BR112017021703B1

BR112017021703B1 - Promotor de planta para expressão de transgene

Info

Publication number: BR112017021703B1
Application number: BR112017021703-1A
Authority: BR
Inventors: Sandeep Kumar; Daren Hemingway; Carla Ausmus; Andrew F. Worden; Andrew ASBERRY
Original assignee: Corteva Agriscience Llc
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2016-04-13
Publication date: 2023-11-28
Also published as: AU2016250064A1; WO2016168229A1; UY36626A; IL254864A0; EP3283632A1; BR112017021703A2; AR104252A1; US20180087063A1; BR112017021703A8; CA2982920A1; JP2018511331A; CL2017002578A1; PH12017501858A1; US10443067B2; US20160304894A1; CN107624136A; US9914933B2; RU2017138655A; CO2017011476A2; KR20170136573A

Abstract

PROMOTOR DE PLANTA PARA EXPRESSÃO DE TRANSGENE. Esta divulgação refere-se a composições e métodos para promover a transcrição de uma sequência nucleotídica em uma planta ou célula vegetal, empregando um promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Algumas modalidades referem-se a um promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que funciona em plantas para promover a transcrição de sequências nucleotídicas operacionalmente ligadas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao benefício de Pedido de Patente Provisório U.S. n° de série 62/147.868 depositado em 15 de abril de 2015, cuja divulgação está integralmente incorporada por referência por meio deste.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL ENVIADO ELETRONICAMENTE

[0002] Incorporada integralmente por referência está uma listagem de sequência de nucleotídeos/aminoácidos legível em computador enviada concomitantemente a este documento e identificada conforme se segue: Um arquivo ACII (texto) de 36,7 KB nomeado “77035-WO-PCT- 20160322-Sequence-Listing-ST25.txt” criado em 22 de março de 2016.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[0003] A presente divulgação em geral diz respeito a composições e métodos para promover a transcrição de uma sequência de nucleotídeos em uma planta ou célula de planta. Algumas modalidades referem-se a um promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que funciona em plantas para promover a transcrição de uma sequência nucleotídica operacionalmente ligada. Modalidades particulares dizem respeito a métodos incluindo um promotor (por exemplo, para introduzir uma molécula de ácidos nucleicos em uma célula) e células, culturas de células, tecidos, organismos e partes de organismos compreendendo um promotor, bem como produtos produzidos a partir do mesmo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0004] Muitas espécies de plantas são capazes de serem transformadas com transgenes para introduzir traços ou características agronomicamente desejáveis. Espécies de plantas são desenvolvidas e/ou modificadas para possuírem traços desejados. Geralmente, traços desejáveis incluem, por exemplo, melhorar a qualidade do valor nutricional, aumentar o rendimento, conceder resistência a pestes ou doenças, aumentar a tolerância a seca e ao estresse, melhorar as qualidades horticulturais (por exemplo, pigmentação e crescimento), transmitir tolerância a herbicidas, permitir a produção de compostos e/ou materiais industrialmente úteis a partir da planta e/ou permitir a produção de farmacêuticos.

[0005] Espécies de plantas transgênicas compreendendo transgenes múltiplos piramidados em um único locus genômico são produzidas por meio de tecnologias de transformação de plantas. As tecnologias de transformação de plantas resultam na introdução de um transgene em uma célula de planta, recuperação de uma planta transgênica fértil que contém a cópia integrada com estabilidade do transgene no genoma da planta e subsequente expressão de transgenes por meio de transcrição e tradução dos resultados do genoma da planta em plantas transgênicas que possuem traços e fenótipos desejáveis. Contudo, são desejáveis mecanismos que permitam a produção de espécies de plantas transgênicas que expressem altos níveis de transgenes múltiplos manipulados geneticamente como uma pirâmide de traços.

[0006] Da mesma forma, são desejáveis mecanismos que permitem a expressão de um transgene dentro de tecidos ou órgãos particulares de uma planta. Por exemplo, maior resistência de uma planta a infecção por patógenos transmitidos pelo solo pode ser obtida por transformar o genoma da planta com um gene de resistência a patógeno de forma que a proteína de resistência a patógeno é expressa de forma robusta dentro das raízes da planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene em tecidos de plantas que estejam em uma fase de crescimento ou desenvolvimento particular, por exemplo, divisão ou alongamento celular. Além do mais, pode ser desejável expressar um transgene nos tecidos da folha ou caule de uma planta para fornecer tolerância contra herbicidas ou resistência contra insetos ou pestes acima do solo.

[0007] Portanto, existe uma necessidade por novos elementos reguladores de genes que possam direcionar os níveis desejados de expressão de transgenes em tecidos específicos de plantas.

BREVE SUMÁRIO

[0008] Nas modalidades da divulgação do objeto, a divulgação refere-se a um vetor de ácido nucleico que compreende um promotor operacionalmente ligado a: uma sequência de poliligante; um gene não tipo metalotioneína; ou uma combinação da sequência de poliligante e um gene não tipo metalotioneína, em que o referido promotor compreende uma sequência polinucleotídica que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o promotor tem 2.000 bp de comprimento. Em modalidades adicionais, o promotor consiste em uma sequência polinucleotídica que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o promotor conduz a expressão de um polinucleotídeo que codifica um marcador selecionável. Em outras modalidades, o promotor está operacionalmente ligado a um transgene. Nos aspectos desta modalidade, o transgene codifica um marcador selecionável ou um produto gênico que confere resistência a inseticidas, tolerância a herbicidas, eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso de água, ou qualidade nutricional. O promotor da SEQ ID NO:1 é fornecido para uso com uma sequência polinucleotídica não traduzida 3' (3’-UTR), a sequência polinucleotídica não traduzida 3' compreendendo uma sequência que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, em que a sequência polinucleotídica não traduzida 3' está operacionalmente ligada ao referido poliligante ou ao referido transgene. Em outras modalidades, o promotor da SEQ ID NO:1 é fornecido para uso com uma sequência polinucleotídica não traduzida 5', a sequência polinucleotídica não traduzida 5' compreendendo uma sequência que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:4, em que a sequência polinucleotídica não traduzida 5' está operacionalmente ligada ao referido poliligante ou ao referido transgene. Em outras modalidades, o promotor da SEQ ID NO:1 compreende ainda uma sequência de íntron. Em uma outra modalidade, o promotor da SEQ ID NO:1 conduz uma expressão específica em tecidos abaixo do solo.

[0009] Em ainda outra modalidade, a divulgação do objeto fornece uma planta diferente de Brachypodium que compreende uma sequência polinucleotídica que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a um transgene. De acordo com esta modalidade, a planta é selecionada do grupo consistindo em milho, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana de açúcar, soja, algodão, Arabidopsis, tabaco, girassol e canola. Subsequentemente, a planta diferente de Brachypodium que compreende a sequência polinucleotídica que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 pode ser uma planta Zea mays em algumas modalidades. Em outras modalidades, o transgene que está operacionalmente ligado à sequência polinucleotídica que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 é inserido no genoma de uma planta. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 é um promotor e a referido promotor está operacionalmente ligado a um transgene. Em outras modalidades, a planta diferente de Brachypodium compreende uma sequência não traduzida 3' que compreende a SEQ ID NO:3 ou uma sequência não traduzida 3' que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3, em que a sequência não traduzida 3' está operacionalmente ligada ao referido transgene. Em uma modalidade adicional, a sequência polinucleotídica que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 conduz a expressão do transgene com expressão específica em tecidos abaixo do solo. Em outra modalidade, a sequência polinucleotídica que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 tem 2.000 bp de comprimento.

[0010] Em uma modalidade, a divulgação do objeto fornece um método de produção de uma célula vegetal transgênica, o método compreendendo as etapas de: transformação de uma célula vegetal com um cassete de expressão gênica compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência polinucleotídica de interesse; isolamento da célula vegetal transformada compreendendo o cassete de expressão gênica; e produção de uma célula vegetal transgênica compreendendo o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência polinucleotídica de interesse. Em outras modalidades, a etapa de transformação da célula vegetal é realizada com um método de transformação de planta. O método de transformação da planta pode ser selecionado do grupo consistindo em um método de transformação mediado por Agrobacterium, um método de transformação biolístico, um método de transformação de carbeto de silício, um método de transformação de protoplasto, e um método de transformação de lipossoma. Em outras modalidades, a sequência polinucleotídica de interesse é constitutivamente expressa por toda a célula vegetal transgênica. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica de interesse está estavelmente integrada no genoma da célula vegetal transgênica. Nesse sentido, o método para produção de uma célula vegetal transgênica pode compreender ainda as etapas de: regeneração da célula vegetal transgênica em uma planta transgênica; e obtenção da planta transgênica, em que a planta transgênica compreende o cassete de expressão gênica compreendendo o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligado a pelo menos uma sequência polinucleotídica de interesse. Em uma modalidade, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal transgênica monocotiledônea ou uma célula vegetal transgênica dicotiledônea. Por exemplo, a célula vegetal transgênica dicotiledônea pode ser selecionada do grupo consistindo em uma célula vegetal de Arabidopsis, uma célula vegetal de tabaco, uma célula vegetal de soja, uma célula vegetal de canola e uma célula vegetal de algodão. Além disso, a célula vegetal transgênica de monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma célula vegetal de milho, uma célula vegetal de arroz, e uma célula vegetal de trigo. O promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) usado no método pode compreender o polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Nas modalidades, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) pode compreender ainda uma primeira sequência polinucleotídica de interesse operacionalmente ligada à extremidade 3' da SEQ ID NO:1.

[0011] Em uma modalidade, a divulgação do objeto fornece um método para expressão de uma sequência polinucleotídica de interesse em uma célula vegetal, o método compreendendo a introdução na célula vegetal de uma sequência polinucleotídica de interesse operacionalmente ligada a um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica de interesse operacionalmente ligada ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) é introduzida na célula vegetal por um método de transformação de planta. Como tal, o método de transformação de planta pode ser selecionado do grupo consistindo em um método de transformação mediado por Agrobacterium, um método de transformação biolístico, um método de transformação de carbeto de silício, um método de transformação de protoplasto, e um método de transformação de lipossoma. Nas modalidades, a sequência polinucleotídica de interesse é expressa constitutivamente por toda a célula vegetal. Em algumas modalidades, a sequência polinucleotídica de interesse está estavelmente integrada no genoma da célula vegetal. Como tal, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal de monocotiledônea ou uma célula vegetal de dicotiledônea. Como um exemplo, a célula vegetal de dicotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma célula vegetal de Arabidopsis, uma célula vegetal de tabaco, uma célula vegetal de soja, uma célula vegetal de canola e uma célula vegetal de algodão. Além disso, a célula vegetal de monocotiledônea é selecionada do grupo consistindo em uma célula vegetal de milho, uma célula vegetal de arroz, e uma célula vegetal de trigo.

[0012] Em uma modalidade, a divulgação do objeto fornece uma célula vegetal transgênica que compreende um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Em algumas modalidades, a célula vegetal transgênica compreende um evento transgênico. Em um aspecto da modalidade, o evento transgênico compreende um traço agronômico. Nesse sentido, o traço agronômico é selecionado do grupo consistindo em um traço de resistência a inseticidas, traço de tolerância a herbicidas, traço de eficiência do uso de nitrogênio, traço de eficiência do uso de água, traço de qualidade nutricional, traço de ligação a DNA, traço de marcador selecionável, traço de pequeno RNA, ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, o traço agronômico compreende um traço de tolerância a herbicidas. Em um aspecto da modalidade, o traço de tolerância a herbicidas compreende uma sequência codificante aad-1. Em algumas modalidades, a célula vegetal transgênica produz um produto de bem de consumo. O produto de bem de consumo é selecionado dentre concentrado de proteínas, isolado de proteínas, grãos, farinhas, polvilho, óleos ou fibras. Em uma modalidade, a célula vegetal transgênica é selecionada do grupo consistindo em uma célula vegetal de dicotiledônea ou em uma célula vegetal de monocotiledônea. Consequentemente, a célula vegetal de monocotiledônea é uma célula vegetal de milho. Em outras modalidades, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreende um polinucleotídeo com pelo menos 90% de identidade de sequência ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Em ainda outra modalidade, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) tem 2.000 bp de comprimento. Em outras modalidades, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste na SEQ ID NO:1. Nas modalidades adicionais, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste na SEQ ID NO:1 e está operacionalmente ligado à extremidade 3' da SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) conduz a expressão de um traço agronômico em tecidos vegetais abaixo do solo.

[0013] A divulgação do objeto fornece um polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo isolado conduz a expressão específica em tecidos abaixo do solo. Em outras modalidades, o polinucleotídeo isolado possui atividade de expressão dentro de uma célula vegetal. Nas modalidades, o polinucleotídeo isolado compreende um polinucleotídeo de quadro de leitura aberto que codifica um polipeptídeo; e uma sequência de terminação. Outras modalidades incluem o polinucleotídeo isolado que compreende uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 90% de identidade de sequência ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:1, em que o polinucleotídeo da SEQ ID NO:1 tem 2.000 bp de comprimento.

[0014] As características anteriores e outras características se tornarão mais aparentes a partir da seguinte descrição detalhada de várias modalidades as quais procedem com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0015] Figura 1: Esta figura é um esquema de pDAB102419 que contém o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:1 (marcado como promotor MTL de B distachyon) e 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:3 (marcada como 3’UTR de MTL de B distachyon).

[0016] Figura 2: Esta figura fornece um alinhamento polinucleotídico do promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:1 (2.000 bp) e os promotores truncados do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:7 (1.730 bp), SEQ ID NO:8 (1.530 bp), SEQ ID NO:9 (1.330 bp), SEQ ID NO:10 (1.130 bp) e SEQ ID NO:11 (1.001 bp).

[0017] Figura 3: Esta figura fornece um alinhamento polinucleotídico do promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:1 e o promotor modificado do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:12.

[0018] Figura 4: Esta figura fornece um alinhamento polinucleotídico da 3'-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:3 e as 3'-UTRs truncadas do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:13 (264 bp), SEQ ID NO:14 (332 bp), SEQ ID NO:15 (630 bp), e SEQ ID NO:16 (727 bp).

[0019] Figura 5: Esta figura fornece um alinhamento polinucleotídico da 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:3 e a 3’-UTR modificada do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão geral das várias modalidades

[0020] O desenvolvimento de produtos de plantas transgênicas esta se tornando cada vez mais complexo. Plantas transgênicas comercialmente viáveis agora exigem a piramidação de múltiplos transgenes em um único locus. Promotores de plantas usados para pesquisa básica ou aplicações biotecnológicas são geralmente unidirecionais, direcionando apenas um gene que foi fundido em sua extremidade 3' (a jusante). Nesse sentido, cada transgene geralmente requer um promotor para expressão, em que múltiplos promotores são necessários para expressar múltiplos transgenes dentro de uma pirâmide de genes. Com um número cada vez maior de transgenes nas pirâmides de genes, o mesmo promotor é usado de forma rotineira para obter níveis semelhantes de padrões de expressão de diferentes transgenes. É necessário obter níveis semelhantes de expressão de transgenes para a produção de um único traço poligênico. Infelizmente, construtos multigênicos induzidos pelo mesmo promotor são conhecidos por causar o silenciamento de genes, resultando em produtos transgênicos menos eficazes no campo. Os elementos promotores repetidos podem levar a um silenciamento gênico com base em homologia. Além disso, sequências repetitivas dentro de um transgene podem levar a recombinação homóloga intra locus de genes resultando em rearranjos de polinucleotídeos. O silenciamento e rearranjo dos transgenes provavelmente terá um efeito indesejado no desempenho de uma planta transgênica produzida para expressar transgenes. Além disso, o excesso de sítios de ligação a fator de transcrição (TF) devido à repetição do promotor pode causar depleção de TFs endógenos resultando em inativação transcricional. Dada a necessidade de introduzir múltiplos genes em plantas para engenharia metabólica e piramidação de traços, uma variedade de promotores é necessária para desenvolver culturas transgênicas que conduzem a expressão de múltiplos genes.

[0021] Um problema particular na identificação do promotor é a necessidade de identificar promotores específicos de tecido relativos a tipos celulares específicos, estágios de desenvolvimento e/ou funções na planta que não são expressas em outros tecidos de plantas. Promotores tecido-específicos (isto é, preferenciais de tecido) ou órgão-específicos conduzem a expressão gênica em um determinado tecido, tal como na semente, raiz, folha ou tapetum da planta. Promotores específicos de tecidos e estágio de desenvolvimento podem ser identificados inicialmente pela observação da expressão de genes que são expressos em tecidos particulares ou em períodos de tempo particulares durante o desenvolvimento da planta. Esses promotores específicos de tecidos são necessários para determinadas aplicações na indústrias de plantas transgênicas e são desejáveis pois permitem a expressão específicas de genes heterólogos em uma maneira seletiva do tecido e/ou estágio de desenvolvimento do gene heterólogo diferencialmente em vários órgãos, tecidos e/ou vezes, mas não em outro tecido. Por exemplo, maior resistência de uma planta a infecção por patógenos transmitidos pelo solo pode ser obtida por transformar o genoma da planta com um gene de resistência a patógeno de forma que a proteína de resistência a patógeno é expressa de forma robusta dentro das raízes da planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene em tecidos de plantas que estejam em uma fase de crescimento ou desenvolvimento particular, por exemplo, divisão ou alongamento celular. Outra aplicação é a conveniência de utilizar promotores específicos de tecido para confinar a expressão de transgenes que codificam um traço agronômico em tipos de tecidos específicos como células do parênquima em desenvolvimento. Como tal, um problema particular na identificação dos promotores é como identificar os promotores e relacionar o promotor identificar com propriedades de desenvolvimento da célula para expressão específica de tecidos.

[0022] Outro problema em relação à identificação de um promotor é a exigência para clonar todos os elementos de controle transcricionais relevantes de ação cis e ativação trans de forma que o fragmento de DNA clonado acione a transcrição no padrão de expressão específico desejado. Dado que os elementos de controle estão localizados distalmente a partir do sítio de iniciação ou partida de tradução, o tamanho do polinucleotídeo que é selecionado para compreender o promotor é de importância para fornecer o nível de expressão e os padrões de expressão da sequência de polinucleotídeos do promotor. É conhecido que os comprimentos do promotor incluem informações funcionais, e diferentes genes se mostraram como tendo promotores mais longos ou mais curtos do que os promotores dos outros genes no genoma. Elucidar o sítio de partida de transcrição de um promotor e prever os elementos funcionais de gene na região do promotor é desafiador. Adicionado ao desafio estão a complexidade, diversidade e natureza degenerada inerente de motivos reguladores e elementos reguladores cis e trans (Blanchette, Mathieu, et al. "Genome-wide computational prediction of transcriptional regulatory modules reveals new insights into human gene expression." Genome research 16.5 (2006): 656-668). Os elementos reguladores cis e trans estão localizados nas partes distais do promotor que regulam a expressão espacial e temporal de um gene para ocorrer apenas em sítios exigidos e em tempos específicos (Porto, Milena Silva, et al. "Plant promoters: an approach of structure and function." Molecular biotechnology 56.1 (2014): 38-49). Ferramentas existentes de análise de promotores não conseguem identificar com confiabilidade tais elementos reguladores cis em uma sequência genômica, prevendo assim muitos falsos positivos pois estas ferramentas são geralmente focada apenas no teor da sequência (Fickett JW, Hatzigeorgiou AG (1997) Eukaryotic promoter recognition. Genome research 7: 861-878). Consequentemente, a identificação de elementos reguladores de promotor requer que uma sequência adequada de um tamanho específico seja obtida que resultará na indução da expressão de um transgene ligado operacionalmente em uma forma desejável.

