais para a concepção incluem a aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para o processamento de informações em um banco de dados que armazena informações de projetos de ZFP existentes e dados de ligação. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 6.140.081; 6.453.242; 6.534.261 e 6.794.136; ver também as WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.

[0065] Em outros exemplos, o domínio de ligação ao DNA de uma ou mais das nucleases compreende um domínio de ligação ao DNA efetor TAL de ocorrência natural ou planejado (de ocorrência não natural). Ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 20110301073. As bactérias patogênicas de plantas do género Xanthomonas são conhecidas de causar muitas doenças em lavouras importantes. A patogenicidade de aanhOomoaas eeeenee ee mm sistema de secreção de tipo III conservada (T3S) que injeta mais do que diferentes proteínas efetoras dentro da célula vegetal. Entre estas proteínas injetados estão os efetores como ativador da transcrição (TALEN) que imitam os ativadores de transcrição da planta e manipulam a transcriptoma da planta Kay et al.( (207)S) Soicece 318:648-651). Estas proteínas contêm um domínio de ligação ao DNA e um domínio de ativação da transcrição. Um dos efetores TAL mais bem caracterizados é AvrBs3 de Xonhhomoaas aomsesgrris pv. Vesicatória (ver Bonas et al, (1989) MoG Gon Goent218:12—1-16 6 e WO 2212229432). Os efetores TAL contêm um domínio centralizado de repetições em tandem, cada repetição contendo aproximadamente 34 aminoácidos, que são fundamentais para a especificidade de ligação ao DNA destas proteínas. Além disso, eles contêm uma sequência de localização nuclear e um domínio de ativação transcricional acídico (para uma revisão ver Schornack S, et al.. (2226) J Plaot Physiol 133(3): 256-222). Aimrn disso, na s badtéria s fitopatogênicas Ralstooia solaoacearum dois genes, designados brg11 e hpx17, foram observados de serem homólogos à família AvrBs3 de Xaothomooas na cepa biovar de R. solaoacearum GMI1222 e na cepa biovar 4 RS1222 (Ver Heuer ea al., -2227) Appl dnE EnvinoMiono 23(13): 4329-4384). Estes genes são 98,9 % idênticos na sequência de nucleotídeo entre si, mas diferem por uma deleção de 1222 bp no domínio de repetição de hpx12. No entanto, ambos os produtos genéticos possuem menos do que 42 % de identidade de sequência com as proteínas da família AvrBs3 de aontoomoass. Ver, oor exemplo, a publicação de Patente U.S. No. 22112321223.

[0066] A especificidade destes efetores TAL depende das sequências encontradas nas repetições em tandem. A sequência repetida compreende aproximadamente 122 bp e as repetições são "protospacer". A Cas9 cliva o DNA para gerar extremidades embotadas na quebra do fita dupla (DSB) nos sítios especificados por uma sequência guia de 20 nucleotídeos contida dentro da transcrição de crRNA. A Cas9 requer tanto o crRNA quanto o tracrRNA para o reconhecimento e clivagem do DNA específico do sítio. Este sistema foi agora planejado de tal modo que o crRNA e o tracrRNA podem ser combinadas em uma molécula (o "RNA de guia única"), e a porção equivalente ao crRNA do RNA de único guia pode ser planejada para guiar a Cas9 nuclease para direcionar qualquer sequência desejada (ver Jinek et al., (2012) Science 337, pp. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, e David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Assim, o sistema CRISPR/Cas pode ser planejado para criar uma DSB em um alvo desejado em um genoma, e o reparo da DSB pode ser influenciado pelo uso de inibidores de reparação para provocar um aumento no reparo propenso a erro.

[0068] Em outros exemplos, o transgene de ligação ao DNA é uma nuclease específica do sítio que compreende uma meganuclease planejada (de ocorrência não natural) (também descrito como uma endonuclease residente). As sequências de reconhecimento de endonucleases ou meganucleases residentes tais como I-See I, I-Ceu I, PI- Psp I, PI-See, I-See IV, I-Csm I, I-Pan I, I-See II, I-Ppo I, I-See III, I-Cre I, I-Tev I, I-Tev II and I-Tev III são conhecidas. Ver também a Patente U.S. No 5.420.032; a Patente U.S. No 6.833.252; Belfort tot al., (1977) Nueleie Aeids Res. 25:3379-30 3388 ; Dujon et al9198Ge Gene 82:115-118; Perler et al., 11994) Nucleic Adds ReS; 22; 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228 ; Gimble et al., 19966JJ. Mol. Biol. 263:163-180; Argast tot al., 19988J J.Mol. Biol. ^84^5^5-35e o o catálogo New England Biolabs. Além disso, a especificidade de ligação ao DNA de endonucleases e meganucleases residentes pode ser planejada para se ligar aos sítios alvos não naturais. Ver, por exemplo, Chevalier et al., (2002) Melee. ee//0O:895-9O5EPniaat et a7,003 03) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962; Ashworth et al., (0066}NaUene 441:696-698; Paques et al, (097O )CurrenG teee Iterpyy 7:46-66; Publicação de Patente U.S. No. 29979117128. Os domínios de ligação ao DNA das endonucleases e meganucleases residentes podem ser alterados no contexto da nuclease como um todo (isto é, de tal modo que a nuclease inclui o domínio de clivagem cognato) ou podem ser fundidos a um domínio de clivagem heterólogo.

[0069] Como aqui utilizado, o termo "transformação" abrange todas as técnicas em que uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em uma tal célula. Exemplos incluem, mas não são limitados a estes: transfecção com vetores virais; transformação com vetores plasmídicos; eletroporação; lipofecção; microinjeção (Mueller et el., (1878) Cell 19:978-89); transferência mediada por Aguobecteuium; absorção direta de DNA; transformação mediada por WHISKERS™; e bombardeamento de microprojéteis. Estas técnicas podem ser utilizadas tanto para a transformação estável quanto para a expressão transitória de uma célula vegetal. A "transformação estável" refere-se à introdução de um fragmento de ácido nucleico dentro de um genoma de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Assim que estavelmente transformado, o fragmento de ácido nucleico é estavelmente integrado no genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração subsequente. Os organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são referidos como organismos "transgênicos". A "transformação transitória" refere-se à introdução de um fragmento de ácido nucleico no núcleo, ou organela contendo DNA, de um organismo hospedeiro, resultando na expressão genética sem herança geneticamente estável.

[0070] Como aqui utilizado, o termo "transduzir" refere-se a um processo onde um vírus transfere ácido nucleico para dentro de uma célula.

[0071] Como aqui utilizado, o termo "transgene" refere-se a uma sequência de ácido nucleico exógena. Em um exemplo, um transgene é uma sequência de gene (por exemplo, um gene de tolerância ao herbicida), um gene que codifica um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica um traço agrícola desejável. Em mais outro exemplo, um transgene é um pequeno RNA, tal como uma sequência de ácido nucleico antissenso, em que a expressão da sequência de pequeno RNA inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. Um transgene pode conter sequências reguladoras operativamente ligadas ao transgene (por exemplo, um promotor, íntron, ou 3'-UTR). Em algumas modalidades, um ácido nucleico de interesse é um transgene. No entanto, em outras modalidades, um ácido nucleico de interesse é um ácido nucleico endógeno, em que cópias genômicas adicionais do ácido nucleico endógeno são desejadas, ou um ácido nucleico que está na orientação antissenso em relação à sequência de um ácido nucleico alvo em um organismo hospedeiro.

[0072] Como aqui utilizado, o termo "pequeno RNA" refere-se a várias classes de ácido ribonucleico se codificação (ncRNA). O termo pequeno RNA descreve as cadeias curtas de ncRNA produzidas nas células bacterianas, animais, plantas e fungos. Estas cadeias curtas de ncRNA podem ser produzidas naturalmente dentro da célula ou podem ser produzidas através da introdução de uma sequência exógena que expressa a cadeia curta ou ncRNA. As sequências de pequeno RNA não codificam diretamente uma proteína, e diferem na função de outros RNA em que as sequências de pequeno RNA são apenas transcritas e não traduzidas. As sequências de pequeno RNA estão envolvidas em outras funções celulares, incluindo a expressão e modificação do gene. As moléculas de pequeno RNA são geralmente preparadas com cerca de 20 a 30 nucleotídeos. As sequências de pequeno RNA podem ser derivadas de precursores mais longos. Os precursores formam estruturas que rebatem entre si nas regiões autocomplementares; eles são depois processados pela nuclease Dicer em animais ou DCL1 nas plantas.

[0073] Muitos tipos de pequeno RNA existem naturalmente ou são produzidos artificialmente, incluindo microRNAs (miRNAs), RNAs de curta interferência (siRNAs), RNA anti-senetido, RNA grampo de cabelo curto (shRNA), e pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs). Certos tipos de pequeno RNA, tais como microRNA e siRNA, são importantes para o silenciamento do gene e a interferência de RNA (RNAi). O silenciamento do gene é um processo de regulação genética em que um gene que normalmente deve ser expresso é "desligado" por um elemento intracelular, neste caso, o pequeno RNA. A proteína que normalmente seria formada por esta informação genética não é formada devido à interferência, e a informação codificada no gene é bloqueada a partir da expressão.

[0074] Como aqui utilizado, o termo "pequeno RNA" abrange moléculas de RNA descritas na literatura como "RNA diminuto" (Storz, (2002) Scincce 9662600-3; lllanaasekare al al., 99 9 99) RNA 5:1482-1489); "pequeno RNA" procariótico (sRNA) (Wassarman ct al., (1999) Trends Microbio/. 7:37-45); "RNA sem codificação eucariótico (ncRNA)"; "micro-RNA (miRNA)"; "pequeno não mRNA (snmRNA)," "RNA funcional (fRNA)," "RNA de transferência (tRNA)," "RNA catalítico" [por exemplo, ribozimas, incluindo ribozimas de auto-acilação (Illangaseare ct al., (1999) RNA 5:1482-1489); "pequeno RNAs nucleolar (snoRNAs)," "tmRNA" (a.k.a. "10S RNA," Muto ct al., (1998) Trnnds Bioecem Sei. 23:25-29; e Gllle/ et a/., (2009)Mol Microbiol. 42:879-885); moléculas de RNAi incluindo sem limitação "pequeno RNA interferente (siRNA)," "siRNA preparado por endorribonuclease (e-siRNA)", "pequeno RNA grampo de cabelo (shRNA)", e "pequeno RNA temporalmente regulado (stRNA)", "siRNA cortado e cubos (d-siRNA ), "e aptâmeros, oligonucleotídeos e outros ácidos nucleicos sintéticos que compreendem pelo menos uma base de uracila.

[0075] Como aqui utilizado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico tal como introduzida em uma célula, produzindo assim uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que permitem a sua replicação na célula hospedeira, tais como uma origem de replicação. Exemplos incluem, mas não são limitados a estes, um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano (BAC), ou vírus que transporta o DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, moléculas antissenso e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar, ou infectar uma célula, desse modo fazendo com que a célula se expresse nas moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor pode opcionalmente incluir materiais para auxiliar na obtenção de entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma).

[0076] Como aqui utilizado, os termos "cassete", "cassete de expressão" e "cassete de expressão do gene" refere-se a um segmento de DNA que pode ser inserido em um ácido nucleico ou polinucleotídeo nos sítios de restrição específicos ou pela recombinação homóloga. Um segmento de DNA compreende um polinucleotídeo contendo um gene de interesse que codifica para um pequeno RNA ou um polipeptídeo de interesse, e o cassete e os sítios de restrição são designados para garantir a inserção do cassete na estrutura de leitura apropriada para a transcrição e translação. Em uma modalidade, um cassete de expressão pode incluir um polinucleotídeo que codifica um pequeno RNA ou um polipeptídeo de interesse e ter elementos além do polinucleotídeo que facilita a transformação de uma célula hospedeira particular. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene também pode incluir elementos que permitem a expressão aumentada de um pequeno RNA ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira. Estes elementos podem incluir, mas não são limitados a estes: um promotor, um promotor mínimo, um intensificador, um elemento de resposta, um íntron, uma sequência de região não traduzida 5', não traduzida 3', uma sequência de terminação, uma sequência de poliadenilação, e outros mais.

[0077] Como aqui utilizado, o termo "sequência de codificação heteróloga" é utilizado para indicar qualquer polinucleotídeo que codifica, ou finalmente codifica, um peptídeo ou proteína ou a sua sequência de aminoácido equivalente, por exemplo, uma enzima, que normalmente não está presente no organismo hospedeiro e pode ser expresso na célula hospedeira sob condições apropriadas. Como tal, as "sequências de codificação heterólogas" podem incluir um ou mais cópias adicionais de sequências de codificação que normalmente não estão presentes na célula hospedeira, de tal modo que a célula expressa cópias adicionais de uma sequência de codificação que não estão normalmente presentes nas células. As sequências de codificação heterólogas podem ser RNA ou qualquer tipo deste, por exemplo, mRNA, DNA ou qualquer tipo deste, por exemplo, cDNA, ou um híbrido de RNA/DNA. Exemplos de sequências de codificação incluem, mas não são limitadas a estas, unidades de transcrição de comprimento total que compreendem tais aspectos como a sequência de codificação, íntrons, regiões promotoras, 5'-UTR, 3'- UTRs e regiões intensificadoras.

[0078] As "sequências de codificação heterólogas" também incluem a parte codificadora do peptídeo ou enzima, isto é, a sequência de cDNA ou mRNA, do peptídeo ou enzima, assim como a parte de codificação da unidade de transcrição de comprimento total, isto é, o gene compreendendo íntrons e éxons, assim como sequências "otimizadas pelo códon", sequências truncadas ou outras formas de sequências alteradas que codificam a enzima ou codificam a sua sequência de aminoácido equivalente, contanto que a sequência de aminoácido equivalente produza uma proteína funcional. Tais sequências de aminoácido equivalentes podem ter uma deleção de um ou mais aminoácidos, com a deleção sendo N-terminal, C-terminal ou interna. As formas truncadas são previstas contanto que elas tenham a capacidade catalítica aqui indicada.

[0079] Como aqui utilizado, o termo "controle" refere-se a uma amostra utilizada em um procedimento analítico para propósitos de comparação. Um controle pode ser "positivo" ou "negativo". Por exemplo, onde o propósito de um procedimento analítico for detectar uma transcrição diferencialmente expressa ou polipeptídeo nas células ou tecidos, é geralmente preferível incluir um controle positivo, tal como uma amostra de uma planta conhecida que apresenta a expressão desejada, e um controle negativo, tal como uma amostra de uma planta conhecida que carece da expressão desejada.

