TW201307553A - 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術 - Google Patents

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Ann Owens Merlo
Dayakar Reddy Pareddy
Scott Bevan
James G Metz
Jerry M Kuner
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Dow Agrosciences Llc
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Abstract

本發明提供一種以多元不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶系統及一或多種輔助蛋白質基因改造的重組宿主有機體，其允許在該宿主有機體中生產PUFA及/或改良PUFA之生產。本發明亦關於一種製得及使用此有機體的方法和從此有機體獲得的產物。

Description

在植物中生產二十二碳六烯酸(DHA)及其他長鏈多元不飽和脂肪酸 (LC-PUFA)之技術 發明領域
本發明普遍關於一種重組宿主有機體(例如，植物)，其經基因改造含有一多元不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶系統及一或多種輔助蛋白質而允許在該宿主有機體中生產PUFA及/或改良PUFA之生產。本發明亦關於此有機體之製得及使用方法(例如，獲得PUFA)和從此有機體獲得的產物(例如，油及種子)。
 發明背景
多元不飽和脂肪酸(PUFA)對營養應用、醫藥應用、工業應用及其它目的來說視為有用。但是，對長時間商業需求來說，現在來自自然來源(例如，魚油)及來自化學合成的PUFA供應量不足。
源自於植物(例如，油種子農作物)的植物油相對不貴且不具有與魚油相關的污染物問題。但是，在商業發展的植物及植物油中所發現之PUFA典型不包括更飽和或較長鏈的PUFA，及典型僅包括諸如亞麻油酸(具有2個雙鍵在δ 9及12位置處的十八碳-18：2 δ 9,12)及次亞麻油酸(18：3 δ 9,12,15)之脂肪酸。
已經描述出藉由改造由植物內生性生產的脂肪酸而在植物中生產出更不飽和或較長鏈的PUFA。例如，已經描述出含有多種編碼出脂肪酸鏈加長酶及/或去飽和酶 的各別基因之基因改造植物，如導致包含明顯程度的較長鏈及更不飽和PUFA(諸如，廿碳五烯酸(EPA))之葉子或種子產生，但是其亦包含明顯程度之混合的較短鏈及較少不飽和的PUFA(齊(Qi)等人，Nature Biotech.22：739(2004)；WO 04/071467；阿巴狄(Abbadi)等人，Plant Cell 16：1(2004)；拿皮爾(Napier)及沙亞諾娃(Sayanova)，Proceedings of the Nutrition Society 64：387-393(2005)；羅伯(Robert)等人，Functional Plant Biology 32：473-479(2005)；2010年5月17日提出的U.S.Appl.Pub.No.2004/0172682、U.S.Appl.No.61/345,537)。
蠶豆科(Fabaceae )(或豆科(Leguminosae ))係一大且經濟重要的開花植物科，其常見已知有莢豆科、豌豆科、豆子科或豆科(pulse family)。大豆係在蠶豆科中的一屬及包括例如變白大豆(Glycine albicans )、阿芬諾塔大豆(Glycine aphyonota )、沙生大豆(Glycine arenari )、銀毛大豆(Glycine argyrea )、灰毛大豆(Glycine canescens )、隱秘大豆(Glycine clandestine )、彎莢大豆(Glycine curvata )、彎裂片大豆(Glycine cyrtoloba )、鐮莢大豆(Glycine falcate )、細頸大豆(Glycine gracei )、硬毛莖大豆(Glycine hirticaulis )、亞種小硬毛莖大豆(Glycine hirticaulis subsp.leptosa )、乳綠大豆(Glycine lactovirens )、寛葉大豆(Glycine latifolia )、紫色大豆(Glycine latrobeana )、小葉大豆(Glycine microphylla )、蒙帝斯-道格拉斯大豆(Glycine montis-douglas )、佩洛托沙大豆(Glycine peratosa )、澎湖大豆(Glycine pescadrensis )、屏 大尼卡大豆(Glycine pindanica )、普連尼大豆(Glycine pullenii )、鏽紅大豆(Glycine rubiginosa )、史丹諾菲塔大豆(Glycine stenophita )、連結大豆(Glycine syndetika )、烟豆(Glycine tabacina )、短絨葉大豆(Glycine tomentella )、鳥豆(Glycine soja )及黃豆(Glycine max )(大豆)。該蠶豆科亦包括花生、豆類(四季豆(Phaseolus vulgaris ))、蠶豆(胡豆(Vicia faba ))或豌豆(荷蘭豆(Pisum sativum ))。
多數的大豆油呈植物油形式，其生產用於人類消費。對將大豆油使用在工業應用上亦有成長市場。
 發明概要
在技藝中，對相對不貴之有效率且有效地在植物、植物種子或植物油中生產一定量(例如，商業量)的較長鏈或更不飽和PUFA，和在植物、植物種子或植物油中於此PUFA中富含一定量的脂質(例如，甘油三酯(TAG)及磷脂(PL))之方法有需求。在技藝中，藉由提供經基因改造而含有一多元不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶及一或多種輔助蛋白質之重組宿主有機體(如描述於本文)，在該宿主有機體(例如，植物)中提供及改良PUFA生產的系統係一明顯的替代方法。
本發明係針對經基因改造的植物(例如，蠶豆科或大豆屬植物，諸如大豆)、後代、種子、細胞、組織或其部分，其包含：(i)一編碼出能生產至少一種PUFA的多元不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶(例如，海藻PUFA合成酶)之核酸 序列；及(ii)一編碼出能將磷酸泛醯巰基乙胺基輔因子轉移至PUFA合成酶系統(例如，海藻PUFA合成酶系統)ACP區段的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)之核酸序列。
在本發明的某些具體實例中，該PUFA合成酶包含一與該胺基酸序列SEQ ID NO：1有80%至99%相同的胺基酸序列或包含該胺基酸序列SEQ ID NO：1。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含一與該核酸序列SEQ ID NO：6有80%至99%相同的核酸序列或包含該核酸序列SEQ ID NO：6。在某些具體實例中，該PUFA合成酶包含一與該胺基酸序列SEQ ID NO：2有80%至99%相同的胺基酸序列或包含該胺基酸序列SEQ ID NO：2。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含一與該核酸序列SEQ ID NO：7有80%至99%相同的核酸序列或包含該核酸序列SEQ ID NO：7。在某些具體實例中，該PUFA合成酶包含一與該胺基酸序列SEQ ID NO：3有80%至99%相同的胺基酸序列或包含該胺基酸序列SEQ ID NO：3。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含一與該核酸序列SEQ ID NO：8有80%至99%相同的核酸序列或包含該核酸序列SEQ ID NO：8。在某些具體實例中，該PUFA合成酶包含該胺基酸序列SEQ ID NO：1、2或3或其任何組合。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含該核酸序列SEQ ID NO：6、7或8或其任何組合。
在某些具體實例中，該PPTase包含一與SEQ ID NO：5有80%至99%相同的胺基酸序列或包含該胺基酸序列SEQ ID NO：5。在某些具體實例中，該編碼出PPTase的核酸序列係與該核酸序列SEQ ID NO：10有80%至99%相同或包含該核酸序列SEQ ID NO：10。
在某些具體實例中，該核酸序列(i)及(ii)係包含在單一重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)及(ii)係包含在不同重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)及/或(ii)係操作連結至種子專一性啟動子。在某些具體實例中，該核酸序列(i)及/或(ii)係操作連結至一選自於PvDlec2、PvPhaseolin、LfKCS3、FAE 1、BoACP及BnaNapinC的啟動子。在某些具體實例中，該核酸序列(i)及/或(ii)係操作連結至葉專一性啟動子。在某些具體實例中，該核酸序列(i)及/或(ii)係操作連結至泛素(ubiquitin)或CsVMV啟動子。
在某些具體實例中，該經基因改造的植物、後代、種子、細胞、組織或其部分進一步包含：(iii)一編碼出能催化長鏈PUFA游離脂肪酸(PFFA)轉換成醯基-CoA的醯基-CoA合成酶(ACoAS)之核酸序列。在某些具體實例中，該ACoAS包含一與SEQ ID NO：4有80%至99%相同的胺基酸序列或包含該胺基酸序列SEQ ID NO：4。在某些具體實例中，該ACoAS包含一與該核酸序列SEQ ID NO：9有80%至99%相同的核酸序列或包含該核酸序列SEQ ID NO：9。在某些具體實例中，該編碼出ACoAS的核酸序列包含該核酸序列SEQ ID NO：34。在某些具體實例中，該核酸序列 (i)、(ii)及/或(iii)係包含在單一重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)、(ii)及(iii)係包含在不同重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)及(ii)係包含在單一重組表現載體中及該核酸序列(iii)係包含在不同重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)及(iii)係包含在單一重組表現載體中及該核酸序列(ii)係包含在不同重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(ii)及(iii)係包含在單一重組表現載體中及該核酸序列(i)係包含在不同重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)、(ii)及/或(iii)係操作連結至種子專一性啟動子。在某些具體實例中，該核酸序列(i)、(ii)及/或(iii)係操作連結至一選自於PvDlec2、LfKCS3、FAE 1、BoACP及BnaNapinC的啟動子。在某些具體實例中，該核酸序列(i)、(ii)及/或(iii)係操作連結至葉專一性啟動子。在某些具體實例中，該核酸序列(i)、(ii)及/或(iii)係操作連結至泛素或CsVMV啟動子。
在某些具體實例中，該經基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分進一步包含一編碼出乙醯基CoA羧化酶(ACCase)的核酸序列及/或一編碼出型式2二醯基甘油轉醯酶(DGAT2)的核酸序列。
在某些具體實例中，該經基因改造的植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含下列之至少一種：pDAB7361、pDAB7362、pDAB7363、pDAB7368、pDAB7369、pDAB7370、pDAB100518、pDAB101476、 pDAB101477、pDAB9166、pDAB9167、pDAB7379、pDAB7380、pDAB9323、pDAB9330、pDAB9337、pDAB9338、pDAB9344、pDAB9396、pDAB101412、pDAB7733、pDAB7734、pDAB101493、pDAB109507、pDAB109508、pDAB109509、pDAB9151、pDAB108207、pDAB108208、pDAB108209、pDAB9159、pDAB9147、pDAB108224及pDAB108225。
在某些具體實例中，該經基因改造的植物、後代、細胞、組織、種子或其部分或從該經基因改造的植物、後代、種子、細胞、組織或其部分獲得的油(例如，種子油)包含可偵測的量之DHA(廿二碳六烯酸(C22：6，n-3))、DPA(n-6)(廿二碳五烯酸(C22：5，n-6))及/或EPA(廿碳五烯酸(C20：5，n-3))。在某些具體實例中，該經基因改造的植物、後代、細胞、組織、種子或其部分或從該經基因改造的植物、後代、種子、細胞、組織或其部分獲得的油(例如，種子油)包含0.01%至15%的DHA(以總脂肪酸的重量計)、0.05%至10%的DHA(以總脂肪酸的重量計)或0.05%至5%的DHA(以總脂肪酸的重量計)。在某些具體實例中，該經基因改造的植物、後代、細胞、組織、種子或其部分或從該經基因改造的植物、後代、種子、細胞、組織或其部分獲得的油(例如，種子油)包含0.01%至10%的EPA(以總脂肪酸的重量計)、0.05%至5%的EPA(以總脂肪酸的重量計)或0.05%至1%的EPA(以總脂肪酸的重量計)。在某些具體實例中，該經基因改造的植物、後代、細胞、組織、種子或其 部分或從該經基因改造的植物、後代、種子、細胞、組織或其部分獲得的油(例如，種子油)包含0.01%至10%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)、0.01%至5%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)或0.01%至1%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)。在某些具體實例中，該經基因改造的植物、後代、細胞、組織、種子或其部分或從該經基因改造的植物、後代、種子、細胞、組織或其部分獲得的油(例如，種子油)包含EPA：DHA比率係1：1至1：30、或1：1至1：3(以總脂肪酸的重量計)。在某些具體實例中，該經基因改造的植物、後代、細胞、組織、種子或其部分或從該經基因改造的植物、後代、種子、細胞、組織或其部分獲得的油(例如，種子油)包含DPA(n-6)：DHA比率係1：1至1：10、或1：1至1：3(以總脂肪酸的重量計)。在某些具體實例中，從經基因改造的植物、後代、細胞、組織、種子或其部分獲得的油(例如，種子油)包含70%至99%之三酸甘油脂(以該油的重量計)。
在某些具體實例中，亦在從該經基因改造的植物、後代、組織、種子或其部分獲得之穀實及/或粗粉中發現該可偵測的DHA、DPA(n-6)及/或EPA量。
本發明係關於從描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分獲得的油(例如，種子油)或種子。本發明係有關一種包含從描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分獲得的油(例如，種子油)之食物產物。本發明亦針對一 種包含從描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分獲得之油(例如，種子油)或種子的功能性食物。本發明係有關一種包含從描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或部分獲得之油(例如，種子油)或種子的醫藥產物。
本發明係有關一種生產包含至少一種LC-PUFA的油之方法，包括回收來自描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分，或來自描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分之種子的油。本發明亦針對一種生產包含至少一種LC-PUFA的油之方法，包括生長描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分。本發明亦針對一種在種子油中生產至少一種LC-PUFA的方法，包括回收來自描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分之種子的油。