[0023] São fornecidos métodos e composições para superar tais problemas através do uso de elementos reguladores de promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) para expressar transgenes em plantas.

II. Termos e Abreviaturas

[0024] Em todo o pedido, inúmeros termos são usados. A fim de fornecer um entendimento claro e consistente da especificação e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado em tais termos, são fornecidas as seguintes definições.

[0025] Conforme usado neste documento, o termo “íntron” se refere a qualquer sequência de ácido nucleico compreendida em um gene (ou sequência de polinucleotídeos expressa de interesse) que é transcrita, mas não traduzida. Íntrons incluem sequência de ácidos nucleicos não traduzida dentro de uma sequência expressa de DNA, bem como a sequência correspondente em moléculas de RNA transcritas a partir da mesma. Um construto descrito neste documento também pode conter sequências que aumentam a estabilidade de tradução e/ou do mRNA assim como os íntrons. Um exemplo do referido íntron é o primeiro íntron do gene II da variante histona H3 de Arabidopsis thaliana ou qualquer outra sequência de íntrons geralmente conhecida. Íntrons podem ser usados em combinação com uma sequência de promotores para amentar a estabilidade de tradução e/ou mRNA.

[0026] O termo “isolado” conforme usado neste documento significa ter sido removido do seu ambiente natural ou removido de outros compostos presentes quando o composto é formado pela primeira vez. O termo “isolado” abrange materiais isolados de fontes naturais bem como materiais (por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas) recuperados após preparação por expressão recombinante em uma célula hospedeira ou compostos quimicamente sintetizados tais como moléculas de ácidos nucleicos, proteínas e peptídeos.

[0027] O termo “purificado” conforme usado neste documento diz respeito ao isolamento de uma molécula ou composto em uma forma que é significativamente livre de contaminantes normalmente associados com a molécula ou composto em um ambiente nativo ou natural ou significativamente enriquecida em concentração relativa a outros compostos presentes quando o composto é formado pela primeira vez e meios tendo sido aumentados em pureza em resultado de ser separado de outros compostos da composição original. O termo “ácido nucleico purificado” é usado neste documento para descrever uma sequência de ácidos nucleicos que foi separada, produzida a parte ou purificada separada de outros compostos biológicos, inclusive, mas não limitados a, polipeptídeos, lipídeos e carboidratos, embora efetuando uma alteração química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser purificado a partir de um cromossomo por remover os contaminantes de proteína e quebrar as ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao restante do DNA no cromossomo).

[0028] O termo “sintético” conforme usado neste documento se refere a uma molécula de polinucleotídeo (por exemplo, DNA ou RNA) que foi criada por meio de síntese química como um processo in vitro. Por exemplo, um DNA sintético pode ser criado durante uma reação dentro de um tubo de Eppendorf™ de forma que o DNA sintético é produzido enzimaticamente a partir de um filamento nativo de DNA ou RNA. Outros métodos laboratoriais podem ser usados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeos. Oligonucleotídeos podem ser quimicamente sintetizados em um oligossintetizador por meio de síntese de fase sólida usando fosforamiditas. Os oligonucleotídeos sintetizados podem ser recozidos em um outro como um complexo, produzindo assim um polinucleotídeo “sintético”. Outros métodos para sintetizar quimicamente um polinucleotídeo são conhecidos na técnica e podem ser prontamente implementados para uso na presente divulgação.

[0029] O termo “cerca de” conforme usado neste documento significa maior ou menor do que o valor ou intervalo de valores declarados por 10 por cento, mas não pretende designar qualquer valor ou intervalo de valores apenas para esta definição mais ampla. Cada valor ou intervalo de valores precedidos pelo termo “cerca de” também pretende abranger a modalidade do valor absoluto declarado ou intervalo de valores.

[0030] Para fins da presente divulgação, um “gene” inclui uma região de DNA que codifica um produto de gene (veja infra) bem como regiões de DNA que regulam a produção do produto do gene, cujas sequências reguladoras são ou não são adjacentes às sequências codificantes e/ou transcritas. Consequentemente, um gene inclui, mas não é necessariamente limitado a, sequências de promotores, terminadores, sequências reguladoras traducionais tais como sítios de ligação a ribossomos e sítios internos de entrada de ribossomos, potencializadores, silenciadores, isoladores, elementos limítrofes, origens de replicação, sítios de ligação a matriz e regiões de controle de locus.

[0031] Conforme usado neste documento, os termos “nativo” ou “natural” definem uma condição encontrada na natureza. Uma “sequência de DNA nativo” é uma sequência de DNA presente na natureza que foi produzida por meios naturais ou técnicas de reprodução tradicionais, mas não foi gerada por engenharia genética (por exemplo, usando técnicas de biologia molecular/transformação).

[0032] Conforme usado neste documento, um “transgene” é definido como uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um produto de gene, incluindo por exemplo, mas não limitado a, um mRNA. Em uma modalidade, o transgene é um ácido nucleico exógeno onde a sequência de transgene foi introduzida em uma célula hospedeira por engenharia genética (ou a progênie deste) onde o transgene não é normalmente encontrado. Em um exemplo, um transgene codifica um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica um traço agrícola desejável (por exemplo, um gene de resistência a herbicidas). Em ainda outro exemplo, um transgene é uma sequência de ácidos nucleicos antisense em que a expressão da sequência de ácidos nucleicos antisense inibe a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos alvo. Em ainda outra modalidade, o transgene é um ácido nucleico endógeno em que as cópias genômicas adicionais do ácido nucleico endógeno são desejáveis ou um ácido nucleico que está na orientação antisense com respeito a sequência de um ácido nucleico alvo em um organismo hospedeiro.

[0033] Como usado neste documento, o termo "transgene não tipo metalotioneína" ou "gene não tipo metalotioneína" é qualquer transgene que tenha menos de 80% de identidade de sequência com a sequência codificante do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (SEQ ID NO:6).

[0034] Um “produto de gene” conforme definido neste documento é qualquer produto feito pelo gene. Por exemplo, o produto de gene pode ser produto transcricional direto de um gene (por exemplo, mRNA, tRNA, rRNA, RNA antisense, RNA de interferência, ribozima, RNA estrutural ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida por tradução de um mRNA. Produtos de genes também incluem RNAs que são modificados por processos tais como fechamento, poliadenilação, metilação e edição e proteínas modificadas por, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, robosilação do ADP, miristilação e glicosilação. A expressão do gene pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismos a um agente que aumenta ou diminui a expressão de genes. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer local na via a partir do DNA para RNA para proteína. A regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, através de controles atuando na transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA ou através de ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteínas específicas depois de serem produzidas ou por combinações destes. A expressão de genes pode ser mensurada no nível de RNA ou no nível de proteínas por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot ou ensaios de atividade proteica in vitro, in situ ou in vivo.

[0035] Conforme usado neste documento, o termo “expressão de gene” diz respeito ao processo pelo qual as informações codificadas de uma unidade transcricional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico) são convertidas em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, em geral incluindo a síntese de uma proteína. A expressão do gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismos a um agente que aumenta ou diminui a expressão de genes. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer local na via a partir do DNA para RNA para proteína. A regulação da expressão do gene ocorre, por exemplo, através de controles atuando na transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA ou através de ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteínas específicas depois de serem produzidas ou por combinações destes. A expressão de genes pode ser mensurada no nível de RNA ou no nível de proteínas por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot ou ensaios de atividade proteica in vitro, in situ ou in vivo.

[0036] Conforme usado neste documento, “silenciamento de gene com base em homologia” (HBGS) é um termo genérico que inclui tanto o silenciamento de gene transcricional como silenciamento de gene pós- transcricional. O silenciamento de um locus alvo por um locus de silenciamento não ligado pode resultar da inibição de transcrição (silenciamento de gene transcricional; TGS) ou degradação de mRNA (silenciamento de gene pós-transcricional; PTGS), devido a produção de RNA de fita dupla (dsRNA) correspondente ao promotor ou sequências transcritas, respectivamente. O envolvimento de componentes celulares distintos em cada processo sugere que TGS e PTGS induzido por dsRNA provavelmente resulta da diversificação de um mecanismos de ancestral comum. Contudo, uma comparação estrita de TGS e PTGS tem sido difícil de se obter pois geralmente é pautada na análise de loci de silenciamento distintos. Em algumas instâncias, um único locus de transgene pode acionar TGS e PTGS, devido a produção de dsRNA correspondente ao promotor e sequências transcritas de diferentes genes alvo. Mourrain et al. (2007) Planta 225:365-79. É provável que siRNAs sejam as moléculas reais que acionam TGS e PTGS em sequências homólogas: os siRNAs neste modelo acionariam o silenciamento e metilação de sequências homólogas em cis e em trans através do espalhamento da metilação de sequências de transgenes no promotor endógeno.

[0037] Conforme usado neste documento, o termo “molécula de ácido nucleico” (ou “ácido nucleico” ou “polinucleotídeo”) pode se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos que pode incluir fitas senso e antisense de RNA, cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros mistos do mencionado acima. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer um dos tipos de nucleotídeo. Uma “molécula de ácido nucleico” conforme usada neste documento é sinônimo de “ácido nucleico” e “polinucleotídeo”. Uma molécula de ácido nucleico possui geralmente 10 bases em comprimento, exceto se especificado de outra forma. O termo pode se referir a uma molécula de RNA ou DNA de comprimento indeterminado. O termo inclui forma de fita única ou dupla de DNA. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir um dos ou ambos nucleotídeos de ocorrência natural ou modificados ligados um ao outro por ligações de nucleotídeos de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural.

[0038] Moléculas de ácidos nucleicos podem ser modificadas quimicamente ou biologicamente ou podem contém bases de nucleotídeos não naturais ou derivatizadas, conforme será prontamente apreciado pelos versados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídeos (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamiditas, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; frações pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anomêricos, etc.). O termo “molécula de ácidos nucleicos” também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita única, fita dupla, parcialmente duplexado, triplexado, em forma de gancho, circular e em forma de cadeado.

[0039] A transcrição processe em uma maneira 5' para 3' ao longo de uma fita de DNA. Isso significa que o RNA é feito por uma adição sequencial de ribonucleotídeo-5'-trifosfatos ao terminal 3' da cadeia crescente (com uma eliminação de requisito do pirofosfato). Em uma molécula de ácido nucleico linear ou circular, elementos discretos (por exemplo, sequências de nucleotídeos particulares) pode ser mencionadas como sendo “à montante” ou “5'” em relação a um elemento adicional caso eles sejam ligados ou serial ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 5' a partir daquele elemento. De forma semelhante, elementos discretos podem estar “a jusante” ou “3'” em relação a um elemento adicional caso estejam ou estariam ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 3' do referido elemento.

[0040] Uma “posição” base, conforme usada neste documento, se refere ao local de uma determinada base ou resíduo de nucleotídeo dentro de um ácido nucleico designado. O ácido nucleico designado pode ser definido pelo alinhamento (vide abaixo) com um ácido nucleico de referência.

[0041] A hibridização diz respeito a ligação de duas fitas de polinucleotídeo através de ligações de hidrogênio. Oligonucleotídeos e seus análogos hibridizam por ligação de hidrogênio que inclui ligação de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa entre bases complementares. Geralmente, moléculas de ácidos nucleicos consistem em bases nitrogenadas que são pirimidinas (citosina (C), uracila (U) e timina (T)) ou purinas (adenina (A) e guanina (G)). Essas bases nitrogenadas formam ligações de hidrogênio entre uma pirimidina e uma purina e a ligação da pirimidina a purina é mencionada como “pareamento de bases”. Mais especificamente, A ligação de hidrogênio em T ou U e G serão ligado a C. “Complementar” se refere ao pareamento de bases que ocorre entre duas sequências de ácidos nucleicos distintas ou duas regiões distintas da mesma sequência de ácidos nucleicos.

[0042] “Especificamente hibridizável” ou “especificamente complementar” são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade de forma que ocorre ligação estável e específica entre o oligonucleotídeo e o DNA ou RNA alvo. O oligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar a sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. Um oligonucleotídeo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo a molécula de DNA ou RNA alvo interfere com a função normal do DNA ou RNA alvo e existe grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica ao oligonucleotídeo com sequências não algo sob condições onde a ligação específica é desejável, por exemplo, sob condições fisiológicas no caso de ensaios ou sistemas in vivo. A referida ligação é mencionada como hibridização específica.

[0043] As condições de hibridização resultantes de graus particulares de rigorosidade irão variar dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e a composição e comprimento das sequência de ácidos nucleicos de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a resistência iônica (especificamente, a concentração de Na+ e/ou Mg2+) do tampão de hibridização contribuirá para a rigorosidade de hibridização, embora os períodos de limpeza também influenciem na rigorosidade. Cálculos relativos às condições de hibridização necessários para atingir graus específicos de rigorosidade são discutidos em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989, chs. 9 e 11.

[0044] Conforme usado neste documento, “condições rigorosas” englobam condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se existir menos do que 50% de disparidade entre a molécula de hibridização e o DNA alvo. “Condições rigorosas” incluem níveis particulares adicionais de rigorosidade. Assim, conforme usado neste documento, condições de “rigorosidade moderada” são aquelas sob as quais moléculas com mais de 50% de disparidade de sequências não hibridização; condições de “alta rigorosidade” são aquelas sob as quais sequências com mais de 20% de disparidade não hibridizarão; e condições de “rigorosidade muito alta” são aquelas sob as quais sequências com mais de 10% de disparidade não hibridizarão.

[0045] Em modalidades particulares, condições rigorosas podem incluir hibridização em 65°C seguida de lavagens em 65°C com 0,1x SSC/0,1% SDS durante 40 minutos.

[0046] Seguem condições de hibridização representativas não limitantes: Rigorosidade muito alta: Hibridização em tampão 5x SSC em 65°C durante 16 horas: lavagem duas vezes em tampão 2x SSC em temperatura ambiente durante 15 minutos cada: e lavagem duas vezes em tampão 0,5x SSC em 65°C durante 20 minutos cada. Rigorosidade alta: Hibridização em tampão 5x-6x SSC em 6570°C durante 16-20 horas: lavagem duas vezes em tampão 2x SSC em temperatura ambiente durante 5-20 minutos cada: e lavagem duas vezes em tampão 1x SSC em 55-70°C durante 30 minutos cada. Rigorosidade Moderada: Hibridização em tampão 6x SSC em temperatura ambiente em 55°C durante 16-20 horas; lavagem em pelo menos duas vezes em tampão 2x-3x SSC em temperatura ambiente em 55°C durante 20-30 minutos cada.

[0047] Em modalidades particulares, moléculas de ácidos nucleicos especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização com rigorosidade muito alta. Nestas e em modalidades adicionais, moléculas de ácidos nucleicos especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização com rigorosidade alta. Nestas e em modalidades adicionais, moléculas de ácidos nucleicos especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização com rigorosidade moderada.

[0048] Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Oligonucleotídeos podem ser formados por clivagem de segmentos maiores de ácidos nucleicos ou por polimerizar precursores individuais de nucleotídeos. Sintetizadores automáticos permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de pares de bases em comprimento. Visto que oligonucleotídeos podem se ligar a uma sequência de nucleotídeos complementar, eles podem ser usados como sondas para detectar DNA ou RNA. Oligonucleotídeos compostos por DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA pequeno. No PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente mencionado como um “primer” que permite que uma polimerase de DNA estenda o oligonucleotídeo e replique a fita complementar.

[0049] Conforme usado neste documento, o termo “identidade de sequência” no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo pode ser referir aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada.

[0050] Conforme usado neste documento, o termo “percentual de identidade de sequência” pode se referir ao valor determinado por comparar duas sequências alinhadas de forma ideal (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos) sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (por exemplo, lacunas) em comparação à sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. O percentual é calculado determinando o número de posições em que o resíduo de nucleotídeos ou aminoácidos idêntico ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicar o resultado por 100, para produzir o percentual da identidade de sequência.

[0051] Métodos para alinhar sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos, por exemplo, em: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento de sequências e cálculos de homologia podem ser encontrados em, por exemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.

[0052] A Ferramenta de Pesquisa Básica em Alinhamento Local (Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) do The National Center for Biotechnology Information (NCBI) está disponível a partir de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD) e na internet para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar identidade de sequências usando este programa está disponível na internet na seção “ajuda” para BLAST™. Para comparações de sequências de ácidos nucleicos, a função “Blast 2 sequences” do programa BLAST™ (Blastn) pode ser usada pelos parâmetros padronizados. Sequências de ácidos nucleicos com similaridade ainda maior às sequências de referência exibirão identidade percentual progressiva quando avaliadas por este método.

[0053] Conforme usado neste documento, o termo “ligado operacionalmente” diz respeito a uma primeira sequência de ácidos nucleicos que está ligada operacionalmente a uma segunda sequência de ácidos nucleicos quando a primeira sequência de ácidos nucleicos está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor é ligado operacionalmente a uma sequência codificante quando o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência codificante. Quando produzido de forma recombinante, sequências de ácidos nucleicos ligados operacionalmente são geralmente contíguas e, quando necessário, juntam-se a duas regiões codificantes de proteína na mesma estrutura de leitura. Contudo, elementos necessitam ser contíguos para serem ligados operacionalmente.

[0054] Conforme usado neste documento, o termo “promotor” se refere a uma região de DNA que geralmente está localizada à montante (em direção a região 5’de um gene) de um gene e é necessária para iniciar e induzir a transcrição do gene. Um promotor pode permitir a ativação ou repressão adequada de um gene que o controla. Um promotor pode conter sequências específicas que são reconhecidas por fatores de transcrição. Estes fatores podem ser ligar a uma sequência de DNA promotor que resulta no recrutamento de DNA polimerase, uma enzima que sintetiza RNA a partir da região codificante do gene. O promotor geralmente se refere a todos os elementos reguladores de genes localizados a montante do gene, incluindo, promotores a montante, 5 UTR, íntrons e sequências líderes.

[0055] Conforme usado neste documento, o termo “promotor à montante” se refere a uma sequência de polinucleotídeos contígua que é suficiente para orientar a iniciação da transcrição. Conforme usado neste documento, um promotor à montante engloba o sítio de iniciação de transcrição com vários motivos de sequência que inclui caixa TATA, sequência de iniciador, elementos de reconhecimento de TFIIB e outros motivos de promotores (Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592). O promotor à montante fornece o sítio de ação para RNA polimerase II que é uma enzima de multi-subunidades com os fatores de transcrição gerais ou basais como TFIIA, B, D, R, F e H. Esses fatores se unem em um complexo pré-iniciação de transcrição que catalisa a síntese de RNA a partir do modelo de DNA.