[0080] Como aqui utilizado, o termo "planta" inclui plantas e partes de plantas incluindo, mas não limitadas a estas, células vegetais e tecidos vegetais tais como folhas, caules, raízes, flores, pólen e sementes. Uma classe de planta que pode ser utilizada na presente invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores receptivas à mutagênese, incluindo angiospermas, gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Assim, "planta" inclui plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas. Exemplos de plantas dicotiledôneas incluem tabaco, Arabidopsis, soja, tomate, papaia, canola, girassol, algodão, alfafa, batata, videira, guandu, ervilha, Brassica, grão de bico, beterraba açucareira, colza, melancia, melão, pimenta, amendoim, abóbora, rabanete, espinafre, abóbora, brócolis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo, couve chinesa, pepino, berinjela e alface. Exemplos de plantas monocotiledôneas incluem milho, arroz, trigo, cana de açúcar, cevada, centeio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, taboa, lírios, aveia, cebola, painço, trigo e triticale.

[0081] Como aqui utilizado, o termo "matéria vegetal" refere-se às folhas, caules, raízes, flores ou partes das flores, frutos, pólen, óvulos, zigotos, sementes, mudas, culturas de células ou tecidos, ou qualquer outra parte ou produto de uma planta. Em uma modalidade, a matéria vegetal inclui cotilédone e folha. Em uma modalidade, a matéria vegetal inclui tecidos da raiz ou outros tecidos vegetais localizados embaixo da terra.

[0082] Como aqui utilizado, o termo "gene marcador selecionável" refere-se a um gene que é opcionalmente utilizado na transformação de plantas, por exemplo, para proteger as células vegetais de um agente seletivo, ou fornecer resistência/tolerância a um agente seletivo. Além disso, o "gene marcador selecionável" pretende abranger os genes repórteres. Só as células ou plantas que recebem um marcador selecionável funcional são capazes de dividir ou cultivar sob condições tendo um agente seletivo. Exemplos de agentes seletivos podem incluir, por exemplo, antibióticos, incluindo espectinomicina, neomicina, canamicina, paramomicina, gentamicina e higromicina. Estes marcadores selecionáveis incluem neomicina fosfotransferase (npt ll), que expressa uma enzima que confere resistência ao antibiótico canamicina e os genes para os antibióticos relacionados neomicina, paromomicina, gentamicina, e G418, ou o gene para a higromicina fosfotransferase (hpt), que expressa uma enzima que confere resistência à higromicina. Outros genes marcadores selecionáveis podem incluir genes que codificam a tolerância ao herbicida incluindo bar ou pa( (tolerância contra glufosinato de amônio ou fosfinotricina), ceeOolcctaOo sintaee (ALS , tolerância contra inibidores tais como sulfonilureias (SUS), imidazolinonas (IMIs), triazolopirimidinas (TPs), oxibenzoatos de pirimidinila (POBs), e carbonil triazolinonas de sulfonilamino que impedem a primeira etapa na síntese dos aminoácidos de cadeia ramificada), glifosato, 2,4-D, e resistência ou sensibilidade a metais. Exemplos de "genes repórteres" que podem ser utilizados como um gene marcador selecionável incluem a observação visual de proteínas do gene repórter expressas tais como as proteínas que codificam a ß- glucuronidase (GUS), luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarela (YFP), DsRed, ß-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina, e outros mais. A expressão "marcador positivo" refere-se às plantas que foram transformadas Para incluir um gene marcador selecionável.

[0083] Como aqui utilizado, o termo "marcador detectável" refere- se a um rótulo capaz de detecção, tal como, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, quelante de metal ou enzima. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, mas não são limitados a estes, o que se segue: rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanídeos fosforescentes), rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano-picante, ß- galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina) grupos de biotinila quimioluminescentes, epitopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares do zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, rótulos de epitopo ). Em uma modalidade, um marcador detectável pode ser ligado através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o bloqueio estérico potencial.

[0084] Como aqui utilizado, o termo "detecção" é utilizado no sentido mais amplo para incluir as medições tanto qualitativas quanto quantitativas de uma molécula específica, por exemplo, medições de um polipeptídeo específico.

[0085] A não ser que de outra maneira especificamente explicada, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como normalmente entendido por aqueles de habilidade prática na técnica que esta divulgação pertence. As definições dos termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994; Kendrew et a/,, (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994; and Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995.

ELEMENTOS REGULADORES

[0086] Os promotores vegetais utilizados para a investigação básica ou aplicações biotecnológicas direcionam a expressão do transgene que foi fundido na sua extremidade 3' (a jusante) para expressar de forma robusta os transgenes dentro plantas para o planejamento metabólica e concentração de traços. Como um resultado, existe uma necessidade de novos promotores que possam direcionar a expressão de múltiplos genes em culturas transgênicas. Aqui divulgado é um promotor que pode direcionar a expressão de um primeiro gene que foi fundida na sua extremidade 3' (a jusante).

[0087] O desenvolvimento de produtos transgênicos está se tornando cada vez mais complexo, o que requer a expressão robusta de transgenes e a concentração de múltiplos transgenes em um único lócus. Tradicionalmente, cada transgene requer um único promotor para expressão em que múltiplos promotores são requeridos para expressar diferentes transgenes dentro de uma concentração de genes. Com um tamanho crescente de concentrações de genes, isto frequentemente leva ao uso repetido do mesmo promotor para obter níveis semelhantes de padrões de expressão de diferentes transgenes para a expressão de um único traço poligênico. Os construtos de múltiplos genes impulsionados pelo mesmo promotor são conhecidos de provocar o silenciamento do gene, resultando em produtos transgênicos menos eficazes no campo. Excesso de sítios de ligação ao fator de transcrição (TF) devido à repetição de promotores de ligação pode causar a depleção de TFs endógenos que levam à inativação da transcrição. O silenciamento do transgene provavelmente afetará de forma indesejável o desempenho de uma planta transgênica produzida para expressar os transgenes. As sequências repetitivas dentro de um transgene pode levar à recombinação homóloga intralócus do gene resultando em rearranjos de polinucleotídeo.

[0088] Os promotores específicos do tecido (isto é, preferido do tecido) ou específicos de órgãos impulsionam a expressão genética em um determinado tecido tal como no grão, raiz, folha, ou tapete da planta. Os promotores específicos do tecido e do estágio de desenvolvimento derivam a expressão de genes, os quais são expressos nos tecidos particulares ou em períodos de tempo especiais durante o desenvolvimento da planta. Os promotores específicos do tecido são requeridos para certas aplicações na indústria de plantas transgênicas e são desejáveis visto que eles permitem a expressão específica dos genes heterólogos de uma maneira seletiva do estágio de tecido e/ou de desenvolvimento, indicando a expressão do gene heterólogo diferencialmente em vários órgãos, tecidos e/ou tempos, mas não em outros. Por exemplo, o aumento da resistência de uma planta à infecção por patógenos do solo pode ser executado pela transformação do genoma de uma planta com um gene de resistência ao agente patogênico de tal modo que a proteína de resistência ao patógeno é robustamente expressa dentro das raízes da planta. Alternativamente, seria desejável expressar um transgene nos tecidos vegetais que estão em um crescimento particular ou fase de desenvolvimento tais como, por exemplo, divisão celular ou alongamento. Outra aplicação é o desejo de utilizar os promotores específicos de tecidos, por exemplo, de tal forma que iria limitar a expressão dos transgenes que codificam um traço agronômico no desenvolvimento de xilema. Um problema particular que permanece na identificação dos promotores específicos do tecido é como identificar os genes potencialmente mais importantes e seus promotores correspondentes, e relacioná-los com as propriedades específicas em desenvolvimento da célula. Outro problema é clonar todos os elementos de controle da transcrição de atuação cis relevantes de modo que o fragmento de DNA clonado impulsione a transcrição no padrão de expressão específico desejado. Dado que tais elementos de controle estão localizados de forma distal a partir do início da translação ou sítio de partida, o tamanho do polinucleotídeo que é selecionada de compreender o promotor é de importância para fornecer o nível de expressão e os padrões de expressão da sequência de polinucleotídeo do promotor. Um problema particular é identificar os promotores específicos de tecido, relacionados aos tipos específicos de célula, estágios de desenvolvimento e/ou funções na planta que não são expressas em outros tecidos vegetais.

[0089] Métodos e construtos são fornecidos utilizando elementos reguladores do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays para expressar os transgenes na planta. Em uma modalidade, um promotor pode ser um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total de: GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCA AATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAAC AATTGTTTAAGATAACATTAGGACATGTACAATATGTGTCTTTGGAT GTGTTTAAGGAGTAAATGTAAAAAAAATAGATACGTCTCTTAACGA AGTCATTGTGTCTTGGCTCTATGCTCGAGACGGAGAAATAGCTAA TTGATTAATTTAATTTATTGAATGTTCTTATTGGTGTAATGAATATAG TAAGGCACTGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCTTATGCTATG TTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCCTAAGAGAAA ATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGTTATTTTTTCA ACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGATTTACATAATT TTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGTATTTTATGAG TCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTTTGACTTTTGA GAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTAAACCTTAAAA TACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAATTTTCTGAAAA TAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTAGGTTATTAG GGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCGATAGGCACA GGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATTTTAGGGCCTGT TTGGTTCACGGCTAATTATGCCACACTTTGCCTAAGGTTAGTCGTC CGAATTGAAGAACTAACCTTATGCAGAAAAGTTAGGCAAAGTATG GCAAGTTAGGTAGTAAACCAAACAGGCCAAAGTATTTGTCATCAA GCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGATTGCTAGAAAATAAA GAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTTATCTATAACTTATAT GCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCCCTACGAACCTTGAG GCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCTTGGCGCCGGCCCT GGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGCGACTGGTCACGAG GCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAAATGGCAAGGGCGG CATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAGGACAACTGAAAAGT TACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACACGTTAAAAAGTCGAT TATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACCGCCAGCAAGCTTG TTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCTTTCACCAAAAATA CAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAAATCTTAATGTTTTA AATTAAAATATGTGGCTCTACGTAGGAAAAAATAATTCAATCGAGT CTCATTTCATAAAAAAAATTTGGTCAAAAAATTATACACCATCTCGC TCAAGTGACTCAAATATACTAAACGGTACTGAGCTGTCTTATAATA TAAATTTGATTTACTGTTAGAATATGATGTTTTATGAGTGCACTAAA TTCTATAAAATATATTTATTTTTAAATTATAAGATATTTTTATAGGTC TGCTCTTAGAGAGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAA ATCCATAACCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCC GCGGAGATTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAG GCTCCGGTGGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATG GCATCCGAGCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCG GCGGTGTTTCCCTCCATCTGCTCTGCTCTTTAAATACCTCCGTCGT CTCCTCGTCTCCACAGCATCTCAAGTCTTCACACTCCTCGCCATCA CATAAAACCAGTGCAAGCAGAAGCAGCGCA (SEQ ID NO:1)

[0090] Em uma modalidade, um promotor pode ser um promotor a montante do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays de comprimento total de: GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCA AATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAAC AATTGTTTAAGATAACATTAGGACATGTACAATATGTGTCTTTGGAT GTGTTTAAGGAGTAAATGTAAAAAAAATAGATACGTCTCTTAACGA AGTCATTGTGTCTTGGCTCTATGCTCGAGACGGAGAAATAGCTAA TTGATTAATTTAATTTATTGAATGTTCTTATTGGTGTAATGAATATAG TAAGGCACTGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCTTATGCTATG TTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCCTAAGAGAAA ATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGTTATTTTTTCA ACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGATTTACATAATT TTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGTATTTTATGAG TCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTTTGACTTTTGA GAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTAAACCTTAAAA TACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAATTTTCTGAAAA TAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTAGGTTATTAG GGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCGATAGGCACA GGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATTTTAGGGCCTGT TTGGTTCACGGCTAATTATGCCACACTTTGCCTAAGGTTAGTCGTC CGAATTGAAGAACTAACCTTATGCAGAAAAGTTAGGCAAAGTATG GCAAGTTAGGTAGTAAACCAAACAGGCCAAAGTATTTGTCATCAA GCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGATTGCTAGAAAATAAA GAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTTATCTATAACTTATAT GCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCCCTACGAACCTTGAG GCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCTTGGCGCCGGCCCT GGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGCGACTGGTCACGAG GCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAAATGGCAAGGGCGG CATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAGGACAACTGAAAAGT TACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACACGTTAAAAAGTCGAT TATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACCGCCAGCAAGCTTG TTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCTTTCACCAAAAATA CAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAAATCTTAATGTTTTA AATTAAAATATGTGGCTCTACGTAGGAAAAAATAATTCAATCGAGT CTCATTTCATAAAAAAAATTTGGTCAAAAAATTATACACCATCTCGC TCAAGTGACTCAAATATACTAAACGGTACTGAGCTGTCTTATAATA TAAATTTGATTTACTGTTAGAATATGATGTTTTATGAGTGCACTAAA TTCTATAAAATATATTTATTTTTAAATTATAAGATATTTTTATAGGTC TGCTCTTAGAGAGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAA ATCCATAACCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCC GCGGAGATTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAG GCTCCGGTGGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATG GCATCCGAGCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCG GCG (SEQ ID NO:2)

[0091] Em uma modalidade, um promotor pode ser um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado de: GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCA AATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAAC AATTGTTTAAGATAACATGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCT TATGCTATGTTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCC TAAGAGAAAATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGT TATTTTTTCAACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGAT TTACATAATTTTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGT ATTTTATGAGTCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTT TGACTTTTGAGAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTA AACCTTAAAATACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAAT TTTCTGAAAATAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTA GGTTATTAGGGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCG ATAGGCACAGGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATAAA GTATTTGTCATCAAGCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGAT TGCTAGAAAATAAAGAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTT ATCTATAACTTATATGCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCC CTACGAACCTTGAGGCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCT TGGCGCCGGCCCTGGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGC GACTGGTCACGAGGCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAA ATGGCAAGGGCGGCATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAG GACAACTGAAAAGTTACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACAC GTTAAAAAGTCGATTATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACC GCCAGCAAGCTTGTTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCT TTCACCAAAAATACAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAA ATCTGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAAATCCATAA CCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCCGCGGAGA TTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAGGCTCCGGT GGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATGGCATCCGA GCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCGGCGGTGTT TCCCTCCATCTGCTCTGCTCTTTAAATACCTCCGTCGTCTCCTCGT CTCCACAGCATCTCAAGTCTTCACACTCCTCGCCATCACATAAAAC CAGTGCAAGCAGAAGCAGCGCA (SEQ ID NO:3)