本發明係有關一種在種子油中生產至少一種PUFA的方法，包括生長描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分。本發明亦針對一種將包含至少一種PUFA的補充品或治療產物提供至個體之方法，包括對該個體提供一描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分、描述於本文的油、描述於本文的種子、描述於本文的食物產物、描述於本文的功能性食物、或描述於本文的醫藥產物。在某些具體實例中，包含在此具體實例中的PUFA係DHA、 DPA(n-6)及/或EPA。
本發明係有關一種生產描述於本文之經基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分之方法，包括以下列轉形一植物或植物細胞：(i)一編碼出能生產至少一種多元不飽和脂肪酸(PUFA)的PUFA合成酶(例如，海藻PUFA合成酶)之核酸序列；及(ii)一編碼出能將磷酸泛醯巰基乙胺基輔因子轉移至PUFA合成酶(例如，海藻PUFA合成酶)ACP區段的磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)之核酸序列。在某些具體實例中，該方法進一步包括以(iii)一編碼出能催化長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉換成醯基-CoA之醯基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列來轉形該植物或植物細胞。
圖式簡單說明
可從下列詳細說明、圖形及伴隨的序列描述(其形成本申請案的一部分)更完整地了解本發明之多個具體實例。
圖1描出編碼出PUFA OrfA的9個重覆區段每個之重新設計的DNA序列之Clustal W(在Vector NTI中排比)。
圖2係pDAB7362的質體圖譜。
圖3係pDAB7361的質體圖譜。
圖4係pDAB7363的質體圖譜。
圖5係pDAB7365的質體圖譜。
圖6係pDAB7368的質體圖譜。
圖7係pDAB7369的質體圖譜。
圖8係pDAB7370的質體圖譜。
圖9係pDAB100518的質體圖譜。
圖10係pDAB101476的質體圖譜。
圖11係pDAB101477的質體圖譜。
圖12顯示出來自以pDAB7362轉形的二種大豆事件之T1植物的單一T2大豆種子之DHA及LC-PUFA含量。
圖13顯示出在T2大豆種子蛋白質萃取物中之PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB及PUFA合成酶嵌合OrfC的西方墨點法(Western blot)偵測。
圖14係pDAB9166的質體圖譜。
圖15係pDAB9167的質體圖譜。
圖16係pDAB7379的質體圖譜。
圖17係pDAB7380的質體圖譜。
圖18係pDAB9323的質體圖譜。
圖19係pDAB9330的質體圖譜。
圖20係pDAB9337的質體圖譜。
圖21係pDAB9338的質體圖譜。
圖22係pDAB9344的質體圖譜。
圖23係pDAB9396的質體圖譜。
圖24係pDAB101412的質體圖譜。
圖25係pDAB7733的質體圖譜。
圖26係pDAB7734的質體圖譜。
圖27係pDAB101493的質體圖譜。
圖28係pDAB109507的質體圖譜。
圖29係pDAB109508的質體圖譜。
圖30係pDAB109509的質體圖譜。
圖31係pDAB9151的質體圖譜。
圖32係pDAB108207的質體圖譜。
圖33係pDAB108208的質體圖譜。
圖34係pDAB108209的質體圖譜。
圖35係pDAB9159的質體圖譜。
圖36係pDAB9147的質體圖譜。
圖37係pDAB108224的質體圖譜。
圖38係pDAB108225的質體圖譜。
圖39顯示出來自以pDAB101493、pDAB7362、pDAB7369、pDAB101412或pDAB7380轉形的各別轉殖基因型阿拉伯芥屬事件之T2種子的DHA及LC-PUFA含量。
 較佳實施例之詳細說明
如於本文中所使用，用語“多元不飽和脂肪酸”或“PUFA”指為具有碳鏈長度至少16個碳、至少18個碳、至少20個碳、或22或更多碳，與至少3或更多雙鍵、4或更多雙鍵、5或更多雙鍵、或6或更多雙鍵之脂肪酸，其中全部雙鍵皆呈順式組態。
如於本文中所使用，用語“長鏈多元不飽和脂肪酸”或“LC-PUFA”指為碳鏈長度20及更多，包含3或更多個雙鍵；或22或更多碳，含有至少3或更多雙鍵、4或更多雙鍵、5或更多雙鍵、或6或更多雙鍵的脂肪酸。Ω-6系列的 LC-PUFA包括(但不限於)二-高-γ-次亞麻油酸(C20：3 n-6)、花生四烯酸(C20：4 n-6)、腎上腺酸(亦稱為廿二碳四烯酸或DTA)(C22：4 n-6)、及廿二碳五烯酸(C22：5 n-6)。Ω-3系列的LC-PUFA包括(但不限於)廿碳三烯酸(C20：3 n-3)、廿碳四烯酸(C20：4 n-3)、廿碳五烯酸(C20：5 n-3)、廿二碳五烯酸(C22：5 n-3)、及廿二碳六烯酸(C22：6 n-3)。LC-PUFA亦包括具有多於22個碳及4或更多雙鍵的脂肪酸，包括(但不限於)C28：8(n-3)。
如於本文中所使用，用語“PUFA合成酶”指為生產多元不飽和脂肪酸(PUFA)，特別是長鏈PUFA(LC-PUFA)的酵素，和此酵素在複體中的任何區段。用語“PUFA合成酶”包括(但不限於)用於PUFA之生產的PUFA PKS系統或類PKS系統。於本文中，某些特定的PUFA合成酶藉由額外的標記標示，例如，“SzPUFA”合成酶或“hSzThPUFA”合成酶(如在本申請案中所定義)。用語“PUFA合成酶系統”包括PUFA合成酶，及當在異種有機體中表現出時可影響PUFA合成酶的功能之任何輔助酵素(例如，PPTase或ACS)。
如於本文中所使用，用語“磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶”及“PPTase”指為藉由將輔因子(例如，4-磷酸泛醯巰基乙胺)從輔酶A(CoA)轉移至存在於該PUFA合成酶中的一或多個ACP區段來活化PUFA合成酶之酵素。可活化描述於本文的PUFA合成酶之一或多個ACP區段的PPTase之一個實施例為念珠藻(Nostoc sp.)PCC 7120(以前稱為魚腥藻(Anabaena sp.)PCC 7120)的Het I蛋白質，於本文中標示為 “NoHetI”。
如於本文中所使用，用語“醯基-CoA合成酶”、“ACoAS”及“ACS”指為催化長鏈多元不飽和游離脂肪酸(FFA)轉換成醯基-CoA之酵素。於本文中，某些特定的醯基-CoA合成酶由額外的標記標示，例如，“SzACS-2”(如在本申請案中所定義)。
如於本文中所使用，用語“植物”包括任何後代、細胞、組織、種子、種子油或其部分。
“營養食品”意謂著從植物分離、純化、濃縮或產生而提供生理利益或提供對抗疾病的保護之產物，其一起包括補充此產物的加工食物，與從已經基因操縱而包含提高程度的此生理活性組分之農作物所產生之食物。
“功能性食物”意謂著一食物，其(a)外觀類似習知食物或可為習知食物，其經食用如為一般飲食的部分；及(b)以典型存在於未改造的食物中之組分比例的改造為基礎，具有提高的營養值及/或特定的膳食利益。
用語“多核苷酸”及“核酸”想要包括單一核酸和複數核酸、核酸分子或片段、其變異體或衍生物、或建構體(例如，信息RNA(mRNA)或質體DNA(pDNA))。該多核苷酸或核酸可包括全長cDNA序列的核苷酸序列、或其片段，包括未轉譯的5’及3’序列及編譯序列。該多核苷酸或核酸可由任何多核糖核苷酸或多去氧核糖核苷酸構成，其可係未經改造的RNA或DNA或經改造的RNA或DNA。例如，該多核苷酸或核酸可由單及雙股DNA、單與雙股區域的混合物 之DNA、單及雙股RNA、及單與雙股區域的混合物之RNA、包含DNA及RNA(其可係單股，或更典型係雙股，或單與雙股區域之混合物)的雜交分子構成。這些用語亦包括多核苷酸或核酸之經化學、酵素或新陳代謝改造的形式。
多核苷酸或核酸序列當已經從其天然環境移出時可指為“經分離”。例如，對本發明之目的來說，包含在載體中編碼出具有二羥基酸脫水酶活性的多胜肽或多胜肽片段之異種多核苷酸或核酸視為經分離。經分離的多核苷酸或核酸之進一步實施例包括維持在異種宿主細胞中之重組多核苷酸，或在溶液中之經純化(部分或實質上)的多核苷酸或核酸。根據本發明之經分離的多核苷酸或核酸進一步包括合成生產的此分子。呈DNA的聚合物形式之經分離的多核苷酸或核酸可由一或多個cDNA斷片、基因組DNA或合成的DNA組成。
用語“基因”指為能表現出如為特定蛋白質的核酸或其片段，選擇性包括處在該編譯序列前(5’非編譯序列)及後(3’非編譯序列)的調控序列。
如於本文中所使用，用語“編譯區”指為編譯特定的胺基酸序列之DNA序列。“合適的調控序列”指為位於編譯序列的上游(5’非編譯序列)、內或下游(3’非編譯序列)之核苷酸序列，及其影響轉錄、RNA加工或穩定性、或相關編譯序列之轉譯。該調控序列可包括啟動子、轉譯領導序列、插入子、聚腺苷酸化辨識序列、RNA加工位置、受動器結合位置及莖環結構。
如於本文中所使用，用語“多胜肽”想要包括單一“多胜肽”和複數“多胜肽”及其片段，及指為由醯胺鍵(亦已知為胜肽鍵)線性連結的單體(胺基酸)構成之分子。用語“多胜肽”指為二或更多個胺基酸之任何鏈，且不指為特定長度的產物。因此，胜肽、二胜肽、三胜肽、寡肽、蛋白質、胺基酸鏈或使用來指出二或更多個胺基酸鏈的任何其它用語皆包括在“多胜肽”之定義內，及可使用該用語“多胜肽”替換任何這些用語或可與其互換地使用。多胜肽可源自於自然生物來源或藉由重組技術產生，但是不必需從所標示的核酸序列轉譯。其可以任何方式產生，包括藉由化學合成。
想要“經分離的”多胜肽或其片段、變異體或衍生物係一不在其自然周圍環境中的多胜肽。不需要特別的純化程度。例如，經分離的多胜肽可從其天然或自然環境移出。對本發明的目的來說，重組產生的多胜肽及在宿主細胞中表現出的蛋白質皆視為分離，如係已經藉由任何合適的技術分離、分餾或部分或實質上純化之天然或重組多胜肽般。
如於本文中所使用，“天然”指為如在自然中發現般具有其自己的調控序列(若存在的話)之多核苷酸、基因或多胜肽形式。
如於本文中所使用，“內生性”指為多核苷酸、基因或多胜肽在其自然場所中在有機體或有機體的基因組中之天然形式。“內生性多核苷酸”包括在其自然場所中在有 機體的基因組中之天然多核苷酸。“內生性基因”包括在其自然場所中在有機體的基因組中之天然基因。“內生性多胜肽”包括在其自然場所中在有機體中的天然多胜肽。
如於本文中所使用，“異種”指為正常不在宿主有機體中找到而是引進宿主有機體中之多核苷酸、基因或多胜肽。“異種多核苷酸”包括一天然編譯區或其部分，其以與該相應的天然多核苷酸不同的形式再引進該來源有機體中。“異種基因”包括一天然編譯區或其部分，其以與相應的天然基因不同的形式再引進該來源有機體中。例如，異種基因可包括一再引進該天然宿主中、包含非天然調控區域的嵌合基因之一部分的天然編譯區。“異種多胜肽”包括一以與相應的天然多胜肽不同之形式再引進該來源有機體中的天然多胜肽。
如於本文中所使用，用語“改造”指為改變揭示於本文的多核苷酸，而造成減低、實質上消除或消除由該多核苷酸所編碼出的多胜肽之活性；和改變揭示於本文的多胜肽，而造成減低、實質上消除或消除該多胜肽的活性。此改變可藉由在技藝中熟知的方法製得，包括(但不限於)刪除、突變(例如，自發性致突變、隨機致突變、由突變基因造成的致突變、或轉位子致突變)、替換、插入、向下調節、改變細胞定位、改變多核苷酸或多胜肽的狀態(例如，甲基化、磷酸化或泛素化)、移除輔因子、引進反義RNA/DNA、引進干擾RNA/DNA、化學改造、共價改造、以UV或X射線照射、同源重組、有絲分裂重組、啟動子置 換方法及/或其組合。可藉由比較特別的多核苷酸或多胜肽序列與同源多核苷酸或多胜肽(例如，酵母菌或細菌)之序列，及最大化在高同源性區域(保守區域)或一致序列中所製得之改造數目找到決定何種核苷酸或胺基酸殘基可被改造之指導。
如於本文中所使用，用語“衍生物”指為在本發明中所揭示的序列之改造。此改造之闡明將係一或多個與揭示於本文的編譯序列之核酸序列相關的鹼基之替換、插入及/或消除，其保有、稍微改變或增加揭示於本文的編譯序列在油種子農作物物種中之功能。此衍生物可由熟習該項技術者容易地決定，例如，使用電腦模型技術來預測及最佳化序列結構。因此，用語“衍生物”亦包括與於本文所揭示的編譯序列具有實質上序列同源性之核酸序列，如此它們能夠具有所揭示使用來生產本發明的LC-PUFA之功能性。
如於本文中所使用，用語“變異體”指為使用例如重組DNA技術(諸如致突變)產生胺基酸插入、消除、突變及替換，而與特別敘述之本發明的多胜肽不同之多胜肽。可藉由比較特別多胜肽的序列與同源多胜肽的序列，及減少在高同源性區域(保守區域)中所製得的胺基酸序列改變之數目，或藉由以一致序列置換胺基酸找到決定何種胺基酸殘基可被置換、加入或刪除而沒有廢除有興趣的活性之指導。
再者，可利用在基因密碼中的“表現多型 (redundancy)”來合成或選擇編碼出這些相同或類似多胜肽的重組多核苷酸變異體。為了表現，可引進多種密碼子替換(諸如沉默改變，其產生多種限制區)來最佳化選殖進入質體或病毒載體中。在多核苷酸序列中的突變可反映在該多胜肽或加入至該多胜肽的其它胜肽之區段中，以修改該多胜肽的任何部分之性質。
胺基酸“替換”可係以另一種具有類似結構及/或化學性質的胺基酸置換一個胺基酸(即，保守性胺基酸置換)的結果；或它們可係以具有不同結構及/或化學性質的胺基酸置換一個胺基酸(即，非保守性胺基酸置換)的結果。可以所包含的殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性或兩性本質的類似性為基礎進行該“保守性”胺基酸替換。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺酸；正電荷(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；及負電荷(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。再者，可藉由選擇在任何這些胺基酸的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性或兩性本質上之差異進行“非保守性”胺基酸替換。“插入”或“消除”可在如由該重組蛋白質於結構或功能上所容忍的變化範圍內。所允許的變化可使用重組DNA技術在多胜肽分子中系統性製得胺基酸之插入、消除或替換，及分析所產生的重組變異體之活性而實驗決定。
用語“啟動子”指為能控制編譯序列或功能性RNA的表現性之DNA序列。通常來說，啟動子序列的編譯序列位於3’。該啟動子可整體從天然基因取得，或由來自自然發現的不同啟動子之不同元素構成，或甚至包含合成的DNA斷片。要由熟習該項技術者了解，不同啟動子可支配基因在不同組織或細胞型式中、或在不同發展階段處、或因應不同環境或生理條件的表現性。造成基因在大部分細胞型式中在大多數時間表現出的啟動子通常指為“組成型啟動子(constitutive promoter)”。要進一步了解的是，因為在大部分情況中並未完整地定義精確的調控序列界限，不同長度的DNA片段可具有相同啟動子活性。
用語“操作連結”指為在單一核酸片段上的核酸序列之結合，以便一個之功能受其它影響。例如，啟動子當其能影響一編譯序列的表現性時(例如，該編譯序列在該啟動子之轉錄控制下)，與該編譯序列操作連結。編譯序列可在正義或反義取向上操作連結至調控序列。
如於本文中所使用，用語“表現性”指為來自本發明的核酸片段之正義(mRNA)或反義RNA的轉錄及穩定累積。表現性亦可指為mRNA轉譯成多胜肽。
如於本文中所使用，用語“過度表現”指為表現性高於相同或相關基因的內生性表現性。異種基因若其表現性高於可比較的內生性基因時，其係過度表現。
如於本文中所使用，用語“轉形”指為核酸或片段轉移進宿主有機體中產生基因穩定的遺傳。包含該轉形的 核酸片段之宿主有機體指為“轉殖基因”或“重組”或“轉形”的有機體。
如於本文中所使用，用語“質體”及“載體”指為經常攜帶非為該細胞的中心新陳代謝之部分的基因之額外的染色體元素，及其通常呈環型雙股DNA分子形式。此元素可係自主性複製序列(autonomously replicating sequences)、基因組整合序列、噬菌體或來自任何來源之核苷酸序列(線性或環型、單或雙股DNA或RNA)，其中一些核苷酸序列已經連結或重組成獨特結構，其能將用於所選擇的基因產物之啟動子片段及DNA序列與適當3’未轉譯的序列一起引進細胞中。
如於本文中所使用，用語“密碼子簡并性”指為基因密碼的本質，其准許變化核苷酸序列而沒有影響所編碼出的多胜肽之胺基酸序列。熟練的人士充分地察覺特定的宿主細胞在使用核苷酸密碼子來具體指定所提供的胺基酸時，存在有“密碼子偏倚(codon-bias)”。因此，當合成用以改良在宿主細胞中的表現性之基因時，想要將該基因設計成其密碼子使用頻率接近該宿主細胞的較佳密碼子使用頻率。