[0056] A ativação do promotor à montante é feita pela sequência adicional de elementos reguladores de sequência de DNA aos quais várias proteínas se ligam e, subsequentemente, interagem com o complexo de iniciação de transcrição para ativar a expressão de genes. Essas sequências de elementos reguladores de genes interagem com fatores específicos de ligação ao DNA. Esses motivos de sequência podem às vezes ser mencionados como elementos cis. Tais elementos cis aos quais fatores de transcrição específicos de tecidos e específicos de desenvolvimento se ligam, individualmente ou em combinação, podem determinar o padrão de expressão espaço-temporal de um promotor no nível transcricional. Esses elementos cis variam muito no tipo de controle que exercem nos genes ligados operacionalmente. Alguns elementos atuam para aumentar a transcrição de genes ligados operacionalmente em resposta às respostas ambientais (por exemplo, temperatura, umidade e injúria). Outros elementos cis podem responder às pistas de desenvolvimento (por exemplo, germinação, maturação de sementes e florescimento) e às informações espaciais (por exemplo, especificidade do tecido). Vide, por exemplo, Langridge et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23. Esses elementos cis estão localizados em uma distância variada a partir do ponto inicial de transcrição, alguns elementos cis (chamados de elementos proximais) são adjacentes a uma região mínima de promotor de núcleo embora outros elementos possam ser posicionados várias quilobases à montante ou à jusante do promotor (potencializadores).

[0057] Conforme usado neste documento, os termos “região não traduzida 5’” ou ”5’-UTR” são definidos como o segmento não traduzido no terminal 5’ de pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, em mRNAs maduros, uma 5’-UTR normalmente abriga, em sua extremidade 5’, um cap de 7-metilguanosina e está envolvido em muitos processos, tais como splicing, poliadenilação, exportação de mRNA em direção ao citoplasma, identificação da extremidade 5’ do mRNA pela maquinaria traducional, e proteção dos mRNAs contra a degradação.

[0058] Conforme usado neste documento, os termos “terminador de transcrição” é definido como o segmento transcrito no terminal 3’ de pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, trechos mais longos do DNA além do sítio do “sinal de poliadenilação” são transcritos como um pré-mRNA. Esta sequência de DNA geralmente contém sinal de terminação de transcrição para o processamento adequado do pré- mRNA no mRNA maduro.

[0059] Conforme usado neste documento, os termos “região não traduzida 3’” ou ”3’-UTR” são definidos como o segmento não traduzido no terminal 3’ dos pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, em mRNAs maduros, essa região abriga a cauda poli-(A) e é conhecida como possuindo muitos papéis na estabilidade do mRNA, iniciação de tradução e exportação de mRNA. Além disso, a 3’ UTR é considerada como incluindo o sinal de poliadenilação e o terminador de transcrição.

[0060] Conforme usado neste documento, o termo “sinal de poliadenilação” designa uma sequência de ácidos nucleicos presente nos transcritos de mRNA que permite que transcritos, quando na presença de uma polimerase poli-(A), sejam poliadenilados no sítio de poliadenilação, por exemplo, localizado nas bases 10 a 30 à jusante do sinal de poli-(A). Muitos sinais de poliadenilação são conhecidos na técnica e são úteis para a presente invenção. Uma sequência exemplificativa incluir AAUAAA e variantes deste, conforme descrita em Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468.

[0061] Um “transgene de ligação a DNA” é uma sequência codificante de polinucleotídeos que codifica uma proteína de ligação ao DNA. A proteína de ligação ao DNA é subsequentemente capaz de se ligar a outra molécula. Uma proteína de ligação pode se ligar a, por exemplo, uma molécula de DNA (uma proteína de ligação ao DNA), uma molécula de RNA (uma proteína de ligação a RNA), e/ou uma molécula de proteína (uma proteína de ligação a proteína). No caso de uma proteína de ligação a proteína, esta pode se ligar a si mesma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) e/ou pode se ligar a uma ou mais moléculas de uma proteína ou proteínas diferentes. Uma proteína de ligação pode ter mais de um tipo de atividade de ligação. Por exemplo, proteínas do dedo de zinco possuem atividade de ligação a DNA, de ligação a RNA e de ligação a proteína.

[0062] Exemplos de proteínas de ligação a DNA incluem; meganucleases, dedos de zinco, domínios de ligação CRISPRs e TALE que podem ser “geneticamente manipulados” para se ligarem a uma sequência de nucleotídeos pré-determinada. Tipicamente, as proteínas de ligação a DNA manipuladas geneticamente (por exemplo, dedos de zinco, CRISPRs ou TALEs) são proteínas de ocorrência não natural. Exemplos não limitantes dos métodos para proteínas de ligação a DNA manipulado geneticamente são projeto e seleção. Uma proteína de ligação a DNA projetada é uma proteína que não ocorre na natureza cujo projeto/composição resulta principalmente dos critérios racionais. Critérios racionais para projeto incluem aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processar informações em uma base de dados de armazenamento de informações de ZFP, CRISPR e/ou TALE existentes e dados de ligação. Vide, por exemplo, Patentes US 6.140.081; 6.453.242 e 6.534.261; vide também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496 e Publicações US n° 20110301073, 20110239315 e 20119145940.

[0063] Uma “proteína de ligação a DNA de dedo de zinco” (ou domínio de ligação) é uma proteína ou domínio dentro de uma proteína maior que se liga a DNA em uma maneira específica de sequência através de um ou mais dedos de zinco que são regiões de sequências de aminoácidos dentro do domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon de zinco. O Termo proteína de ligação a DNA do dedo de zinco é geralmente abreviada como uma proteína de dedo de zinco ou ZFP. Os domínios de ligação ao dedo de zinco podem ser “geneticamente manipulados” para se ligarem a uma sequência de nucleotídeos pré-determinada. Exemplos não limitantes dos métodos para manipulação genéticas de proteínas de dedo de zinco são projeto e seleção. Uma proteína de dedo de zinco projetada é uma proteína que não ocorre na natureza cujo projeto/composição resulta principalmente dos critérios racionais. Critérios racionais para projeto incluem aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processar informações em uma base de dados de armazenamento de informações de desenhos de ZFP existentes e dados de ligação. Vide, por exemplo, Pat. U.S. n° 6.140.081; 6.453.242; 6.534.261 e 6.794.136; vide também documento WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.

[0064] Em outros exemplos, o domínio de ligação ao DNA de uma ou mais das nucleases compreende um domínio de ligação a DNA efetor de ocorrência natural ou TAL manipulado geneticamente (de ocorrência não natural). Vide, por exemplo, Publicação de Patente US N° 20110301073, incorporado por referência em sua totalidade neste documento. As bactérias patogênicas de plantas do gênero Xanthomonas são conhecidas por causarem muitas doenças em plantas de culturas importantes. A patogenicidade de Xanthomonas depende de um sistema de secreção tipo III conservado (T3S) que injeta mais de proteínas efetoras diferentes na célula da planta. Entre estas proteínas injetadas estão os efetores tipo ativador de transcrição (TALEN) que imitam os ativadores transcricionais de planta e manipulam o transcriptoma (vide Kay et al., (2007) Science 318:648-651). Essas proteínas contém um domínio de ligação a DNA e um domínio de ativação transcricional. Um dos efetores TAL mais bem caracterizados é AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (vide Bonas et al., (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 e WO2010079430). Efetores TAL contém um domínio centralizado de repetições tandem, cada repetição contendo aproximadamente 34 aminoácidos que são principais para a especificidade de ligação a DNA destas proteínas. Além disso, eles contém uma sequência de localização nuclear e um domínio de ativação transcricional ácido (para uma análise, vide Schornack S, et al., (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Além disso, nas bactérias fitopatogênicas Ralstonia solanacearum dois genes, com nome de brg11 e hpx17 foram descobertos como sendo homólogos a família AvrBs3 de Xanthomonas na cepa GMI1000 de biovar e na cepa RS1000 de biovar 4 de R. solanacearum (Vide Heuer et al.(2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384). Esses genes são 98,9% idênticos na sequência de nucleotídeos de cada um, mas diferem por uma deleção de 1,575 bp no domínio de repetição de hpx17. No entanto, ambos produtos de genes possuem menos do que 40% de identidade de sequência com proteínas da família AvrBs3 de Xanthomonas. Vide, por exemplo, Publicação de Patente US N° 20110301073, incorporado por referência em sua totalidade neste documento.

[0065] A especificidade destes efetores TAL depende das sequências encontradas nas repetições de tandem. A sequência repetida compreende aproximadamente 102 bp e as repetições são tipicamente 91-100% homólogas umas com as outras (Bonas et al., ibid). O polimorfismo das repetições geralmente está localizado nas posições 12 e 13 e parecem ser uma correspondência um-a-um entre a identidade de di-resíduos hipervariáveis nas posições 12 e 13 com a identidade dos nucleotídeos contíguos na sequência alvo de efetores TAL (vide Moscou e Bogdanove, (2009) Science 326:1501 e Boch et al., (2009) Science 326:1509-1512). Experimentalmente, o código natural para reconhecimento de DNA destes efetores TAL foi determinado de forma que uma sequência HD nas posições 12 e 13 resulta em uma ligação a citosina (C), NG se liga a T, NI a A, C, G ou T, NN se liga a A ou G e ING se liga a T. Estas repetições de ligação a DNA foram montadas em proteínas com novas combinações e números de repetições para criar fatores de transcrição artificiais que são capazes de interagir com novas sequências e ativar a expressão de um gene repórter não endógeno em células de planta (Boch et al., ibid). Proteínas TAL manipuladas geneticamente foram ligadas a um meio domínio de clivagem de FokI para resultar em uma fusão de nuclease de domínio efetor TAL (TALEN) exibindo atividade em um ensaio de repórter de levedura (alvo com base em plasmídeo).

[0066] O sistema de nuclease CRISPR (Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas)/Cas (Associadas a CRISPR) é um sistema de nuclease recentemente manipulado geneticamente com base em um sistema bacteriano que pode ser usado para engenharia de genomas. É baseado em parte da resposta imune adaptativa de muitas bactérias e Archaea. Quando um vírus ou plasmídeo invade uma bactéria, os segmentos do DNA invasor são convertidos em RNAs de CRISPR (crRNA) pela resposta imune. Esse crRNA então se associa através de uma região de complementariedade adicional com outro tipo de RNA chamado de tracrRNA para guiar a nuclease Cas9 para uma região homóloga ao crRNA no DNA alvo chamada de um “protoespaçador”. Cas9 cliva o DNA para gerar extremidades cegas na quebra de fita dupla (DSB) nos sítios especificados por uma sequência guia de 20 nucleotídeos contida dentro do transcrito de crRNA. Cas9 requer tanto crRNA como tracrRNA para reconhecimento e clivagem de DNA específico de sítio. Esse sistema foi agora manipulado geneticamente de forma que o crRNA e tracrRNA possa ser combinado em uma molécula (o “RNA guia único”) e a porção equivalente de crRNA do RNA guia único pode ser manipulada geneticamente para guiar a nuclease de Cas9 para direcionar qualquer sequência desejada (vide Jinek et al., (2012) Science 337, pp. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, e David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Assim, o sistema CRISPR/Cas pode ser manipulado geneticamente para criar um DSB em um alvo desejado em um genoma e reparar o DSB pode ser influenciado pelo uso de inibidores de reparo para causar um aumento no reparo propenso a erros.

[0067] Em outros exemplos, o transgene de ligação a DNA é uma nuclease específica de sítio que compreende uma Meganuclease (também descrita como uma endonuclease de retorno) manipulada geneticamente (de ocorrência não natural). As sequências de reconhecimento de endonucleases de retorno ou meganucleases tais como I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII são conhecidas. Vide também Patente US N° 5.420.032; Patente US N° 6.833.252; Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon et al., (1989) Gene 82:115-118; Perler et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al., (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al., (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 e o catálogo da New England Biolabs. Além disso, a especificidade de ligação a DNA de endonucleases de retorno e meganucleases pode ser manipulada geneticamente para se ligar a sítios alvo não naturais. Vide, por exemplo, Chevalier et al., (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962; Ashworth et al., (2006) Nature 441:656-659; Paques et al., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Publicação de Patente US n° 20070117128. Os domínios de ligação ao DNA de endonucleases de retorno e meganucleases podem ser alterados no contexto da nuclease como um todo (por exemplo, de forma que a nuclease inclui o domínio de clivagem cognato) ou podem ser fundidos em um domínio de clivagem heterólogo.

[0068] Conforme usado neste documento, o termo “transformação” abrange todas as técnicas que uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida na referida célula. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: transfecção com vetores virais; transformações com vetores de plasmídeo: eletroporação; lipofecção; microinjeção (Mueller et al., (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium; captação direta de DNA; transformação mediada por WHISKERS™; e um bombardeio de microprojéteis. Essas técnicas podem ser usadas para transformação estável e transformação transitória de uma célula de planta. “Transformação estável” se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro resultando em herança geneticamente estável. Quando transformado de forma estável, o fragmento de ácido nucleico é integrado estavelmente no genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração posterior. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácidos nucleicos transformados são mencionados como organismos “transgênicos”. “Transformação transitória” se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico no núcleo ou organela contendo DNA de um organismo hospedeiro resultando em expressão de genes sem herança geneticamente estável.

[0069] Uma sequência de ácidos nucleicos exógena. Em um exemplo, um transgene é uma sequência de genes (por exemplo, um gene com resistência a herbicida), um gene que codifica um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil ou um gene que codifica um traço agrícola desejável. Em ainda outro exemplo, o transgene é uma sequência de ácidos nucleicos antisense em que a expressão da sequência de ácidos nucleico antisense inibe a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos alvo. Um transgene pode conter sequências reguladoras ligadas operacionalmente ao transgene (por exemplo, um promotor). Em algumas modalidades, uma sequência de polinucleotídeos de interesse é um transgene. Contudo, em outras modalidades, uma sequência de polinucleotídeos de interesse é uma sequência de ácido nucleicos endógenos em que as cópias genômicas adicionais da sequência de ácidos nucleicos endógenos são desejáveis ou uma sequência de ácidos nucleicos que está na orientação antisense com respeito a sequência de uma molécula de ácido nucleico alvo em um organismo hospedeiro.

[0070] Conforme usado neste documento, o termo um “evento” transgênico é produzido por transformação de células de plantas com DNA heterólogo, ou seja, um construto de ácido nucleico que inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população de plantas resultando da inserção do transgene no genoma da planta e seleção de uma planta particular caracterizada pela inserção em um local particular no genoma. O termo “evento” se refere ao transformante original e progênie do transformante que inclui um DNA heterólogo. O termo “evento” também se refere a progênie produzida por um cruzamento outcross sexual entre o transformante e outra variedade que incluir o DNA genômico/transgene. Mesmo após retrocruzamento repetido em um parente recorrente, o DNA de transgene inserido e DNA genômico de flanqueamento (DNA genômico/transgene) a partir do parente transformado está presente na progênie do cruzamento no mesmo local cromossômico. O termo “evento” também se refere ao DNA do transformante original e progênie do mesmo compreendendo o DNA inserido e sequência genômica de flanqueamento imediatamente adjacente ao DNA inserido que se espera ser transferido para uma progênie que recebe DNA inserido, incluindo o transgene de interesse em resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transformante original e progênie resultante do autocruzamento) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido.

[0071] Conforme usado neste documento, os termos “Reação em Cadeia da Polimerase” ou “PCR” define um procedimento ou técnica na qual quantidades minutas de ácido nucleico, RNA e/ou DNA são amplificadas conforme descrito na Pat. U.S. N° 4.683.195 emitida em 28 de julho de 1987. Geralmente, as informações de sequências pelas extremidades da região de interesse ou além necessitam estar disponíveis de forma que os primers de oligonucleotídeos possam ser designados e estes primers serão idênticos ou semelhantes em sequência às fitas opostas do modelo a ser amplificado. Os nucleotídeos do terminal 5’ dos dois primers podem coincidir com as extremidades do material amplificado. O PCR também pode ser usado para amplificar sequências específicas de RNA, sequências específicas de DNA pelo DNA genômico total e cDNA transcrito pelo RNA celular total, sequências de bacteriófagos ou plasmídeos, etc. Vide, em geral, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).

[0072] Conforme usado neste documento, o termo “iniciador” se refere a um oligonucleotídeo capaz de atuar como um ponto de iniciação de síntese juntamente com uma fita complementar quando as condições são adequadas para síntese de um produto de extensão de iniciador. As condições de sintetização incluem a presença de quatro diferentes trifosfatos de desoxirribonucleotídeos e pelo menos um agente de indução de polimerização tal como transcriptase reversa ou DNA polimerase. Esses estão presente em um tampão adequado que pode incluir constituintes que são cofatores ou que afetam as condições tais como pH e semelhantes em várias temperaturas adequadas. Um iniciador é, preferencialmente, uma sequência de fita única de forma que a eficiência de amplificação é otimizada, mas sequência de fitas duplas podem ser usadas.

[0073] Conforme usado neste documento, o termo “sonda” se refere a um oligonucleotídeo que hibridiza em uma sequência alvo. No procedimento de ensaio estilo TaqMan® ou TaqMan®, a sonda hibridiza em uma porção do alvo situada entre o sítio de recozimento e os dois primers. Uma sonda inclui cerca de oito nucleotídeos, cerca de dez nucleotídeos, cerca de quinze nucleotídeos, cerca de vinte nucleotídeos, cerca de trinta nucleotídeos, cerca de quarenta nucleotídeos ou cerca de cinquenta nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda inclui de cerca de oito nucleotídeos a cerca de quinze nucleotídeos. Uma sonda pode incluir ainda um marcador detectável, por exemplo, um fluoróforo (Texas-Red®, isotiocianato de Fluoresceína, etc.). O marcador detectável pode ser ligado de covalentemente de forma direta ao oligonucleotídeo da sonda, por exemplo, localizado na extremidade 5’ da sonda ou na extremidade 3’ da sonda. Uma sonda incluindo um fluoróforo também pode incluir ainda um supressor, por exemplo, Black Hole Quencher™, Iowa Black™, etc.

[0074] Conforme usado neste documento, os termos “endonucleases de restrição” e “enzimas de restrição” se referem às enzimas bacterianas que cortam DNA de fita dupla no ou próximo a sequência específica de nucleotídeos. Enzimas de restrição tipo-2 reconhecem e clivam DNA no mesmo sítio e incluem, mas não estão limitadas a XbaI, BamHI, HindIII, EcoRI, XhoI, SalI, KpnI, AvaI, PstI e SmaI.