[0092] Em uma modalidade, um promotor pode ser um promotor a montante do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado de: GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCA AATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAAC AATTGTTTAAGATAACATGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCT TATGCTATGTTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCC TAAGAGAAAATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGT TATTTTTTCAACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGAT TTACATAATTTTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGT ATTTTATGAGTCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTT TGACTTTTGAGAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTA AACCTTAAAATACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAAT TTTCTGAAAATAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTA GGTTATTAGGGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCG ATAGGCACAGGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATAAA GTATTTGTCATCAAGCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGAT TGCTAGAAAATAAAGAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTT ATCTATAACTTATATGCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCC CTACGAACCTTGAGGCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCT TGGCGCCGGCCCTGGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGC GACTGGTCACGAGGCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAA ATGGCAAGGGCGGCATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAG GACAACTGAAAAGTTACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACAC GTTAAAAAGTCGATTATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACC GCCAGCAAGCTTGTTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCT TTCACCAAAAATACAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAA ATCTGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAAATCCATAA CCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCCGCGGAGA TTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAGGCTCCGGT GGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATGGCATCCGA GCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCGGCG (SEQ ID NO:4)

[0093] Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um promotor. Em uma modalidade, um promotor pode ser um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays da presente divulgação. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um promotor, em que o promotor é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 % ou 100 % idêntico à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene que compreende o promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays pode impulsionar a expressão de dois ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[0094] A expressão de transgene também pode ser regulada por uma região do íntron localizado a jusante da sequência do promotor. Tanto um promotor quanto um íntron pode regular a expressão do transgene. Enquanto um promotor é necessário para impulsionar a transcrição, a presença de um íntron pode aumentar os níveis de expressão que resultam na transcrição de mRNA para a translação e síntese de proteína. Uma região do íntron do gene ajuda a expressão estável de um transgene.

[0095] Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um íntron. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, o íntron pode ser um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays (1) de: GTGTTTCCCTCCATCTGCTCTGCTCTTTAAATACCTCCGTCGTCTC CTCGTCTCCACAG (SEQ ID NO:5)

[0096] Em uma modalidade, um íntron pode ser o íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays (2) de: GTGGAGGCGCCACCGCCCACCGGCCACCGCTGCGGATATCTAG (SEQ ID NO:6)

[0097] Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um íntron, em que o íntron é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, ou 100 % idêntico à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um íntron de um gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um promotor, em que o promotor é um promotor do gene de Zea mays, ou um promotor que se origina de uma planta (por exemplo, promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays ou promotor de ubiquitina 1 eea mays), um víuus (po e exemplo, promotor do vírus do mosaico da nervura de mandioca), ou uma bactéria (por exemplo, Agoobactenum tumeaaciens deiaa mas). Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um íntron de um gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays 3 que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiente de uso de água, um transgene qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[0098] A expressão de transgene também pode ser regulada por uma região do gene não traduzida 3' (isto é, 3'-UTR) localizada a jusante da sequência de codificação do gene. Tanto um promotor quanto uma 3'- UTR pode regular a expressão do transgene. Embora um promotor seja necessário para impulsionar a transcrição, uma região do gene da 3'-UTR pode terminar a transcrição e iniciar a poliadenilação de uma transcrição de mRNA resultante para translação e síntese de proteína. Uma região do gene da 3'-UTR auxilia a expressão estável de um transgene. Em uma modalidade, uma 3'-UTR pode ser um comprimento total do 3’-UTR do gene die ligação de clorofila a/b de Zea mays de: GGGGGTGGAGGCGCCACCGCCCACCGGCCACCGCTGCGGATAT CTAGGTGTTCGGATGCACGTGAGCGCGCACTGGTTCCAGTTTGTA CCATGATGTAAATTACTTACCGTACCAGGGTTCAATCGGCAAGGA AGAATTGTTGTGTTCACTGTCTTGGGCAGTCTCTTGGTCCAATATG AATCAACTTACACAGCATCTCCAAAAACTTCTAAAATTACTAGCTG AATGCCCGTGCGTTGCAACGGGAATATATAATACCAGTATACTAC GATAACTTATATACAAAATGTATGTTATATCGTTATGAGAAAATGTT TCATAACCAATTTATGATTCTGGTCATACATAAATTTTGTTATTTATA GTCTATCTGTTTCACCACTACATTGCAACCATCAGTATCATGCAGA CTTCGATATATGTTACGATTTGTATGGTCTCATTATTGGAGAGCAC GTTCCACACATACCGGAAGAAATTTTCTCGTACATCGTTAGTCATC AGACACGTACCACCATACACTTTTGCTTAAACAAAAATGCAAGTGT GTGTTTGCGAAGAGAATTAAAGGCAAGTCGACACAAAAGCTACCC CAACGGTGGCGAGGATGACGAACTGGTCATTTTTGTCGGTCCTCC CCTGCGTCACCTCTGGCGCCAAGATGACGCCATAGTCCTCGATAT AGTAATCGTCGAACGCGCGCGACATACCGAGTACTGATGACTCTT GGCTGGGCTGTAAAACGAAGTGCACCCCGGGCTCATCAGCAAGG TAGTACCCCTGGTCGTTGCACTACCGGATGCGCTACTACTCTACA TGCATCGTGTTCGAGGATACTCATACAACGTCAGCAACGGCTATC GTCTCAGTGCACAAGAATTCATGCCTAGTCAGTAGCGACTTACGT GGCTGGTTGGGCTTCAGGTGAACGATGAGCTGGACAACGTGATG GCGTCGTCGTCGAATGCAGTGCCCAGAACAACCCGAAAGTCGCC GACG (SEQ ID NO:7)

[0099] Em uma modalidade, uma 3'-UTR pode ser uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificada: GGGGGTGGAGGCGCCACCGCCCACCGGCCACCGCTGCGGATAT CTAGGTGTTCGGATGCACGTGAGCGCGCACTGGTTCCAGTTTGTA CCATGATGTAAATTACTTACCGTACCAGGGTTCAATCGGCAAGGA AGAATTGTTGTGTTCACTGTCTTGGGCAGTCTCTTGGTCCAATATG AATCAACTTACACAGCATCTCCAAAAACTTCTAAAATTACTAGCTG AATGCCCGTGCGTTGCAACGGGAATATATAATACCAGTATACTAC GATAACTTATATACAAAATGTATGTTATATCGTTATGAGAAAATGTT TCATAACCAATTTATGATTCTGGTCATACATAAATTTTGTTATTTATA GTCTATCTGTTTCACCACTACATTGCAACCATCAG (SEQ ID NO:8)

[00100] Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende uma 3'-UTR. Em uma modalidade, uma 3'-UTR pode ser uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende uma 3'- UTR, em que a 3'-UTR é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende uma 3-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligada a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende uma 3'-UTR que é operativamente ligada a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00101] Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um promotor, íntron, e uma 3'-UTR purificada a partir do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende: a) um promotor, em que o promotor é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 % ou 100 % idêntico à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; b) um íntron, em que o íntron é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, ou 100 % idêntico à SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6; e/ou, c) uma 3'-UTR, em que a 3'-UTR é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

[00102] Por exemplo, um cassete de expressão do gene pode incluir um promotor e uma 3'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7. Em outra modalidade, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 3'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade subsequente, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 3'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7. Em mais outra modalidade, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 3'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8.

[00103] Em uma outra modalidade, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 3'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 3, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7. Em mais outra modalidade, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 3'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 3, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 3'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 4, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7. Em mais outra modalidade, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 3'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 4, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8.

[00104] Em outra modalidade, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron, e uma 3'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7. Em uma outra modalidade, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron, e uma 3'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e o 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade adicional, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron e uma 3'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 3, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7. Em uma outra modalidade, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron, e uma 3'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 3, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8.

[00105] Em outra modalidade, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron e uma 3'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7. Em uma outra modalidade, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron e uma 3'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade adicional, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron e uma 3'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 4, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7. Em uma outra modalidade, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron e uma 3'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 4, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e a 3'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 8.

[00106] Em uma modalidade, uma 5'-UTR pode ser uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays: CATCTCAAGTCTTCACACTCCTCGCCATCACATAAAACCAGTGCAA GCAGAAGCAGCGCA (SEQ ID NO:19)

[00107] Em uma modalidade, um construto de ácido nucleico é fornecido compreendendo uma 5'-UTR, em que a 5'-UTR é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende uma 5'-UTR. Em uma modalidade, uma 5'-UTR pode ser uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende uma 5'-UTR, em que a 5'- UTR é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays 5' -UTR que é operativamente ligado a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende uma 5'-UTR que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, uma transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00108] Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um promotor, um íntron, e uma 5'-UTR purificada a partir do 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende: a) um promotor, em que o promotor é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4; b) um íntron, em que o íntron é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6; e/ou, c) uma 5'-UTR, em que a 5'-UTR é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, ou 100 % idêntica à SEQ ID NO: 19.

[00109] Por exemplo, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 5'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 e a 5'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade subsequente, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 5'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2 e a 5'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 19.

[00110] Em uma outra modalidade, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 5'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 3 e a 5'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 19. Em mais outra modalidade, um cassete de expressão do gene pode incluir tanto um promotor quanto uma 5'-UTR em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 4 e a 5'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 19.

[00111] Em outra modalidade, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron, e uma 5'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 2, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e a 5'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 19. Em uma outra modalidade, o cassete de expressão do gene pode incluir um promotor, um íntron, e uma 5'-UTR, em que o promotor é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 4, o íntron é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5, e a 5'-UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 19.

[00112] Um promotor, um íntron, uma 3'-UTR e/ou uma 5'-UTR podem ser operativamente ligados a diferentes transgenes dentro de um cassete de expressão do gene, quando um cassete de expressão do gene inclui um ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um promotor do gene de Zea mays (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4) que está operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um promotor do gene de Zea mays (SEQ ID NO): 1, SEQ ID NO): 2, SEQ ID NO: 3, ou SEQ ID NO: 4), um íntron (SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6), e uma 5'-UTR (SEQ ID NO: 19) que é operativamente ligada a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um gene de Zea mays 3'-UTR (SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8) que é ligado operativamente a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações. Em outra modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um gene de Zea mays 5'-UTR (SEQ ID NO: 19) que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00113] Em uma modalidade, um vetor compreende um cassete de expressão do gene como aqui divulgado. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um bacteriófago, um vírus, ou um fragmento de polinucleotídeo cortado para uso na transformação ou direcionamento de genes tal como um DNA doador.

[00114] Em uma modalidade, uma célula ou planta compreende um cassete de expressão do gene como aqui divulgado. Em uma modalidade, uma célula ou planta compreende um vetor compreendendo um cassete de expressão do gene como aqui divulgado. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo bacteriano artificial (BAC), um bacteriófago, ou um vírus. Desse modo, uma célula ou planta compreendendo um cassete de expressão do gene como aqui divulgado é uma célula transgênica ou uma planta transgênica, respectivamente. Em uma modalidade, uma planta transgênica pode ser uma planta monocotiledônea. Em uma modalidade, uma planta monocotiledônea transgênica pode ser, mas não é limitada a estas, milho, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, banana, cana de açúcar e painço. Em uma modalidade, uma planta transgênica pode ser uma planta dicotiledônea. Em uma modalidade, uma planta dicotiledônea transgênica pode ser, mas não é limitada a estas, soja, algodão, girassol e canola. Uma modalidade também inclui uma semente transgênica de uma planta transgênica como aqui divulgada.

[00115] Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui dois ou mais transgenes. Os dois ou mais transgenes podem ser operativamente ligados a um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, um íntron ou uma 3'-UTR como aqui divulgado. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene inclui um ou mais transgenes. Em uma modalidade com um ou mais transgenes, pelo menos um transgene é operacionalmente ligado a um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, intron, ou 3-UTR ou a presente divulgação.

MARCADORES SELECIONÁVEIS

[00116] Vários marcadores selecionáveis também descritos como genes repórteres podem ser incorporados em um vetor de expressão selecionado para levar em conta a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Vários métodos estão disponíveis para confirmar a expressão de marcadores selecionáveis nas plantas transformadas, incluindo, por exemplo, o sequenciamento de DNA e a PCR (reação em cadeia de polimerase), Southern blotting, mancha de RNA, métodos imunológicos para a detecção de uma proteína expressa a partir do vetor, por exemplo, a proteína precipitada que medeia a resistência de fosfinotricina, ou observação visual de outras proteínas tais como os genes repórteres que codificam a ß- glucuronidase (GUS), luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarela (YFP), DsRed, g-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina, e outros mais (Ver Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001).

[00117] Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores selecionáveis incluem os genes que codificam a resistência a antibiótico, tais como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), assim como os genes que conferem tolerância aos compostos herbicidas. Os genes de tolerância ao herbicida geralmente codificam uma proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou uma enzima que degradou desintoxica o herbicida na planta antes que ele possa atuar. Por exemplo, a tolerância ao glifosato foi obtida através do uso de genes que codificam as enzimas alvos mutantes, 5-enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS). Os genes e mutantes de EPSPS e são bem conhecidos, e ainda descritos abaixo. A tolerância ao glifosinato amônio, bromoxinila, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida através do uso de genes bacterianos que codificam pat ou SSM-2, uma nitrilsee, um gene aact-1 ou aadt72, que desintaxica os respectivos herbicidas.