用語“密碼子最佳化”當其指為用於多種宿主之轉形的基因或核酸分子之編譯區域時，其指為改變在該基因或核酸分子的編譯區域中之密碼子，以反映出該宿主有機體的典型密碼子使用而沒有改變由該DNA所編碼的多胜肽。此最佳化包括以在該有機體的基因中更常使用的一或 多個密碼子置換至少一個、多於一個或明顯數目的密碼子。
在包含編碼出任何多胜肽鏈的胺基酸之密碼子的核苷酸序列中之偏差允許在該基因的序列編譯時變化。因為每個密碼子由三個核苷酸組成及該包含核苷酸的DNA受限於四種特定鹼基，有64種可能的核苷酸組合，其中61種編碼出胺基酸(剩餘的三種密碼子編碼出結束轉譯的訊號)。顯示出何種密碼子編碼出何種胺基酸的“基因密碼”於本文中重現於表1。結果，許多胺基酸由多於一種密碼子標示。例如，丙胺酸及脯胺酸胺基酸係由四種三聯體編譯，絲胺酸及精胺酸係由六種，然而色胺酸及甲硫胺酸僅由一種三聯體編譯。此簡并性允許DNA鹼基組成物在廣泛範圍內變化而沒有改變由該DNA編碼的蛋白質之胺基酸序列。
許多有機體顯示出使用特別的密碼子偏倚來編譯用以在生長胜肽鏈中插入特別的胺基酸。密碼子較佳物或密碼子偏倚(在有機體間之密碼子使用差異)係由基因密 碼的簡并性給予，及在許多有機體當中已充分地文件化。密碼子偏倚經常與信息RNA(mRNA)之轉譯的效率相關聯，依次咸信尤其是依欲轉譯的密碼子性質及特別的傳遞RNA(tRNA)分子之可用度而定。所選擇的tRNA在細胞中之優勢通常係在胜肽合成中最時常使用的密碼子之反映。此外，基因可在所提供的有機體中以密碼子最佳化為基準修改用於最理想的基因表現。
已提供大量廣泛多種動物、植物及微生物物種之可獲得的基因序列，其可計算出密碼子使用的相對頻率。密碼子使用表可容易獲得及可以一些方法適應。參見中村(Nakamura)等人，Nucl.Acids Res.28：292(2000)。藉由使用此或類似的表，一般技藝人士可將該頻率施加至任何所提供的多胜肽序列，及產生一編碼出該多胜肽的密碼子最佳化編譯區之核酸片段，但是其對所提供的物種使用最理想的密碼子。本發明涉及OrfA、OrfB、嵌合OrfC、PPTase及/或本發明的其它輔助蛋白質之密碼子最佳化形式，如進一步描述於本文。
如在技藝中已知，用語“同一性百分比”係在二或更多個多胜肽序列或二或更多個多核苷酸序列間之關係，如藉由比較該等序列決定。在技藝中，“同一性”亦意謂著在多胜肽或多核苷酸序列間之序列關係的程度，如該情況可係如藉由在此序列串間之匹配決定。“同一性”及“類似性”可藉由已知的方法容易地計算，包括(但不限於)揭示在下列的那些：1)計算分子生物學(Computational Molecular Biology)(雷斯克(Lesk)，A.M.，編輯)牛津大學(Oxford University)：NY(1988)；2)生物計算：資訊學及基因組計劃(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)(史密斯(Smith)，D.W.，編輯)Academic：NY(1993)；3)電腦分析序列資料，第I部(Computer Analysis of Sequence Data,Part I)(葛里芬(Griffin)，A.M.，及葛里芬，H.G.，編輯)休門尼亞(Humania)：NJ(1994)；4)分子生物學中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)(凡黑鎳(von Heinje)，G.，編輯)Academic(1987)；及5)序列分析引子(Sequence Analysis Primer)(葛利斯科夫(Gribskov)，M.及戴弗路斯(Devereux)，J.，編輯)斯德頓市(Stockton)：NY(1991)。
測量同一性的方法經設計，以在所測試之序列間提供最好匹配。在公開可獲得電腦程式中編纂測量同一性及類似性的方法。可例如使用Vector NTI®套裝的AlignX程式(因維錯俊(Invitrogen)，卡爾斯貝得(Carlsbad)，CA)或LASERGENE生物資訊學計算套裝的MegAlign®程式(DNASTAR公司(DNASTAR Inc.)，麥迪森(Madison)，WI)來進行序列排比及同一性百分比計算。使用“Clustal排比方法”進行該序列的多重排比，其包括數種演算法變化，包括與標記為Clustal V之排比方法相應的“Clustal V排比方法”(由希金斯(Higgins)及夏普(Sharp)揭示，CABIOS.5：151-153(1989)；希金斯，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))；及在LASERGENE生物資訊學計算套裝 的MegAlign®程式(DNASTAR公司)中進行。對多重排比來說，預設值與GAP PENALTY=10及GAP LENGTH PENALTY=10相應。使用Clustal方法之成對排比及蛋白質序列的同一性百分比之計算的預設參數係KTUPLE=1，GAP PENALTY=3，WINDOWS=5及DIAGONALS SAVED=5。對核酸來說，這些參數係KTUPLE=2，GAP PENALTY=5，WINDOWS=4及DIAGONALS SAVED=4。在使用Clustal V程式排比該等序列後，可藉由觀察在相同程式中的“序列距離”表獲得“同一性百分比”。額外地，“Clustal W排比方法”可獲得及與標記為Clustal W排比方法相應(由希金斯及夏普描述，CABIOS.5：151-153(1989)；希金斯，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992))；及在LASERGENE生物資訊學計算套裝的MegAlign®v6.1程式(DNASTAR公司)中進行。多重排比的預設參數(GAP PENALTY=10，GAP LENGTH PENALTY=0.2，Delay Divergen Seqs(%)=30，DNA Transition Weight=0.5，Protein Weight Matrix=Gonnet Series，DNA Weight Matrix=IUB)。在使用Clustal W程式排比該等序列後，可藉由觀看在相同程式中的“序列距離”表獲得“同一性百分比”。
用語“序列分析軟體”指為任何對核苷酸或胺基酸序列分析有用的電腦演算法或軟體程式。“序列分析軟體”可商業購得或各自獨立地發展。典型的序列分析軟體將包括(但不限於)：1.)GCG程式套裝(威斯康辛州套裝軟體版本(Wisconsin Package Version)9.0，基因電腦團隊(Genetics Computer Group)(GCG)，麥迪森，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(歐次諸(Altschul)等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR公司，麥迪森，WI)；4.)西昆雀(Sequencher)(基因編譯股份(有限)公司(Gene Codes Corporation)，安那寶市(Ann Arbor)，MI)；及5.)併入史密斯-瓦特門(Smith-Waterman)演算法的FASTA程式(W.R.皮耳森(Pearson)，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，會議日期1992，111-20。編輯者：蘇海(Suhai)、山德(Sandor)。普立冷(Plenum)：紐約，NY)。在本申請案的上下文內將了解，若使用序列分析軟體來分析時，分析的結果將以參照的程式之“預設值”為基準，除非其它方面有具體指定。如於本文中所使用，“預設值”將意謂著該軟體當首先初始化時原始負載之任何設定值或參數。
於此所使用的標準重組DNA及分子選殖技術在技藝中熟知，及例如由山姆布魯克(Sambrook)等人，分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，NY(2000)；及由西爾哈維(Silhavy)等人，基因融合實驗(Experiments with Gene Fusions)，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY(1984)；及由歐蘇貝爾(Ausubel)等人，分子生物學現代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，由格林尼出版協會(Greene Publishing Assoc.)及威利科學間(Wiley-Interscience)出版 (1987至現在)所描述。
於本文中所揭示的重組宿主之基因操控可使用標準基因技術進行及篩選，且可在任何合適於基因操控的宿主細胞中製得。在某些具體實例中，該重組宿主可為(但不限於)任何高等植物，包括雙子葉及單子葉植物二者；及消耗性植物，包括農作物植物及使用其油的植物。因此，可如進一步在下列描述般選擇任何植物物種或植物細胞。
本發明的油亦可使用於非烹調或膳食方法及組成物。這些用途某些可係工業、化粧品或醫療。本發明的油亦可使用在適合本發明的油之任何應用中。通常來說，本發明的油可使用在多種應用中，用以置換例如礦物油、酯類、脂肪酸或動物脂肪，諸如潤滑劑、潤滑添加劑、金屬加工液、液壓液及耐燃性液壓液。本發明的油亦可使用作為在生產改質的油之方法中的材料。用以改質本發明的油之技術的實施例包括分餾、氫化、改變油的油酸或次亞麻油酸含量、及由熟習該項技術者已知的其它改質技術。
本發明的油之化粧品用途的實施例包括使用在化粧品組成物中作為潤膚劑；作為凡士林置換；作為包含肥皂的部分，或作為在製造肥皂的方法中之材料；作為包含口服治療溶液的部分；作為包含老化治療組成物的部分；及作為包含皮膚或毛髮氣溶膠泡沫製劑的部分。
額外地，本發明的油可使用在醫療應用中。例如，本發明的油可使用在保護性障壁中對抗感染，及高Ω-9脂肪酸的油可使用來提高移植器官移植存活(美國專利案 號6,210,700)。
應瞭解前述係本發明的油所適合之非烹調用途的非為限制的實施例。如先前描述，本發明的油及經改質的油可使用在由熟習該項技術者已知的全部應用中來置換例如礦物油、酯類、脂肪酸或動物脂肪。
PUFA合成酶
在真核有機體中合成長鏈PUFA(LC-PUFA)的“標準”或“傳統”途徑包括中鏈長飽和或單不飽和脂肪酸之延長及去飽和，且已經描述。亦已描述出經由PUFA合成酶的長鏈PUFA合成途徑，及其與“標準”途徑非常不同。特別是，PUFA合成酶使用丙二酸單醯基-CoA作為碳來源及產生最後PUFA而沒有釋放出任何明顯量的中間物。同樣地，伴隨著PUFA合成酶，會在使用不需要氧的機制合成期間加入適當的順式雙鍵。在某些具體實例中，在合成循環期間使用NADPH作為還原劑。
本發明係關於已經基因改造而表現出PUFA合成酶(內生性或藉由基因操控)的宿主有機體(例如，植物，諸如大豆)。在某些具體實例中，關於該有機體以PUFA合成酶或以不由該有機體內生性表現出的另一種蛋白質改造，該已經基因改造而表現出PUFA合成酶的有機體(其中該有機體非自然(內生性，沒有基因改造)表現出此酵素)或至少該有機體經基因改造含有特別的PUFA合成酶或其部分，於本文中可指為“異種”宿主有機體。本發明之基因改造可使用在內生性表現出PUFA合成酶的宿主有機體(其中該有機 體未進一步以不同PUFA合成酶或其部分改造)中來改良PUFA生產。
根據本發明的PUFA合成酶可包含數種多功能性蛋白質(及可包括單一功能蛋白質，特別是對來自海洋細菌的PUFA合成酶來說)，其可在所選擇的循環中一起作用以進行脂肪酸鏈的迭代加工和非迭代加工(包括反-順式異構化反應及烯醯基還原反應)二者。這些蛋白質於本文中亦可指為核心PUFA合成酶酵素複體或核心PUFA合成酶。包含在這些蛋白質內的區段及基序(motif)之一般功能在技藝中各別已知，及關於來自海洋細菌及真核有機體的多種PUFA合成酶已經詳細描述(參見例如，美國專利案號6,140,486；美國專利案號6,566,583；美次(Metz)等人，Science 293：290-293(2001)；U.S.Appl.Pub.No.2002/0194641；U.S.Appl.Pub.No.2004/0235127；U.S.Appl.Pub.No.2005/0100995，及WO 2006/135866)。如上述提及，該等區段可發現如為單一蛋白質(例如，該區段與蛋白質係同義)或如為在單一蛋白質中的二或更多個(多重)區段之一。已經描述出來自海洋細菌及破囊壺菌屬(Thraustochytrium)成員的多種PUFA合成酶之區段結構，及包含此PUFA合成酶的基因及蛋白質之結構及功能性特徵(參見例如美國專利案號6,140,486；美國專利案號6,566,583；美次等人，Science 293：290-293(2001)；U.S.Appl.Pub.No.2002/0194641；U.S.Appl.Pub.No.2004/0235127；U.S.Appl.Pub.No.2005/0100995及WO 2006/135866)。
具有PUFA合成酶活性的多核苷酸、基因及多胜肽之許多實施例在技藝中已知，及可使用在揭示於本文的基因改造宿主中。在本發明中有用的PUFA合成酶蛋白質或區段可包括細菌及非細菌PUFA合成酶二者。非細菌PUFA合成酶係一來自或源自於非細菌的有機體(諸如真核細胞)之系統。細菌PUFA合成酶描述例如在U.S.Appl.Pub.No.2008/0050505中。可併入含有細菌PUFA合成酶功能性區段的非細菌PUFA合成酶功能性區段，和來自其它PKS系統(型式I迭代或模組化、型式II或型式III)或FAS系統之PUFA合成酶功能性區段或蛋白質來生產本發明之基因改造植物。
在某些具體實例中，本發明的PUFA合成酶包含至少下列生物活性區段，其典型包含在三、四或更多種蛋白質上：(a)至少一個烯醯基-ACP還原酶(ER)區段；(b)多重醯基載體蛋白質(ACP)區段(例如，至少來自一至四個，或至少五個ACP區段，及在某些具體實例中，最高六、七、八、九、十或多於十個ACP區段)；(c)至少二個β-酮脂醯基-ACP合成酶(KS)區段；(d)至少一個轉醯酶(AT)區段；(e)至少一個β-酮脂醯基-ACP還原酶(KR)區段；(f)至少二個FabA-似的β-羥基醯基-ACP脫水酶(DH)區段；(g)至少一個鏈長度因子(CLF)區段；及/或(h)至少一個丙二酸單醯基-CoA：ACP轉醯酶(MAT)區段。在某些具體實例中，根據本發明的PUFA合成酶亦包含至少一個包含脫水酶(DH)保守活性位置基序之區域。
在某些具體實例中，該PUFA合成酶包含至少下 列生物活性區段：(a)至少一個烯醯基-ACP還原酶(ER)區段；(b)至少五個醯基載體蛋白質(ACP)區段；(c)至少二個β-酮脂醯基-ACP合成酶(KS)區段；(d)至少一個轉醯酶(AT)區段；(e)至少一個β-酮脂醯基-ACP還原酶(KR)區段；(f)至少二個FabA-似的β-羥基醯基-ACP脫水酶(DH)區段；(g)至少一個鏈長度因子(CLF)區段；及(h)至少一個丙二酸單醯基-CoA：ACP轉醯酶(MAT)區段。在某些具體實例中，根據本發明的PUFA合成酶亦包含至少一個包含脫水酶(DH)保守活性位置基序(其非為FabA-似的DH區段之部分)的區域或區段。這些區段每個的結構及功能特徵詳細描述在U.S.Appl.Pub.No.2002/0194641；U.S.Appl.Pub.No.2004/0235127；U.S.Appl.Pub.No.2005/0100995；U.S.Appl.Pub.No.2007/0245431；及WO 2006/135866中。
有三個形成該核心裂壺菌屬(Schizochytrium)PUFA合成酶的開放性讀碼區，且先前已經描述例如在U.S.Appl.Pub.No.2007/0245431中。每個開放讀碼區的區段結構如下。
裂壺菌屬開放讀碼區A(OrfA或Pfa1)：OrfA係一8730個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼出一2910個胺基酸序列。在OrfA內有十二個區段：(a)一個β-酮基醯基-ACP合成酶(KS)區段；(b)一個丙二酸單醯基-CoA：ACP轉醯酶(MAT)區段；(c)九個醯基載體蛋白質(ACP)區段；及(d)一個酮還原酶(KR)區段。已經從裂壺菌(Schizochytrium sp.)ATCC 20888及ATCC 20888的子代株(daughter strain)(指 示為裂壺菌，菌株N230D)二者分離及定序出編碼OrfA的基因組DNA選殖株(質體)。
基因組選殖株pJK1126(指示為pJK1126 OrfA基因組選殖株，呈包含來自裂壺菌屬ATCC 20888的“OrfA”基因之大腸桿菌質體載體形式)於2006年6月8日寄存在美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-7648。
基因組選殖株pJK306(指示為pJK306 OrfA基因組選殖株，呈包含來自裂壺菌N230D的OrfA基因之5’部分的大腸桿菌質體(2.2kB與pJK320重疊)形式)於2006年6月8日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-7641。