[0075] Conforme usado neste documento, o termo “vetor” é usado permutavelmente com os termos “construto”, “vetor de clonagem” e “vetor de expressão” e significa o veículo pelo qual uma sequência de DNA ou RNA (por exemplo, um gene estranho) pode ser introduzido em uma célula hospedeira de maneira a transformar o hospedeiro e promover a expressão (por exemplo, transcrição e tradução) da sequência introduzida. Um “vetor não viral” pretende significar qualquer vetor que não compreende um vírus ou retrovírus. Em algumas modalidades, um “vetor” é uma sequência de DNA compreendendo pelo menos uma origem de replicação de DNA e pelo menos um gene de marcador selecionável. Exemplos incluem, mas não se limitam a, um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano (BAC) ou vírus que transporta DNA exógeno para uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, moléculas antisense, e/ou genes de marcador selecionável e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, fazendo assim com que a célula expresse as moléculas de ácidos nucleicos e/ou proteínas codificadas pelo vetor. O termo “plasmídeo” define uma fita circular de ácidos nucleicos capaz de replicação autossômica em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. O termo inclui ácido nucleico que pode ser DNA ou RNA e pode ser de fita única ou dupla. O plasmídeo da definição também pode incluir as sequências que correspondem a uma origem bacteriana de replicação.

[0076] Conforme usado neste documento, o termo “gene de marcador selecionável” conforme usado neste documento define um gene ou outro cassete de expressão que codifica uma proteína que facilita a identificação de células na qual o gene de marcador selecionável é inserido. Por exemplo, um “gene de marcador selecionável” engloba genes repórteres bem como genes usados em transformação de plantas para, por exemplo, proteger células de plantas de um agente seletivo ou fornecer resistência/tolerância a um agente seletivo. Em uma modalidade, apenas aquelas células ou plantas que recebem um marcador selecionável funcional são capazes de se dividirem ou crescer sob condições com um agente seletivo. Exemplos de agentes seletivos podem incluir, por exemplo, antibióticos, incluindo espectinomicina, neomicina, canamicina, paromomicina, gentamicina e higromicina. Esses marcadores selecionáveis incluem neomicina fosfotransferase (npt II) que expressa uma enzima que confere resistência a canamicina antibiótica e genes para antibióticos relacionados, neomicina, paromomicina, gentamicina e G418 e o gene para higromicina fosfotransferase (hpt) que expressa uma enzima que confere resistência a higromicina. Outros genes de marcador selecionável podem incluir genes que codificam resistência a herbicidas incluindo bar ou pat (resistência contra glufosinato de amônio ou fosfinotricina), acetolactato sintase (ALS, resistência contra inibidores tais como sulfonilureias (SUs), imidazolinonas (IMIs), triazolopirimidinas (TPs), pirimidinil oxibenzoatos (POBs), e sulfonilamino carbonil triazolinonas que previnem a primeira etapa na síntese de aminoácidos de cadeia ramificada), glifosato, 2,4-D e resistência ou sensibilidade a metais. Exemplos de “genes repórteres” que podem ser usados como gene de marcador selecionável incluem a observação visual de proteínas de gene repórter expresso tais como proteínas que codificam β-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarelo fluorescente (YFP), DsRed, β-galactosidade, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina e semelhantes. A frase “marcador positivo” se refere a plantas que foram transformadas para incluir um gene de marcador selecionável.

[0077] Conforme usado neste documento, o termo “marcador detectável” se refere a um marcador capaz de detecção, tal como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, quelante metálico ou enzima. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, mas não estão limitados aos que se seguem: marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidade, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescente, grupos biotinil, epítopos de polipeptídeos pré-determinados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíperes de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, sinalizadores de epítopos). Em uma modalidade, um marcador detectável pode ser ligado pelos braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento estérico.

[0078] Conforme usado neste documento, os termos “cassete”, “cassete de expressão” e “cassete de expressão de genes” se referem a um segmento de DNA que pode ser inserido em um ácido nucleico ou polinucleotídeo em sítios de restrição específicos ou por recombinação homóloga. Conforme usado neste documento, o segmento de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e o cassete e sítios de restrição são projetados para garantir a inserção do cassete na estrutura de leitura adequada para transcrição e tradução. Em uma modalidade, um cassete de expressão pode incluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse e que contém elementos além do polinucleotídeo que facilita a transformação de uma célula hospedeira particular. Em uma modalidade, um gene de expressão pode incluir também elementos que permitem a expressão aumentada de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira. Esses elementos podem incluir, mas não estão limitados a: um promotor, um promotor mínimo, um potencializador, um elemento de resposta, um sequência terminadora, uma sequência de poliadenilação e semelhantes.

[0079] Conforme usado neste documento, um “ligante” ou “espaçador” é uma ligação, molécula ou grupo de moléculas que ligam duas entidades separadas em uma outra. Ligadores e espaçadores podem fornecer espaçamento ideal de duas entidades e podem fornecer ainda uma ligação lábil que permite que duas entidades estejam separadas umas das outras. Ligações lábeis incluem grupos fotocliváveis, frações lábeis em ácido, frações lábeis em bases e grupos cliváveis em enzimas. Os termos “poliligante” ou “sítio de clonagem múltipla” conforme usado neste documento define um grupo de três ou mais sítios de enzimas de restrição tipo 2 localizados dentro de 10 nucleotídeos de um outro em uma sequência de ácidos nucleicos. Construtos compreendendo um poliligante são usados para inserção e/ou excisão de sequências de ácidos nucleicos tais como região codificante de um gene. Em outros casos, o termo “poliligante”, como usado neste documento, se refere a um trecho de nucleotídeos que são direcionados para unir duas sequências por meio de qualquer método de clonagem sem emendas (isto é, Gibson Assembly®, NEBuilder HiFiDNA Assembly®, Golden Gate Assembly®, BioBrick® Assembly, etc.). Construtos compreendendo um poliligante são usados para inserção e/ou excisão de sequências de ácidos nucleicos tais como região de codificação de um gene.

[0080] Conforme usado neste documento, o termo “controle” se refere a uma amostra usada em um procedimento analítico para fins de comparação. Um controle pode ser “positivo” ou “negativo”. Por exemplo, onde a finalidade de um procedimento analítica é detectar um transcrito expresso de forma diferencial ou polipeptídeo em células ou tecido, é geralmente preferencial incluir um controle positivo tal como uma amostra de uma planta conhecida exibindo a expressão desejada e um controle negativo, tal como uma amostra de uma planta conhecida faltando a expressão desejada.

[0081] Conforme usado neste documento, o termo “planta” incluir uma planta inteira e qualquer descendente, célula, tecido ou parte de uma planta. Uma classe de planta que pode ser usada na presente invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas superiores e inferiores receptível à mutagênese incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Assim, “planta” inclui planta dicotiledôneas e monocotiledôneas. O termo “partes de planta” inclui qualquer parte(s) de uma planta, incluindo, por exemplo, e sem limitação: semente (incluindo semente madura e semente imatura), um corte de planta: uma célula vegetal; uma cultura de células vegetais; um órgão vegetal (por exemplo, pólen, embrião, flores, frutos, galhos, folhas, raízes, caules e explantes). Um tecido de planta ou órgão de planta pode ser uma semente, protoplasto, calo ou qualquer outro grupo de células de plantas que é organizado em unidade estrutural ou funcional. Uma célula de planta ou cultura de tecidos pode ser capaz de regenerar um planta contendo as características fisiológicas e morfológicas da planta a qual a célula ou tecido foi obtida e de regenerar uma planta significativamente com o mesmo genótipo da planta. Em contraste, algumas células de plantas não são capazes de ser regeneradas para produzir plantas. Células regeneráveis em uma célula vegetal ou cultura de tecidos podem ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólen, folhas, anteras, pontas de raízes, cabelos, flores, sementes, espigas, sabugo, cascas ou talos.

[0082] Partes de plantas incluem partes que podem ser colhidas e partes úteis para propagação de plantas de progênie. Partes de plantes úteis para propagação incluem, por exemplo, e sem limitação: semente; fruto; um corte; uma muda; um bulbo e um rizoma. Uma parte que pode ser colhida de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, incluindo, por exemplo e sem limitação: flor; pólen; muda; bulbo; folha; caule; fruto; semente e raiz.

[0083] Uma célula de planta é a unidade estrutural e fisiológica da planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular. Uma célula de planta pode estar na forma de um célula única isolada ou um agregado de células (por exemplo, um calo friável e uma célula cultivada) e pode ser parte de uma unidade organizada superior (por exemplo, um tecido de planta, um órgão de planta e planta). Assim, uma célula de planta pode ser um protoplasto, um célula produtora de gametas ou uma célula ou conjunto de células que podem regenerar em uma planta inteira. Como tal, uma semente que compreende múltiplas células de plantas e é capaz de regenerar em uma planta inteira é considerada uma “célula de planta” nas modalidades deste documento.

[0084] Conforme usado neste documento, o termo “RNA pequeno” se refere a várias classes de ácidos ribonucleicos não codificadores (ncRNA). O termo RNA pequeno descreve cadeias curtas de ncRNA produzidas em células bacterianas, animais, plantas e fungos. Estas cadeias curtas de ncRNA podem ser produzidas naturalmente dentro da célula ou podem ser produzidas pela introdução de uma sequência exógena que expressa a cadeia curta ou ncRNA. As sequências de RNA pequeno não codificam diretamente para uma proteína e diferem em função de outro RNA pelo fato de que sequências de RNA pequeno são apenas transcritas e não traduzidas. As sequências de RNA pequeno são envolvidas em outras funções celulares, incluindo expressão e modificação de genes. Moléculas de RNA pequeno são geralmente feitas de cerca de 20 a 30 nucleotídeos. As sequências de RNA pequeno podem ser derivadas de precursores maiores. Os precursores formam estruturas que redobram sobre cada uma em regiões autocomplementares que são processadas pela nuclease Dicer em animais ou DCL1 em plantas.

[0085] Muitos tipos de RNA pequeno existem naturalmente ou são produzidos artificialmente, incluindo microRNAs (miRNAs), RNA curtos de interferência (siRNAs), RNA antisense, RNA curto em gancho (shRNA) e RNAs pequenos nucleolares (snoRNAs). Certos tipos de RNA pequeno, tais como microRNA e siRNA, são importantes no silenciamento de genes e interferência de RNA (RNAi). O silenciamento de genes é um processo de regulação genética no qual um gene que normalmente seria expresso é “desligado” por um elemento intracelular, neste caso, o RNA pequeno. A proteína que seria normalmente formada por esta formação genética não é formada devido à interferência e as informações codificadas no gene são bloqueadas pela expressão.

[0086] Conforme usado neste documento, o termo “small RNA” abrange moléculas de RNA descritas na literatura como “tiny RNA” (Storz, (2002) Science 296:1260-3; Illangasekare et al., (1999) RNA 5:1482-1489); “small RNA” procariótico (sRNA) (Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45); “noncoding RNA (ncRNA)” eucariótico; “micro-RNA (miRNA)”; “small non-mRNA (snmRNA)”; “functional RNA (fRNA)”; “transfer RNA (tRNA)”; “catalytic RNA” [por exemplo, ribozimas, incluindo ribozimas de autoacilação (Illangaskare et al., (1999) RNA 5:1482-1489); “small nucleolar RNAs (snoRNAs),” “tmRNA” (também conhecido como “10S RNA,” Muto et al., (1998) Trends Biochem Sci. 23:25-29; e Gillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885); moléculas de RNAi, incluindo, sem limitação, “small interfering RNA (siRNA),” “endoribonuclease-prepared siRNA (e-siRNA),” “short hairpin RNA (shRNA),” e “small temporally regulated RNA (stRNA),” “diced siRNA (d-siRNA),” e aptâmeros, oligonucleotídeos e outros ácidos nucleicos sintéticos que compreendem pelo menos uma base uracila.

[0087] Exceto se especificamente explicado em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento possuem o mesmo significado conforme comumente compreendido pelos versados na técnica. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontrados em, por exemplo: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[0088] Conforme usado neste documento, “um”, “uma” e “a/o” incluem referências no plural, exceto se o contexto ditar claramente e ambiguamente em contrário.

III. Promotor do Gene tipo Metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) e Ácidos Nucleicos Compreendendo o Mesmo

[0089] São fornecidos métodos e composições para uso de um promotor a partir de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) para expressar transgenes não tipo metalotioneína em plantas. Em uma modalidade, um promotor pode ser o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:1.

[0090] Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo compreendendo um promotor, em que o promotor é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8% ou 100% idêntico à SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, um promotor é um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que compreende um polinucleotídeo de pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, ou 100% de identidade ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, um polinucleotídeo isolado é fornecido compreendendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8% ou 100% de identidade ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, é fornecido um polinucleotídeo compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que está operacionalmente ligado a um poliligante. Em uma modalidade, é fornecido um cassete de expressão gênico compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que está operacionalmente ligado a um transgene não tipo metalotioneína. Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que está operacionalmente ligado a um transgene não tipo metalotioneína. Em uma modalidade, o promotor consiste na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade ilustrativa, um vetor de ácido nucleico compreende um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que está ligado operacionalmente a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticidas, um transgene de tolerância a herbicidas, um transgene de eficiência de uso do nitrogênio, um transgene de eficiência de uso da água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação a DNA, um transgene de pequeno RNA, transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos.

[0091] A expressão do transgene também pode ser regulada pela região não traduzida 3' do gene (isto é, 3'-UTR) localizada à jusante da sequência codificante do gene. Tanto um promotor quanto uma 3’-UTR podem regular a expressão do transgene. Embora um promotor seja necessário para conduzir a transcrição, uma região 3’-UTR do gene pode terminar a transcrição e iniciar a poliadenilação de um transcrito de mRNA resultante para tradução e síntese proteica. Uma região 3’-UTR do gene auxilia a expressão estável de um transgene.

[0092] Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) conforme descrito neste documento e uma 3’-UTR. Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Em uma modalidade, a 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) é a SEQ ID NO:3.

[0093] Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) conforme descrito neste documento e uma 3’-UTR, em que 3’-UTR é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8% ou 100% idêntica ao polinucleotídeo da SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) conforme descrito neste documento e a 3’ -UTR, em que o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) e a 3’ -UTR são, ambos, operacionalmente ligados a extremidades opostas de um poliligante. Em uma modalidade, é fornecido um cassete de expressão gênico compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) conforme descrito neste documento e a 3’ -UTR, em que o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) e a 3’ -UTR são, ambos, operacionalmente ligados a extremidades opostas de um transgene não tipo metalotioneína. Em uma modalidade, 3’-UTR consiste na SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, é fornecido um cassete de expressão gênico compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) conforme descrito neste documento e a 3’ - UTR, em que o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreende a SEQ ID NO: 1 e a 3’ -UTR compreende a SEQ ID NO: 3 em que o promotor e a 3'-UTR são operacionalmente ligados às extremidades opostas de um transgene não tipo metalotioneína. Em um aspecto desta modalidade, o 3’-UTR consiste na SEQ ID NO:3. Em outro aspecto desta modalidade, o promotor consiste na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão gênica compreende uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que é operacionalmente ligada a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência do uso de nitrogênio, um transgene de eficiência do uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação a DNA, um transgene de pequeno RNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos. Em uma outra modalidade, o transgene está operacionalmente ligado a um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) e a uma 3’ -UTR do mesmo gene tipo metalotioneína.

[0094] A expressão do transgene também pode ser regulada por uma região de íntrons localizada a jusante de uma sequência de promotor. Tanto um promotor como um íntron podem regular a expressão do transgene. Embora o promotor seja necessário para induzir a transcrição, a presença de um íntron pode aumentar os níveis de expressão resultante em transcrito de mRNA para tradução e síntese de proteínas. Uma região de gene de íntron auxiliar a expressão estável de um transgene. Em uma outra modalidade, um íntron está operacionalmente ligado a um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl).

[0095] A expressão do transgene também pode ser regulada por uma região 5’-UTR localizada a jusante de uma sequência promotora. Tanto o promotor como uma 5’-UTR podem regular a expressão do transgene. Embora um promotor seja necessário para conduzir a transcrição, a presença de uma 5’-UTR pode aumentar os níveis de expressão resultando em um transcrito de mRNA para tradução e síntese proteica. Uma região 5’-UTR do gene auxilia a expressão estável de um transgene. Em uma outra modalidade, uma 5’-UTR está operacionalmente ligada a um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl).

[0096] Um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) também pode compreender um ou mais elementos de sequência adicionais. Em algumas modalidades, um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) pode compreender um éxon (por exemplo, um peptídeo líder ou sinal, tal como um peptídeo de trânsito de cloroplasto ou sinal de retenção de ER). Por exemplo, e sem limitação, um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) pode codificar um éxon incorporado no promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) como uma modalidade adicional.

[0097] Em uma modalidade, um vetor de ácidos nucleicos compreende um cassete de expressão de genes conforme divulgado neste documento. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, um vírus ou um fragmento de polinucleotídeo excisado para uso em transformação direta ou direcionamento de gene tal como um DNA doador.

[0098] De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico compreendendo um cassete de expressão gênica recombinante, em que o cassete de expressão gênica recombinante compreende um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligado a uma sequência de poliligante, um transgene não tipo metalotioneína, ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, o cassete gênico recombinante compreende um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligado a um transgene não tipo metalotioneína. Em uma modalidade, o cassete gênico recombinante compreende um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl), como divulgado neste documento, operacionalmente ligado a uma sequência de poliligante. O poliligante está operacionalmente ligado ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) de uma forma que essa inserção de uma sequência codificante em um dos sítios de restrição do poliligante irá ligar operacionalmente a sequência codificante, permitindo a expressão da sequência codificante quando o vetor for transformado ou transfectado em uma célula hospedeira.

[0099] De acordo com uma modalidade, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. De acordo com uma modalidade, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. De acordo com uma modalidade, a sequência de promotor possui um comprimento total de mais do que 1,5, 2, 2,5, 3 ou 4 kb. De acordo com uma modalidade, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste na SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de 2.000 bp que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. De acordo com uma modalidade, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste na SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de 2.000 bp que tenha 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

[00100] Ainda fornecida como uma modalidade do promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) está a SEQ ID NO:12. Essa sequência modificada de promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) pode ser usada neste documento para conduzir a expressão de um transgene, e fornecer sequências promotoras alternativas que podem ser usadas em vez da SEQ ID NO:1 conforme fornecido pela divulgação do objeto neste documento. As sequências polinucleotídicas de promotor da SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:12 compartilham 97,2% de identidade de sequência. O promotor da SEQ ID NO:12 é fornecido como uma modalidade adicional de um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl).

[00101] Também fornecidas como modalidades do promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) estão a SEQ ID NO:7 (1.730 bp), SEQ ID NO:8 (1.530 bp), SEQ ID NO:9 (1.330 bp), SEQ ID NO:10 (1.130 bp) e SEQ ID NO:11 (1.001 bp) conforme mostrado na Figura 2. Essas sequências truncadas de promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) podem ser usadas neste documento para conduzir a expressão de um transgene, e fornecer sequências promotoras alternativas que podem ser usadas em vez da SEQ ID NO:1 conforme fornecido pela divulgação do objeto neste documento. O promotor de 1.730 bp da SEQ ID NO:7 é fornecido como uma modalidade adicional de um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Além disso, o promotor de 1.530 bp da SEQ ID NO:8 é fornecido como uma modalidade adicional de um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). O promotor de 1.330 bp da SEQ ID NO:9 é fornecido como uma modalidade adicional de um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Além disso, o promotor de 1.130 bp da SEQ ID NO:10 é fornecido como uma modalidade adicional de um promotor pode ser o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Além disso, o promotor de 1.001 bp da SEQ ID NO:9 é fornecido como uma modalidade adicional de um promotor pode ser o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl).