[00118] Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir o ponto ou meristema em crescimento, incluindo a imidazolinona ou sulfonilureia, e genes para a resistência/tolerância de acetoidroxiácido sintetase (AHAS) e acetolactato sintase (ALS) para esses herbicidas são bem conhecidos. Os genes de tolerância ao glifosato incluem os genes mutantes de 5-enolpiruvilchi2uimato-3-fosfato sintase (EPSPs) e ggt- 28 (através da introdução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou várias formas de mutagênese in vivo dos genes nativos EPSPs), os genes aroA e genes de glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente). Os genes da resistência para outros compostos de fosfono incluem os genes bar de espécies Streptomcces, incluindo Streptomyces Cygroecoptcue e Streptomcees vtridichromoenee, , e piridinóxi ou ácidos fenóxi propriônicos e cicloexonas (genes de codificação do inibidor de ACCase). Os genes exemplares que conferem resistência à cicloexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipropanoi co (incluindo Haloxifop, Diclofop, Fenoxiprop, Fluazifop, Quizalofop) incluem os genes de acetil coenzima A carboxilase (ACCase)--Acc1-S1, Acc1-S2, e Acc1-S3. Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene de nitrilase).

[00119] Em uma modalidade, os genes marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados aos genes que codificam: a neomicina fosfotransferase II; a cianamida hidratase; aspartato cinase; diidrodipicolinato sintase; triptofano descarboxilase; diidrodipicolinato sintase e aspartato cinase insensível; o gene bar; triptofano descarboxilase; neomicina fosfotransferase (NEO); higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG); diidrofolato redutase (DHFR); fosfinotricina acetiltransferase; 2,2-ácido dicloropropiônico desalogenase; acetoidroxiácido sintase; 5-enolpiruvil-chiquimato- fosfato sintase (aroA); haloarilnitrilase; acetil-coenzima A carboxilase; diydropteroato sintase (sul I); e 32 kD fotossistema II polipeptídeo (psbA).

[00120] Uma modalidade também inclui os genes que codificam resistência a: cloranfenicol; metotrexato; higromicina; espectinomicina; bromoxinila; glifosato; e fosfinotricina.

[00121] A lista acima de genes marcadores selecionáveis não se destina a ser limitativa. Qualquer gene repórter ou marcador selecionável é incluído pela presente invenção.

[00122] Os genes marcadores selecionáveis são sintetizados com relação à expressão ideal em uma planta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de codificação de um gene foi modificada pela otimização do códon para aumentar a expressão nas plantas. Um gene marcador selecionável pode ser otimizado com relação à expressão em uma espécie vegetal particulara ou alternativamente pode ser modificado para a expressão ideal em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Os códons preferidos da planta podem ser determinados a partir dos códons de maior frequência nas proteínas expressas na maior quantidade da espécie vegetal particular de interesse. Em uma modalidade, um gene marcador selecionável é concebido para ser expresso nas plantas em um nível mais elevado que resulta em maior eficiência de transformação. Métodos para a otimização de genes na planta são bem conhecidos. Orientação em relação à otimização e fabricação de sequências de polinucleotídeo sintéticas pode ser encontrada, por exemplo, nas WO 2013016546, WO 2011146524, WO 1997013402, Patente U.S. No 6.166.302, e Patente U.S. No 5.380.831.

TRANSGENES

[00123] Os métodos e composições divulgados podem ser utilizados para expressar as sequências do gene de polinucleotídeo dentro do genoma da planta. Consequentemente, a expressão de genes que codificam tolerância ao herbicida, resistência a insetos, nutrientes, antibióticos, ou moléculas terapêuticas pode ser impulsionada por um promotor vegetal.

[00124] Em uma modalidade o elemento regulador do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays da presente divulgaãão é combinado ou operativamente ligado com as sequências de polinucleotídeo de codificação do gene que fornecem resistência ou tolerância ao glifosato ou outro herbicida, e/ou fornece resistência a insetos ou doenças selecionadas e/ou melhorias nutricionais, e/ou características agronômicas melhoradas e/ou proteínas ou outros produtos úteis na ração, no alimento, na indústria, em farmacêutica, ou outros usos. Os transgenes podem ser "concentrados" com duas ou mais sequências de ácido nucleico de interesse dentro do genoma da planta. A concentração pode ser consumada, por exemplo, através da reprodução convencional de plantas utilizando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com um construto que contém as sequências de interesse, retransformação de uma planta transgênica, ou adição de novos traços através da integração direcionada por meio da recombinação homóloga.

[00125] Tais sequências de polinucleotídeo de interesse incluem, mas não são limitadas a estas, os exemplos apresentados abaixo: 1. Genes ou Sequência de Codificação (por exemplo, iRNA) que conferem resistência às Pragas ou Doenças

[00126] (A) Genes de Resistência às Doenças das Plantas. As defesas das plantas são muitas vezes ativadas pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência correspondente (Avr) no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com o gene de resistente clonado para planejar as plantas que são resistentes às cepas patogênicas específicas. Exemplos de tais genes incluem o gene de tomate Cf-9 para a resistência a Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994, Science, 266:789), o gene do tomate Pto, que codifica uma proteína cinase, para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al., 1993 Science 262:1432), e o gene de Arabidopsis RSSP2 para resistência a Psuudomnass synngae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089).

[00127] (B) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado deste, ou um polipeptídeo sintético modelado nesse, tal como uma sequência de nucleotídeo de um gene Bt d-endotoxina (Geise r et al. , 1986 Gene 48:109), e um gene inseticida vegetativo (VIP) (ver, por exemplo, Estruch et al., (996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94). Além do mais, as moléculas de DNA que codificam os genes de d- endotoxina podem ser adquiridas da American Type Culture Collection (Rockville, Md.), sob os números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995e31998.

[00128] (C) Uma lectina tal como as sequências de nucleotídeo de vários genes de lectina de ligação a manose Clivia miniata (Van Damme st al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825).

[00129] (D) Uma proteína de ligação de vitamina, tal como avidina e homólogos de avidina que são úteis como larvicidas contra pragas de inseto. Ver a Patente U.S. No 5.659.026.

[00130] (E) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor da protease ou um inibidor da amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor da cisteína proteinase do arroz (Abe st a/,, 19)857 J, Bio., Chem. 262:16793), um inibidor da proteinase do tabaco I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), e um inibidor da a-amilase (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243).

[00131] (F) Um hormônio ou feromônio específico de insetos tais como um ecdiesteroi de e hormônio juvenil, uma variante destes, um mimético com base nele, ou um antagonista ou agonista deste, tal como a expressão de baculovírus do hormônio esterase juvenil clonado, um inativador do hormônio juvenil (Hammock ea a/, , 1990 Nature 344:458).

[00132] (G) Um peptídeo ou neuropeptídeo específico de inseto que, após a expressão, perturba a fisiologia da praga afetada (J. Biol. Chem. 269:9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diurético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diplpptera uncctata (Pratt, 1999) , e neurotoxinas paralisantes de específicas de inseto (Patente U.S. No 5.266.361).

[00133] (H) Um veneno específico de inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc., tal como um peptídeo insetotóxico de escorpião (Pang, 1992 Gene 116:165).

[00134] (I) Uma enzima responsável por uma hiperacumulação do monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroi de, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoi de ou outra molécula não proteica com atividade inseticida.

[00135] (J) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação de pós-translação, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, enzima glicolíticas, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma cinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, quer natural ou sintética. Exemplos de tais genes incluem, um gene calas (pedido publicado PCT WO 93/02197), sequências de codificação de quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, a partir da ATCC sob os números de acesso 3999637 e 67152), ancilóstomo quitinase do tabaco (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691), e o gene ubi4- 2 poliubiquitina da salsa (Kawalleck ea a/, . 1993 Plant Molec . Biol . 21:673).

[00136] (K) Uma molécula que estimula a transdução de sinal. Exemplos de tais moléculas incluem as sequências de nucleotídeo de clones de cDNA de calmodulina de feijão mung (Botella et a.,, 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeo de um clone de cDNA de calmodulina do milho (Griess et a.,, 1994 Plant Physiol. 104:1467).

[00137] (L) Um peptídeo momento hidrofóbico. Ver as Patentes U.S. Nos 5.659.026 e 5.607.914; este último ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças.

[00138] (M) Um membrana permease, um formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo de peptídeo cecropin-ß lítico (Jaynes et a.,, 1993 Plant Sei. 89:43) que torna as plantas de tabaco transgênicas resistentes à Pseudomonas solanacearum.

[00139] (N) Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada desta. Por exemplo, a acúmulo de proteínas de revestimento virais em células vegetais transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento da doença efetuado pelo vírus a partir do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como pelos vírus relacionados. A resistência mediada pela proteína de revestimento foi conferida após as plantas transformadas contra o vírus mosaico da alfalfa, vírus do mosaico do pepino, vírus de estria do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus da gravura de tabaco, vírus de chocalho do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Ver, por exemplo, Beachy et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451.

[00140] (O) Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada deste. Assim, um anticorpo direcionado para uma função metabólica crítica no intestino do inseto iria inativar uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor et al., (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions shows enzymatic inactivation in transgenic tobacco via production of single-chain antibody fragments.

[00141] (P) Um anticorpo específico do vírus. Ver, por exemplo, Tavladoraki et al., (1993) Nature 266:469, que mostra que as plantas transgênicas que expressam os genes de anticorpos recombinantes são protegidos do ataque do vírus.

[00142] (Q) Uma proteína interrompida no desenvolvimento, produzida na natureza por um agente patogênico ou um parasita. Assim, endo a-1,4-D poligalacturases es fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutrientes da planta através da solubilização da parede celular vegetal homo a-1,4-D-galacturonsse (Lamb et a/., 1992 Bio/eccnnolggy 104466). A olonosem e caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição da endopoligalacturonase do feijão são descritas por Toubart et al., (1999 Plant J. 9:467).

[00143] (R) Uma proteína de interrupção do desenvolvimento produzida na natureza por uma planta, tal como o gene inativação do ribossoma da cevada que fornece uma maior resistência à doença fúngica (Longemann et al., 1999 Bio/Technology 10:4405).

[00144] (S) Interferência de RNA, em que uma molécula de RNA é utilizada para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA em um exemplo é parcial ou totalmente de fita dupla, o que desencadeia uma resposta de silenciamento, resultando na clivagem do dsRNA em pequenos RNAs interferentes, que são depois incorporados em um complexo de direcionamento que destrói os mRNAs homólogos. Ver, por exemplo, Fire et al., US aatent 6,506,559; Graham et al., 6,573,099. 2. Genes que Conferem Tolerância a um Herbicida

[00145] (A) Os genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como uma imidazalinona, sulfonanilida, ou herbicidas de sulfonilureia. Genes exemplar neste código de categoria para acetolactato sintase (ALS) (Lee et a/,, 1988 EMBOJ. 7:1241) também conhecida como enzima acetoidroxiácido sintase (AHAS) (Miki et al,, 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449).

[00146] (B) Um ou mais genes adicionais que codificam resistência ou tolerância ao glifosato conferida pelos genes de EPSP sintase mutantes e aroA, ou através da inativação metabólica por genes tais como DGT-28, 2mEPSPS, GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos de fosfono tais como o glufosinato (genes pat, bar e dsm-2), e ácidos ariloxifenoxipropiônico e cicloexanodionas (genes de codificação do inibidor de ACCase). Ver, por exemplo, a Patente U.S. No 4.940.835, que divulga a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSP que pode conferir resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob o Número de Acesso ATCC 39256, e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é divulgada na Patente U.S. No 4.769.061. O pedido de patente Europeu No. 0 333 033 e a Patente U.S. No 4.975.374 divulgam as sequências de nucleotídeo dos genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas tais como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene de fosfinotricinacetil-transferase é fornecida no pedido Europeu No. 0 242 246. De Greef et al., (1989 Bio/Technology 7:61) descreve a produção de plantas transgênicas que expressam os genes bar quiméricos que codificam a atividade de fosfinotricina acetil transferase. Exemplos de genes que conferem resistência aos ácidos ariloxifenoxipropiônico e cicloexanodionas, tais como setoxidim e haloxifop, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall et al., (1992 Theor. Appl. Genet. 83:435).

[00147] (C) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla et a/., (1991 Plant Cell 3:169) descrevem o uso de plasmídeos que codificam os genes psbA mutantes para transformar Clamidomonas. As sequências de nucleotídeo para os genes de nitrilase são divulgados na Patente U.S. No 4.810.648, e as moléculas de DNA que contêm estes genes estão disponíveis sob os números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e expressão de DNA que codifica uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes et al. , 119522 Biochem . J . 285:173).

[00148] (D) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que se liga às hidroxifenilpiruvato dioxigenases (HPPD), enzimas que catalisam a reação em que o para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isso inclui herbicidas tais como isoxazóis (EP 418175, EP 470856, EP 487352, EP 527036, EP 560482, EP 682659, Patente U.S. No 5.424.276), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para o milho, dicetonitrilas (EP 496630, EP 496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3- 4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4- 2,3Cl2fenil)propano-1,3-diona, tricetonas (EP 625505, EP 625508, Patente U.S. No 5.506.195), em particular sulcotriona, e pirazolinatos. Um gene que produz um excesso de HPPD nas plantas pode fornecer tolerância ou resistência a tais herbicidas, incluindo, por exemplo, os genes descritos na Patente U.S. Nos 6.268.549 e 6.245.968 e Pedido de Patente U.S., Publicação No. 20030066102.

[00149] (E) Genes que codificam resistência ou tolerância aos herbicidas de fenóxi auxina, tais como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que também podem conferir resistência ou tolerância aos herbicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de a-ostoglutarato (aad-1), descrito na Patente U.S. No 7.838.733.

[00150] (F) Genes que codificam a resistência ou tolerância aos herbicidas fenóxi auxínicos, tais como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que também podem conferir resistência ou tolerância aos herbicidas piridilóxi auxina, tais como fluroxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de a-cetoglutarato (aad-12), descrito em WO 2007/053482 A2.

[00151] (G) Genes que codificam resistência ou tolerância a dicamba (ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 20030135879).

[00152] (H) Genes que fornecem resistência ou tolerância aos herbicidas que inibem a protoporfirinogênio oxidase (PPO) (ver a Patente U.S. No 5.767.373).

[00153] (I) Genes que fornecem resistência ou tolerância aos herbicidas de triazina (tais como atrazina) e herbicidas derivados de ureia (tais como diuron) que se ligam às proteínas do núcleo do centros reação do fotossistema II (PS II) (Ver Brussian et a/,, (19)89)) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245). 3. Genes que Conferem ou Contribuem com um Traço Adicionado ao Valor

[00154] (A) Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, através da transformação de milho ou Brsssica oom um gene antissenso ou ACP dessaturase de estearoíla para aumentar o teor de ácido esteárico da planta (Knultzon et cl, 1992 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624).