基因組選殖株pJK320(指示為pJK320 OrfA基因組選殖株，呈包含來自裂壺菌N230D的OrfA基因之3’部分的大腸桿菌質體(2.2kB與pJK306重疊)形式)於2006年6月8日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)，及分配到ATCC登錄編號PTA-7644。
裂壺菌屬開放讀碼區B(OrfB或Pfa2)：OrfB係一6177個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼出一2059個胺基酸序列。在OrfB內有四個區段：(a)一個酮基醯基-ACP合成酶(KS)區段；(b)一個鏈長度因子(CLF)區段；(c) 一個醯基轉移酶(AT)區段；及(d)一個烯醯基ACP-還原酶(ER)區段。已經從裂壺菌ATCC 20888及ATCC 20888的子代株(指示為裂壺菌，菌株N230D)二者分離及定序出編碼OrfB的基因組DNA選殖株(質體)。
基因組選殖株pJK1129(指示為pJK1129 OrfB基因組選殖株，呈包含來自裂壺菌屬ATCC 20888的“OrfB”基因之大腸桿菌質體載體形式)於2006年6月8日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-7649。
基因組選殖株pJK324(指示為pJK324 OrfB基因組選殖株，呈包含來自裂壺菌N230D的OrfB基因序列之大腸桿菌質體形式)於2006年6月8日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-7643。
裂壺菌屬開放讀碼區C(OrfC或Pfa3)：OrfC係一4506個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼出一1502個胺基酸序列。在OrfC內有三個區段：(a)二個FabA-似的羥基醯基-ACP脫水酶(DH)區段；及(b)一個烯醯基ACP-還原酶(ER)區段。已經從裂壺菌ATCC 20888及ATCC 20888的子代株(指示為裂壺菌，菌株N230D)二者分離及定序出編碼OrfC的基因組DNA選殖株(質體)。
基因組選殖株pJK1131(指示為pJK1131 OrfC基因組選殖株，呈包含來自裂壺菌屬ATCC 20888的“OrfC”基 因之大腸桿菌質體載體形式)於2006年6月8日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-7650。
基因組選殖株pBR002(指示為pBR002 OrfC基因組選殖株，呈包含來自裂壺菌N230D的OrfC基因序列之大腸桿菌質體載體形式)於2006年6月8日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-7642。
此外，有三個形成先前已經描述的核心破囊壺菌屬PUFA合成酶之開放性讀碼區。每個開放讀碼區的區段結構如下。
破囊壺菌屬23B開放讀碼區A(OrfA)：OrfA係一8433個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼出一2811個胺基酸序列。下列區段存在於Th .23B OrfA中：(a)一個β-酮脂醯基-ACP合成酶(KS)區段；(b)一個丙二酸單醯基-CoA：ACP轉醯酶(MAT)區段；(c)八個醯基載體蛋白質(ACP)區段；及(d)一個β-酮脂醯基-ACP還原酶(KR)區段。
基因組選殖株Th23BOrfA_pBR812.1(指示為Th23BOrfA_pBR812.1基因組選殖株，呈包含來自破囊壺菌屬23B的OrfA基因序列之大腸桿菌質體載體形式)於2007年3月1日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-8232。基因組選殖株Th23BOrfA_pBR811 (指示為Th23BOrfA_pBR811基因組選殖株，呈包含來自破囊壺菌屬23B的OrfA基因序列之大腸桿菌質體載體形式)於2007年3月1日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-8231。
破囊壺菌屬23B開放讀碼區B(OrfB)：OrfB係一5805個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼出一1935個胺基酸序列。下列區段存在於Th.23B OrfB中：(a)一個β-酮脂醯基-ACP合成酶(KS)區段；(b)一個鏈長度因子(CLF)區段；(c)一個轉醯酶(AT)區段；及(d)一個烯醯基-ACP還原酶(ER)區段。基因組選殖株Th23BOrfB_pBR800(指示為Th23BOrfB_pBR800基因組選殖株，呈包含來自破囊壺菌屬23B的OrfB基因序列之大腸桿菌質體載體形式)於2007年3月1日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-8227。
破囊壺菌屬23B開放讀碼區C(OrfC)：OrfC係一4410個核苷酸序列(不包括終止密碼子)，其編碼出一1470個胺基酸序列。下列區段存在於Th.23B OrfC中：(a)二個FabA-似的β-羥基醯基-ACP脫水酶(DH)區段，二者皆對該FabA蛋白質(一種酵素，其催化反-2-癸烯醯基-ACP之合成，及此產物至順-3-癸烯醯基-ACP的可逆異構化反應)具有同源性；及(b)一個烯醯基-ACP還原酶(ER)區段，其對裂壺菌屬OrfB的ER區段具有高同源性。基因組選殖株 Th23BOrfC_pBR709A(指示為Th23BOrfC_pBR709A基因組選殖株，呈包含來自破囊壺菌屬23B的OrfC基因序列之大腸桿菌質體載體形式)於2007年3月1日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-8228。
嵌合或雜交的PUFA合成酶：在某些具體實例中，該PUFA合成酶包含選自於描述於本文的那些之任何區段，其中結合該等區段(例如，混合及匹配)以形成滿足描述於本文的最小需求之完全PUFA合成酶。在某些具體實例中，本發明之基因改造的有機體可進一步以另一種PUFA合成酶的至少一個區段或其生物活性片段改造。在某些具體實例中，可改造PUFA合成酶的自然結構其任何區段以改造或提高該區段在該PUFA合成酶系統中之功能(例如，改造該PUFA型式或其由該系統生產的比率)。此混合區段來產生嵌合的PUFA合成酶係描述在於本文提出的專利及公告中。
在某些具體實例中，該PUFA合成酶包含一裂壺菌屬PUFA合成酶，其中以來自破囊壺菌屬23B的OrfC置換該來自裂壺菌屬PUFA合成酶的OrfC。在某些具體實例中，此來自破囊壺菌屬23B之嵌合的OrfC係由已對裂壺菌屬密碼子使用最佳化之核酸序列編碼。至於此嵌合的OrfC之非為限制的實施例，質體pThOrfC-synPS(指示為pThOrfC-synPS，呈包含已對在裂壺菌屬或其它異種宿主中的表現性最佳化之“完美縫合(perfect stitch)”的合成破囊壺 菌屬23B PUFA PKS OrfC密碼子之大腸桿菌質體載體形式)於2007年3月1日寄存在美國菌種保存中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209 USA)中，及分配到ATCC登錄編號PTA-8229(亦參見U.S.Appl.Pub.No.2008/0022422)。
可使用在本發明之基因改造的有機體中之PUFA合成酶基因及多胜肽的其它實施例包括(但不限於)下列藉由進一步描述於本文的方法所產生之密碼子最佳化序列：SEQ ID NO：1(SzPUFA OrfA v3蛋白質)；SEQ ID NO：2(SzPUFA OrfB v3蛋白質)；SEQ ID NO：3(hSzThPUFA OrfC v3蛋白質)；SEQ ID NO：6(SzPUFA OrfA基因)；SEQ ID NO：7(SzPUFA OrfB v3基因)；及SEQ ID NO：8(hSzThPUFA OrfC v3基因)、和此序列的活性變異體、部分、片段或衍生物，其中此基因編碼或此多胜肽或蛋白質具有PUFA合成酶活性。本發明包括一包含一或多個此序列或由其組成之分離的多核苷酸或多胜肽。
可使用在本發明中的PUFA合成酶基因及多胜肽之其它實施例包括(但不限於)與描述於本文的PUFA合成酶基因或多胜肽之任何一種有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的PUFA合成酶基因或多胜肽。可在任何這些值間選擇有用的範圍(例如，80%至100%相同、85%至100%相同、90%至100%相同、95%至100%相同、80%至99%相同、85%至99%相同、90%至99%相同、或95%至99%相同)。可 使用在本發明之基因改造的有機體中之PUFA合成酶基因及多胜肽的又其它實施例包括(但不限於)描述於本文的PUFA合成酶或序列之任何一種的衍生物之活性變異體、部分、片段，其中此基因編碼或此多胜肽具有PUFA合成酶活性。
在某些具體實例中，該PUFA合成酶可係海藻PUFA合成酶。在某些具體實例中，該PUFA合成酶可包含一與該胺基酸序列SEQ ID NO：1有80%至100%相同、85%至100%相同、90%至100%相同、95%至100%相同、80%至99%相同、85%至99%相同、90%至99%相同、或95%至99%相同的胺基酸序列。在某些具體實例中，該PUFA合成酶可包含該胺基酸序列SEQ ID NO：1。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列可包含一與該核酸序列SEQ ID NO：6有80%至100%相同、85%至100%相同、90%至100%相同、95%至100%相同、80%至99%相同、85%至99%相同、90%至99%相同、或95%至99%相同的核酸序列。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列可包含該核酸序列SEQ ID NO：6。在某些具體實例中，該PUFA合成酶可包含一與該胺基酸序列SEQ ID NO：2有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%相同的胺基酸序列。在某些具體實例中，該PUFA合成酶可包含該胺基酸序列SEQ ID NO：2。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列可包含一與該核酸序列SEQ ID NO：7有至少80%、 至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的核酸序列。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列可包含該核酸序列SEQ ID NO：7。在某些具體實例中，該PUFA合成酶可包含一與該胺基酸序列SEQ ID NO：3有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%相同的胺基酸序列。在某些具體實例中，該PUFA合成酶包含該胺基酸序列SEQ ID NO：3。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含一與該核酸序列SEQ ID NO：8有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%相同的核酸序列。在某些具體實例中，該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含該核酸序列SEQ ID NO：8。
在某些具體實例中，該PUFA合成酶包含該胺基酸序列SEQ ID NO：1、2或3或其任何組合。在某些具體實例中，該PUFA合成酶包含該核酸序列SEQ ID NO：6、7或8或其任何組合。在某些具體實例中，該核酸序列編碼出該胺基酸序列SEQ ID NO：1、2或3、或其描述於本文的任何組合或同一性百分比。
在某些具體實例中，其它PUFA合成酶基因及/或多胜肽的序列可在由熟習人士熟知的文獻及生物資訊學資料庫中，使用於本文所揭示及可在技藝中獲得的序列來鑑別。例如，此序列可經由BLAST搜尋公開可獲得含有已知的PUFA合成酶基因或多胜肽序列之資料庫鑑別。在此方 法中，同一性可以Clustal W排比方法為基準，使用下列預設參數：GAP PENALTY=10，GAP LENGTH PENALTY=0.1，及Protein Weight Matrix係Gonnet 250系列。
額外來說，可使用於本文所揭示或技藝已知之PUFA合成酶基因或多胜肽序列來鑑別在本質上其它PUFA合成酶同源物。例如，於本文中所揭示的每個PUFA合成酶核酸片段可使用來分離基因編碼同源蛋白質。使用序列相依的方法來分離同源基因在技藝中熟知。該序列相依的方法之實施例包括(但不限於)(1)核酸雜交方法；(2)DNA及RNA放大方法，如由多種核酸放大技術之使用例示(例如，聚合酶連鎖反應(PCR)，慕里斯(Mullis)等人，美國專利案號4,683,202；接合酶(ligase)連鎖反應(LCR)，塔伯(Tabor)，S.等人，Proc.Acad.Sci.U.S.A.82：1074(1985)；或股置換放大(SDA)，沃克(Walker)等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992))；及(3)文庫構建及藉由互補篩選方法。
全部這些方法可由熟習該項技術者利用已知或已鑑別編碼出標的蛋白質之序列容易地實行。在某些具體實例中，環繞標的PUFA合成酶編譯序列的DNA序列亦在某些改造程序中有用，及可容易地由熟知技藝之人士在公開可獲得資料庫中找到。用來產生基因突變的方法常見及在技藝中熟知，且可應用至產生突變體的運用。
磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶
磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶類(PPTases)係一酵 素家族，其已經在脂肪酸合成、聚乙醯合成及非核醣體胜肽合成上充分標出特徵。特別是，存在於該PUFA合成酶酵素中的ACP區段需要藉由將來自輔酶A的輔因子(4-磷酸泛醯巰基乙胺)接附至醯基載體蛋白質(ACP)而活化。此輔因子之接附係藉由PPTases進行。若該宿主有機體的內生性PPTases不能活化該PUFA合成酶ACP區段時，則其需要提供一能進行該功能的PPTase。許多PPTases序列已知，及結晶結構已經決定(例如，魯特(Reuter)等人，EMBO J.18：6823-31(1999))和胺基酸殘基的突變分析對活性重要(莫菲德(Mofid)等人，Biochemistry 43：4128-36(2004))。
先前已經闡明用來識別描述於本文作為基質的OrfA ACP區段之異種PPTase的一個實施例係念珠藻PCC 7120(以前稱為魚腥藻PCC 7120)的Het I蛋白質。Het I在念珠藻屬中以基因簇顯現，其已知係合成長鏈羥基脂肪酸(其係存在於該有機體的異型細胞中之糖脂質層組分)的原由(布雷克(Black)及沃克(Wolk)，J.Bacteriol.176：2282-2292(1994)；坎貝爾(Campbell)等人，Arch.Microbiol.167：251-258(1997))。Het I有活化蛋白質Hgl E(存在於該簇中)之ACP區段的可能。Hgl E的二個ACP區段與在裂壺菌屬Orf A及其它PUFA合成酶中發現的ACP區段具有高程度之序列同源性。
在某些具體實例中，該PUFA合成酶可視為包含至少一個4’-磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)區段，或此區段可視為對該PUFA合成酶的輔助區段或蛋白質。 PPTases的結構及功能性特徵已經詳細描述例如在U.S.Appl.Pub.No.2002/0194641；U.S.Appl.Pub.No.2004/0235127；及U.S.Appl.Pub.No.2005/0100995中。
具有PPTase活性的基因及多胜肽之數個實施例在技藝中已知，及若它們能活化欲使用的特別PUFA合成酶之ACP區段時，其可使用在本發明之基因改造的有機體中。可使用在本發明之基因改造的有機體中之基因及多胜肽的實施例可包括(但不限於)下列進一步描述於本文之密碼子最佳化的序列：SEQ ID NO：5(NoHetI v3蛋白質)及SEQ ID NO：10(NoHetI v3基因)。
可使用在本發明之基因改造的有機體中之PPTase基因及多胜肽的其它實施例包括(但不限於)具有與描述於本文的任何一種PPTase或序列有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的PPTase基因或多胜肽。可在任何這些值間選擇有用的範圍(例如，80%至100%相同、85%至100%相同、90%至100%相同、95%至100%相同、80%至99%相同、85%至99%相同、90%至99%相同、或95%至99%相同)。可使用在本發明之基因改造的有機體中之PPTase基因及多胜肽的又其它實施例包括(但不限於)描述於本文的任何一種PPTase序列之活性變異體、片段、部分或衍生物，其中此基因編碼或此多胜肽具有PPTase活性。