[00102] De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico compreendendo um cassete gênico que consiste em um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl), um transgene não tipo metalotioneína e uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, a 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO: 3 está operacionalmente ligada à extremidade 3' do transgene não tipo metalotioneína. Em outra modalidade, a sequência não traduzida 3' compreende a SEQ ID NO: 3, ou uma sequência que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a sequência não traduzida 3' compreende a SEQ ID NO: 3, ou uma sequência que tenha 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete gênico que consiste na SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de 2.000 bp que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, um transgene não tipo metalotioneína e uma 3’-UTR, em que a SEQ ID NO: 1 está operacionalmente ligada à extremidade 5' do transgene não tipo metalotioneína e a 3'-UTR da SEQ ID NO:3 está operacionalmente ligada à extremidade 3' do transgene não tipo metalotioneína. De acordo com uma modalidade, é fornecido um vetor de ácido nucleico que compreende um cassete gênico que consiste na SEQ ID NO: 1, ou uma sequência de 2.000 bp que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1, um transgene não tipo metalotioneína e uma 3’-UTR, em que a SEQ ID NO: 1 está operacionalmente ligada à extremidade 5' do transgene não tipo metalotioneína e a 3'-UTR da SEQ ID NO:3 está operacionalmente ligada à extremidade 3' do transgene não tipo metalotioneína. Em outra modalidade, a sequência não traduzida 3' compreende a SEQ ID NO: 3, ou uma sequência que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a sequência não traduzida 3' consiste na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de 1.002 bp que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a sequência não traduzida 3' compreende a SEQ ID NO: 3, ou uma sequência que tenha 80, 85, 90, 95, 99 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a sequência não traduzida 3' consiste na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de 1,002 bp que tem 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3.

[00103] Ainda fornecida como modalidades da 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) está a SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18. Essas sequências modificadas de 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) podem ser usadas neste documento para finalizar a expressão de um transgene, e fornece sequências de 3’-UTR alternativas que podem ser usadas em vez da SEQ ID NO:3 conforme fornecido pela divulgação do objeto neste documento. As sequências polinucleotídicas de 3’-UTR da SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:17 compartilham 94,2% de identidade de sequência. As sequências polinucleotídicas de 3’-UTR da SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:18 compartilham 97,5% de identidade de sequência. Finalmente, as sequências polinucleotídicas de 3’-UTR da SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:17 compartilham 92,7% de identidade de sequência. A 3’-UTR da SEQ ID NO:17 é fornecida como uma modalidade adicional de uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). A 3’-UTR da SEQ ID NO:18 é fornecida como uma modalidade adicional de uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl).

[00104] Também fornecidas como modalidades da 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) estão a SEQ ID NO:13 (264 bp), SEQ ID NO:14 (332 bp), SEQ ID NO:15 (630 bp), e SEQ ID NO:16 (727 bp) conforme mostrado na Figura 4. Essas sequências truncadas de 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) podem ser usadas neste documento para finalizar a expressão de um transgene, e fornece uma sequência de 3’-UTR alternativa que pode ser usada em vez da SEQ ID NO:3 conforme fornecido pela divulgação do objeto neste documento. A 3’-UTR de 264 bp da SEQ ID NO:13 é fornecida como uma modalidade adicional de uma 3’- UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Além disso, a 3’-UTR de 332 bp da SEQ ID NO:14 é fornecida como uma modalidade adicional de uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). A 3’-UTR de 630 bp da SEQ ID NO:15 é fornecida como uma modalidade adicional de uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Além disso, a 3’-UTR de 727 bp da SEQ ID NO:16 é fornecida como uma modalidade adicional de uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl).

[00105] Em uma modalidade, é fornecido um construto de ácido nucleico que compreende um promotor e um transgene não tipo metalotioneína e, opcionalmente, um ou mais dos seguintes elementos: a) uma região não traduzida 5'; b) um íntron; e c) uma região não traduzida 3', em que o promotor consiste na SEQ ID NO:1 ou numa sequência com 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1; e a região não traduzida 3' consiste na SEQ ID NO:3 ou numa sequência com 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3; em que, ainda, o referido promotor está operacionalmente ligado ao referido transgene e cada elemento opcional, quando presente, também está operacionalmente ligado ao promotor e ao transgene. Em uma outra modalidade, é fornecida uma célula transgênica que compreende o construto de ácido nucleico divulgado imediatamente acima. Em uma modalidade, a célula transgênica é uma célula vegetal e, em outra modalidade, é fornecida uma planta em que a planta compreende as referidas células transgênicas.

[00106] Em uma modalidade, é fornecido um construto de ácido nucleico que compreende um promotor e um transgene não tipo metalotioneína e, opcionalmente, um ou mais dos seguintes elementos: 112. uma região não traduzida 3', em que o promotor consiste na SEQ ID NO:1 ou numa sequência com 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1; e a região não traduzida 3' consiste na SEQ ID NO:3 ou numa sequência com 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3; em que, ainda, o referido promotor está operacionalmente ligado ao referido transgene e cada elemento opcional, quando presente, também está operacionalmente ligado ao promotor e ao transgene. Em uma outra modalidade, é fornecida uma célula transgênica que compreende o construto de ácido nucleico divulgado imediatamente acima. Em uma modalidade, a célula transgênica é uma célula vegetal e, em outra modalidade, é fornecida uma planta em que a planta compreende as referidas células transgênicas.

[00107] Em uma modalidade, é fornecido um construto de ácido nucleico que compreende um promotor e um poliligante e, opcionalmente, um dos ou mais seguintes elementos: 113. uma região não traduzida 5', 114. um íntron, e 115. uma região não traduzida 3', em que o promotor consiste na SEQ ID NO:1 ou numa sequência com 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1; e a região não traduzida 3' consiste na SEQ ID NO:3 ou numa sequência com 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:3; em que, ainda, o referido promotor está operacionalmente ligado ao referido poliligante e cada elemento opcional, quando presente, também está operacionalmente ligado ao promotor e ao poliligante.

[00108] De acordo com uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende ainda uma sequência que codifica um marcador selecionável. De acordo com uma modalidade, o cassete de gene recombinante está operacionalmente ligado a uma borda do T-DNA de Agrobacterium. De acordo com uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende ainda uma primeira e uma segunda borda do T-DNA, em que a primeira borda do T-DNA está operacionalmente ligada a uma extremidade do construto gênico, e a segunda borda do T-DNA está operacionalmente ligada à outra extremidade do construto gênico. A primeira e a segunda bordas do T-DNA de Agrobacterium podem ser independentemente selecionadas das sequências de borda de T-DNA que se originam de cepas bacterianas selecionadas do grupo consistindo em uma borda do T-DNA de Agrobacterium que sintetiza nopalina, uma borda do T-DNA de Agrobacterium que sintetiza octopina, uma borda do T-DNA de Agrobacterium que sintetiza manopina, uma borda do T-DNA de Agrobacterium que sintetiza succinamopina, ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, é fornecida uma cepa de Agrobacterium selecionada do grupo consistindo em uma cepa sintetizadora de nopalina, uma cepa sintetizadora de manopina, uma cepa sintetizadora de succinamopina, ou uma cepa sintetizadora de octopina, em que a referida cepa compreende um plasmídeo em que o plasmídeo compreende um transgene operacionalmente ligado a uma sequência selecionada da SEQ ID NO: 1, ou uma sequência com 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1.

[00109] Os transgenes de interesse que são adequados para uso nos presentes construtos divulgados incluem, mas não estão limitados a, sequências codificantes que conferem (1) resistência a pragas ou doenças, (2) tolerância a herbicidas, (3) características agronômicas de valor agregado, tais como: melhoria de rendimento, eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso de água e qualidade nutricional, (4) ligação de uma proteína ao DNA de uma forma sítio-específica, (5) expressão de pequeno RNA, e (6) marcadores selecionáveis. De acordo com uma modalidade, o transgene codifica um marcador selecionável ou um produto gênico que confere resistência a inseticidas, tolerância a herbicidas, expressão de pequeno RNA, eficiência do uso de nitrogênio, eficiência do uso de água, ou qualidade nutricional.

1. Resistência a Insetos

[00110] Várias sequências codificantes de resistência a insetos podem estar operacionalmente ligadas ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Várias sequências codificantes de resistência a insetos podem estar operacionalmente ligadas ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. As sequência operacionalmente ligadas podem então ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). As sequências de codificação de resistência a insetos são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades de sequências de codificação de resistência a insetos podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, as seguintes características são fornecidas. As sequência de codificação que proporcionam resistência a insetos lepidópteros exemplares incluem: cry1A; cry1A.105; cry1Ab; cry1Ab(truncada); cry1Ab- Ac (proteína de fusão); cry1Ac (comercializada como Widestrike®); cry1C; cry1F (comercializada como Widestrike®); cry1Fa2; cry2Ab2; cry2Ae; cry9C; mocry1F; pinII (proteína inibidora da protease); vip3A(a); e vip3Aa20. As sequência de codificação que proporcionam resistência a insetos coleópteros incluem: cry34Ab1 (comercializada como Herculex®); cry35Ab1 (comercializada como Herculex®); cry3A; cry3Bb1; dvsnf7; e mcry3A. As sequências de codificação que proporcionam resistência a múltiplos insetos exemplares incluem ecry31.Ab. A lista acima de genes de resistência a insetos não se destina a ser limitante. Quaisquer genes de resistência a insetos estão abrangidos pela presente divulgação.

2. Tolerância a Herbicidas

[00111] Várias sequências codificantes de tolerância a herbicidas podem estar operacionalmente ligadas ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Várias sequências codificantes de tolerância a herbicidas podem estar operacionalmente ligadas ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. As sequência operacionalmente ligadas podem então ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Sequências de codificação de tolerância a herbicidas exemplares são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades de sequências de codificação de tolerância a herbicidas podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, as seguintes características são fornecidas. O herbicida glifosato contém um modo de ação através da inibição da enzima EPSPS (5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase). Esta enzima está envolvida na biossíntese de aminoácidos aromáticos que são essenciais para o crescimento e desenvolvimento de plantas. São conhecidos na técnica vários mecanismos enzimáticos que podem ser utilizados para inibir esta enzima. Os genes que codificam essas enzimas podem ser operacionalmente ligados aos elementos reguladores do gene do objeto da divulgação. Em uma modalidade, os genes de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados aos genes que codificam os genes de resistência ao glifosato que incluem: genes EPSPS mutantes, tais como os genes 2mEPSPS, genes cp4 EPSPS, genes mEPSPS, genes dgt-28; genes aroA; e genes de degradação do glifosato, tais como os genes da glifosato acetil transferase (gat) e os genes da glifosato oxidase (gox). Essas características são atualmente comercializadas como Gly- TolTM, Optimum® GAT®, Agrisure® GT e Roundup Ready®. Os genes de resistência para os compostos glufosinato e/ou bialafos incluem os genes dsm-2, bar e pat. As características de bar e pat são atualmente comercializadas como LibertyLink®. Também incluídos estão os genes de tolerância que proporcionam resistência a 2,4-D, tais como os genes aad-1 (deve-se notar que os genes aad-1 têm atividade adicional sobre os herbicidas de ariloxifenoxipropionato) e os genes aad-12 (deve-se notar que os genes aad-12 têm atividade adicional sobre as auxinas sintéticas de piridiloxiacetato). Essas características são comercializadas como tecnologia de proteção de colheita Enlist®. Os genes de resistência para inibidores de ALS (sulfonilureias, imidazolinonas, triazolopirimidinas, pirimidiniltiobenzoatos e sulfonilamino-carbonil-triazolinonas) são bem conhecidos na técnica. Esses genes de resistência resultam mais comumente de mutações pontuais na sequência do gene codificante de ALS. Outros genes de resistência de inibidor de ALS incluem os genes hra, os genes csr1-2, genes Sr-HrA e os genes surB. Algumas das características são comercializadas sob o nome comercial Clearfield®. Os herbicidas que inibem HPPD incluem as pirazolonas, tais como pirazoxifeno, benzofenap e topramezona; tricetonas, tais como mesotriona, sulcotriona, tembotriona, benzobiciclona; e dicetonitrilas, tais como isoxaflutol. Esses herbicidas HPPD exemplares podem ser tolerados pelas características conhecidas. Exemplos de inibidores de HPPD incluem os genes hppdPF_W336 (para resistência ao isoxaflutol) e os genes avhppd- 03 (para resistência à meostriona). Um exemplo de características tolerantes ao herbicida oxinil inclui o gene bxn, que mostrou conferir resistência ao herbicida/antibiótico bromoxinil. Os genes de resistência para dicamba incluem o gene da dicamba mono-oxigenase (dmo) conforme divulgado na Publicação PCT Internacional n° WO 2008/105890. Os genes de resistência para herbicidas do tipo inibidor de PPO ou PROTOX (por exemplo, acifluorfeno, butafenacil, flupropazil, pentoxazona, carfentrazona, fluazolato, piraflufeno, aclonifeno, azafenidina, flumioxazina, flumiclorac, bifenox, oxifluorfeno, lactofeno, fomesafeno, fluoroglicofeno e sulfentrazona) são conhecidos na técnica. Genes exemplares que conferem resistência a PPO incluem a superexpressão de uma enzima PPO de Arabidopsis thaliana do tipo selvagem (Lermontova I e Grimm B, (2000) Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen. Plant Physiol 122:7583.), o gene da PPO de B. subtilis (Li, X. e Nicholl D. 2005. Development of PPO inhibitor-resistant cultures and crops. Pest Manag. Sci. 61:277-285 e Choi KW, Han O, Lee HJ, Yun YC, Moon YH, Kim MK, Kuk YI, Han SU e Guh JO, (1998) Generation of resistance to the diphenyl ether herbicide, oxyfluorfen, via expression of the Bacillus subtilis protoporphyrinogen oxidase gene in transgenic tobacco plants. Biosci Biotechnol Biochem 62:558-560.) Genes de resistência para ácidos piridinoxi ou fenoxi propriônicos e ciclohexonas incluem os genes codificantes do inibidor da ACCase (por exemplo, Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3). Genes exemplares que conferem resistência a ciclohexanodionas e/ou ao ácido ariloxifenoxipropanoico incluem haloxifop, diclofop, fenoxiprop, fluazifop e quizalofop. Finalmente, os herbicidas que podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina ou benzonitrila, adquirem tolerância pelos genes psbA (tolerância à triazina), genes 1s+ (tolerância à triazina) e pelos genes da nitrilase (tolerância à benzonitrila). A lista acima de genes de tolerância a herbicidas não pretende ser limitante. Qualquer um dos genes de tolerância a herbicidas estão englobados pela presente divulgação.

3. Características Agronômicas

[00112] Várias sequências codificantes de traços agronômicos podem estar operacionalmente ligadas ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Várias sequências codificantes de traços agronômicos podem estar operacionalmente ligadas ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. As sequência operacionalmente ligadas podem então ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Sequências de codificação de características agronômicas exemplares são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades de sequências de codificação de características agronômicas podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, as seguintes características são fornecidas. O amolecimento retardado de frutas conforme proporcionado pelos genes pg inibe a produção da enzima poligalacturonase responsável pela quebra das moléculas de pectina na parede celular e provoca, assim, o amolecimento retardado da fruta. Além disso, o amadurecimento/senescência retardada da fruta dos genes acc age para suprimir a expressão normal do gene nativo da acc sintase, resultando na redução da produção de etileno e no amadurecimento retardado da fruta. Enquanto isso, os genes accd metabolizam o precursor do hormônio de amadurecimento da fruta, resultando em um amadurecimento retardado da fruta. Alternativamente, os genes sam-k provocam o amadurecimento retardado através da redução da S-adenosilmetionina (SAM), um substrato para a produção de etileno. Fenótipos de tolerância de estresse pela seca, conforme proporcionado pelos genes cspB, mantêm as funções celulares normais sob condições de estresse por água através da preservação da estabilidade e tradução do RNA. Outro exemplo inclui os genes EcBetA que catalisam a produção do composto osmoprotetor, glicina betaína, que confere tolerância ao estresse por água. Além disso, os genes RmBetA catalisam a produção do compostos osmoprotetor, glicina betaína, que confere tolerância ao estresse por água. A intensificação da fotossíntese e do rendimento é proporcionada com o gene bbx32 que expressa uma proteína que interage com um ou mais fatores de transcrição endógenos para regular os processos fisiológicos do dia/noite da planta. A produção de etanol pode ser aumentada pela expressão dos genes amy797E que codificam uma enzima alfa-amilase termoestável que aumenta a produção de bioetanol através do aumento da termoestabilidade da amilase usada na degradação do amido. Finalmente, as composições modificadas de aminoácidos pode resultar pela expressão dos genes cordapA que codificam uma enzima dihidrodipicolinato sintase que aumenta a produção do aminoácido lisina. A lista acima de sequências de codificação de características agronômicas não pretende ser limitante. Qualquer sequência de codificação de característica agronômica está abrangida pela presente divulgação.

4. Proteínas de Ligação ao DNA

[00113] Várias sequências codificantes de proteínas de ligação ao DNA podem estar operacionalmente ligadas ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Várias sequências codificantes de proteínas de ligação ao DNA podem estar operacionalmente ligadas ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. As sequências operacionalmente ligadas podem então ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir a identificação e possibilidade de seleção de plantas transformadas ("transformantes"). As sequências de codificação de proteínas de ligação ao DNA são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades das sequências de codificação de proteínas de ligação ao DNA podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, os seguintes tipos de proteínas de ligação ao DNA podem incluir dedos de zinco, Talens, CRISPRS e meganucleases. A lista acima de sequências de codificação de proteínas de ligação ao DNA não se destina a ser limitante. Quaisquer sequências de codificação de proteínas de ligação ao DNA estão abrangidas pela presente divulgação.