[00155] (B) Diminuição do teor de fitato

[00156] (1) A introdução de um gene de codificação da fitase, tal como o gene da fitase de Aspergillus niger (Van Hartingsveldt ea al. , 1993 Gene 127:87), aumenta a desagregação de fitato, a adição de fosfato mais livre na planta transformada.

[00157] (2) Um gene pode ser introduzido que reduz o teor de fitato. No milho, isto, por exemplo, pode ser executado pela clonagem e depois reintrodução do DNA associado com o único alelo que é responsável por mutantes de milho caracterizados por baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).

[00158] (C) Composição de carboidratos modificada efetuada, por exemplo, pela transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima que altera o padrão de ramificação do amido. Exemplos de tais enzimas incluem, o gene de frutosiltransferase de Streptococcus muco (Shiroza et al., 1988 J. Bacteriol. 170:810), gene de levansucrase de Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1985, Mol. Gen. Genel. 200:220), a-amllase de Bacillus llchenifomiis (Pena et a., . 1992. Bio/Technology 10:292), genes de invertase do tomate (Elliot et al., 1993 Plant Mol. Biol. 21:515-524), o gene de amilase da cevada (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480), e enzima II de ramificação de amido do endosperma de milho (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450).

TRANSFORMAÇÃO

[00159] Os métodos adequados para a transformação de plantas incluem qualquer método que o DNA possa ser introduzido em uma célula, por exemplo, e sem limitação: eletroporação (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5.384.253); bombardeamento de microprojéteis (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861 e 6.403.865); transformação mediada por Agrobacterium (ver, por exemplo, as Patente U.S. No 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840 e 6.384.301); e transformação de protoplastos (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 5.508.184). Estes métodos podem ser utilizados para transformar de forma estável ou transitoriamente transformar uma planta.

[00160] Um construto de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula vegetal utilizando técnicas tais como agitação com fibras de carboneto de silício (ver, por exemplo, as Patente U.S. No 5.302.523 e 5.464.765), ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido vegetal utilizando métodos biolísticos, tais como bombardeamento de partículas de DNA (ver, por exemplo, Klein et al, (1987) Nature 327:70-73). Alternativamente, o construto de DNA pode ser introduzido na célula vegetal através da transformação de nanopartículas (ver, por exemplo, a Publicação de Patente U.S. No. 2009/0104700).

[00161] Além disso, a transferência genética pode ser conseguida utilizando bactérias não Agrobacterium ou vírus, tais como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium Loti', vírus X da batata, vírus do mosaico da couve-flor e vírus do mosaico da nervura da mandioca e/ou vírus do mosaico de tabaco, ver, por exemplo, Chung et ai., (2006) Trends Plant Scl. 11(1):1-4.

[00162] Através da aplicação de técnicas de transformação, as células de praticamente qualquer espécie de planta podem ser transformadas de forma estável, e estas células podem ser desenvolvidas em plantas transgênicas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto de transformação de algodão são descritas nas Patentes U.S. Nos 5.846.797; 5.159.135; 5.004.863 e 6.624.344; as técnicas para a transformação de plantas de Brasslca em particular são descritas, por exemplo, na Patente U.S. No 5.750.871; as técnicas para a transformação da soja são descritas, por exemplo, na Patente U.S. No 6.384.301; e as técnicas para a transformação de milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 7.060.876 e 5.591.616, e Publicação Internacional PCT WO 95/06722.

[00163] Após efetuar a liberação de um ácido nucleico exógeno a uma célula receptora, uma célula transformada é geralmente identificada para outro cultivo e regeneração da planta. A fim de melhorar a capacidade de identificar transformantes, pode-se desejar empregar um gene marcador selecionável com o vetor de transformação utilizado para gerar o transformante. Em uma modalidade ilustrativa, uma população de células transformadas pode ser experimentada mediante a exposição das células a um agente ou agentes seletivos, ou as células podem ser submetidas a triagem para o traço genético desejado do marcador.

[00164] As células que sobrevivem a exposição a um agente seletivo, ou células que foram marcados positivas em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas em meios que sustentam a regeneração das plantas. Em uma modalidade, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado pode ser modificado pela inclusão de outras substâncias, tais como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com os reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para iniciar os esforços de regeneração da planta, ou após rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), depois transferido para o meio conducente para a formação do broto. As culturas são transferidas periodicamente até que formação de broto suficiente ocorra. Assim que os brotos são formados, eles são transferidos para o meio conducente para a formação de raízes. Assim que raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para posterior crescimento e maturação.

[00165] Para confirmar a presença de construtos compreendendo ácido nucleico desejados na regeneração de plantas, uma variedade de ensaios pode ser executada. Tais ensaios podem incluir: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting e PCR; ensaios bioquímicos, tais como a detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, através de meios imunológicos (ELISA, Western blot, e/ou LC-MS MS espectrofotometria), ou através da função enzimática; ensaios com partes de plantas, tais como ensaios com folhas ou raízes; e/ou análise do fenótipo da planta regenerada inteira.

[00166] Eventos transgênicos podem ser submetidos a triagem, por exemplo, através da amplificação da PCR utilizando, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos para as moléculas de ácido nucleico de interesse. A genotipagem de PCR é compreendida de incluir, mas não se limita a estes, amplificação da reação de cadeia polimerase (PCR) do DNA genômico derivado do tecido do calo isolado da planta hospedeira prevista para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguido pela clonagem padrão e análise de sequência de produtos da amplificação da PCR. Os métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (ver, por exemplo, Rios et al., (2002) Plant J. 32:243-53), e podem ser aplicados ao DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta ou tipo de tecido, incluindo as culturas de células. As combinações de iniciadores oligonucleotídeo que se ligam tanto na sequência alvo quanto na sequência introduzida podem ser utilizadas sequencialmente ou multiplexadas em reações de amplificação da PCR. Os iniciadores de oligonucleotíde concebidos para anelar com o sítio alvo, sequências de ácido nucleico introduzidas, e/ou combinações dos dois, podem ser produzidos. Assim, as estratégias de genotipagem de PCR podem incluir, por exemplo e sem limitação: a amplificação de sequências específicas no genoma da planta; amplificação de múltiplas sequências específicas no genoma da planta; amplificação das sequências não específicas no genoma da planta; e combinações de qualquer um dos precedentes. Uma pessoa versada na técnica pode planejar combinações adicionais de iniciadores e reações de amplificação para examinar o genoma. Por exemplo, um conjunto de iniciadores de oligonucleotídeo avançados e reversos pode ser projetado para anelar com as sequências de ácido nucleico específicos para o alvo fora dos limites da sequência de ácido nucleico introduzida.

[00167] Os iniciadores oligonucleotídeo avançados e reversos podem ser concebidos para se anelar especificamente a uma molécula de ácido nucleico introduzida, por exemplo, em uma sequência que corresponde a uma região de codificação dentro de uma sequência de nucleotídeo de interesse aqui compreendida, ou outras partes da molécula de ácido nucleico. Os iniciadores podem ser utilizados em conjunto com os iniciadores aqui descritos. Os iniciadores de oligonucleotídeo podem ser sintetizados de acordo com uma sequência desejada e estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA). A amplificação pode ser seguida pela clonagem e sequenciamento, ou pela análise de sequência direta dos produtos de amplificação. Em uma modalidade, os iniciadores oligonucleotídeo específicos para o gene alvo são empregados nas amplificações da PCR.

MÉTODO DE EXPRESSAR UM TRANSGENE

[00168] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente iigado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um promotor e íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operccionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta que compreende o crescimento de uma planta compreendendo um gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays 3' -UTR operccienalmente Hadoo a eek) menos mo transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um promotor, íntron e 3'--TR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta que compreende o crescimento de uma planta compreendendo uma 5’--TR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente iigada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um promotor, íntron e 5'- -TR do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta que compreende o crescimento de uma planta compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta que compreende o crescimento de uma planta compreendendo um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays op>er^a^o>nam)eni^^ ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta que compreende o crescimento de uma planta compreendendo um promotor e íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta que compreende o crescimento de uma planta compreendendo uma 3--UTR do gene de iigação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente iigada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta que compreende o crescimento de uma planta compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operccionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta que compreende o crescimento de uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta que compreende o crescimento de uma planta compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e um gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays 5' -UTR operacionalmente ligados a pelo menos um transgene.

[00169] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal que compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal que compreende um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal que compreende um promotor e íontron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente iigado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal que compreende uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal que compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e uma 3’-UITR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal que compreende um promotor, íntron e 3'-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal que compreende uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal que compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente iigados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal que compreende um promotor, íntron e 5'-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene.

[00170] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende um promotor e íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de eaa rnays operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operativamente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende um promotor, íntron e 3'-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zee mays e uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zaa aiays operativamente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o crescimento de uma planta compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende um promotor, íntron e 5'-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene.

[00171] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão do gene de um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão do gene de um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zaa mays operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão do gene de um promotor e íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão do gene de uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão do gene de um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e uma 3’- UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zaa mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende um promotor, íntron e 3'-UTR operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão do gene de uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente iigada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão do gene de um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operccionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão do gene que compreende um promotor, íntron e 5'-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays operacionalmente ligados a pelo menos um transgene.

[00172] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays (também incluindo um promotor a montante). Em uma modalidade, um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays pode ser a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, em que o promotor é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 % ou 100 % idêntico à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que está operativamente ligado a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea may's que está operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00173] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um íntron. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, o íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um íntron, em que o íntron é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 % ou 100 % idêntico à SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um promotor, em que o promotor é um promotor de Zea mays, ou um promotor que se origina de uma planta (por exemplo, promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays ou promotor de ubiquitina 1 de eea may)) , um vírus (po s exemplo, promotor do vírus do mosaico da nervura da mandioca), ou uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas) , Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays que é operativamente ligado a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido vegetal ou uma célula vegetal que compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00174] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, o 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, em que o 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 % ou 100 % idêntico à SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays que é operacionalmente ligada a um promotor, em que o promotor é um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, ou um promoter que se origina de uma planta (por exemplo, promotor de ubiquitina 1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor do vírus do mosaico da nervura da mandioca), ou uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium tumefaciens delta mas). Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é ligada operativamente a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido vegetal ou uma célula vegetal que compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é ligada operativamente a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00175] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays. Em uma modalidade, o 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays é um polinucleotídeo de SEQ ID NO: 19. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, em que o 5’- UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 % ou 100 % idêntico à SEQ ID NO: 19 . Em uma modalidade, um cassete de expressão do gene compreende uma 5’- UTR do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays que é operacionalmente ligada a um promotor, em que o promotor é um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, ou um promotor que se origina de uma planta (por exemplo, promotor de ubiquitina 1 de Zea mays), um vírus (por exemplo, promotor do vírus do mosaico da nervura da mandioca), ou uma bactéria (por exemplo, Agrobacterium tumefacieny delta mas). Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays que é operativamente ligada a um transgene. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido vegetal ou uma célula vegetal que compreende um cassete de expressão do gene compreendendo uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligada a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00176] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que são ligados operativamente a um transgene. O promotor, íntron, 3'-UTR e 5'-UTR podem ser operativamente ligados a diferentes transgenes dentro de um cassete de expressão do gene, quando um cassete de expressão do gene inclui dois ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00177] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que são operativamente ligados a um transgene. O promotor, íntron e 3'-UTR podem ser operativamente ligados a diferentes transgenes dentro de um cassete de expressão do gene, quando um cassete de expressão do gene inclui dois ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligada a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00178] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um cassete de expressão do gene compreendendo um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, um a3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays e uma 5’- UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que são ligados operativamente a um transgene. O promotor, íntron, 3'-UTR e 5'-UTR podem ser operativamente ligados a diferentes transgenes dentro de um cassete de expressão do gene, quando um cassete de expressão do gene inclui dois ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende um íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays que é operativamente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão do gene compreende uma 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays é operativamente ligada a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência ao inseticida, um transgene de tolerância ao herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene marcador selecionável, ou suas combinações.

[00179] Em uma modalidade, a expressão do transgene utilizando os métodos aqui descritos é expressa dentro de uma folha da planta e tecidos do caule. Em uma modalidade, a expressão do transgene inclui mais do que um transgene expresso na folha da planta e tecidos do caule. Em uma modalidade, um método de crescimento de uma planta transgênica como aqui descrito, inclui a expressão preferida do transgene na folha e caule. Em uma modalidade, um método de expressão de um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal inclui os tecidos preferidos da folha e do caule e as células preferidas da folha e do caule. Em uma modalidade, a expressão preferida da folha e caule inclui a expressão preferida da folha e caule do milho.

[00180] Em uma outra modalidade, a expressão do transgene utilizando os métodos aqui descritos é expressa dentro dos tecidos vegetais acima do solo (por exemplo, os tecidos vegetais acima do solo incluem folha, casca, caule e seda). Em uma modalidade, a expressão do transgene inclui mais do que um transgene expresso nos tecidos vegetais acima do solo. Em uma modalidade, um método de crescimento de uma planta transgênica como aqui descrita inclui a expressão do transgene dos tecidos vegetais acima do solo. Em uma modalidade, um método de expressão de um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal, tecidos vegetais acima do solo e células vegetais acima do solo. Em uma modalidade, a expressão do tecido vegetal acima do solo inclui a expressão do tecido vegetal de milho acima do solo.

[00181] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um vetor compreendendo um elemento regulador do promotor, íntron, 3'-UTR ou 5'-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays como aqui divulgado . Em uma modaiidade . uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um vetor compreendendo um elemento regulador do promotor, íntron, 3'-UTR ou 5'-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays como aqui divulgado ligado operativamente a um transgene. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um vetor compreendendo um cassete de expressão do gene como aqui divulgado. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, ou de um fragmento de vírus.

[00182] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal de acordo com os métodos aqui divulgados pode ser monocotiledônea. A planta, tecido vegetal ou uma célula vegetal monocotiledônea pode ser, mas não limitado a estes, milho, arroz, trigo, cana de açúcar, cevada, centeio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, taboa, lírio, aveia, cebola, painço, trigo e triticale.

[00183] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal de acordo com os métodos aqui divulgados pode ser dicotiledônea. A planta, tecido vegetal ou célula vegetal dicotiledônea pode ser, mas não é limitado estes, colza, canola, mostarda da Índia, mostarda da Etiópia, soja, girassol e algodão.