在某些具體實例中，該PPTase可係海藻PPTase。在某些具體實例中，該PPTase可包含一與該胺基酸序列 SEQ ID NO：5有80%至100%相同、85%至100%相同、90%至100%相同、95%至100%相同、80%至99%相同、85%至99%相同、90%至99%相同或95%至99%相同的胺基酸序列。在某些具體實例中，該PPTase可包含該胺基酸序列SEQ ID NO：5。在某些具體實例中，該編碼出該PPTase的核酸序列可包含一與該核酸序列SEQ ID NO：10有80%至100%相同、85%至100%相同、90%至100%相同、95%至100%相同、80%至99%相同、85%至99%相同、90%至99%相同或95%至99%相同的核酸序列。在某些具體實例中，該編碼出PPTase的核酸序列可包含該核酸序列SEQ ID NO：10。在某些具體實例中，該核酸序列編碼出該胺基酸序列SEQ ID NO：5或其描述於本文的任何同一性百分比。
在本發明的某些具體實例中，可提供一PPTase用以在異種宿主中生產及/或累積PPTase。
在某些具體實例中，可使用編碼出PPTase的基因及/或多胜肽來鑑別另一種PPTase基因及/或多胜肽序列，及/或其可使用來鑑別在其它細胞中的PPTase同源性物。此PPTase編譯序列可例如在由熟習人士熟知的文獻及/或生物資訊資料庫中鑑別。例如，可經由BLAST(如上述揭示)搜尋公開可獲得含有已知的PPTase編碼DNA及多胜肽序列(諸如提供於本文的那些之任何)的資料庫，使用生物資訊學達成在另一種細胞型式中的PPTase編譯序列之鑑別。同一性係以Clustal W排比方法，使用下列預設參數為基準：GAP PENALTY=10，GAP LENGTH PENALTY=0.1，及Protein Weight Matrix係Gonnet 250系列。
在某些具體實例中，該基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分包括一PUFA合成酶及一PPTase。在某些具體實例中，該基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分在單一重組表現載體中包含該核酸序列(i)及(ii)。在某些具體實例中，該基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分在不同重組表現載體中包含該核酸序列(i)及(ii)。
醯基-CoA合成酶
本發明提供一種催化長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉換成醯基-CoA的醯基-CoA合成酶(ACoAS)蛋白質。該PUFA的內生性製造者(藉由裂壺菌屬之PUFA合成酶)擁有一或多種能將其PUFA合成酶的游離脂肪酸產物轉換成醯基-CoA之ACoAS。因此，裂壺菌屬和內生性包含PUFA合成酶的其它有機體(例如，其它破囊壺菌類)或可將PUFA FFAs轉換成醯基-CoAs的其它有機體(諸如假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)或寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii))，可代表在准許或增加表現於異種宿主中的PUFA合成酶之產物的累積上有用之基因編碼酵素來源。其它ACoAS序列已經描述在U.S.Appl.Pub.No.2007/0245431中。
數個具有ACoAS活性的基因及多胜肽之實施例在技藝中已知及可使用在本發明之基因改造的有機體中。可使用在本發明之基因改造的有機體中之基因及多胜肽的 實施例可包括(但不限於)下列進一步描述於本文之密碼子最佳化的序列：SEQ ID NO：4(SzACS-2v3蛋白質)及SEQ ID NO：9(hSzThACS-2 v3基因)。
可使用在本發明之基因改造的有機體中之ACoAS基因及多胜肽的其它實施例包括(但不限於)具有與描述於本文的ACoAS或序列之任何一種有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%序列同一性的ACoAS基因或多胜肽。可在任何這些值間選擇有用的範圍(例如，80%至100%相同、85%至100%相同、90%至100%相同、95%至100%相同、80%至99%相同、85%至99%相同、90%至99%相同、或95%至99%相同)。可使用在本發明之基因改造的有機體中之ACoAS基因及多胜肽的又其它實施例包括(但不限於)描述於本文的ACoAS序列之任何一種的活性變異體、片段、部分或衍生物，其中此基因編碼或此多胜肽具有ACoAS活性。
在某些具體實例中，該ACoAS可係海藻ACoAS。在某些具體實例中，該ACoAS可包含一與該胺基酸序列SEQ ID NO：4有80%至100%相同、85%至100%相同、90%至100%相同、95%至100%相同、80%至99%相同、85%至99%相同、90%至99%相同或95%至99%相同的胺基酸序列。在某些具體實例中，該ACoAS可包含該胺基酸序列SEQ ID NO：4。在某些具體實例中，該編碼出ACoAS的核酸序列可包含一與該核酸序列SEQ ID NO：9有80%至99%相同、85%至99%相同、90%至99%相同、80%至95%相 同或85%至95%相同的核酸序列。在某些具體實例中，該編碼出ACoAS的核酸序列可包含該核酸序列SEQ ID NO：9。在某些具體實例中，該編碼出ACoAS的核酸序列包含該核酸序列SEQ ID NO：34。在某些具體實例中，該核酸序列編碼出該胺基酸序列SEQ ID NO：4或其於本文描述的任何同一性百分比。
在本發明的某些具體實例中，ACoAS可提供用於在異種宿主中生產及/或累積ACoAS，和用於在內生性宿主中改良ACoAS之生產及/或累積。
在某些具體實例中，可使用編碼出ACoAS的基因及/或多胜肽來鑑別另一種ACoAS基因及/或多胜肽序列，及/或其可使用來鑑別在其它細胞中的ACoAS同源性物。此ACoAS編譯序列可例如在由熟習人士熟知的文獻及/或生物資訊學資料庫中鑑別。例如，可經由BLAST(如上述揭示)搜尋公開可獲得含有已知的ACoAS編碼DNA及多胜肽序列(諸如提供於本文的那些之任何)的資料庫，達成使用生物資訊學鑑別該在另一種細胞型式中的ACoAS編譯序列。同一性係以Clustal W排比方法，使用下列預設參數為基準：GAP PENALTY=10，GAP LENGTH PENALTY=0.1及Protein Weight Matrix係Gonnet 250系列。
在某些具體實例中，該基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細胞、組織或其部分包含一PUFA合成酶及一ACoAS；或一PUFA合成酶、一PPTase及一ACoAS。在某些具體實例中，該基因改造的植物(例如，大豆)、後代、細 胞、組織或其部分包含核酸序列(i)、(ii)或(iii)或其任何組合，其包含在單一重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)、(ii)及(iii)係包含在不同重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)及(ii)係包含在單一重組表現載體中，及該核酸序列(iii)係包含在不同重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)及(iii)係包含在單一重組表現載體中，及該核酸序列(ii)係包含在不同重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(ii)及(iii)係包含在單一重組表現載體中，及該核酸序列(i)係包含在不同重組表現載體中。在某些具體實例中，該核酸序列(i)、(ii)或(iii)或其任何組合係在一或多種種子專一性啟動子之控制下。
製得基因改造的有機體之方法
為了生產明顯高產率之一或多種想要的多元不飽和脂肪酸，可基因改造一植物以將PUFA合成酶引進該植物中。本發明亦關於改良或提高此基因改造的效率，及特別是，改良或提高PUFA合成酶的最後產物(例如，PUFA)之生產及/或累積的方法。
用於在基因改造的有機體(包括(但不限於)植物)中基因表現之方法在技藝中已知。在某些具體實例中，欲表現的PUFA合成酶基因之編譯區可對標的宿主細胞進行密碼子最佳化，如描述在下列。基因在重組宿主細胞(包括(但不限於)植物細胞)中的表現性可需要一操作連結至有興趣的編譯區之啟動子，及/或一轉錄終止子。可在基因之建 構載體中使用一數量的啟動子，包括(但不限於)種子專一性啟動子(例如，PvDlec2、LfKCS3、FAE 1、BoACP或BnaNapinC)或葉專一性啟動子(例如，泛素或CsVMV)。可使用在本發明中的啟動子之其它非為限制的實施例包括揭示在WO 1992/18634中之醯基載體蛋白質啟動子；揭示在下列中的四季豆β-菜豆蛋白啟動子及截斷倒位(truncated version)：史賴通(Slightom)等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：1897-1901；1983)；山古普塔(Sengupta)-勾帕蘭(Gopalan)等人(Proc.Nat.Acad.Sci.82：3320-3324；1985)；凡德吉斯特(van der Geest)等人(Plant Mol.Biol.33：553-557；1997)，及巴士托斯(Bustos)等人(EMBO J.10：1469-1479；1991)。
在本發明的某些具體實例中，重組載體係一經設計(例如，人工產生)的核酸分子，其使用作為操控核酸序列之選擇及將此核酸序列引進宿主細胞中的工具。因此，該重組載體合適於使用在選殖、定序及/或其它操控該核酸序列之選擇，諸如藉由將該選擇的核酸序列表現及/或傳遞進宿主細胞中以形成重組細胞。此載體典型包括異種核酸序列，其係未自然發現與欲選殖或傳遞的核酸序列毗連之核酸序列，雖然該載體亦可包括已自然發現與本發明的核酸分子毗連或對本發明的核酸分子之表現性有用的調控核酸序列(例如，啟動子、未轉譯的區域)。該載體可係RNA或DNA(原核或真核生物)，及典型為質體。該載體可維持如為染色體外的元素(例如，質體)，或其可整合進重組有機體 (例如，微生物或植物)的染色體中。整個載體可適當地存在於宿主細胞內，或在某些條件下，可刪除質體DNA，留下本發明的核酸分子。整合的核酸分子可在染色體啟動子控制下，在天然或質體啟動子控制下，或在數種啟動子控制之組合下。可將單一或多重核酸分子複製品整合進入染色體中。本發明的重組載體可包含至少一種可選擇的標誌。
在某些具體實例中，在本發明之重組核酸分子中所使用的重組載體係一表現載體。在此具體實例中，將編碼出欲產生的產物(例如，PUFA合成酶)之核酸序列插入該重組載體中以產生一重組核酸分子。以將該核酸序列操作連結至在載體中的調控序列之方式(其能夠讓該核酸序列於重組宿主細胞內轉錄及轉譯)，將編碼出欲產生的蛋白質之核酸序列插入該載體中。
對多種宿主有機體及細胞之轉形有用的載體常見且揭示在文獻中。典型來說，該載體包括可選擇的標誌及允許在想要的宿主中自主性複製或染色體接合之序列。此外，合適的載體可包含一藏匿轉錄起始控制的啟動子區域及一轉錄終止控制區域，在其之間可插入一編譯區DNA片段，以提供該插入的編譯區之表現性。二者控制區域可來自與該轉形的宿主細胞同源之基因，然而要瞭解此控制區域亦可來自對所選擇作為生產宿主的特定物種係非天然之基因。
本發明包括一或多種如於本文所描述及例示的醯基-CoA合成酶、與如於本文所描述的PUFA合成酶及與外 源PPTase之表現性，其單獨使用或與描述於本文的任何一或多種策略組合(例如，一、二、三或四種之任何：密碼子最佳化、細胞器標的、對丙二酸單醯基CoA的PUFA合成酶競爭之提高(例如，藉由FAS之抑制)、及/或一或多種轉醯酶或相關酵素的表現性)，以增加PUFA在異種宿主中的生產及/或累積。
本發明的某些具體實例係關於PUFA合成酶酵素、PPTase及/或任何一或多種輔助蛋白質之表現性標的、及/或對一或多種宿主的細胞器之標的基因改造。例如，在某些具體實例中，該PUFA合成酶系統及PPTase的表現性可把植物的質體作為標的。在某些具體實例中，該PUFA合成酶及PPTase的表現性把胞質液作為標的。在某些具體實例中，該PUFA合成酶及PPTase的表現性把植物之質體及胞質液二者作為標的。在任何這些具體實例中，可將其它標的引導至該質體或胞質液。
在某些具體實例中，該醯基-CoA合成酶表現在胞質液中以將DHA及/或其它LC-PUFA游離脂肪酸轉換成醯基-CoAs，其依次可由轉醯酶使用。
多種質體標的序列在技藝中已知及可使用在該異種宿主係植物或植物細胞及想要將該質體作為標的之具體實例中。
本發明包括使用含有如描述於本文的PUFA合成酶及含有外源的PPTase之表現性的細胞器標的(例如，在植物中的質體或葉綠體)，其單獨使用或與描述於本文之任何 一或多種策略組合(例如，任何一、二、三或四種：密碼子最佳化、對丙二酸單醯基CoA的PUFA合成酶競爭之提高(例如，藉由FAS之抑制)、一或多種醯基-CoA合成酶的表現性、及/或一或多種轉醯酶或相關酵素的表現性)，以增加PUFA在異種宿主中之生產及/或累積。
基因產物把質體或葉綠體作為標的之控制係藉由在多種蛋白質的胺基終端末端處找到之訊息序列進行，及該序列係在匯入產生該成熟蛋白質期間被切割(例如，關於葉綠體標的，參見例如，科馬伊(Comai)等人，J.Biol.Chem.263：15104-15109(1988))。這些訊號序列可融合至異種基因產物以實現異種產物輸入葉綠體中(凡登布洛克(van den Broeck)等人，Nature 313：358-363(1985))。可從編碼出RUBISCO蛋白質、CAB蛋白質、EPSP合成酶酵素、GS2蛋白質及許多已知被葉綠體定域的其它蛋白質之cDNAs分離出用於適當訊號序列的DNA編碼。
在本發明的某些具體實例中，在本發明中所使用的蛋白質之定域係有關於一種亞細胞區室(subcellular compartment)，例如，質體或葉綠體。蛋白質可藉由在其胺基終端處包括一葉綠體運送胜肽(CTP)傳至葉綠體。類似地，蛋白質可藉由在其N-終端處包括一質體運送或發信胜肽傳至質體。
自然發生的葉綠體標的蛋白質(其經合成如為較大的前驅物蛋白質，其包括將該前驅物傳至葉綠體運輸機組(import machinery)的胺基終端葉綠體標的胜肽)在技藝 中熟知。葉綠體標的胜肽通常藉由位於葉綠體細胞器內的特定內切蛋白酶切割，因此釋放出成熟標的物及可將來自該前驅物的酵素活化進葉綠體周圍環境中。合適於將該基因或基因產物標的傳至該植物細胞之葉綠體或質體的序列編碼胜肽之實施例包括矮牽牛屬(petunia)EPSPS CTP、阿拉伯芥屬EPSPS CTP2及插入序列、及由熟習該項技術者已知的其它胜肽。此標的序列提供將想要表現的蛋白質轉移至可在其中最有效作用的細胞結構，或將想要表現的蛋白質轉移至想要顯型的功能所需要之細胞過程集中的細胞區域。葉綠體標的胜肽的特定實施例在技藝中熟知及包括擬南芥(Arabidopsis thaliana)核酮糖雙磷酸羧化酶小次單位ats1A運送胜肽、擬南芥EPSPS運送胜肽、及玉米(Zea maize)核酮糖雙磷酸羧化酶小次單位運送胜肽。
最佳化的運送胜肽已例如由凡登布洛克等人描述，Nature，313：358-363(1985)。原核及真核生物訊號序列係例如由米迦勒斯(Michaelis)等人揭示，Ann.Rev.Microbiol.36：425(1982)。可使用在本發明中的運送胜肽之額外實施例包括葉綠體運送胜肽，諸如描述在凡黑內(Von Heijne)等人，Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126(1991)；馬惹(Mazur)等人，Plant Physiol.85：1110(1987)；弗斯特(Vorst)等人，Gene 65：59(1988)中的那些。陳(Chen)及賈珍朵夫(Jagendorf)(J.Biol.Chem.268：2363-2367(1993))已描述出使用葉綠體運送胜肽來運輸異種轉殖基因。所使用的此胜肽係來自皺葉菸草(Nicotiana plumbaginifolia)的rbcS 基因之運送胜肽(抛爾森(Poulsen)等人，Mol.Gen.Genet.205：193-200(1986))。已於本文中作用以將異種蛋白質定位至葉綠體的一種CTP係來自大油菜(Brassica napus)醯基-ACP硫酯酶。