5. Pequeno RNA

[00114] Vários pequenos RNAs podem estar operacionalmente ligados ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Vários pequenos RNAs podem estar operacionalmente ligados ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreendendo a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. As sequência operacionalmente ligadas podem então ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir a identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Características de pequenos RNAs exemplares são conhecidas na técnica. Uma vez que as modalidades de sequências de codificação de pequenos RNAs podem estar operacionalmente ligadas aos elementos reguladores do objeto da divulgação, as seguintes características são fornecidas. Por exemplo, o amadurecimento/senescência retardada da fruta do pequeno RNA anti-efe retarda o amadurecimento através da supressão da produção de etileno através do silenciamento do gene ACO que codifica uma enzima formadora de etileno. A produção alterada de lignina do pequeno RNA de ccomt reduz o teor de guanacil (G) lignina através da inibição da S- adenosil-L-metionina: trans-cafeoil CoA 3-O-metiltransferase endógena (gene CCOMT). Além disso, a tolerância ao esmagamento com mancha negra em Solanum verrucosum pode ser reduzida pelo pequeno RNA Ppo5 que desencadeia a degradação de transcritos de Ppo5 para impedir o desenvolvimento do esmagamento com mancha negra. Também está incluído o pequeno RNA dvsnf7 que inibe a larva da lagarta-da-raiz do milho com dsRNA contendo um fragmento de 240 bp do gene Snf7 da larva da lagarta-da-raiz do milho. Amido/carboidratos modificados podem resultar de pequenos RNAs, tal como o pequeno RNA pPhL (degrada os transcritos de PhL para limitar a formação de açúcares reduzidos através da degradação do amido) e o pequeno RNA pR1 (degrada os transcritos de R1 para limitar a formação de açúcares reduzidos através da degradação do amido). Adicionalmente, benefícios, tais como acrilamida reduzida, resultam do pequeno RNA asn1 que desencadeia a degradação de Asn1 para diminuir a formação de asparagina e reduzir a poliacrilamida. Finalmente, o fenótipo não escurecido do pequeno RNA de supressão pgas resulta na supressão de PPO para produzir maçãs com um fenótipo não escurecido. A lista acima de pequenos RNAs não se destina a ser limitante. Quaisquer sequências de codificação de pequeno RNA estão abrangidas pela presente divulgação.

6. Marcadores Selecionáveis

[00115] Vários marcadores selecionáveis também descritos como genes repórteres podem estar operacionalmente ligados ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. Vários marcadores selecionáveis também descritos como genes repórteres podem estar operacionalmente ligados ao promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1. As sequências operacionalmente ligadas podem então ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir a identificação e possibilidade de seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Muitos métodos estão disponíveis para confirmar a expressão de marcadores selecionáveis em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, sequenciamento de DNA e PCR (reação em cadeia da polimerase), Southern blotting, RNA blotting, métodos imunológicos para detecção de uma proteína expressa a partir do vetor. Mas, geralmente os genes repórter são observados através da observação visual de proteínas que, quando expressas, produzem um produto colorido. Genes repórter exemplares são conhecidos na técnica e codificam β-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarela fluorescente (YFP, Phi-YFP), proteína vermelha fluorescente (DsRFP, RFP, etc), β-galactosidase, e similares (ver Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, terceira edição, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, cujo conteúdo está incorporado integralmente neste documento por referência).

[00116] Genes de marcadores selecionáveis são utilizados para seleção de células ou tecidos transformados. Os genes de marcadores selecionáveis incluem genes que codificam resistência a antibióticos, tais como aqueles que codificam a neomicina fosfotransferase II (NEO), resistência à espectinomicina/estreptinomicina (AAD) e higromicina fosfotransferase (HPT ou HGR), bem como os genes que conferem resistência a compostos herbicidas. Os genes de resistência a herbicidas geralmente codificam uma proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou uma enzima que degrada ou desintoxica o herbicida na planta antes deste agir. Por exemplo, a resistência ao glifosato foi obtida através do uso de genes que codificam enzimas alvo mutantes, 5-enolpiruvilchiquimato-3- fosfato sintase (EPSPS). Os genes e mutantes para EPSPS são bem conhecidos, e descritos mais detalhadamente abaixo. A resistência ao glufosinato de amônio, bromoxinil e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida através do uso de genes bacterianos que codificam PAT ou DSM-2, uma nitrilase, uma AAD-1, ou uma AAD-12, cada uma das quais são exemplos de proteínas que desintoxicam seus respectivos herbicidas.

[00117] Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfonilureia, e os genes para resistência/tolerância da acetohidroxiácido sintase (AHAS) e acetolactato sintase (ALS) para esses herbicidas são bem conhecidos. Os genes de resistência ao glifosato incluem os genes mutantes da 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase (EPSPs) e dgt-28 (através da introdução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou diversas formas de mutagênese in vivo de genes EPSPs nativos), genes aroA e genes da glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente). Os genes de resistência para outros fosfono-compostos incluem os genes bar e pat das espécies Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes, e ácidos piridinoxi ou fenoxi propriônicos e ciclohexonas (genes codificantes do inibidor da ACCase). Os genes exemplares que conferem resistência às ciclohexanodionas e/ou ao ácido ariloxifenoxipropanoico (incluindo haloxifop, diclofop, fenoxiprop, fluazifop, quizalofop) incluem os genes da acetil coenzima A carboxilase (ACCase); Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3. Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene da nitrilase). Além disso, esses marcadores selecionáveis podem incluir marcadores de seleção positivos, tais como a enzima fosfomanose isomerase (PMI).

[00118] Em uma modalidade, os genes de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados aos genes que codificam: 2,4-D; neomicina fosfotransferase II; cianamida hidratase; aspartato quinase; dihidrodipicolinato sintase; triptofano descarboxilase; dihidrodipicolinato sintase e aspartato quinase dessensibilizada; gene bar; triptofano descarboxilase; neomicina fosfotransferase (NEO); higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG); dihidrofolato redutase (DHFR); fosfinotricina acetiltransferase; ácido 2,2-dicloropropiônico dehalogenase; acetohidroxiácido sintase; 5-enolpiruvilchiquimato-fosfato sintase (aroA); haloarilnitrilase; acetil-coenzima A carboxilase; dihidropteroato sintase (sul I); e polipeptídeo do fotossistema II de 32 kD (psbA). Uma modalidade também inclui os genes de marcadores selecionáveis que codificam a resistência a: cloranfenicol; metotrexato; higromicina; espectinomicina; bromoxinil; glifosato; e fosfinotricina. A lista acima de genes de marcadores selecionáveis não se destina a ser limitante. Qualquer gene repórter ou de marcador selecionável está abrangido pela presente divulgação.

[00119] Em algumas modalidades, as sequências de codificação são sintetizadas para a expressão ótima em uma planta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de codificação de um gene foi modificada por códon otimizado para intensificar a expressão em plantas. Um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência do uso de nitrogênio, um transgene de eficiência do uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, ou um transgene de marcador selecionável pode ser otimizado para a expressão em uma espécie específica de planta ou, alternativamente, pode ser modificado para a expressão ótima em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Os códons vegetais preferenciais podem ser determinados a partir dos códons de frequência mais alta nas proteínas expressas em maior quantidade, nas espécies vegetais específicas de interesse. Em uma modalidade, uma sequência de codificação, gene, ou transgene é manipulado para ser expresso em plantas em um maior nível, resultando em maior eficiência de transformação. Os métodos para a otimização de genes vegetais são bem conhecidos. Orientação em relação à otimização e produção de sequências sintéticas de DNA podem ser encontradas, por exemplo, em WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, Patente US n° 6166302, e Patente US n° 5380831, incorporadas neste documento por referência.

Transformação

[00120] Métodos adequados para transformação de plantas incluem qualquer método pelo qual o DNA possa ser introduzido em uma célula, por exemplo e sem limitação: eletroporação (ver, por exemplo, Patente U.S. 5.384.253); bombardeamento de microprojéteis (ver, por exemplo, Patentes U.S. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861, e 6.403.865); transformação mediada por Agrobacterium (ver, por exemplo, Patentes U.S. 5.635.055, 5.824.877, 5.591.616; 5.981.840, e 6.384.301); e transformação por protoplasto (ver, por exemplo, Patente U.S. 5.508.184).

[00121] Um construto de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula vegetal usando técnicas, tais como agitação com fibras de carbeto de silício (ver, por exemplo, Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765), ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido vegetal usando métodos biolísticos, tais como bombardeamento de partículas de DNA (ver, por exemplo, Klein et al. (1987) Nature 327:7073). Alternativamente, o construto de DNA pode ser introduzido na célula vegetal através de transformação de nanopartícula (ver, por exemplo, Publicação de Patente US n° 20090104700, que está incorporada integralmente neste documento por referência).

[00122] Além disso, a transferência de genes pode ser obtida usando bactérias não Agrobacterium ou vírus, tais como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus X da batata, vírus do mosaico da couve-flor e vírus do mosaico das nervuras da mandioca e/ou vírus do mosaico do tabaco, ver, por exemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4.

[00123] Através da aplicação de técnicas de transformação, as células de praticamente qualquer espécie vegetal podem ser transformadas de forma estável, e essas células podem ser desenvolvidas em plantas transgênicas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto de transformação de algodão são descritas nas Patente U.S. 5.846.797, 5.159.135, 5.004.863, e 6.624.344; técnicas para transformação de plantas Brassica em particular são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 5.750.871; técnicas para transformação de soja são descritas, por exemplo, na Patente U.S. 6.384.301; e técnicas para transformação de milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. 7.060.876 e 5.591.616, e Publicação PCT Internacional WO 95/06722.

[00124] Após a distribuição eficiente de um ácido nucleico exógeno a uma célula receptora, uma célula transformada é geralmente identificada para cultivo e regeneração de planta posteriores. A fim de melhorar a capacidade de identificar transformantes, pode-se desejar empregar um gene de marcador selecionável com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. Em uma modalidade ilustrativa, uma população de células transformadas pode ser avaliada através da exposição das células a um agente ou agentes seletivos, ou as células podem ser triadas para a característica do gene de marcador desejada.

[00125] As células que sobrevivem à exposição a um agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de triagem, podem ser cultivadas em meios que suportem a regeneração de plantas. Em uma modalidade, quaisquer meios de cultura de tecido vegetal adequados podem ser modificados pela inclusão de substâncias adicionais, tais como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar os esforços de regeneração da planta, ou seguindo rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), e, em seguida, transferidas para o meio condutor para a formação do broto. As culturas são transferidas periodicamente até que tenha ocorrido formação suficiente do broto. Uma vez que os brotos são formados, eles são transferidos para um meio condutor para a formação do broto. Uma vez que raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento e maturidade posteriores.

Confirmação Molecular

[00126] Uma célula vegetal transformada, calo, tecido ou planta pode ser identificado e isolado por seleção ou triagem do material vegetal manipulado para características codificadas pelos genes de marcador presentes no DNA transformador. Por exemplo, a seleção pode ser realizada através do cultivo do material vegetal manipulado no meio contendo uma quantidade inibitória do antibiótico ou herbicida ao qual o construto do gene de transformação confere resistência. Além disso, as plantas e células vegetais transformadas também podem ser identificadas através da triagem para atividades de quaisquer genes de marcador visíveis (por exemplo, os genes da β-glucuronidase, luciferase, ou gfp) que podem estar presentes nos construtos de ácido nucleico recombinante. Essas metodologias de seleção e triagem são bem conhecidas aos versados na técnica. Os métodos moleculares de confirmação que podem ser usados para identificar plantas transgênicas são conhecidos aos versados na técnica. Vários métodos exemplares são descritos em mais detalhes abaixo.

[00127] Sondas de hibridização moleculares ("molecular beacons") têm sido descritas para uso na detecção de sequências. Resumidamente, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada para se sobrepor à junção de DNA de inserto e genômico flanqueador. A estrutura exclusiva da sonda FRET resulta em ela conter uma estrutura secundária que mantém as frações fluorescente e supressora em estrita proximidade. A sonda FRET e primers de PCR (um primer na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica flanqueadora) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após a amplificação por PCR bem sucedida, a hibridização da(s) sonda(s) FRET na sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e na separação espacial das frações fluorescente e supressora. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserto genômico/transgene flanqueadora devido a amplificação e hibridação bem-sucedida. Tal um ensaio com sonda de hibridização molecular para detecção de como uma reação de amplificação é uma modalidade da divulgação de assunto.

[00128] Ensaio de sonda de hidrólise, também conhecido com TAQMAN® (Life Technologies, Foster City, Califórnia), é um método de detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Brevemente, uma sonda de oligonucleotídeo de FRET é projetada com um oligo dentro do transgene e uma na sequência genômica de flanqueamento para a detecção de eventos específicos. A sonda FRET e primers de PCR (um primer na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica flanqueadora) são ciclados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na clivagem e liberação da fração fluorescente longe da fração supressora na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserto genômico/flanqueadora devido a amplificação e hibridação bem-sucedida. Tal um ensaio com sonda de hidrolise para detecção de como uma reação de amplificação é uma modalidade da divulgação de assunto.

[00129] Os ensaios de KASPar® são um método de detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Brevemente, a amostra de DNA genômica compreendendo o polinucleotídeo de cassete de expressão gênica integrado é exibida usando um ensaio bom base em reação em cadeia de polimerase (PCR) conhecido como sistema de ensaio de KASPar®. O ensaio de KASPar® utilizado na prática da divulgação do assunto pode utilizar uma mistura de ensaio de PCR de KASPar® que contenha vários primers. Os primers utilizados na mistura de ensaio de PCR podem compreender em pelo menos um primer forward e pelo menos um primer reverse. O primer forward contém uma sequência correspondente a uma região específica do polinucleotídeo de DNA e o primer reverse contém uma sequência correspondente a uma região específica da sequência genômica. Além disso, os primers utilizados na mistura de ensaio de PCR podem compreender em pelo menos um primer forward e pelo menos um primer reverse. Por exemplo, o mistura de ensaio de PCR de KASPar® pode usar dois primers forward correspondente a dois alelos diferentes e um primer reverse. Um dos primers forward contém uma sequência correspondente a região específica da sequência genômica endógena. A segunda primer forward contém uma sequência correspondente a uma região específica do polinucleotídeo de DNA. Um primer reverse contém uma sequência correspondente a região específica da sequência genômica. Tal um ensaio de KASPar® para detecção de como uma reação de amplificação é uma modalidade da divulgação de assunto.

[00130] Em algumas modalidades o sinal fluorescente ou corante fluorescente é selecionado do grupo que consiste em um corante fluorescente HEX, um corante fluorescente FAM, um corante fluorescente JOE, um corante fluorescente TET, um corante fluorescente Cy 3, um corante fluorescente Cy 3.5, um corante fluorescente Cy 5, um corante fluorescente Cy 5.5, um corante fluorescente Cy 7 e um corante fluorescente ROX.

[00131] Em outras modalidades a reação de amplificação é executada usando os segundos corantes de DNA fluorescentes apropriados que são capazes de marcar o DNA celular em um intervalo de concentração detectável por citometria de fluxo e tem um espectro de emissão fluorescente que é detectável por um termociclador em tempo real. Esse deve ser apreciado por aqueles de conhecimento comum que outros corantes de ácidos nucleicos são conhecidos e estão continuamente sendo identificados. Qualquer corante de ácido nucleico apropriado com espectros de emissão e excitação apropriados podem ser empregados, tais como YO-PRO-1®, SYTOX Green®, SYBR Green I®, SYTO11®, SYTO12®, SYTO13®, BOBO®, YOYO® e TOTO®. Em uma modalidade, um segundo corante de DNA fluorescente é SYTO13® usado em menos de 10 μM, menos de 4 μM ou menos de 2,7 μM.

[00132] Em modalidades adicionais, Sequenciamento de Próxima Geração (Next Generation Sequencing - NGS) pode ser usado para a detecção. Conforme descrito por Brautigma et al., 2010, a análise de sequências de DNA pode ser usada para determinar a sequência nucleotídica do fragmento amplificado e isolado. Os fragmentos amplificados podem ser isolados e sub clonados em um vetor e sequenciado usando o método de terminador de cadeia (também conhecido como sequenciamento Sanger) ou sequenciamento de terminador de corante. Além disso, o amplicon pode ser sequenciado com o Sequenciamento de Próxima Geração. Tecnologias de NGS não exigem a etapa de sub clonagem e várias leituras de sequenciamento podem ser concluídas em uma única reação. Três plataformas de NGS estão comercialmente disponíveis, a Genome Sequencer FLX™ de 454 Life Sciences/Roche, o Illumina Genome Analyser™ de Solexa and Applied Biosystems’ SOLiD™ (acrônimo para: "Sequencing by Oligo Ligation and Detection"). Além disso, existem dois métodos de sequenciamento de molécula que atualmente estão sendo desenvolvidos. Isso inclui true Single Molecule Sequencing (tSMS) de Helicos Bioscience™ e sequenciamento Single Molecule Real Time™ (SMRT) de Pacific Biosciences.

[00133] Genome Sequencher FLX™ que é comercializado por 454 Life Sciences/Roche é um NGS de longa leitura, que usa a emulsão de PCR e pirossequenciamento para gerar leituras de sequenciamento. Os fragmentos de DNA de 300 - 800 bp ou bibliotecas contendo fragmentos de 3 - 20 kb podem ser usados. As reações podem produzir mais de um milhão de leituras de cerca de 250 a 400 bases por execução para um rendimento total de 250 a 400 megabases. Essa tecnologia produz as leituras mais longas, mas a saída total de sequência por execução é baixa em comparação a outras tecnologias de NGS.

[00134] Illumina Genome Analyser™ que é comercializada pela Solexa™ é uma leitura curta de NGS que usa o sequenciamento por síntese aproximar com nucleotídeos de terminador reversível marcado com corante fluorescente e baseia-se em PCR em fase sólida. A construção de bibliotecas de sequenciamento extremidades em pares contendo fragmentos de DNA de até 10 kb pode ser usada. As reações produzem mais 100 milhões leituras curtas que são 35 - 76 bases de comprimento. Esses dados podem produzir 3-6 gigabases por execução.

[00135] O sistema Sequencing by Oligo Ligation and Detection (SOLiD) comercializado pela Applied Biosystems™ é uma tecnologia de leitura curta. Essa tecnologia de NGS usa DNA de cadeia dupla fragmentado que são de até 10 kb de comprimento. O sistema usa o sequenciamento pela ligação de primers de oligonucleotídeo marcado com corante e PCR de emulsão para gerar um bilhão leituras curtas que resultam em uma saída de sequência total de até 30 gigabases por execução.

[00136] tSMS de Helicos Bioscience™ e SMRT de Pacific Biosciences™ aplicar uma abordagem diferente que utiliza as moléculas de DNA única para as reações de sequência. O sistema de tSMS Helicos™ produz até 800 milhões leituras curtas que resultam em 21 gigabases por execução. Essas reações são concluídas usando nucleotídeos de terminador virtual marcado com corante fluorescente que são descritas como uma abordagem de "sequenciamento por síntese".

[00137] O sistema de SMRT Next Generation Sequencing comercializado pela Pacific Biosciences™ usa uma sequência em tempo real por síntese. Essa tecnologia pode produzir leituras de até 1.000 bp de comprimento como resultado de não ser limitada por terminadores reversíveis. O rendimento de leitura bruta que é equivalente uma cobertura de uma dobra de um genoma humano diploide pode ser produzido por dia usando essa tecnologia.

[00138] Em outra modalidade, a detecção pode ser concluída usando a ensaios de blotting, incluindo Western blots, Northern blots e Southern blots. Tais ensaios de blotting são técnicas comumente utilizadas em pesquisas biológicas para a identificação e a quantificação de amostras biológicas. Esses ensaios incluem primeiro separar os componentes de amostra em géis por eletroforese, seguido pela transferência dos componentes eletroforeticamente separados dos géis para transferir as membranas que são feitas de materiais como nylon, fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou nitrocelulose. Analitos também podem ser diretamente localizados sobre esses suportes ou direcionados às regiões específicas nos suportes, aplicando-se vácuo, ação capilar ou pressão, sem prévia separação. As membranas de transferência são comumente submetidas a um tratamento após a transferência para aumentar a capacidade dos analitos sejam distinguidos uns dos outros e detectadas, visualmente ou por leitores automatizados.