[00184] No que diz respeito à produção de plantas geneticamente modificadas, os métodos para a engenharia genética das plantas são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, numerosos métodos para a transformação de plantas têm sido desenvolvidos, incluindo os protocolos de transformação biológica e física para plantas dicotiledôneas, assim como as plantas monocotiledôneas (por exemplo, Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)). Além disso, os vetores e métodos de cultivo in vttro para a transformação e regeneração de célula ou tecido vegetal de plantas estão disponíveis, por exemplo, em Gruber et a/,, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993).

[00185] Uma pessoa de habilidade na técnica reconhecerá que assim que a sequência exógena está estavelmente incorporada nas plantas transgênicas e confirmada de ser operável, pode ser introduzida em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer uma de várias técnicas de reprodução padrão pode ser utilizada, dependendo da espécie a ser cruzada.

[00186] Uma célula vegetal, calo, tecido ou planta transformada pode ser identificado e isolado mediante a seleção ou triagem da matéria vegetal planejada com relação aos traços codificados pelos genes marcadores presentes no DNA transformante. Por exemplo, a seleção pode ser executada através do crescimento da matéria vegetal planejada em meio contendo uma quantidade inibidora do antibiótico ou herbicida a qual o construto do gene transformante confere resistência. Além disso, as células transformadas também podem ser identificadas através da triagem com relação as atividade de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes yfp, gfp, ß-glucuronidase, luciferase , B ou C1) que podem esta r presentes nos construtos de ácido nucleico recombinante. Tais metodologias de seleção e triagem são bem conhecidas daqueles versados na técnica.

[00187] Os métodos físicos e bioquímicos também podem ser utilizados para identificar os transformantes de plantas ou células vegetais que contêm construtos de genes inseridos. Estes métodos incluem, mas não são limitados a estes: 1) análise de Southern ou amplificação da PCR para detectar e determinar a estrutura da inserção de DNA recombinante; 2) Northern blot, proteção de S1 RNase, extensão do iniciador ou amplificação da PCR por transcriptase reversa para a detecção e exame dos transcritos de RNA dos construtos de genes; 3) ensaios enzimáticos para a detecção da atividade de enzima ou ribozima, onde tais produtos genéticos são codificados pelo construto do gene; 4) análise do sequenciamento da próxima geração (NGS); 5) eletroforese em gel de proteína, técnicas de western blot, imunoprecipitação, ou ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), onde os produtos de construto do gene são as proteínas. Técnicas Adicionais, tais como hibridização in situ, marcação de enzima, e imunomarcação, também podem ser utilizadas para detectar a presença ou a expressão do construto recombinante em órgãos e tecidos específicos da planta. Os métodos para fazer todos esses ensaios são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

[00188] Efeitos da manipulação genética utilizando os métodos aqui divulgados podem ser observados, por exemplo, Northern blots do RNA (por exemplo, mRNA) isolados a partir dos tecidos de interesse. Tipicamente, se o mRNA estiver presente ou a quantidade de mRNA aumentou, pode presumir-se que o transgene correspondente está sendo expresso. Outros métodos de medição do gene e/ou da atividade de polipeptídeo codificado podem ser utilizados. Diferentes tipos de ensaios enzimáticos podem ser utilizados, dependendo do substrato utilizado e do método de detecção do aumento ou diminuição de um produto de reação ou subproduto. Além disso, os níveis de polipeptídeo expressos podem ser medidos de forma imunoquímica, isto é, ELISA, RIA, EIA e outros ensaios baseados no anticorpo bem conhecidos daqueles de habilidade na técnica, tais como por meio de ensaios de detecção eletroforéticos (com coloração ou western blottiing). Como um exemplo não limitativo, a detecção das proteínas AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenase; ver a WO 2005/107437) e PAT (fosfinotricina-N-acetil-transferase) utilizando um ensaio de ELISA é descrita na Publicação de Patent U.S. No. 20090093366. O transgene pode ser seletivamente expresso em alguns tipos de células ou tecidos da planta ou em alguns estágios de desenvolvimento, ou o transgene pode ser expresso em praticamente todos os tecidos vegetais, substancialmente ao longo de todo o seu ciclo de vida. No entanto, qualquer modo de expressão combinatória também é aplicável.

[00189] A presente divulgação também abrange as sementes das plantas transgênicas descritas acima, em que a semente compreende o transgene ou cassete de expressão do gene. A presente divulgação abrange ainda a progênie, clones, linhagens celulares ou células das plantas transgênicas descritas acima em que dita descendência, clone, linhagem celular ou célula compreendem o construto de transgene ou gene.

[00190] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos métodos e modalidades específicas, será observado que várias modificações e alterações podem ser feitas sem se afastar da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação de Elementos Reguladores de Expressão Elevada

[00191] Novos elementos reguladores do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays foram identifiaados através de uma abordagem de perfil transcricional mediante a utilização de Next Generation Sequencing (NGS). Estes elementos reguladores foram então identificados, isolados e clonados para caracterizar o perfil de expressão dos elementos reguladores para uso nas plantas transgênicas. As linhagens de milho transgênicas transformadas de forma estável com um gene cry34Ab1 isolado de Bacillus thuringienyiy e um gene marcador selecionável aa1 foram produzidas e os níveis de expressão do transgene e a especificidade do tecido foram avaliados. Como tais, os novos elementos reguladores do gene de ligação de clorofila a/b de eea mays foram identifiaados e aaracterizados . Divulgados pela primeira vez são os elementos reguladores de promotor, íntron, 5'-UTR e 3'-UTR para uso em construtos de expressão do gene.

Abordagem do Perfil Transcricional:

[00192] Os tecidos de milho foram obtidos de plantas cultivadas em diferentes estágios de crescimento e desenvolvimento da planta com relação ao perfil de transcrição para identificar e selecionar os elementos reguladores dos genes nativos de milho com perfis de expressão desejados para uso em cassetes de expressão do gene. Por exemplo, as amostras de tecido do desenvolvimento de quatro estágios de folha (V4 (duplicada), V12 e R3) e quatro estágios de raiz (V4 e V12 nodal e tecidos fibrosos), pólen, seda, sabugo, grãos imaturos (20 dias após a polinização), casca e caule (V4 e R1) foram coletadas. O mRNA total foi isolado de todos os tecidos acima descritos e o mRNA de alta qualidade em quantidades desejadas foi obtido.

[00193] Logo depois, as bibliotecas de cDNA foram preparadas de cada uma das amostras de mRNA e o sequenciamento de alto rendimento foi concluído utilizando um ILLUMINA HISEQ® 2000 (Illumina Inc., San Diego, CA). Além disso, o kit de preparação de amostra de RNA da ILLUMINA TRUSEQ® foi utilizado de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante para a preparação da amostra de RNAseq. Em resumo, 5 µg de RNA total foram purificados utilizando glóbulos magnéticos ligados a poli-T oligo seguido pela fragmentação em pequenos pedaços (cerca de 200 bp de comprimento médio) utilizando cátions divalentes sob alta temperatura. Depois, os iniciadores da transcriptase reversa SUPERSCRIPT® II e aleatórios foram então utilizados para copiar o mRNA fragmentado no primeiro cDNA da fita. O cDNA foi ainda convertido no cDNA de fita dupla (ds cDNA), utilizando o DNA polimerase I e RNAase H. Os fragmentos de cDNA de fita dupla depois passaram pela reparação final, extremidade A, e então a ligação aos adaptadores da extremidade emparelhada (PE) Ilumina indexados. Finalmente, os produtos da biblioteca foram limpos e enriquecidos com 15 ciclos de PCR e purificados. As bibliotecas enriquecidas foram normalizadas para uma concentração de 2 nM, desnaturadas com hidróxido de sódio, e diluídas em 12 pM em tampão de hibridização para carregar em uma única pista de uma célula de fluxo HISEQ®. Geração de cluster, hibridização do iniciador e reações de sequenciamento foram realizadas de acordo com um protocolo de sequenciamento recomendado pelo fabricante Ilumina.

[00194] As leituras de sequenciamento foram então filtradas para remover as leituras de baixa qualidade. Cerca de 99,9 % das leituras de sequenciamento foram retidas após a filtragem. As leituras de sequenciamento foram alinhadas no genoma anotado de Zea mays c.v. B73 disponível no maizeGDB. As leituras de sequenciamento que foram mapeadas no genoma do milho em mais do que um lócus foram eliminadas para evitar confusão na identificação dos genes de alta expressão e a sua caracterização adicional. Esta etapa levou ao alinhamento de > 70 % de leituras de sequenciamento de cada uma das amostras no genoma do milho. A unidade de expressão genética quantitativa de fragmentos por quilobase do éxon por milhão de fragmentos mapeados (ou valores FPKM) foi utilizadas para classificar os genes para o teste de transformação estável que coincide com um padrão de expressão desejável para uso nos construtos de expressão do gene. Aproximadamente de 15 a 20 genes de expressão elevada, que representam ~0,1 % dos genes mais altamente expressos no milho, foram priorizados para testes nas linhagens transgênicas estáveis (Fig. 1).

Exemplo 2: Identificação do Elemento Regulador do Gene

[00195] As sequências de promotor, íntron, 5'-UTR e 3'-UTR foram extraídas da sequência do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays Zea que foi dlentifi^da a partir dos perfis dóis abordagens do perfil de bioinformática e transcrição anteriormente descritos. A sequência isolada e purificada do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays, a partir do genoma de Zea May c.v. B73 é fornecida como SEQ ID NO: 9. A sequência do promotor de 2006 bp de comprimento total (SEQ ID NO: 1) compreende pares de bases de 1 a 2006 da SEQ ID NO: 9. A sequência promotora a montante de 1887 bp (SEQ ID NO: 2) compreende pares de bases de 1 a 1887 da SEQ ID NO: 9. A sequência de íntron de 59 bp (SEQ ID NO: 5) compreende pares de base de 1888 a 1946 da SEQ ID NO: 9. A sequência de 5'-UTR de 60 bp (SEQ ID NO: 19) compreende pares de bases de 1947 a 2006 da SEQ ID NO: 9. Os códons de partida e parada translacionais ATG e TGA que flanqueiam a sequência de codificação compreendem pares de base de 2007 a 2009 e de 2802 a 2804, respectivamente, da SEQ ID NO: 9. A sequência de 3'-UTR de 1000 bp (SEQ ID NO: 7) compreende pares de base de 2805 a 3804 da SEQ ID NO: 9. Um segundo íntron de 43 bp (SEQ ID NO: 6) é identificado dentro da 3'- UTR e compreende pares de base de 2809 a 2851 da SEQ ID NO: 9.

[00196] Os elementos de DNA foram amplificados quer ou sintetizados e clonados nos vetores de entrada. Os tamanhos do promotor de comprimento total e da 3'-UTR de comprimento total foram 2006 bp e 1000 bp, respectivamente.

Exemplo 3: Modificações das Sequências de Promotor e 3'-UTR do Gene de Ligação de Clorofila a/b de Zea mays

[00197] A sequência de promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays foi modificada. Sequências repetidas foram identificadas e removidas, resultando assim em uma sequência de promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificada de: GCACAAAATACATAAAACTAGATTAGAAAAGGAAGAGAATACGCCA AATTGCAGCTTAATCAATTAGACGATTTAGTCCTGTTTTTACGAAAC AATTGTTTAAGATAACATGGCCTTATACTTGGAGTTTGGCATGTCT TATGCTATGTTGCAAACAGGCCCGGTCTTGACATTTCGGGGGCCC TAAGAGAAAATTTATATAGAGGTCCTATACGAAAATTTGAGTCTGT TATTTTTTCAACTTTTAAATAATATATGAAAAATAAAAAATTGATGAT TTACATAATTTTATTCAAAATGATATGACTGGAAATATTGTTACAGT ATTTTATGAGTCGTAAAATTATATAAATTATGTAATATACATTTGTTT TGACTTTTGAGAGAGTATTTTTACTTTTAATTTGTCAAACTAGCCTA AACCTTAAAATACACAGTAAACCAAATCTAAATACATTAGATCAAAT TTTCTGAAAATAAAGTTCAGCAAACTAAACTAGGATTAATCAATGTA GGTTATTAGGGTCGACCCTTCGGTAGGCTAGAATTAAGCAACGCG ATAGGCACAGGTGTACAACACCTTTCGTCCTTCCCACGTCAATAAA GTATTTGTCATCAAGCAGACGGTTGCGCGACCTCAAAGAGATGAT TGCTAGAAAATAAAGAGACGCAACAAAAGAATGAAAATATAGATTT ATCTATAACTTATATGCATTTGATATAAGATAGATAAATGGGAGCC CTACGAACCTTGAGGCTCTGAGCAGTCGCATATCCTGCACACCCT TGGCGCCGGCCCTGGTTGCAAATATGCAATTGTGTCCTTATCCGC GACTGGTCACGAGGCTAGGATTGATCGAAAGCTGCCGATGAGAA ATGGCAAGGGCGGCATGCTGTGGCCTTTTTTTTACGGTCTGTCAG GACAACTGAAAAGTTACAAATTTATAGTGGTTGTAAACAGCAACAC GTTAAAAAGTCGATTATCAGTTTCACAGAAAGAGGTCGTTAAAACC GCCAGCAAGCTTGTTTCACTATCAGTCTGTCGCTAAGACAATCTCT TTCACCAAAAATACAATTTGCTTTCTTGCCGTTGCTTCAAGTGAAA ATCTGAGCTAAAAAAGAGAGAGGCTGTCTGAAGAAAAATCCATAA CCAACGCAAAATCCCGGGCGCCCAATCAGCCTTCTCCGCGGAGA TTCCTAGCCTCAGCCAGAGCTACCTCATCTGCGTGAGGCTCCGGT GGCGCCAAGTGTTCCGGCATCCCGGACGCACCAATGGCATCCGA GCAACAGATCTTTTCTGCAACAACGCTTCGCGTCGCGGCGGTGTT TCCCTCCATCTGCTCTGCTCTTTAAATACCTCCGTCGTCTCCTCGT CTCCACAGCATCTCAAGTCTTCACACTCCTCGCCATCACATAAAAC CAGTGCAAGCAGAAGCAGCGCA (SEQ ID NO:3)

[00198] A FIG. 2 fornece um alinhamento do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea may's de comprimento total (SEQ ID NO: 1) em comparação com o promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado (SEQ ID NO: 3), este alinhamento mostra as sequências de polinucleotídeo repetidas que foram removidas para produzir a sequência de promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificada.