另一種用以將基因定位至葉綠體或質體的方法包括葉綠體或質體轉形。可產生僅有葉綠體DNA已經改變而併入在本申請案中所設想的分子之重組植物。在葉綠體中作用的啟動子於技藝中已知(漢雷(Hanley)-包登(Bowden)等人，Trends in Biochemical Sciences 12：67-70(1987))。獲得包含已經插入異種DNA之葉綠體的細胞之方法及組成物已經例如由丹尼爾(Daniell)等人(美國專利案號5,693,507)及馬利加(Maliga)等人(美國專利案號5,451,513)描述。
策略組合
根據本發明，在生產用於一或多種標的PUFA之生產及累積的異種宿主時，可使用任何一或多種(任何組合)描述於本文用以改良PUFA在宿主中之生產及/或累積的策略。更確切來說，已預期多種策略組合將係加成性或協同性及提供改良的PUFA生產及/或累積，如與缺乏一或多種此策略比較。更確切來說，該等實施例提供在宿主有機體中生產PUFA的範例性策略。
使用這些改造組合的任何植物或植物細胞，或描述於本文的任何其它改造或改造之組合皆由本發明所包含。在某些具體實例中，此植物已經進一步基因改造以表現出如描述於本文的輔助蛋白質，用以改良宿主(例如， ACoAS、GPAT、LPAAT、DAGAT或乙醯基CoA羧化酶(ACCase))的PUFA之生產及/或累積(或PUFA合成酶的其它生物活性產物)。再者，使用描述於本文的任何改造或改造的組合之任何宿主細胞或有機體皆由本發明所包含，如係來自此細胞或有機體的任何產物，包括包含該標的PUFA的種子或油。
在某些具體實例中，根據本發明之基因改造的植物(例如，植物宿主細胞)包括(但不限於)任何高等植物，包括雙子葉及單子葉植物二者，及特別是消耗性植物，包括農作物植物及特別是使用其油的植物。此植物可包括(但不限於)例如：大豆、油菜籽、亞麻子、玉米、紅花類、向日葵類及煙草。因此，可選擇任何植物物種或植物細胞。在某些具體實例中，該植物係蠶豆科(豆科、莢豆科、豌豆科、豆子科或豆科(pulse family))。在某些具體實例中，該植物係大豆屬。在某些具體實例中，該植物係白大豆、阿芬諾塔大豆、沙生大豆、銀毛大豆、灰毛大豆、隱秘大豆、彎莢大豆、彎裂片大豆、鐮莢大豆、細頸大豆、硬毛莖大豆、亞種小硬毛莖大豆、乳綠大豆、寛葉大豆、紫色大豆、小葉大豆、蒙帝斯-道格拉斯大豆、佩洛托沙大豆、澎湖大豆、屏大尼卡大豆、普連尼大豆、鏽紅大豆、史丹諾菲塔大豆、連結大豆、烟豆、短絨葉大豆、鳥豆或黃豆(大豆)。在某些具體實例中，該植物係花生、豆類(四季豆)、蠶豆(胡豆)或豌豆(荷蘭豆)。
如於本文中所使用，“植物部分”包括植物的任何 部分，包括(但不限於)種子(包括成熟種子及未成熟種子)、花粉、胚胎、花卉、果實、幼芽、葉子、根、莖、外植體等等。在某些具體實例中，經基因改造的植物具有從其正常(例如，野生型或自然發生)形式改造(例如，突變或改變)之基因組，如此達成想要的結果(例如，增加或改造的PUFA合成酶及/或使用該PUFA合成酶生產及/或累積想要的產物)。在某些具體實例中，可使用標準菌株發展及/或分子基因技術達成植物的基因改造。用來生產轉殖基因植物之方法在技藝中已知，其中將編碼出想要的胺基酸序列之重組核酸分子併入該植物的基因組中。在某些具體實例中，根據本發明之基因改造的植物係合適於由動物(包括人類)消耗的植物。
可產生、選擇或鑑別來自這些植物已對特別想要的特性最佳化(例如，抗病性、植物轉形容易、油含量或曲線等等)之植物品種。在某些具體實例中，該植物品種可透過植物育種，或透過諸如標記輔助育種(marker assisted breeding)及耕作方法選擇。在某些具體實例中，可使用植物細胞培養物，及其例如係未生長成分化植物及使用普通的農業實施耕種，而是替換在液體媒質中生長及維持。
在某些具體實例中，該植物可係油種子植物，其中該油種子及/或在該油種子中的油包含由該PUFA合成酶所生產之PUFA。在某些具體實例中，此油可包含可偵測量之至少一種標的或主要PUFA(其係PUFA合成酶的產物)。在某些具體實例中，此油可實質上無非為標的或主要PUFA產 物之中間物或側產物，及其未由在野生型植物中的內生性FAS系統自然產生(例如，野生型植物經由FAS系統產生某些較短或中鏈PUFA(諸如18碳PUFA)，但是將由於以PUFA合成酶基因改造而在該植物中生產新或額外的脂肪酸)。
關於基因改造的植物之生產，植物的基因工程方法在技藝中熟知。例如，已經發展出數種用於植物轉形的方法，包括用於雙子葉植物和單子葉植物之生物及生理轉形方法(例如，後藤-文之(Goto-Fumiyuki)等人，Nature Biotech 17：282-286(1999)；三木(Miki)等人，在植物分子生物學及生物工藝學中的方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)，葛利克(Glick)，B.R.及松普森(Thompson)，J.E.編輯，CRC出版社公司(CRC Press,Inc.)，布卡拉通(Boca Raton)，PP.67-88(1993))。此外，可例如在葛拉伯(Gruber)等人，在植物分子生物學及生物工藝學中的方法，葛利克，B.R.及松普森，J.E.編輯，CRC出版社公司，布卡拉通，PP.89-119(1993)中獲得用於植物細胞或組織轉形及植物再產生的載體及試管內培養方法。
本發明獲得一種包含選自於SEQ ID NO：6-10的核酸序列之分離的核酸分子，和一種包含如描述於本文的此序列之改造或突變的分離的核酸分子。本發明獲得一種包含選自於SEQ ID NO：1-5的胺基酸序列之分離的多胜肽，和一種包含如描述於本文的改造或突變或此序列之分離的多胜肽。
本發明包括一重組表現載體pDAB7361。本發明 包括一重組表現載體pDAB7362。本發明包括一重組表現載體pDAB7363。本發明包括一重組表現載體pDAB7365。本發明包括一重組表現載體pDAB7368。本發明包括一重組表現載體pDAB7369。本發明包括一重組表現載體pDAB7370。本發明包括一重組表現載體pDAB100518。本發明包括一重組表現載體pDAB101476。本發明包括一重組表現載體pDAB9166。本發明包括一重組表現載體pDAB9167。本發明包括一重組表現載體pDAB7379。本發明包括一重組表現載體pDAB7380。本發明包括一重組表現載體pDAB9323。本發明包括一重組表現載體pDAB9330。本發明包括一重組表現載體pDAB9337。本發明包括一重組表現載體pDAB9338。本發明包括一重組表現載體pDAB9344。本發明包括一重組表現載體pDAB9396。本發明包括一重組表現載體pDAB101412。本發明包括一重組表現載體pDAB7733。本發明包括一重組表現載體pDAB7734。本發明包括一重組表現載體pDAB101493。本發明包括一重組表現載體pDAB109507。本發明包括一重組表現載體pDAB109508。本發明包括一重組表現載體pDAB109509。本發明包括一重組表現載體pDAB9151。本發明包括一重組表現載體pDAB108207。本發明包括一重組表現載體pDAB108208。本發明包括一重組表現載體pDAB108209。本發明包括一重組表現載體pDAB9159。本發明包括一重組表現載體pDAB9147。本發明包括一重組表現載體pDAB108224。本發明包括一重組表現載體 pDAB108225。
本發明包括一包含重組表現載體pDAB7361的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB7362的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB7363的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB7365的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB7368的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB7369的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB7370的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB100518的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB101476的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9166的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9167的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。
本發明包括一包含重組表現載體pDAB7379的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB7380的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9323的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。 本發明包括一包含重組表現載體pDAB9330的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9337的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9338的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9344的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9396的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB101412的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB7733的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB7734的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。
本發明包括一包含重組表現載體pDAB101493的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB109507的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB109508的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB109509的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9151的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB108207的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB108208的大豆植 物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB108209的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9159的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB9147的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB108224的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。本發明包括一包含重組表現載體pDAB108225的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。
如於本文中所使用，用語“轉染”使用來指為可將外源核酸分子(例如，重組核酸分子)插入細胞中的任何方法。用語“轉形”可與用語“轉染”互換地使用，當此用語使用來指出將核酸分子引進微生物的細胞(諸如藻類、細菌及酵母菌)或植物細胞中時。在微生物及植物系統中，用語“轉形”使用來描述一由於由該微生物或植物取得外源核酸而經遺傳獲得改變，及其基本上與用語“轉染”同義。在某些具體實例中，轉染技術包括(但不限於)轉形、粒子轟擊、擴散、主動運輸、超音波浴、電穿孔法、顯微注射法、微脂粒感染(lipofection)、吸附、感染及原生質體融合。
廣泛使用來將表現載體引進植物中的方法係以農桿菌屬(Agrobacterium)的自然轉形系統為基礎。候趣(Horsch)等人，Science 227：1229(1985)。農桿菌(A.tumefaciens)及毛根農桿菌(A.rhizogenes)係已知對基因轉形植物細胞有用的植物致病性土壤細菌。農桿菌及毛根農 桿菌的Ti及Ri質體各別攜帶是植物基因轉形的原由之基因。卡豆(Kado)，C.I.，Crit.Rev.Plant.Sci.10：1(1991)。農桿菌屬載體系統及農桿菌屬介導性基因轉移的方法之描述亦可獲得，例如，葛拉伯等人，前述；三木等人，前述；莫洛尼(Moloney)等人，Plant Cell Reports 8：238(1989)；及美國專利案號4,940,838及5,464,763。
另一種已知的植物轉形方法係微粒(microprojectile)介導性轉形，其中DNA係攜帶在微粒表面上。在此方法中，以基因鎗(biolistic)裝置(其將微粒加速至足以穿透植物細胞壁及薄膜的速度)將該表現載體引進植物組織中。山福特(Sanford)等人，Part.Sci.Technol.5：27(1987)，山福特，J.C.，Trends Biotech.6：299(1988)，山福特，J.C.，Physiol.Plant 79：206(1990)，克蘭(Klein)等人，Biotechnology 10：268(1992)。
更另一種用於將DNA生理傳遞至植物的方法係標的細胞之超音波法。張(Zhang)等人，Bio/Technology 9：996(1991)。同樣地，已經使用脂粒或球形質體融合來將表現載體引進植物中。戴斯黑斯(Deshayes)等人，EMBO J.，4：2731(1985)，克里斯濤(Christou)等人，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：3962(1987)。亦已報導出使用CaCl2 析出、聚乙烯醇或聚-L-鳥胺酸，讓DNA直接吸收進入原生質體中。罕(Hain)等人，Mol.Gen.Genet.199：161(1985)及追普(Draper)等人，Plant Cell Physiol.23：451(1982)。亦已描述出原生質體及全部細胞及組織之電穿孔法。冬(Donn) 等人，植物細胞及組織培養第VII屆國際會議摘要(Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture)IAPTC，A2-38，p.53(1990)；狄哈侖(D’Halluin)等人，Plant Cell 4：1495-1505(1992)及史班蛇(Spencer)等人，Plant Mol.Biol.24：51-61(1994)。額外地，亦可使用聚碳化矽鬚晶(凱普勒(Kaepler)等人，1990，Plant Cell Reports)及在植物轉形中使用例如花卉浸泡方法(克勞夫(Clough)及班特(Bent)，Plant J.16：735-743(1998))。精確的植物轉形方法可依所選擇的植物物種及所選擇用於轉形的植物細胞型式(例如，幼苗取得的細胞型式，諸如下胚軸及子葉或胚胎組織)而稍微變化。
在將基因建構體引進植物細胞中後，植物細胞可生長及在分化的組織(諸如幼芽及根)出苗後，可產生成熟植物。在某些具體實例中，可產生複數株植物。再生植物之方法已由一般熟知此技藝之人士知曉，及可例如在下列中找到：植物細胞及組織培養(Plant Cell and Tissue Culture)，1994，伐西爾(Vasil)及梭佩(Thorpe)編輯，克魯爾學術出版社(Kluwer Academic Publishers)；及植物細胞培養方法(分子生物學方法(Methods in Molecular Biology)，111，1999，霍爾(Hall)編輯，胡瑪娜出版社(Humana Press))。
在某些具體實例中，描述於本文之基因改造的植物可在發酵媒質中培養或在合適的媒質(諸如土壤)中生長。在某些具體實例中，高等植物之合適的生長媒質可包括任何用於植物的生長媒質，包括(但不限於)土壤、沙、任 何支撐根生長的其它微粒媒質(例如，蛭石、珍珠岩等等)或水耕栽培，和合適的光、水及最佳化高等植物生長的營養補充品。