[00139] Em uma modalidade adicional a detecção pode ser concluída usando um ensaio de ELISA, que usa um imunoensaio enzimático de fase sólida para detectar a presença de uma substância, geralmente um antígeno, em uma amostra de líquido ou amostra molhada. Os antígenos da amostra estão ligados a uma superfície de uma placa. Em seguida, um anticorpo específico adicional é aplicado sobre a superfície, então, pode ligar ao antígeno. Esse anticorpo é ligado a uma enzima e, na etapa final, uma substância que contém substrato da enzima é adicionada. A reação subsequente produz um sinal detectável, mais comumente, uma mudança de cor no substrato.

Plantas Transgênicas

[00140] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal compreende um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl). Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal compreende o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) de uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal compreende o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) de uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal compreende a 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que compreende uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3 ou uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3. Em outra modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal compreende a 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) que compreende uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal compreende um cassete de expressão gênica compreendendo uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1, ou uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1 que está operacionalmente ligada a um transgene não tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal compreende um cassete de expressão gênica compreendendo uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1, ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1 que está operacionalmente ligada a um transgene não tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal compreende um cassete de expressão gênica compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon que está operacionalmente ligado a um transgene, em que o transgene pode ser um transgene de resistência a inseticidas, um transgene de tolerância a herbicidas, um transgene de eficiência do uso de nitrogênio, um transgene de eficiência do uso de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação ao DNA, um transgene de marcador selecionável, ou combinações dos mesmos.

[00141] De acordo com uma modalidade, é fornecida uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal, em que a planta, tecido vegetal, ou célula vegetal compreende uma sequência promotora derivada do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligada a um transgene, em que a sequência promotora derivada do promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) compreende a sequência SEQ ID NO:1, ou uma sequência com 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta ou célula vegetal é fornecida em que a planta, tecido de planta ou célula vegetal compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 operacionalmente ligada a um transgene não tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon. Em uma modalidade, uma planta, tecido de planta ou célula vegetal é fornecida em que a planta, tecido de planta ou célula vegetal compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 1 operacionalmente ligada a um transgene não tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon. Em uma modalidade, a planta, tecido de planta ou célula vegetal é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea ou uma célula ou tecido derivado de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana-de-açúcar, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. De acordo com uma modalidade da planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a um transgene não tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. De acordo com uma modalidade da planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1 operacionalmente ligada a um transgene não tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon. Em uma modalidade da planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um promotor ligado operacionalmente a um transgene em que o promotor consiste em SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo 80%, 85%, 90%, 99,5% ou 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1. Em uma modalidade da planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende um promotor ligado operacionalmente a um transgene em que o promotor consiste em SEQ ID NO: 1, ou uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1. De acordo com uma modalidade, o construto gênico que compreende a sequência promotora derivada do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon operacionalmente ligada a um transgene está incorporado no genoma da planta, tecido vegetal ou célula vegetal.

[00142] Em uma modalidade, é fornecida uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal diferente de Brachypodium que compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, ligado operacionalmente a um transgene. Em uma modalidade, é fornecida uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal diferente de Brachypodium que compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1, operacionalmente ligada a um transgene. De acordo com uma modalidade, a planta, tecido vegetal ou célula vegetal diferente de Brachypodium é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea ou célula ou tecido vegetal derivado de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana-de-açúcar, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. De acordo com uma modalidade a sequência de promotor ligado operacionalmente a um transgene é incorporado no genoma da planta, tecido vegetal ou célula vegetal.

[00143] Em uma modalidade, é fornecida uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal diferente de Brachypodium que compreende a SEQ ID NO: 1, ou uma sequência que tenha pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1, operativamente ligada à extremidade 5' de um transgene e uma sequência não traduzida 3' compreendendo a SEQ ID NO: 3, ou uma sequência que tenha pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com SEQ ID NO:3, em que a sequência não traduzida 3' está operacionalmente ligada ao referido transgene. De acordo com uma modalidade, a planta, tecido vegetal ou célula vegetal diferente de Brachypodium é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea ou é uma célula ou tecido vegetal derivado de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada a partir do grupo que consiste em milho, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana-de-açúcar, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. De acordo com uma modalidade a sequência de promotor ligado operacionalmente a um transgene é incorporado no genoma da planta, tecido vegetal ou célula vegetal.

[00144] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal, de acordo com os métodos divulgados neste documento pode ser uma planta monocotiledônea. A planta monocotiledônea, o tecido vegetal ou a célula vegetal pode ser, mas não se limitando a, milho, arroz, trigo, cana, cevada, centeio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, tifáceas, lírios, aveia, cebola, painço, switchgrass, relva e triticale.

[00145] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal, de acordo com os métodos divulgados neste documento pode ser uma planta dicotiledônea. A planta, tecido vegetal ou célula vegetal de dicotiledônea podem ser, mas não estão limitados a, alfafa, colza, canola, mostarda indiana, mostarda etíope, soja, girassol, algodão, feijão, brócolis, repolho, couve-flor, aipo, pepino, berinjela, alface; melão, ervilha, pimenta, amendoim, batata, abóbora, rabanete, espinafre, beterraba, girassol, tabaco, tomate e melancia.

[00146] Um versado na técnica irá reconhecer que depois que a sequência exógena estável é incorporada de forma estável em plantas transgênicas e confirmada como sendo operável, pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer um de um número de técnicas de reprodução padrão pode ser usado, dependendo da espécie a ser atravessada.

[00147] A presente divulgação também abrange sementes das plantas transgênicas descritos acima, em que as sementes têm o transgene ou construto de gene contendo os elementos reguladores de gene da divulgação de assunto. A presente divulgação engloba ainda progênie, clones, linhas celulares ou células das plantas transgênicas descritas acima, em que a referida progênie, clone, linha celular ou célula tem o transgene ou o construto de gene contendo os elementos reguladores de gene da divulgação de assunto.

[00148] A presente divulgação também abrange o cultivo de plantas transgênicas descritos acima, em que as plantas transgênicas tem o transgene ou construto de gene contendo os elementos reguladores de gene da divulgação de assunto. Por conseguinte, tais plantas transgênicas podem ser projetadas para, inter alia, terem um ou mais traços desejados ou eventos transgênicos contendo os elementos reguladores de gene da divulgação de assunto, sendo transformadas com moléculas de ácido nucleico de acordo com a invenção e podem ser colhidas ou cultivadas por qualquer método conhecido para aqueles versados na técnica.

Método de Expressão de um Transgene

[00149] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o cultivo de uma planta compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) e operacionalmente ligado a pelo menos um transgene ou a uma sequência de poliligante. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o cultivo de uma planta compreendendo uma 3’-UTR do promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene ou a uma sequência de poliligante. Em uma modalidade, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste em uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, a 3’- UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste em uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3 ou uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o cultivo de uma planta compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) e uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligada ao pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um promotor e uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligados a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) e uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligada ao pelo menos um transgene.

[00150] Em uma modalidade, um método de expressão em pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão gênica que compreende um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste em uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste em uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:1. Em outra modalidade, a 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste em uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3 ou uma sequência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3. Em outra modalidade, a 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) consiste em uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada da SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta compreende o cultivo de uma planta compreendendo um cassete de expressão gênico compreendendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) e uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligada ao pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão em pelo menos um transgene em uma planta compreende cultivar uma planta que compreende um cassete de expressão gênica que compreende uma 3’- UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão gênica contendo um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligado a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão gênica contendo uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl)operacionalmente ligada a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende o cultivo de um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo um cassete de expressão gênica, um promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) e uma 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) operacionalmente ligada ao pelo menos um transgene.

[00151] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar certas particularidades e/ou modalidades. Os exemplos não devem ser interpretados para limitar a divulgação para as particularidades ou modalidades exemplificadas.

EXEMPLOS Exemplo 1: Um promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl)

[00152] O promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) (SEQ ID NO:1) tem uma sequência polinucleotídica de 2.000 bp que foi identificada a partir da sequência de DNA genômico (gDNA) de Brachypodium distachyon. A sequência promotora foi identificada pelo BLASTing, o banco de dados Phytozome (Goodstein et al., 2012) com um gene tipo metalotioneína de Zea mays (mtl). Os hits resultantes foram analisados e uma única sequência codificante foi selecionada para análise posterior. A partir da avaliação da sequência cromossômica contígua que abrangeu milhões de pares de bases, uma sequência polinucleotídica de 2.000 bp foi identificada e isolada para uso na expressão de sequências codificantes heterólogas. Essa sequência de polinucleotídeo inovadora foi analisada para uso como uma sequência reguladora para direcionar a expressão de um gene. Como mostrado na sequência (SEQ ID NO:2) abaixo, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) de 2.000 bp da SEQ ID NO:1 é fornecido como os pares de base 1 - 2.000. A sequência codificante do gene de mtl nativo da SEQ ID NO:6 é fornecida como os pares de base 2.001 - 2.345. A 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) de 1.002 bp da SEQ ID NO:3 é fornecida como os pares de base 2.346 - 3.347. Nesse sentido, a SEQ ID NO:2 é fornecida como:

[00153] tttcgtgtgcttacttggggcttcctttgggcctgcggaagcagacggcgtgccagc tgagaccgttggtggacaatgtggatggacgtctagcttcgtggaaggcccttctcctttccaagggag gatgactggtgctggtcaagtccaccctgacagcgatgccggtctactcgatgatgtcactcgaccttt cggacaagatcatcaaaggggtggacaagatctgtcgtggtttcctttggcgtggtcagaaggacgct aaaggggggggggcattgtatggtggcttgggtcgtggtgtgttcgccgaagcctttcggtggactcg gaattccaaatcttcgcatgctcaacgaggccttgagggtccgctagaggtggcttgagagggtgga cgattccaaaccatgggtcggtttcaaggttgagacgcccagaggtctatgttatctttgaggcggcca cttcctctttggtgggcgatggccggaagaccctcttctggaccgatcgttggctgcatggcgtctgttttc gagatgcgttcctgatcctcgtgggccatgtttgccacaagtttttgcgcacgcgcacagtgcgggagg ctctgcatggagcgtggactggcgacatgggtccagacctaaagggaagctactcttgaggagttcc tcactctctgggactggcttcgtggggtccaactggaagaagggagggccgactctcttcattggaact ggtctcgtggtgatagttactcggcaaagactgcttatgcgaatctcttcactggccgcatggttgaccc gttagcggctgagatctagggcttcggagaggtgtcgtttcttcgtctggctcgcagttcgaaatagatg ctagacggcggatcgcttgcgaggcgtgggcttccccaccctgacaagtgtcaggagatggagacc atttcccatctactcttggggtgtgtcttggcgaggcaggtttgggagcgcttgtgggcggcttggggac acgtggagtgggctccgaatgcggatgctactctgcgggaatggtggtcttctcttcccttaccacggc gagcccggagggacttccggacggggatcatacttgttctttggaccatttggtgccattggaatgatgt ggccttccttgcagcttgtcgtgcttcgcctccaggaggagtttggtcggtgggcgcacgccggcctcttt aggggtagagtgtctattccagccttgatggtgagtggttggatagctagcacatagtctttttttctctttctt gccacttggtgatgttgtattgccgcttcggcgttgtactagccttctggctcttcttatttaatcgatgatgca cccgctgggtggcattcttgaaatttttttgagaaaatactcctacaaaggaagtacagtaatttgataca caatgctttctctaaatacgaaaatacaaacatcctaatgttattccaactatgctactccctccgttccta aactcttatctttgtttttgttcaaatttgtaccaaacaacgacaaaaatttagtaacggaggaagtatata tacgaagtgataccaaataaggtgtttctttacttgaaagctagttcctctgaggtaaaagaaatgatga ggatcaaggaaggcccatttcttgccggcacgcagttgccgaagtcagtagatttaaaatgacctcac atactgaagaaggaaagggaagttaaccacgccattgttgctttagcagaaagcaaccatatcctaa ttaacatcacagtacacgttgaaacggcagggcacgataattggtgaagactgattccagggagcat cgtggcacgcaaaaacgcccttgccttgttcccttataaatagtggtgcagaagatacatttgtgatcac catctcaaagcgcctctttattcccctttcatcttgagcttaagtactagagaaaaattaaggatgtcttgc agctgtggatctggatgcagctgcggctcaaactgcacctgcgggtatgtatagatgcttaattctgtgtt gcagattactacgtagctgctaataccatctaagtaatgacaatgctttctcatgatgatcaattttcatttg ctgtgtggttcagcaagatgtaccctgacttggcagagaagagcggcggcacccagcaggccacc accatgatcctcggcgttgcgcctgctaaggcccagtttgaggaggccgccgagtccggtgaggcc ggccatggctgcagctgcggcgccaactgcaagtgcgacccgtgcaactgctaagatgcacgcga cgcgctgctgcttgtggtgtgtgtttgtgtgatctcgactgaataaaagggacacggtacatccggggtt ggttggtgctcgagtcgagtgtgcaaggttgtgtggtttgccagctcttggtgtgtgtctccttgtgctcatgt gacttgtgaaaccattaatagtaaccactttgtgcttgtgtgtgtgtgggcacctgtgtttctgtaatggtcta tctggagtgaatatatacaagacaggtttgcctaaccatgccttttccttccttgaggtcatcgcgccaac acgaatgacgagaaccaatgatcttaggactatcaaatagacaatataactcagcatggagcaatgt actgctaatgaacggtcctaatcaatacagttgggaagcagtaatcgatggaaaacacttcctcagtt cagaagggaacatgtagatgggaaagtaaacaggatatatagacacatgcagttaggtctaccac aagaagacatgccacaggactaaaaacagaagctgggtttggaacaacttatgcagacgctagct atccagataaaccttagagaaacagctatgagaataagcgtctgaaatttgtagttgcctgtttggaat ggcttatggacgacaagcttattttctggagtagcctacaagtacaagccaaggcacatgctgttcca aactggcccatattttgcacaaccaaaggaaaagagacagtgacataagagcatctccagtgattc agtgagataccccaaagtcatccaaatgtccgtttcggccgaaatggacatgctggccagaaaaac atctcccaatgggttaccccaaatagatattttgtatgttttgtccggcccaatccccaaacatctcctaa atttggggcaactttgcggtgtccagtgtccggtgtccgggcccacttctttttctcccaagcgagcatctt cctcccgaagcacgaagcccccgtc

Exemplo 2: Construção de vetor

[00154] Os seguintes vetores foram construídos para incorporar o promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) a montante de um transgene. O construto do vetor pDAB120419 continha um cassete de expressão gênica, no qual o transgene phi-yfp (proteína amarela fluorescente Phi; Clontech, Mountain View, CA) foi acionado pelo promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:1 e flanqueado pela 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:3. Um diagrama desse cassete de expressão gênica é mostrado na Figura 1 e é fornecido como a SEQ ID NO:4. O vetor também continha um cassete de expressão gênica de marcador selecionável que continha o transgene de aad-1 (Pat. n° U.S. 7.838.733) conduzido pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689) e foi terminado por 3'-UTR de Zea mays Lipase (Pat. n° U.S. 7.179.902). Um diagrama desse cassete de expressão gênica é mostrado na Figura 1 e é fornecido como a SEQ ID NO:5. Este construto foi construído através da síntese do promotor recém projetado a partir de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon por um fornecedor externo (Geneart via Life Technologies, Carlsbad, CA), e clonagem do promotor em um vetor doador Gateway™ (Life Technologies) usando o Seamless Cloning and Assembly Kit da GeneArt® (Life technologies) e enzimas de restrição. O vetor de doador resultante foi integrado em um vetor de destino binário final usando o sistema de clonagem de Gateway™ (Life Technologies). Os clones de pDAB120419 foram obtidos e confirmados através de digestões com enzima de restrição e sequenciamento. O construto resultante continha um promotor que robustamente poderia conduzir a expressão de um transgene que estava operacionalmente ligado à extremidade 3' do promotor.

Exemplo 3: Elementos Reguladores Modificados do Gene tipo Metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl)

[00155] O promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) de 2.000 bp da SEQ ID NO:1 foi modificado, fazendo-se alterações na sequência promotora. Uma nova variante foi projetada e é fornecida como a SEQ ID NO:12. Um alinhamento comparando o promotor modificado do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:1 e o promotor modificado do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:12 é fornecido na Figura 3. Como mostrado na Figura 3, as sequências polinucleotídicas do promotor da SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:12 compartilham 97,2% de identidade de sequência. Neste documento são fornecidas novas sequências promotoras que se originam dos promotores do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, a nova sequência polinucleotídica do promotor da SEQ ID NO:12 pode ser usada em um cassete de expressão gênica para conduzir a expressão de transgenes. Em outro aspecto desta modalidade, a nova sequência polinucleotídica do promotor da SEQ ID NO:12 pode ser operacionalmente ligada a uma 3’-UTR, por exemplo, a 3’-UTR da SEQ ID NO:3, e pode ser usada em um cassete de expressão gênica para conduzir a expressão de transgenes.

[00156] A 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) de 1.002 bp da SEQ ID NO:3 foi modificada, fazendo-se alterações na sequência 3’-UTR. Novas variantes foram projetadas e fornecidas como a SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18. Um alinhamento comparando a 3’-UTR modificada do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:3 e as 3’-UTRs modificadas do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18 é fornecido na Figura 5. Como mostrado na Figura 5, as sequências polinucleotídicas da 3’-UTR da SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:17 compartilham 94,2% de identidade de sequência. Representadas na Figura 5, estão as sequências polinucleotídicas da 3’-UTR da SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:18 que compartilham 97,5% de identidade de sequência. Finalmente, a Figura 5 apresenta as sequências polinucleotídicas da 3’-UTR da SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:17 que compartilham 92,7% de identidade de sequência. Neste documento é fornecida uma nova sequência 3’-UTR que se origina da 3’-UTR do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) da SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, a nova sequência polinucleotídica 3’-UTR da SEQ ID NO:17 pode ser usada em um cassete de expressão gênica para finalizar a expressão de transgenes. Em outro aspecto desta modalidade, a nova sequência polinucleotídica 3’-UTR da SEQ ID NO:17 pode ser operacionalmente ligada a um transgene acionado por um promotor, por exemplo, o promotor da SEQ ID NO:1, e pode ser usada em um cassete de expressão gênica para conduzir a expressão de transgenes. Em outra modalidade, a nova sequência polinucleotídica 3’- UTR da SEQ ID NO:18 pode ser usada em um cassete de expressão gênica para finalizar a expressão de transgenes. Em outro aspecto desta modalidade, a nova sequência polinucleotídica 3’-UTR da SEQ ID NO:18 pode ser operacionalmente ligada a um transgene acionado por um promotor, por exemplo, o promotor da SEQ ID NO:1, e pode ser usada em um cassete de expressão gênica para conduzir a expressão de transgenes.