[00199] Logodesoia, equêjuéboD^^ deU’-RTR doge ne dgaigação de clorofila a/b do eaa mays (SEQ ID NO : 7 ) foi modificada . A 3'-UTR foi truncado em uma sequência do polinuclootínoo do 400 bp, resultando assim em uma sequêucia de 3’-UTR do gone do ligação do clorofila a/b do Zea mays modificada (SEQ ID NO: 8) do: GGGGGTGGAGGCGCCACCGCCCACCGGCCACCGCTGCGGATAT CTAGGTGTTCGGATGCACGTGAGCGCGCACTGGTTCCAGTTTGTA CCATGATGTAAATTACTTACCGTACCAGGGTTCAATCGGCAAGGA AGAATTGTTGTGTTCACTGTCTTGGGCAGTCTCTTGGTCCAATATG AATCAACTTACACAGCATCTCCAAAAACTTCTAAAATTACTAGCTG AATGCCCGTGCGTTGCAACGGGAATATATAATACCAGTATACTAC GATAACTTATATACAAAATGTATGTTATATCGTTATGAGAAAATGTT TCATAACCAATTTATGATTCTGGTCATACATAAATTTTGTTATTTATA GTCTATCTGTTTCACCACTACATTGCAACCATCAG (SEQ ID NO:8)

[00200] Os elementos do DNA foram amplificados ou sintetizados o clonados em vetores do entrada. Os comprimentos do promotor modificada e da 3'-UTR modificada foram 1442 bp e 400 bp, respectivamente.

Exemplo 4: Construto do Promotor do Gene de Ligação de Clorofila a/b de Zea mays

[00201] O promotor a montante do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento de SEQ ID NO: 2 ligado com o íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de SEQ ID NO: 5 e uma sequência da 5'-UTR (SEQ ID NO: 19) resultou no promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total de SEQ ID NO: 1. A expressão de cry34Ab1 (gene repórter de B. thurengiensis) foi impulsionada pelo promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento totai (SEQ D NO: 1): e terminou pela 3'-UTR de Solanum tuberosum Pinll (3'-UTR de StPinII v2; An et al., (1989) Plant Cell 1; 115-22). Cada um dos elementos do gene foi amplificado com iniciadores contendo um mínimo de 15 bp de homologia de sobreposição com o seu elemento de DNA de flanqueamento. Todos os fragmentos foram purificados com gel. Em seguida, os três fragmentos juntamente com uma cadeia principal do vetor de entrada, pENTR11, foram montados em uma ordem direcional através de uma reação de clonagem GENEART® Seamless (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma reação de GATEWAY® LR CLONASE® (Invitrogen) foi depois executada com o plasmídeo de entrada resultante e um vetor de destino que leva a um vetor de expressão final, pDAB114438. O vetor de destino continha um cassete marcador selecionável compreendido de um gene add-1 conduzido pelo promotor de ubiquitina-1 de Oua mays de comprimento tota I (Christensen et al,| (19992) Plnnt MoleculaBBíology 18; 775-889) e terminado por uma 3'-UTR da lípase do milho (Patente U.S. No 7.178.802). O construto resultante, pDAB114438, é um construto de expressão heterólogo que contém um cassete de expressão do gene aad-1 e um construto de expressão do gene cry34Ab1 (FIG. 3).

[00202] Em um segundo construto, a expressão de cry34Ab1 (gene repórter de B. thurengiensis) foi impulsionada pelo promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zou mugs de comprimento total (SEQ ID NO: 1), e terminou pela 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zou mugs modificada (SEQ ID NO: 8). Cada um dos elementos genéticos foi amplificado com iniciadores contendo um mínimo de 17 bp de homologia de sobreposição com o seu elemento de DNA de flanqueamento. Todos os fragmentos foram purificados com gel. Em seguida, os três fragmentos juntamente com uma cadeia principal do vetor de entrada, pENTR11, foram montados em uma ordem direcional através de uma reação de clonagem GENEART® Seamless (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma reação de GATEWAY® LR CLONASE® (Invitrogen) foi depois executada com o plasmídeo de entrada resultante e um vetor de destino que leva a um vetor de expressão final, pDAB120166. O vetor de destino continha um cassete marcador selecionável compreendido de um gene add-1 conduzido pelo promotor de ubiquitina-1 de Zea mays (Christensen et al, (191912’) Plant Molecular Biology 18; 675-689) e terminado por uma 3'-UTR da lípase do milho (Patente U.S. No 7.179.902). O construto resultante, pDAB120166, é um construto de expressão heterólogo que contém um cassete de expressão do gene aad-1 e um construto de expressão do gene cry34Ab1 (FIG. 7).

[00203] Em um terceiro construto, a expressão de cry34Ab1 (gene repórter de B. thurengiensis) foi impulsionada pelo promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado . O promotor a montante do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado de SEQ ID NO: 4 ligado com o íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de SEQ ID NO: 5 e uma sequência da 5'-UTR (SEQ ID NO: 19) resultou no promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado de SEQ ID NO b: 3. A expressão do cry34Ab1 (gene repórter de B. thurengiensis) foi impulsionado pelo promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado (SEQ ID NO: 3), e terminou pela 3'-UTR de Solanum tuberosum Pinll (3'-UTR de StPinII v2; An et a/, . 11989. Plnnt Cell 1; 11-5-22 C Cad a um do s elementos do gene foi amplificado com iniciadores contendo um mínimo de 15 bp de homologia de sobreposição com o seu elemento de DNA de flanqueamento. Todos os fragmentos foram purificados com gel. Em seguida, os três fragmentos juntamente com uma cadeia principal do vetor de entrada, pENTR11, foram montados em uma ordem direcional através de uma reação de clonagem GENEART® Seamless (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma reação de GATEWAY® LR CLONASE® (Invitrogen) foi depois executada com o plasmídeo de entrada resultante e um vetor de destino que leva a um vetor de expressão final, pDAB120165. O vetor de destino continha um cassete marcador selecionável compreendido de um gene add-1 conduzido pelo promotor de ubiquitina-1 de Zea mays modificado (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689) e terminado por uma 3'-UTR da lípase do milho (Patente U.S. No 7.179.902). O construto resultante, pDAB120165, é um construto de expressão heterólogo que contém um cassete de expressão do gene aad-1 e um construto de expressão do gene cry34Db1 (FIG. 6).

[00204] Um construto de controle negativo, pDAB101556, foi montado contendo um gene repórter de proteína de fluorescência amarela (YFP; Shagin et al., (2004) Mol Biol Evol 21; 841-50) em lugar do gene cry34Ab1 (FIG. 4) e o mesmo cassete de expressão de aad-1 como presente em pDAB114438. Um construto de controle positivo, pDAB108746, foi formado compreendido do promotor de ubiquitina-1 de Zea mays e da 3'-UTR do gene inibidor da pn^otease de Solnuum tuberosum II (3'-UTR de StPinlI v2; An et a/„ (1989) Plant Ce// 1 ; 115-22) que controlaa a expressão do gene cry34Ab1 (FIG. 5). O cassete de aad-1 foi o mesmo como aquele presente em pDDB114438.

Exemplo 5: Transformação de plantas e confirmação molecular Transformação de Agrobacterium tumefacieas:

[00205] Os vetores de expressão binária foram transformados na cepa de Agrobaeterium tumefaeiens DAt1319 2 (cep a ternári a deficiente de RecD) (Int'l. Pat. Pub. No. WO 2012016222). Ds colônias bacterianas foram selecionadas, e o DND de plasmídeo binário foi isolado e confirmado através da digestão com enzimas de restrição.

Iniciação da Cultura de Agrobacterium:

[00206] Ds culturas de Agrobacterium foram riscadas das matérias- primas de glicerol no meio mínimo DB (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene dnduction, in Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Second Edition Vol. 1, Humana Press, p. 79; produzido sem sacarose e com 5 g/L de glicose e 15 g/L de BACTO™ Agar) e incubadas a 20 °C no escuro durante 3 dias. As culturas de Agrobacterium foram depois riscadas sobre uma placa de meio YEP (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, in Wang, K., ed., Agrbbacterium Protoools Sconnd Edition Vol. 1 , Humana Press, p. 79) e incubadas a 20 °C no escuro durante 1 dia.

[00207] No dia de uma experiência, uma mistura de meio de inoculação (2,2 g/L de sais de MS, 68,4 g/L de sacarose, 36 g/L de glicose, 115 mg/L de L-prolina, 2 mg/L de glicina, 100 mg/L de myoinositol, 0,05 mg/L de ácido nicotínico, 0,5 mg/L de HCl de piridoxina, 0,5 mg/L de HCl de tiamina) e acetossiringona foi preparada em um volume apropriado no tamanho da experiência. Uma solução de matéria-prima 1 M de acetossiringona em 100 % de sulfóxido de dimetila foi adicionada ao meio de inoculação para produzir uma concentração final de acetossiringona de 200 µM.

[00208] Para cada construto, 1 a 2 ciclos de Agrobacterium (da placa de YEP foram colocados em suspensão em 15 ml da mistura de meio de inoculação/acetossiringona dentro de um tubo de centrífuga de 50 ml estéril descartável e a densidade ótica da solução em 600 nm (OD600) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão foi então diluída para 0,25 a 0,35 O.D.600 utilizando mistura adicional de meio de inoculação/acetosiringona. O tubo de suspensão de Agrobacterium foi então colocada horizontalmente sobre um agitador de plataforma fixado em cerca de 75 rpm na temperatura ambiente durante entre 1 e 4 horas antes do uso.

TRANSFORMAÇÃO DO MILHO:

[00209] Os construtos experimentais foram transformados em milho por meio da transformação mediada por Agrobacterium de embriões imaturos isolados da linhagem congênita, Zaa mays c.v , B104, O método utilizado é semelhante àqueles publicados por Ishida et a.,, (1996) Nature Biotechnol 14:745-750 e Frame et al., (2006) Plant Cell Rep 25: 1024-1034, mas com várias modificações e melhoras tornar o método receptível à transformação de alto rendimento. Um exemplo de um método utilizado para produzir vários eventos transgênicos no milho é apresentado na Pub. Do Ped. De Pat. U.S. No 2013/0157369 A1, que começa com a infecção do embrião e as etapas de cocultivo.

CONFIRMAÇÃO MOLECULAR:

[00210] As plantas de milho transgênicas putativas foram experimentadas no estágio de folha V2-3 com relação à presença do transgene utilizando os ensaios da PCR quantitativa de cry34Ab1 e aad-1. O DNA total foi extraído de 4 punções de folha, utilizando o kit de extração de DNA MAGATTRACT® (Qiagen) segundo as instruções do fabricante.

[00211] Para detectar os genes de interesse, os fragmentos de DNA específicos do gene foram amplificados com os conjuntos de iniciador/sonda TaqMan® contendo uma sonda fluorescente rotulada com FAM para o gene cry34Ab1 e uma sonda fluorescente rotulada com HEX para o controle do gene de referência de invertase endógena. Os seguintes iniciadores foram utilizados para as amplificações do gene de referência endógeno cry34Ab1 e invertase. As sequências de iniciador foram como se segue; Iniciadores/sondas de cry34Ab1: Iniciador Avançado: TQ.8v6.1.F: GCCATACCCTCCAGTTG (SEQ ID NO:10) Iniciador Reverso: TQ.8v6.1.R: GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG (SEQ ID NO:11) Sonda: TQ.8v6.1.MGB.P: 5’-/56-FAM / CCG/A\TCCAA\CGGCTTCA / MGB (SEQ ID NO:12) Iniciadores de Invertase: Iniciador Avançado: InvertaseF: TGGCGGACGACGACTTGT (SEQ ID NO:13) Iniciador Reverso: InvertaseR: AAAGTTTGGAGGCTGCCGT (SEQ ID NO:14) Sonda de Invertase: 5’-/HHXX/ GAGCAGACCGCCGGGGACCTT /3BHQ_1/-3’ (SEQ ID NO:15)

[00212] Depois disso, as reações de PCR foram realizadas em um volume final de reação de 10 µl contendo 5 µl de Roche LIGHCCYCLHR® 480 Probes Master Mix (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN); 0,4 µl cada de iniciadores CQ.8v6.1.F, CQ.8v6.1.R, Invertase F e InvertaseR de matérias-primas a 10 µM em uma concentração final de 400 nM; 0,4 µl cada de CQ.8v6.1.MGB.P e Invertase Probes de matérias-primas a 5 µM em uma concentração final de 200 nM, 0,1 µl de polivinilpirrolidona a 10 % (PVP) na concentração final de 0,1 %; 2 µl de DNA genômico a 10 ng/µl e 0,5 µl de água. O DNA foi amplificado em um Roche LIGHCCYCLHR® 480 System sob as seguintes condições: 1 ciclo de 95 °C durante 10 min; 40 ciclos das três etapas seguintes: 95 °C durante 10 segundos; 58 °C durante 35 segundos e 72 °C durante 1 segundo, e um ciclo final de 4 °C durante 10 segundos. O número de cópias de cry34Ab1 foi determinado pela comparação dos valores de Alvo (gene de interesse)/Referência (gene Invertase) para as amostras desconhecidas (produção através de LightCycler® 480) com os valores Alvo/Referência dos controles do número de cópias de cry34Ab1.

[00213] A detecção do gene aad-1 foi realizada como descrito acima para o gene cry34Ab1 utilizando o gene de referência endógeno de invertase. As sequências de iniciador de aad-1 foram como se segue; Iniciador Avançado AAD1: CGCCCGGCCCCCCCCACCAA (SHQ ID NO:16) Iniciador Reverso AAD1: CAACATCCATCACCTTGACTGA (SEQ ID NO:17) Sonda AAD1: 5’-FAM/ CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA-MGB /BHQ-3’ (SEQ ID NO:18)

[00214] Finalmente, as plantas TO contendo o gene de interesse foram experimentadas em V4-5 para ensaios ELISA da folha de cry34Ab1 e AAD-1. Quatro punções de folha foram experimentadas. Outro conjunto de plantas foi experimentado em V4-5 para toda a massa de raízes para ambos os ensaios ELISA da proteína. Os ensaios de ELISA de cry34Ab1 da folha e raiz (Agdia, Inc., Elkart, IN) e AAD-1 (Acadia BioScience) foram executados de acordo com as instruções do fabricante. Os ensaios de ELISA da folha para cry34Ab1 foram expressos como ng/cm2 ou como partes por milhão (ppm, ou ng de proteína por mg de proteína total da planta), enquanto que os resultados de ELISA da raiz foram expressos como ppm. Os ensaios totais de proteína da raiz foram realizados com o método de detecção de Bradford de acordo com as instruções do fabricante.