將由熟習該項技術者察知，重組DNA技術之使用可藉由操控例如在宿主細胞內的核酸分子之複製品數目、那些核酸分子的轉錄效率、所產生的轉錄之轉譯效率及後轉譯改造的效率來改良經轉染的核酸分子之表現性的控制。額外地，該啟動子序列可經基因設計以改良表現性的程度(如與天然啟動子比較)。對控制核酸分子之表現性有用的重組技術包括(但不限於)將核酸分子接合進入一或多個宿主細胞染色體中、將載體穩定性序列加入至質體、轉錄控制訊號(例如，啟動子、操作子、增強子)之替換或改造、轉譯控制訊號(例如，核糖體結合位置、夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列)的替換或改造、核酸分子之改造以與宿主細胞的密碼子使用相應、及消除讓轉錄不穩定的序列。
在某些具體實例中，該植物可包括已知生產使用作為醫藥品、調味劑、營養劑、功能性食物原料或化妝活性試劑的化合物之那些植物、或經基因設計以生產這些化合物/試劑的植物。
本發明的這些具體實例全部皆應用至任何經基因改造的有機體之討論，及如描述於本文之此有機體的生產及使用方法。
來自基因改造的有機體之產物
在某些具體實例中，本發明之基因改造的有機體 生產一或多種多元不飽和脂肪酸，包括(但不限於)EPA(C20：5，n-3)、DHA(C22：6，n-3)、DPA(C22：5，n-6或n-3)、ARA(C20：4，n-6)、GLA(C18：3，n-6)、ALA(C18：3，n-3)及/或SDA(C18：4，n-3))；及在某些具體實例中，一或多種較長鏈PUFA，包括(但不限於)EPA(C20：5，n-3)、DHA(C22：6，n-3)、DPA(C22：5，n-6或n-3)或DTA(C22：4，n-6)、或其任何組合。在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物生產一或多種多元不飽和脂肪酸，包括(但不限於)EPA(C20：5，n-3)、DHA(C22：6，n-3)及/或DPA(C22：5，n-6或n-3)、或其任何組合。在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物不具有高油酸背景。
在某些具體實例中，該基因改造的有機體係一種已經基因改造以重組表現出PUFA合成酶及PPTase的植物，如描述於本文般。在某些具體實例中，此植物已經進一步基因改造以表現出如描述於本文的輔助蛋白質，用以改良宿主(例如，ACoAS、GPAT、LPAAT、DAGAT或ACCase)生產及/或累積PUFA(或PUFA合成酶的其它生物活性產物)。
本發明的某些具體實例包括生產想要的鏈長度與想要的雙鍵數目之多元不飽和脂肪酸，及推而廣之，包含這些PUFA的油種子及從描述於本文之基因改造的植物所獲得的油(例如，從此植物之油或種子獲得)。可由本發明生產的PUFA之實施例包括(但不限於)DHA(廿二碳六烯酸(C22：6，n-3))、ARA(廿碳四烯酸或花生四烯酸(C20：4， n-6))、DPA(廿二碳五烯酸(C22：5，n-6或n-3))、及EPA(廿碳五烯酸(C20：5，n-3))、及其任何組合。本發明允許藉由發展基因改造的植物，透過使用生產PUFA的PUFA合成酶來生產商業有用、富含一或多種想要的(標的或主要)PUFA之脂質。
在某些具體實例中，所提供來自特別的有機體之PUFA合成酶將生產特別的PUFA，如此來自特別的有機體之PUFA合成酶的選擇將導致具體指定的標的或主要PUFA生產。在某些具體實例中，PUFA的比率可依特別的PUFA合成酶之選擇及該系統如何對表現出其的特定條件反應而不同。例如，使用來自破囊壺菌屬23B(ATCC編號20892)的PUFA合成酶亦可導致DHA及DPA(n-6)生產，如為標的或主要PUFA；但是，在破囊壺菌屬23B的情況中，DHA對DPA(n-6)的比率係10：1(及範圍可係8：1至40：1)，然而在裂壺菌屬中，該比率典型係2.5：1。在某些具體實例中，所提供的PUFA合成酶可藉由交互混合來自不同PUFA合成酶的蛋白質及區段改造，或可改造所提供的PUFA合成酶之區段或蛋白質以改變該標的PUFA產物及/或比率。
在某些具體實例中，對生產PUFA的酵素系統之“中間產物”或“側產物”之參照指為任何產物(及特別是，脂肪酸產物)，其係由於標的或主要PUFA系統之生產而由該酵素系統產生，但是其非為主要或標的PUFA。在某些具體實例中，該中間物及側產物可包括由野生型植物或由使用作為所指定的基因改造之接受者的母植物自然產生之非標 的脂肪酸，但是現在因為它們由於該基因改造而較大程度地生產(如與由野生型植物或由使用作為所指定的基因改造之接受者的母植物所生產之程度比較)而分類為中間物或側產物。在某些具體實例中，一種酵素系統之主要或標的PUFA可係不同酵素系統的中間物，其中該主要或標的產物係不同的PUFA。例如，當使用標準途徑來生產EPA時，將生產明顯量的脂肪酸(諸如GLA、DGLA及SDA)如為中間產物(例如，U.S.Appl.Pub.No.2004/0172682)。類似地及亦由U.S.Appl.Pub.No.2004/0172682闡明，當使用該標準途徑來生產DHA時，除了上述提及之脂肪酸外，可生產明顯量的ETA及EPA(在上述第一實施例中，明顯為標的PUFA)及可以明顯較大的量存在(相對於總脂肪酸產物，超過該標的PUFA其自身)。
在某些具體實例中，為了生產明顯高產率之一或多種想要的多元不飽和脂肪酸，可基因改造該植物以將PUFA合成酶系統引進該植物中。植物未知會內生性包含PUFA合成酶，因此，本發明代表一生產出具有獨特脂肪酸生產能力之植物的機會。本發明提供一種經基因設計的植物以在相同植物中生產一或多種PUFA，包括(但不限於)EPA、DHA、DPA(n3或n6)、ARA、GLA、SDA及其它，包括其任何組合。本發明提供以多種比率及形式產生一些“設計者油”之任何一種的能力。在某些具體實例中，使用來自描述於本文的特別海洋有機體之PUFA合成酶可擴大PUFA生產範圍，及在使用來生長大部分農作物植物的溫度 範圍內成功地生產此PUFA。
在某些具體實例中，用來合成PUFA的系統“實質上無“中間物或側產物或不具有實質量的中間物或側產物存在，此意謂著在基因改造的植物(及/或植物的部分及/或種子油部分)中所生產的任何中間物或側產物脂肪酸(非標的PUFA)(由於用來產生PUFA的酵素系統之引進或存在，例如，其未由野生型植物或使用作為所指定的基因改造之接受者的母植物生產)可以下列量存在：少於10%(以總脂肪酸的重量計)、少於9%(以總脂肪酸的重量計)、少於8%(以總脂肪酸的重量計)、少於7%(以總脂肪酸的重量計)、少於6%(以總脂肪酸的重量計)、少於5%(以總脂肪酸的重量計)、少於4%(以總脂肪酸的重量計)、少於3%(以總脂肪酸的重量計)、少於2%(以總脂肪酸的重量計)、少於1%(以總脂肪酸的重量計)或少於0.5%(以總脂肪酸的重量計)。
在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分，或從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分獲得之油或種子包含可偵測的量之DHA(廿二碳六烯酸(C22：6，n-3))、DPA(n-6)(廿二碳五烯酸(C22：5，n-6))或EPA(廿碳五烯酸(C20：5，n-3))。在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分，或從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分獲得之油或種子包含至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、 至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少2.5%、至少3%、至少3.5%、至少4%、至少4.5%、至少5%、至少5.5%、至少6%、至少6.5%、至少7%、至少7.5%、至少8%、至少8.5%、至少9%、至少9.5%、至少10%、至少10.5%、至少11%、至少11.5%、至少12%、至少12.5%、至少13%、至少13.5%、至少14%、至少14.5%或至少15%的DHA(以總脂肪酸的重量計)。可在任何這些值間選擇有用的範圍，例如，0.01%至15%、0.05%至10%及1%至5%的DHA(以總脂肪酸的重量計)。
在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分，或從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分獲得的油或種子包含至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少2.5%、至少3%、至少3.5%、至少4%、至少4.5%、至少5%、至少5.5%、至少6%、至少6.5%、至少7%、至少7.5%、至少8%、至少8.5%、至少9%、至少9.5%或至少10%的EPA(以總脂肪酸的重量計)。可在任何這些值間選擇有用的範圍，例如，0.01%至10%、0.05%至5%及0.1%至5%的EPA(以總脂肪酸的重量計)。
在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物、 後代、細胞、組織或其部分，或從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分獲得的油或種子包含至少0.01%、至少0.02%、至少0.03%、至少0.04%、至少0.05%、至少0.06%、至少0.07%、至少0.08%、至少0.09%、至少0.1%、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少0.6%、至少0.7%、至少0.8%、至少0.9%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少2.5%、至少3%、至少3.5%、至少4%、至少4.5%、至少5%、至少5.5%、至少6%、至少6.5%、至少7%、至少7.5%、至少8%、至少8.5%、至少9%、至少9.5%或至少10%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)。可在任何這些值間選擇有用的範圍，例如，0.01%至10%、0.01%至5%、0.01%至1%、0.01%至0.05%、0.05%至5%及0.1%至5%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)。
在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分，或從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分獲得的油或種子包含EPA：DHA比率係至少1：1、至少1：1.5、至少1：2、至少1：2.5、至少1：3、至少1：3.5、至少1：4、至少1：4.5、至少1：5、至少1：5.5、至少1：6、至少1：6.5、至少1：7、至少1：7.5、至少1：8、至少1：8.5、至少1：9、至少1：10、至少1：11、至少1：12、至少1：13、至少1：14、至少1：15、至少1：16、至少1：17、至少1：18、至少1：19、至少1：20、至少1：21、至少1：22、至少1：23、至少1：24、至少1：25、至少1：26、至少1：27、至少1：28、至少1：29 或至少1：30(以總脂肪酸的重量計)。可在任何這些值間選擇有用的範圍，例如，EPA：DHA比率係1：1至1：30、1：1至1：25、1：1至1：20、1：1至1：15、1：1至1：10、1：1至1：5、1：1至1：3及1：1至1：2(以總脂肪酸的重量計)。
在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分，或從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分獲得的油或種子包含DPA(n-6)：DHA之比率係至少1：1、至少1：1.5、至少1：2、至少1：2.5、至少1：3、至少1：3.5、至少1：4、至少1：4.5、至少1：5、至少1：5.5、至少1：6、至少1：6.5、至少1：7、至少1：7.5、至少1：8、至少1：8.5、至少1：9或至少1：10(以總脂肪酸的重量計)。可在任何這些值間選擇有用的範圍，例如，DPA(n-6)：DHA之比率係1：1至1：10、1：1至1：5、1：1至1：3及1：1至1：2(以總脂肪酸的重量計)。
在某些具體實例中，從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分或種子獲得的油包含至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%的三酸甘油脂(以該油的重量計)。在某些具體實例中，從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分或種子獲得的油包含70%至99%三酸甘油脂(以該油的重量計)、75%至99%三酸甘油脂(以該油的重量計)、80%至99%三酸甘油脂(以該油的重量計)、85%至99%三酸甘油脂(以該油的重量計)或90%至99%三酸甘油脂(以該油的重 量計)。用來純化及分析三酸甘油脂的方法已經描述(例如，魯伊斯-古鐵雷斯(Ruiz-Gutierrez)V及巴隆(Barron)LJ，J.Chromatogr.B.Biomed.Appl.，671：133-168，1995)。
在某些具體實例中，當該PUFA合成酶系統之標的產物係一長鏈PUFA(諸如，DHA、DPA(n-6或n-3)或EPA)時，在經基因改造含有此PUFA合成酶系統的植物之總脂質中，未以實質量存在的中間產物及側產物可包括(但不限於)：γ-次亞麻油酸(GLA；18：3，n-6)；硬脂酮酸(stearidonic acid)(STA或SDA；18：4，n-3)；二高-γ-次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3，n-6)；花生四烯酸(ARA，C20：4，n-6)；廿碳三烯酸(ETA；20：3，n-9)及多種其它中間物或側產物，諸如20：0；20：1(△5)；20：1(△11)；20：2(△8，11)；20：2(△11，14)；20：3(△5，11，14)；20：3(△11，14，17)；米德酸(mead acid)(20：3；△5，8，11)；或20：4(△5，1，14，17)。
根據本發明之植物的基因改造可導致由該植物生產一或多種PUFA。在某些具體實例中，由該植物產生的PUFA曲線及PUFA比率不需與由取得該PUFA合成酶之有機體所產生的PUFA曲線或PUFA比率相同。
在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分可經設計以經由該PUFA合成酶之活性生產PUFA。在某些具體實例中，該PUFA可透過從該植物、後代、細胞、組織或其部分萃取出化合物之純化方法回收。在某些具體實例中，該PUFA可藉由採集該植 物、後代、細胞、組織或其部分回收。在某些具體實例中，該PUFA可藉由採集來自該植物、後代、細胞、組織或其部分(例如，來自該油種子)之油或來自該植物、後代、細胞、組織或其部分之種子回收。在某些具體實例中，該植物、後代、細胞、組織或其部分亦可以其自然狀態消耗或進一步加工成可消耗的產物。
在某些具體實例中，本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分可生產一或多種多元不飽和脂肪酸。在某些具體實例中，該植物、後代、細胞、組織或其部分可生產(例如，在其成熟種子中(若係油種子植物時)，或在油種子植物的種子之油中)至少一種PUFA(標的PUFA)，及其中在累積PUFA的植物或植物之部分(例如，成熟種子(若該植物係一油種子植物時)，或油種子植物的種子之油)中的總脂肪酸曲線包含一可偵測的量之此PUFA。在某些具體實例中，該標的PUFA係至少20個碳的PUFA且包含至少3個雙鍵、至少4個雙鍵或至少5個雙鍵。在某些具體實例中，該標的PUFA可係不由該植物自然生產的PUFA。在某些具體實例中，在累積PUFA的植物或植物之部分(包括該植物的種子油)中的總脂肪酸曲線包含至少0.1%的該標的PUFA(以總脂肪酸的重量計)、至少0.2%、至少0.3%、至少0.4%、至少0.5%、至少1%、至少1.5%、至少2%、至少2.5%、至少3%、至少3.5%、至少4%、至少4.5%、至少5%、至少5.5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至 少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、多於75%的至少一種多元不飽和脂肪酸(該標的PUFA)(以總脂肪酸的重量計)，或0.1%至75%或大於75%(最高100%或100%)之任何百分比的標的PUFA(以0.1%增值)。
如於本文中所使用，對PUFA的百分比量之參照係以所萃取的總脂肪酸之重量的百分比計，除非其它方面有描述。在某些具體實例中，藉由氣相層析法(GC)分析脂肪酸甲基酯(FAME)製劑來測量總脂肪酸，然而總脂肪酸的測量不限於此方法。