Exemplo 4: Transformação de Milho Transformação de Agrobacterium tumefaciens:

[00157] O vetor de expressão binário foi transformado em cepa de Agrobacterium tumefacien DAt13192 (cepa ternária deficiente de RecA) (Pat. Pub. Int. n° WO2012016222). As colônias bacterianas foram selecionadas e DNA de plasmídeo binário foi isolado e confirmado através da digestão da enzima de restrição.

Iniciação de Cultura de Agrobacterium:

[00158] As culturas de Agrobacterium foram riscadas a partir de estoques de glicerol em meio mínimo AB (Gelvin, S., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, em Wang, K., ed., Agrobacterium Protocols Segunda Edição Vol. 1, Humana Press, p. 79; feito sem sacarose e com 5 g/L de glicose e 15 g/L de ágar Bacto™) e incubadas a 20 °C no escuro por 3 dias. As culturas de Agrobacterium foram, então, listradas em uma placa de meio YEP (Gelvin, s., 2006, Agrobacterium Virulence Gene Induction, em Wang, K., ed. Agrobacterium Protocols Segunda Edição Vol. 1, Humana Press, pág. 79) e incubadas a 20 °C no escuro por 1 dia.

[00159] No dia de um experimento, uma mistura de meio de inoculação (2,2 g/L de sais de MS, 68,4 g/L de sacarose, 36 g/L de glucose, 115 mg/L de L-prolina, 2 mg/L de glicina, 100 mg/L de Mio- Inositol, 0,05 mg/L de ácido nicotínico, 0,5 mg/L piridoxina HCl, 0,5 mg/L de tiamina HCl) e acetosiringona foi preparada em um volume apropriado para o tamanho do experimento. Uma solução mãe a 1 M de acetosiringona em 100% de dimetilsulfóxido foi adicionada ao meio de inoculação, para tornar uma concentração final de acetosiringona de 200 μM.

[00160] Para cada construto, 1-2 ciclos de Agrobacterium da placa YEP foram suspensos em 15 ml da mistura de acetosiringona/meio de inoculação dentro um tubo de centrifugar de 50 ml estéril e descartável e a densidade óptica da solução em 600 nm (O.D.600) foi medido em um espectrofotômetro. A suspensão foi, então, diluída até 0,25-0,35 O.D.600 usando a meio de inoculação/mistura de acetosiringona adicional. O tubo da suspensão de Agrobacterium foi, então, colocado horizontalmente em uma agitador de plataforma configurado para cerca de 75 rpm a temperatura ambiente por entre 1 e 4 horas antes do uso.

Transformação de Milho:

[00161] Os construtos experimentais foram transformados em milho através de transformação mediada por Agrobacterium dos embriões imaturos isolados da linha pura, Zea mays c.v. B104. O método usado é semelhante àqueles publicados por Ishida et al., (1996) Nature Biotechnol 14:745-750 e Frame et al., (2006) Plant Cell Rep 25: 10241034, mas com várias modificações e melhorias para tornar o método passível de transformação de alta produtividade. Um exemplo de um método usado para produzir um número de eventos transgênicos no milho é dada na Publicação de Pedido de Patente U.S. n° US 2013/0157369 A1, começando com as etapas de infecção e co-cultivo de embriões.

[00162] As plântulas transgênicas T0 putativas foram transplantadas de Phytatrays™ (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO) para pequenos potes de plásticos de 3.5" (T. O. Plastics ; Clearwater, MN) preenchido com meio de crescimento (Premix BX; Premier Tech Horticulture), coberto com humidomas (Arco Plastics Ltd.) e, então, endurecido em uma sala de crescimento (28 °C dia/24 °C noite, fotoperíodo de 16 horas, 50-70% RH, 200 μEm-2 seg-1 de intensidade luminosa). Quando as plantas atingiram o estágio de desenvolvimento V3-V4 (3-4 colares de folhas visíveis), as mesmas foram transplantadas numa mistura de solo Sunshine Custom Blend 160 e cultivadas para florescerem na estufa (Tipo de exposição de luz: foto ou assimilação; Limite de luz alto: 1200 PAR; duração de 16 horas por dia; 27 °C dia/24 °C noite). As plantas foram analisadas para número de cópia de transgene através de ensaios qPCR usando primers projetados para detectar os números de cópias relativos dos transgenes e eventos de cópia única putativos selecionados para o avanço foram transplantados para potes de 5 galões.

Exemplo 5: Confirmação Molecular do Número de Cópias

[00163] A integração estável do transgene phi-yfp com o genoma das plantas Z. mays transgênicas foi confirmada através de um ensaio com sondas de hidrólise. Plântulas Z. mays transgênicas estavelmente transformadas que se desenvolveram a partir de calos foram obtidas e analisadas para identificar eventos que continham um baixo número de cópias (1-2 cópias) de inserções de fita T de comprimento total. As plântulas identificadas foram encaminhadas para a estufa e cultivadas.

[00164] O sistema Roche Light Cycler480™ foi usado para determinar o número de cópias de transgene. O método utilizou uma reação biplex TaqMan® que empregou oligonucleotídeos específicos ao gene phi-yfp e ao gene de referência endógeno de Z. mays, invertase (Genbank n° de acesso: U16123.1), em um único ensaio. O número de cópias e a zigosidade foram determinados através da medição da intensidade da fluorescência específica de phi-yfp, em relação à fluorescência específica da invertase, em comparação aos padrões conhecidos de número de cópias.

[00165] Um fragmento de DNA específico do gene phi-yfp foi amplificado com um conjunto de primer/sonda TaqMan® contendo uma sonda marcada com corante fluorescente FAM™, e a invertase foi amplificada com um segundo conjunto de primer/sonda TaqMan® contendo uma sonda marcada com fluorescência HEX™. O número de cópias e a zigosidade das amostras foram determinados através da medição da intensidade relativa da fluorescência específica para o gene repórter phi-yfp, em relação à fluorescência específica para o e gene de referência, invertase, em comparação aos padrões conhecidos de número de cópias.

Exemplo 6: Confirmação Molecular da Expressão de Proteína Extração de proteína:

[00166] Placas Maxi-Sorp de 96 poços Nunc® (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) foram usadas para o ELISA. As placas foram revestidas com anticorpo de captura monoclonal anti Phi-YFP (OriGene Technologies Inc., Rockville, MD). O anticorpo foi diluído em PBS (1 μg/mL) e 150 μL de PBS diluído foram adicionados por poço. As placas foram incubadas durante a noite a 4°C. As placas foram mantidas em temperatura ambiente por 20-30 minutos antes de lavar 4X com 350 μL de tampão de lavagem [1X PBS complementado com 0,05% Tween®-20 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)]. Em seguida, as placas foram bloqueadas com 200 μL por poço de tampão de bloqueio [1X PBS complementado com 0,05% Tween®-20 mais 0,5% BSA (Millipore Probumin®)] por um mínimo de 1 hr a +37°C seguido por lavagem 4X com 350 μL de tampão de lavagem (Tomtec QuadraWash™ 2, Tomtec, Inc., Hamden, CT).

[00167] Para o ELISA com Phi-YFP, Phi-YFP recombinante Evrogen 1mg/mL (Axxora LLC, Farmingdale, NY) foi usado como padrão. Uma curva padrão de ajuste de 5 parâmetros (entre os padrões de 1 ng/ml e 0,125 ng/ml) foi usada para garantir que todos os dados estivessem dentro da porção linear da curva. Em seguida, 100 μL de padrão ou amostra foram adicionados ao poço. Uma diluição mínima de 1:4 de amostra no Tampão de Ensaio foi usada. As placas foram incubadas por 1 hora em RT no agitador de placas (250 rpm; agitador Titer Plate) seguido por lavagem 4X com 350 μL de tampão de lavagem (Tomtec QuadraWash™ 2). Cerca de 100 μL de 1 μg/mL de anticorpo primário policlonal de coelho anti Phi-YFP de Evrogen (Axxora) foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador de placas a 250 rpm seguido por lavagem 4X com 350 μL de tampão de lavagem (Tomtec QuadraWash™ 2). Em seguida, 100 μL de anticorpo secundário IgG anti-coelho HRP (Thermo Scientific) foram diluídos 1:5000 em tampão de bloqueio/ensaio, o qual foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente no agitador de placas a 250 rpm seguido por lavagem 4X com 350 μL de tampão de lavagem (Tomtec QuadraWash™ 2). Em seguida, 100 μL do substrato Pierce 1 Step Ultra TMB ELISA™ (Thermo Scientific) foram adicionados ao poço com agitação suave por 10 minutos. A reação foi interrompida através da adição de 50 μL de 0,4N H2SO4. A absorbância foi lida em 450 nm com um filtro de referência de 650 nm.

[00168] Os níveis de expressão de Phi-YFP foram determinados por ELISAs usando kits da Acadia BioSciences (Portland, ME). Os ELISAs foram realizados usando múltiplas diluições dos extratos e usando os reagentes e instruções fornecidos pelo fornecedor. Os níveis de proteína foram normalizados usando um ensaio de proteína solúvel total, realizado usando o reagente de ensaio de proteína de 660 nm fornecido pela Thermo Scientific e seguindo-se as instruções do fornecedor.

Exemplo 7: Expressão de Genes Operacionalmente Ligados ao Promotor de um Gene tipo Metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl)

[00169] Plantas de milho foram transformadas com um construto de expressão gênica que continha o promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl), como descrito acima. A análise do ELISA confirmou que o novo promotor conduziu a expressão forte de um transgene. As medições quantitativas da proteína Phi-YFP obtidas de plantas transgênicas compreendendo novos construtos de promotor são mostrados na TABELA 1. Os dados mostram que a proteína Phi-YFP nas plantas contendo o novo promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) (isto é, pDAB120419) é maior expressa preferencialmente no tecido radicular em comparação ao tecido foliar. TABELA 1: Expressão T0 do Promotor MTL de B. distachyon de Phi-YFP e AAD1

[00170] Plantas de cópia de transgene únicas T0 contendo um evento transgênico pDAB120419 estavelmente integrado foram retrocruzadas com plantas de milho do tipo selvagem B104 para obter sementes T1 que foram cultivadas até plantas maduras. A partir dessas plantas maduras, plantas T1 hemizigóticas foram usadas para análise para determinar a expressão da proteína AAD1 e Phi-YFP. Cinco eventos por construto e dez plantas por evento foram usadas para a análise de expressão de proteína. Três eventos por construto e três a cinco plantas por evento foram usadas para expressão de outro tipo de tecido. A análise da zigosidade foi feita para Phi-YFP e AAD1. As medições do ELISA quantitativo da proteína Phi-YFP e AAD1 obtidas de diferentes tipos de tecido, incluindo tecido de folhas, sabugo, casca, pólen, raiz, cabelo e caule de plantas transgênicas T1 compreendendo novos construtos de promotor são mostradas na TABELA 2. Os dados confirmaram os resultados da expressão de T0 nas folhas e mostraram ainda que foi obtida uma alta expressão consistente da proteína Phi-YFP primariamente nos tecidos radiculares das plantas contendo o novo promotor (pDAB120419). Esses dados demonstram que o novo promotor aqui ilustrado conduz a expressão preferencial do transgene nas raízes nas plantas, e que este perfil de expressão é capaz de ser herdado de uma primeira geração para uma segunda geração. Nesse sentido, o promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) é útil para aplicações biotecnológicas.TABELA 2: Expressão de proteína em diferentes tipos de tecidos de plantas de milho transgênicas

[00171] Os resultados do ELISA de Phi-YFP indicaram que o elemento regulador de promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) (SEQ ID NO:1) conduziu a expressão preferencial em tecidos abaixo do solo, especificamente nos tecidos radiculares, de Phi-YFP em eventos T0 que foram transformados com o construto, pDAB120419. A expressão insignificante de Phi-YFP pelo elemento regulador de promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl)foi observada nos tecidos foliares desses eventos (TABELA 1 e TABELA 2). Os eventos produzidos a partir da transformação também expressaram a proteína AAD1 nos tecidos foliares e radiculares. A expressão de AAD1 nesses eventos serviu como um controle para comparar os níveis de expressão de Phi-YFP em diferentes tecidos. Em resumo, o promotor do gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) foi desenvolvido para a expressão forte de transgenes em tecidos abaixo do solo em espécies de planta, como o milho.

Exemplo 8: Transformação de Colheita de Genes Operacionalmente Ligados ao Promotor de um Gene tipo Metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl)

[00172] A soja pode ser transformada com genes operacionalmente ligados ao promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) através da utilização das mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo #11 ou Exemplo #13 do pedido de patente WO 2007/053482.

[00173] O algodão pode ser transformado com genes operacionalmente ligados ao promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) através da utilização das mesmas técnicas descritas anteriormente nos Exemplos #14 da Patente U.S. n° 7.838.733 ou Exemplo #12 do pedido de patente WO 2007/053482 (Wright et al.).

[00174] A canola pode ser transformada com genes operacionalmente ligados ao promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) através da utilização das mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo #26 da Patente U.S. n° 7.838.733 ou Exemplo #22 do pedido de patente WO 2007/053482 (Wright et al.).

[00175] O trigo pode ser transformado com genes operacionalmente ligados ao promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) através da utilização das mesmas técnicas descritas anteriormente nos Exemplos #23 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.).

[00176] O arroz pode ser transformado com genes operacionalmente ligados ao promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) através da utilização das mesmas técnicas descritas anteriormente no Exemplo #19 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.).

Exemplo 9: Transformação Mediada por Agrobacterium de Genes Operacionalmente Ligados ao Promotor de um Gene tipo Metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl)

[00177] À luz da divulgação do assunto, as culturas adicionais podem ser transformadas de acordo com modalidades da divulgação de assunto usando técnicas que são conhecidas na técnica. Para transformação mediada por Agrobacterium de centeio, consultar, por exemplo, Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye", Transgenic Res. Outubro de 2003;12(5):587-96.). Para transformação mediada por Agrobacterium de sorgo, consultar, por exemplo, Zhao et al., “ Agrobacterium-mediated sorghum transformation,” Plant Mol Biol. Dezembro de 2000;44(6):789-98. Para transformação mediada por Agrobacterium, consultar, por exemplo, Tingay et al, "Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation”, The Plant Journal, (1997) 11: 1369-1376. Para transformação mediada por Agrobacterium de trigo, consultar, por exemplo, Cheng et al., “Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Physiol. Novembro de 1997;115(3):971-980. Para transformação mediada por Agrobacterium de arroz, consultor, por exemplo, Hiei et al, “Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Mol. Biol. Setembro de 1997;35(1- 2):205-18.

[00178] Os nomes em latim para essas e outras plantas são dados abaixo. Deve estar claro que outras técnicas de transformação (diferentes de Agrobacterium) podem ser usadas para transformar os genes operacionalmente ligados ao promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl), por exemplo, nessas e em outras plantas. Exemplos incluem, mas não estão limitados a; milho (Zea mays), trigo (Triticum spp.), arroz (Oryza spp. e Zizania spp.), cevada (Hordeum spp.), algodão (Abroma augusta e Gossypium spp.), soja (Glycine max), açúcar e beterrabas (Beta spp.), cana-de-açúcar (Arenga pinnata), tomate (Lycopersicon esculentum e outras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum e outras spp., e Cyphomandra betacea), batata (Solanum tuberosum), batata doce (Ipomoea batatas), centeio (Secale spp.), pimentas (Capsicum annuum, chinense, e frutescens), alface (Lactuca sativa, perennis, e pulchella), repolho (Brassica spp.), aipo (Apium graveolen s), berinjela (Solanum melongena), amendoim (Arachis hypogea), sorgo (Sorghum spp.), alfafa (Medicago sativa), cenoura (Daucus carota), feijões (Phaseolus spp. e outros gêneros), aveia (Avena sativa e strigosa), ervilhas (Pisum, Vigna, e Tetragonolobus spp.), girassol (Helianthus annuus), abóbora (Cucurbita spp.), pepino (Cucumis sativa), tabaco (Nicotiana spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), turfa (Lolium, Agrostis, Poa, Cynodon, e outros gêneros), trevo (Trifolium), ervilhaca (Vicia). A transformação dessas plantas, com os genes operacionalmente ligados ao promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl), por exemplo, está contemplada nas modalidades da divulgação do objeto.

[00179] Uso do promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) para conduzir genes operacionalmente ligados pode ser implementado em muitas espécies decíduas e de madeira perene. Tais aplicações estão também no escopo das modalidades dessa divulgação. Essas espécies incluem, mas não se limitam a; amieiro (Alnus spp.), cinza (Fraxinus spp.), espécies de choupo e álamo (Populus spp.), faia (Fagus spp.), bétula (Betula spp.), cereja (Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), nogueira amarga (Carya spp.), bordo (Acer spp.), carvalho (Quercus spp.), e pinho (Pinus spp.).

[00180] Uso do promotor de um gene tipo metalotioneína de Brachypodium distachyon (mtl) para conduzir genes operacionalmente ligados pode ser implementado em espécies ornamentais e frutíferas. Tais aplicações estão também no escopo das modalidades dessa divulgação. Exemplos incluem, mas não estão limitados a; rosa (Rosa spp.), arbusto ardente (Euonymus spp.), petúnia (Petunia spp.), begônia (Begonia spp.), rododendro (Rhododendron spp.), Maça silvestre ou doméstica (Malus spp.), pera (Pyrus spp.), pêssego (Prunus spp.) e malmequer (Tagetes spp.).

[00181] Embora uma variedade de aspectos e modalidades exemplares foram discutidos acima, aqueles de versados na técnica reconhecerão certas modificações, permutações, adições e subcombinações respectivas. Pretende-se, portanto, que as seguintes reivindicações anexadas e reivindicações doravante sejam interpretadas para incluir todas essas modificações, permutações, adições e subcombinações como são dentro de seu verdadeiro espírito e escopo.

Claims

1. Vetor de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende um promotor operacionalmente ligado a: a) uma sequência de poliligante; b) uma sequência codificante do tipo não-metalotioneína heteróloga; ou c) uma combinação de a) e b), em que o referido promotor compreende uma sequência polinucleotídica como definida na SEQ ID NO:1 e o referido promotor possui uma expressão preferencial em tecidos de raiz.

2. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor tem 2,0 Kb de comprimento.

3. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor consiste em uma sequência polinucleotídica como definida na SEQ ID NO:1.

4. Vetor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência que codifica um marcador selecionável.

5. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é operacionalmente ligado a uma sequência codificante heteróloga.

6. Vetor de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que transgenia sequência codificante heteróloga codifica um marcador selecionável, uma proteína de resistência a inseticidas, uma molécula de RNA pequeno, uma nuclease sítio- específica, uma proteína de tolerância a herbicidas, uma proteína de eficiência do uso de nitrogênio, uma proteína de eficiência do uso de água, uma proteína de qualidade nutricional ou proteínas de ligação a DNA.

7. Vetor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 e 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência polinucleotídica não traduzida 3' que compreende a SEQ ID NO:3, em que a sequência não traduzida 3' é operacionalmente ligada ao referido poliligante ou à referida sequência codificante heteróloga.

8. Vetor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 e 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência não traduzida 5'.

9. Vetor de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 e 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de íntron.