[00215] As plantas TO foram cruzadas com as linhagens de transformação não transgênicas de eaa mays c.v. B104 para a obtenção de sementes T1. Três linhagens transgênicas ou eventos de cada um dos construtos de elementos reguladores de teste foram avançados para estudos de expressão do gene da proteína e RNA T1 e depois para a produção de sementes T2. Consequentemente, de 30 a 40 sementes T1 de cada um dos eventos foram semeadas; as mudas foram pulverizadas com ASSUREII® no estágio V2-V3 de desenvolvimento para matar os segregantes não transgênicos. As plantas transgênicas foram experimentadas em múltiplos estágios de desenvolvimento da planta com relação a ELISA de cry34Ab1 e AAD-1 como se segue: folha (V4, V12 e R3); raiz (V4 e R1); caule (R1); pólen (R1); seda (R1); casca (R3); grãos (R3); e sabugo (R3). Todos os tecidos foram isolados e colocados em tubos encaixados em gelo seco; que foram então transferidos para 80 °C. Os tecidos congelados foram liofilizados antes da extração de proteína por ELISA.

[00216] As plantas transgênicas putativas TI contendo transgenes de cry34Ab1, yfp e aad-1 foram experimentadas em V4-5 para os ensaios ELISA da folha. Quatro punções de folha foram experimentadas. As punções de folha foram colocadas em um tubo, e um glóbulo de aço inoxidável de 1/8" isolado (Hoover Precision Products, Cumming, GA, USA) foi adicionado a cada tubo de 1,2 ml contendo 300 µl de tampão de extração (1X PBST suplementado com 0,05 % de Tween 20 e 0,5 % de BSA). As amostras foram processadas em um GENOGRINDER™ (SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ) a 1500 rpm durante 4 minutos. As amostras foram centrifugadas a 4000 rpm durante 2 minutos em uma centrífuga Sorvall Legend XFR™. Em seguida, um adicional de 300 µl de tampão de extração foi adicionado e as amostras foram processadas mais uma vez em uma GENOGRINDER™ a 1500 rpm durante 2 minutos. As amostras foram centrifugadas mais uma vez a 4000 rpm durante 7 minutos. Finalmente, o sobrenadante foi coletado e os ensaios ELISA foram concluídos em diferentes diluições juntamente com os padrões de proteína utilizando os kits de ensaio ELISA de cry34Ab1 (Agdia, Inc.) e AAD-1 (Acadia BioScience, LLC) comercialmente disponíveis, de acordo com as instruções do fabricante. A extração de proteína para vários ELISAs do tipo tecido foi realizada através da trituração do tecido liofilizado em um agitador de tinta durante 30 segundos. Para os tecidos que precisam de outra trituração, a etapa de trituração foi repetida durante mais 30 segundos. Pó granada foi adicionado para cobrir a parte curva no fundo do tubo. O tecido triturado grosseiramente foi transferido para tubos de 2 ml e preenchido até a marca de 0,5 ml. Uma bola de cerâmica foi adicionada a cada tubo, quando foi 0,6 ml de tampão de extração parcial (200 µl de coquetel de inibidor da protease, 200 µl de EDTA 500 mM, 15,5 mg de pó de DTT e PBST para 20 ml). Todos os tubos foram mantidos em gelo durante 10 minutos. Os tubos gelados foram transferidas para o suporte de 2 ml da GENOGRINDER®. As amostras foram trituradas duas vezes durante 30 segundos com um esfriamento de 5 minutos em gelo entre elas. Depois, 40 µl de TWEEN®-20 a 10 % e 300 µl de tampão de extração foram adicionados às amostras. As amostras foram trituradas durante mais 30 segundos com 5 minutos de esfriamento. Finalmente, cada amostra foi centrifugada a 13000 rpm durante 7 minutos, e o sobrenadante foi cuidadosamente transferido para um novo tubo para coletar o extrato. O extrato foi colocado novamente em suspensão no tampão de extração e foi diluído conforme necessário para os tecidos foliares dos ensaios ELISA.

Exemplo 6: Expressão da Planta Transgênica To

[00217] Os resultados de ELISA do cry34Ab1 indicaram que o elemento regulador do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) impulsionou a expressão preferida da folha de Cry34Ab1 nos eventos TO que foram transformados com a linhagem, pDAB114438. A expressão insignificante de Cry34Ab1 pelo elemento regulador do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total foi observada nos tecidos da raiz destes eventos (Tabelas 1 e 2). Os eventos produzidos a partir do construto de controle positivo pDAB108746 expressaram Cry34Ab1 nos tecidos tanto foliares quanto radiculares. Não houve nenhuma expressão da folha do Cry34Ab1 observada ou detectada em eventos da planta transformados com o construto de controle negativo, pDAB101556, que não continha o gene cry34Ab1. Todos os construtos expressaram o gene aad-1 nos tecidos tanto da raiz quanto da folha.

[00218] Além disso, o elemento regulador do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4) impulsionou a expressão da expressão de proteína de cry34Ab1 e AAD-1 na folha (V4) conforme medido por ELISA nas plantas transgênicas TO (Tabela 3). As plantas transgênicas TO que foram transformadas com pDAB120165 representam a expressão do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificado (SEQ ID NOs: 3 e 4) em combinação com 3'-UTR de St. Pinll, enquanto que as plantas transgênicas TO transformadas com pDAB120166 representam a expressão do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total (SEQ ID NOs: 1 e 2) em combinação com a 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificada (SEQ ID NO: 8). Estes resultados indicam que as sequências de promotor (SEQ ID NOs: 1 a 4) e de 3'- UTR (SEQ ID NOs: 7 a 8) desta divulgação são funcionais para impulsionar a expressão de um transgene em um cassete de expressão do gene dentro dos eventos da planta de milho TO transgênica. Tabela 1. Resultados de ELISA mostrando a expressão do transgene de cry34Ab1 e AAD-1 nas folhas de milho V4-V6 de vários eventos de construto. STD é uma abreviação de desvio padrão.

Tabela 2. Os resultados do ensaio ELISA que mostram a expressão do transgene de cry34 e AAD-1 nas raízes de milho V4- 6 de vários eventos de construto. STD é uma abreviação de desvio padrão.

Tabela 3. A expressão da proteína Cry34Ab1 na folha (V4) quando impulsionada pelo promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total e terminada pela 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays para pDAB120166 e pela 3’-UTR do gnee de ligçãão de clorofila a/b de Zeamays modificada para pDAB120165 foi medida por ELISA nas plantas transgênicas To. Também incluída está a expressão de proteína na folha (V4) para AAD-1. STD é uma abreviação de desvio padrão.

Exemplo 7: Expressão da Planta Transgênica T1

[00219] Os resultados de ELISA para Cry34 de eventos de planta transgênica TI indicaram que o elemento regulador do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays (SEQ ID IMO : 1) impulsionou a expressão preferida acima do solo, especificamente nos tecidos da folha, caule e casca, de Cry34Ab1. Estes dados foram gerados a partir de eventos T que foram transformados com o construto pDAB114438. Além disso, a expressão insignificante de Cry34Ab1 pelo elemento regulador do promotor do gene de ligação de clorofila a/b de eaa mays (SEQ ID NO : 1 e SEQ ID NO : 2) o>: observada nos tecidos da raiz, grãos e pólen destes eventos (Tabela 4). Curiosamente a expressão de Cry34Ab1 no tecido do sabugo apresentou uma expressão 10 vezes mais baixa do que a expressão de Cry34Ab1 no tecido de seda dos eventos analisados. Não houve nenhuma expressão da folha de Cry34Ab1 observada ou detectada nos eventos da planta transformados com o construto do controle negativo, pDAB101556. Este construto, pDAB101556, não contém o transgene de cry34Ab1. Todos os construtos expressaram o gene aad- 1 nos tecidos tanto da raiz quanto da folha. Tabela 4. Expressão da proteína Cry34Ab1 e AAD-1 em diferentes tipos de tecido como medida por ELISA nas plantas transgênicas TI. STD é uma abreviação de desvio padrão.

[00220] Os resultados de ELISA de Cry34Ab1 TI de folha (V4) apresentou faixa expressão semelhante aos eventos transgênicos pDAB120166 e pDAB114438 contendo o promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total (SEQ ID NOs: 1 e 2) com diferentes 3'-UTRs como elementos reguladores para o gene cry34Ab1. O construto anterior, pDAB120166, continha uma 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificada (SEQ ID NO: 8) derivada do mesmo gene como o promotor, enquanto que o último construto, pDAB114438, continha uma 3'-UTR de St Pinll. A folha TI (V4) Cry34Ab1 (Tabela 5). Ainda incluídos nos resultados de ELISA T1 Cry34Ab1 do tecido foliar (V4) foram eventos transgênicos pDAB120165 que continham o promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento modificado (SEQ ID NOs: 3 e 4) com a 3'-UTR St Pinll como elementos reguladores para o gene cry34Ab1. Os resultados de ELISA de eventos transgênicos pDAB120165 apresentaram aproximadamente 50 % a 60 % menos expressão em comparação com pDAB120166 ou pDAB114438 que contêm o promotor do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total (SEQ ID NOs: 1 e 2). O construto de pDAB120165 continha um promotor modificado (SEQ ID NOs: 3 e 4) e 3'-UTR Pinll. Estes resultados indicam que as sequências de promotor (SEQ ID NO: 1 a 4) e 3'-UTR (SEQ ID NO: 7 a 8) desta divulgação são funcionais para impulsionar a expressão de um transgene em um cassete de expressão do gene dentro de eventos de plantas de milho TI transgênicas. Tabela 5. Expressão de proteína Cry34Ab1 e AAD-1 na Folha (V4), conforme medido por ELISA nas plantas transgênicas TI de diferentes construtos. STD é uma abreviação de desvio padrão.

[00221] Como tal, novos elementos reguladores do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays foram identificados e caracterizados os quais incluem: os promotores do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2; os promotores do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificados de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4; o íntron do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de SEQ ID NO b:: 5; a 5’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de SEQ ID NO: 19; a 5’- UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de SEQ ID NO: 19; a 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays de comprimento total de SEQ ID NO: 7; e a 3’-UTR do gene de ligação de clorofila a/b de Zea mays modificada de SEQ ID NO: 8!. Divulgados pela primeira vez são os novos elementos reguladores do promotor para uso nos construtos de expressão do gene.

Claims (13)

1. Cassete de expressão do gene compreendendo um promotor operativamente ligado a um ácido nucleico heterólogo, caracterizado pelo foto de que o promotor compreende um polinucleotídeo conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2.

2. Cassete de expressão do gene, de acordo com a reivindicação 1, carccteriaddo pelo fato dequo o polinucleorídeo compreende um íntron.

3. Cassete de expressão do gene, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofafoqeqlre oíntronoompreooqelJma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 5.

4. Cassete de expressão do gene, de acordo com a reivindicação 1, caracteriaddo pelo oato qequo o polinucleoríqeo compreende uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1.

5. Cassete de expressão do gene, de acordo com a reivindicação 1, caracteriaddo pelo oato dequo o doidonecloico operacionalmente ligado codifica um polipeptídeo ou um RNA pequeno.

6. Cassete de expressão do gene de acordo com a reivindicação 1, aaracteriaddo pelo oatdde euo o OOKIO necloicé é selecionado do grupo que consiste em um ácido nucleico que confere resistência aos inseticidas, um ácido nucleico que confere tolerância aos herbicidas, um ácido nucleico que confere eficiência de uso de nitrogênio, um ácido nucleico que confere eficiência de uso de água, um ácido nucleico que confere qualidade nutricional, um ácido nucleico que codifica uma proteína de ligação ao DNA e um ácido nucleico que codifica um marcador selecionável.

7. Cassete de expressão do gene, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofatoqeqne oiodaocmpreooqeuma região 3’-não traduzida.

8. Cassete de expressão do gene, de acordo com a reivindicação 7, c^aaacttei^zadio peloaatoeeuue aregiõo3’-nõo traUuziaa compreende uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8.

9. Cassete de expressão do gene, de acordo com a reivindicação 1, caaacterizado pelofatoeeuee niadacomprenaUeuma região 5’-não traduzida, em que a 5’-UTR compreende uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecida na SEQ ID NO: 19.

10. Vetor recombinante compreendendo o cassete de expressão do gene como definido na reivindicação 1, caaacterizado pelo fato de que o vetor é selecionado do grupo consistindo em um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano, um vírus, e um bacteriófago.

11. Cassete de expressão do gene, de acordo com a reivindicação 1, caaacteaizado peloaatoeeue? opromotor éumpromotor preferido do tecido selecionado do tecido de folha, casca, tronco ou seda.

12. Método para a expressão de uma sequência de codificação em uma planta transgênica, caracterizado peloaatoeeue?ooanprenaee: a) transformar uma célula vegetal com um cassete de expressão do gene compreendendo uma sequência de polinucleotídeo conforme definido na SEQ ID NO: 2 operacionalmente ligada à uma sequência de codificação heteróloga, que é operacionalmente ligada a uma região 3’-não traduzida; b) isolar a célula vegetal transformada compreendendo o cassete de expressão do gene; c) regenerar uma planta transgênica a partir da célula vegetal transformada; e, d) obter a planta transgênica, em que a planta transgênica expressa a sequência de codificação.

13. Método para a fabricação de uma sequência de polinucleotídeo sintética conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de que compreende: a) isolar um ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo conforme definido na SEQ ID NO: 2; b) produzir uma pluralidade de sequências de iniciadores de oligonucleotídeo, em que as sequências de iniciadores de oligonucleotídeo se ligam ao ácido nucleico sob condições estringentes de hibridização; c) ligar a pluralidade de sequências de iniciadores de oligonucleotídeo para sintetizara sequência de polinucleotídeo sintética; e d) sequenciar o polinucleotídeo sintético resultante para confirmar que compreende a sequência de ácido nucleico conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2.

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