在某些具體實例中，在本發明的植物(及/或後代、細胞、組織或其部分或種子油部分)中之總脂肪酸可包含少於10%(以由該植物生產的總脂肪酸之重量計)、少於9%(以由該植物所生產的總脂肪酸之重量計)、少於8%(以由該植物、後代、細胞、組織或其部分所產生之總脂肪酸的重量計)、少於7%(以由該植物、後代、細胞、組織或其部分所生產之總脂肪酸的重量計)、少於6%(以由該植物、後代、細胞、組織或其部分所產生之總脂肪酸的重量計)、少於5%(以由該植物、後代、細胞、組織或其部分所產生之總脂肪酸的重量計)、少於4%(以由該植物、後代、細胞、組織或其部分所產生之總脂肪酸的重量計)、少於3%(以由該植物、後代、細胞、組織或其部分所產生之總脂肪酸的重量計)、少於2%(以由該植物、後代、細胞、組織或其部分所產生之總脂肪酸的重量計)、少於1%(以由該植物、後代、細胞、組織或其部分所產生之總脂肪酸的重量計)之選自於 下列的脂肪酸：γ-次亞麻油酸(GLA；18：3，n-6)；硬脂酮酸(STA或SDA；18：4，n-3)；二高-γ-次亞麻油酸(DGLA或HGLA；20：3，n-6)；花生四烯酸(ARA，C20：4，n-6)；廿碳三烯酸(ETA；20：3，n-9)及多種其它脂肪酸，諸如20：0；20：1(△5)；20：1(△11)；20：2(△8，11)；20：2(△11，14)；20：3(△5，11，14)；20：3(△11，14，17)；米德酸(20：3；△5，8，11)；或20：4(△5，1，14，17)。
本發明包括由描述於本文之植物、後代、細胞、組織或其部分所生產的任何種子，和由本發明之植物、後代、細胞、組織或其部分或種子所生產的任何油。本發明亦包括使用如描述於本文的植物、後代、細胞、組織或其部分、種子或油所生產之任何產物。
與本發明之基因改造的有機體相關之使用及產物
本發明包括一種藉由生長或培養上述詳細描述的本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分(例如，大豆)生產PUFA的方法。在某些具體實例中，此方法包括例如在合適的環境(諸如土壤)中生長一具有如先前於本文描述的基因改造及根據本發明之植物。
本發明包括一種生產包含至少一種PUFA的油之方法，其包括從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分，或從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分之種子回收油。
本發明包括一種生產包含至少一種多不飽和脂肪酸的油之方法，其包括生長本發明之基因改造的植物、 後代、細胞、組織或其部分。本發明包括一種在種子油中生產至少一種PUFA的方法，其包括從本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分之種子回收油。本發明包括一種在種子油中生產至少一種PUFA的方法，其包括生長本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分。
本發明包括一種將包含至少一種PUFA的補充品或治療產物提供至需要其之個體的方法，其包括將本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分、本發明的油、本發明的種子、本發明的食物產物、本發明的功能性食物、或本發明的醫藥產物提供至需要其的個體。本發明亦包括一種生產本發明之基因改造的植物、後代、細胞、組織或其部分之方法，包括以下列來轉形植物或植物細胞：(i)一編碼出生產至少一種多元不飽和脂肪酸(PUFA)的海藻PUFA合成酶系統之核酸序列；及(ii)一編碼出磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)的核酸序列，其將磷酸泛醯巰基乙胺基輔因子轉移至海藻PUFA合成酶系統ACP區段。在某些具體實例中，該方法更包括以下列來轉形該植物或植物細胞：(iii)一編碼出醯基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列，其催化長鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉換成醯基-CoA。
在某些具體實例中，本發明的此方法之PUFA係DHA、DPA(n-6)及/或EPA。在某些具體實例中，由本發明之此方法所生產的油係大豆油。在某些具體實例中，由本發明之此方法所生產的油包含0.05%至15%的DHA(以總脂肪酸的重量計)，或其進一步描述於本文的任何量或範圍。 在某些具體實例中，由本發明的此方法所生產之油進一步包含0.01%至5%的EPA(以總脂肪酸的重量計)，或其進一步描述於本文的任何量或範圍。在某些具體實例中，由本發明的此方法所生產之油進一步包含0.01%至5%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)，或其進一步描述於本文的任何量或範圍。在某些具體實例中，由本發明的此方法所生產之油包含EPA：DHA比率係1：1至1：30(以總脂肪酸的重量計)，EPA：DHA比率係1：1至1：3(以總脂肪酸的重量計)，或其進一步描述於本文的任何量或範圍。在某些具體實例中，由本發明的此方法所生產之油進一步包含DPA(n-6)：DHA比率係1：1或1：10(以總脂肪酸的重量計)，DPA(n-6)：DHA比率係1：1至1：3(以總脂肪酸的重量計)，或其進一步描述於本文的任何量或範圍。
本發明進一步包括描述於本文的任何有機體或其部分(例如，植物、後代、細胞、組織、種子或其部分(例如，油種子)、或其製劑或餾分)、和由描述於本文的有機體所生產之任何油。本發明亦包括使用描述於本文的有機體、其部分或油所生產的任何產物。
本發明係關於一種改造包含至少一種脂肪酸的產物之方法，其包括將該產物加入至有機體、其部分、或由根據本發明之基因改造及如描述於本文的有機體(例如，植物、後代、細胞、種子、組織或其部分，其已經如描述於本文般基因改造)所生產之油。由此方法所生產的任何產物或通常包含來自描述於本文的有機體之任何有機 體、其部分或油亦由本發明所包含。
在某些具體實例中，該產物係選自於下列：食物膳食補充品、醫藥調配物、母乳化動物乳、嬰兒配方、營養食品及功能性食物。合適的醫藥調配物包括(但不限於)抗炎性調配物、化學治療劑、活性賦形劑、骨質疏鬆藥、抗抑鬱劑、抗驚厥劑、抗幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)藥、神經變性病治療用藥、退行性肝病(degenerative liver disease)治療用藥、抗生素及膽固醇降低調配物。在某些具體實例中，該產物使用來治療選自於下列的症狀：慢性發炎、急性發炎、胃腸病、癌、惡病質、心臟再阻塞、神經變性病、肝的變性病、血脂異常、骨質疏鬆、骨關節炎、自體免疫病、初期子癇、早產、老年性黃斑部病變、肺病及過氧化物酶體病。
在某些具體實例中，該產物係一種食物產物或功能性食物產物。合適的食物產物包括(但不限於)精製烘焙製品、麵包及捲餅、早餐穀類、加工及未加工的乳酪、佐料(番茄醬、美乃滋等等)、牛奶製品(牛奶、優格)、布丁類及明膠甜點、含二氧化碳的飲料、茶、粉狀飲料混合物、加工的魚產物、水果基礎的飲料、口香糖、硬式糕餅、冷凍的牛奶製品、加工的肉產物、堅果仁及堅果仁基礎的果醬、麵糰、加工的家禽產物、肉汁及調味汁、馬鈴薯片及其它碎片或脆片、巧克力及其它糕餅、湯及湯混合物、大豆基礎產物(例如，牛奶類、飲料、奶油、增白劑)、植物油基礎的果醬、及植物基礎的飲料。
在本發明的某些具體實例中，該產物係一種飼料或粗粉組成物，或一種用於動物之飼料或粗粉組成物的添加劑。用語“動物”包括人類及非人類。動物之非為限制的實施例有非反芻動物(例如，豬、家禽或魚)及反芻動物(例如，牛、羊及馬)。用語“飼料或飼料組成物”意謂著任何合適於或想要由動物攝取之化合物、製劑、混合物或組成物。
在某些具體實例中，本發明係有關一種油摻合物，其包含從描述於本文之基因改造的植物、後代、組織或其部分獲得的油與另一種油。在某些具體實例中，該另一種油係種子油、植物油、魚油、微生物油或其混合物。
在某些具體實例中，從描述於本文之基因改造的植物、後代、組織或其部分獲得之油可進一步加工，以改造在該油中的LC-PUFA，例如，以形成酯類及/或純化該LC-PUFA用於藥用目的。
本發明的某些具體實例係針對一種包含0.05%至15%的DHA(以總脂肪酸的重量計或其進一步描述於本文的任何範圍)之大豆油。在某些具體實例中，該大豆油進一步包含0.05%至5%的EPA(以總脂肪酸的重量計)。在某些具體實例中，該大豆油進一步包含0.01%至5%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)。在某些具體實例中，該大豆油具有大於3.5%的α-次亞麻油酸(以總脂肪酸的重量計或其進一步描述於本文的任何範圍)之脂肪酸曲線。本發明的某些具體實例係針對包含描述於本文的大豆油之組成物。在某些具體實例中，該包含大豆油的組成物包含一或多種油。在某 些具體實例中，該組成物不包括來自非大豆來源的PUFA(例如，DHA)。
本發明的額外目標、優點及新穎特徵將由熟習該項技術者在檢驗其下列實施例後變明瞭，其不想要限制。
實施例 實施例1
PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI之密碼子最佳化
編碼出來自裂壺菌ATCC_20888的PUFA合成酶OrfA(基因銀行(Genbank)ID：AF378327，GI：158518688)、來自裂壺菌ATCC_20888的PUFA合成酶OrfB(基因銀行ID：AF378328，GI：158518690)、來自裂壺菌ATCC_20888及破囊壺菌屬的PUFA合成酶嵌合OrfC(U.S.Appl.Pub.No.2008/0022422)(亦描述為“雜交OrfC)、來自裂壺菌ATCC_20888的醯基-CoA合成酶(U.S.Appl.Pub.No.2007/0245431)及來自念珠藻PCC 7120的4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI(基因銀行ID：P37695，GI：20141367)之DNA序列的分析顯露出存在數種包含非最理想的密碼子組成物之序列基序，其可損害最理想的植物表現性。最佳化編碼出PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI蛋白質之基因的設計，以產生本質更“植物似的”DNA序列，及其中該序列改造不會阻礙轉譯或透過非最 理想的密碼子組成物產生mRNA不穩定性。
由於由基因密碼的多重性/簡并性所給予之適應性(例如，某些胺基酸由多於一種密碼子具體指定)，基因組在不同有機體或有機體的種類中之演變已產生同義密碼子的分別用途。此“密碼子偏倚”反映在蛋白質編譯區域的平均鹼基組成物中。例如，具有相對低G+C含量的基因組之有機體使用更多在同義密碼子的第三位置中具有A或T的密碼子，然而具有較高G+C含量的那些使用更多在第三位置中具有G或C的密碼子。再者，已認為在mRNA內存在“稀少(minor)”密碼子可減低該mRNA的絕對轉譯比例，特別是當與該稀少密碼子相應的帶電荷tRNA之相對豐富性係低時。對多重稀少密碼子來說，此理由之延伸為該轉譯比例由各別的稀少密碼子減少將係至少添加。因此，具有高相對稀少密碼子含量的mRNA將具有相同低的轉譯比例。此比例將由相應低程度之經編碼的蛋白質反映出。
在用以於雙子葉植物(諸如煙草、大豆、棉花或油菜籽)中表現之編碼出PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI蛋白質的設計基因中，從公開可獲得的資料庫取出油菜籽之密碼子使用(表1-1)。
為了對胺基酸平衡剩餘的密碼子選擇之分佈，使用下式對每種密碼子計算加權平均表示(表1-1)：C1的加權平均%=1/(C1%+C2%+C3%+等等)×C1%×100，其中C1係所討論的密碼子及C2%、C3%等等代表表1-1之油菜籽的剩餘同義密碼子的值%之平均(從C及G列取得相關聯的密碼子之平均%值)。每種密碼子的加權平均%值提供在表1-1的D及H列中。
在設計植物表現性的編譯區域時，決定該植物的較佳主要(“第一選擇”)密碼子；和當多重選擇存在時，選擇較佳的第二、第三、第四等等密碼子。然後，設計出基本上編碼出與PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI相同的胺基酸序列之新DNA序列，但是其與原始的DNA序列(編碼出PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI)不同，其替換植物(第一較佳、第二較佳、第三較佳或第四較佳等等)密碼子，以具體指定在該胺基酸序列內的每個位置處之胺基酸。
然後，分析該新序列藉由在該序列中改造所產生的限制酶位置。然後，藉由以第一、第二、第三或第四選擇的較佳密碼子置換該密碼子來改造所鑑別的位置。然後，進一步分析及改造該序列以減低TA或GC成對物頻率。
這些序列之分析顯露出使用在油菜籽基因中所發現且時常使用的密碼子之平衡的密碼子分佈，只對在雙 子葉植物中的最理想表現性各別設計出該基本上編碼出該PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI蛋白質的胺基酸序列之新DNA序列。特別是，該新DNA序列與編碼出PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI的原始DNA序列不同，其替換植物(第一較佳、第二較佳、第三較佳或第四較佳)密碼子，以在該蛋白質胺基酸序列內的每個位置處具體指定適當的胺基酸。
該植物最佳化DNA序列之設計係使用從表1-1之D及H列所建構的油菜籽密碼子偏倚表，逆轉譯PUFA合成酶OrfA(SEQ ID NO：1)、PUFA合成酶OrfB(SEQ ID NO：2)、PUFA合成酶嵌合OrfC(SEQ ID NO：3)、醯基-CoA合成酶(SEQ ID NO：4)及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶Het I(SEQ ID NO：5)之蛋白質序列起始。從原始序列改變該醯基-CoA合成酶(SEQ ID NO：4)之蛋白質序列；其中從該蛋白質移除該第二胺基酸丙胺酸。然後，藉由補償密碼子改變(同時保留整體加權平均密碼子表示)改造該初始序列，以移除或加入限制酶識別位置、移除高穩定性股內二級結構、及移除可損害該經設計的基因在植物中之選殖操控或表現性的其它序列。然後，再分析該DNA序列之可已經由該改造所產生的限制酶識別位置。藉由以第一、第二、第三或第四選擇的較佳密碼子置換相關聯的密碼子進一步改造該經鑑別的位置。在可影響有興趣的基因之轉錄或轉譯 的序列中之其它位置包括外顯子：插入序列接合(5’或3’)、poly A加成訊號、或RNA聚合酶終止訊號。進一步分析及進一步改造經改造的序列以減低TA或CG成對物頻率，及增加TG或CT成對物頻率。除了這些成對物外，具有多於約六個連串的[G+C]或[A+T]殘基之序列區塊可影響該序列的轉錄或轉譯。因此，這些序列區塊亦藉由以其它較佳的密碼子選擇來置換該第一或第二選擇等等之密碼子而改造。在該基因設計中未包括很少使用的密碼子至實質程度，其僅當需要調和與密碼子組成物本身不同之設計準則時使用(例如，加入或消除限制酶識別位置)。
由PUFA合成酶OrfA編碼出之蛋白質包含10個大小範圍17至29個胺基酸之重覆的“脯胺酸-丙胺酸”區段。穿插在該脯胺酸-丙胺酸重覆間者係9個包含87個胺基酸之較長的重覆序列區段。這些重覆的胺基酸序列僅在4個位置處變化，及在每個變異體位置處僅有二個密碼子選擇。使用Clustal W電腦程式分析9個重覆的胺基酸序列產生100%同源性值及95.4%同一性值。在該DNA程度下，編碼出該9個重覆的序列係100%同源、89.7%相同，其僅有在編碼出每個重覆的261個鹼基中之27個位置處不同(27個改變的23個係“沉默”差異，其中相同胺基酸的同義密碼子互換)。
標準基因設計方法無法容易地對此尺寸的多重重覆調和發展出新密碼子偏倚的DNA序列，因為必需以在其它8個重覆中的相同位置處所製得之密碼子選擇來不斷地平衡在各別重覆中的全部密碼子選擇，以避免產生高度 相關的DNA序列。對87個殘基重覆每個來說，有多於4.5x1043 種可能的DNA序列可編碼出相同胺基酸序列(以在序列中的每個胺基酸之同義密碼子數目的乘積計算)。因此，可獲得非常大的計算空間來產生相同編碼的DNA序列。下列方法描述出一種使用來對每個各別重覆產生(電腦內(in silico))多重序列設計，接著大量比較全部序列版本以鑑別出一組代表編碼出該重覆的高度分歧序列之方法：步驟1：萃取編碼出每個重覆的胺基酸區段之天然DNA序列，如為一分開的序列。
步驟2：將該各別重覆的DNA序列(如為分開的序列)匯入基因設計程式(例如，歐皮替基因(OPTGENE)TM ，歐西門生物解答(Ocimum Biosolutions)，海德拉巴(Hyderabad)，印度)中。在每個序列上分別地進行步驟3-5。
步驟3：使用標準基因密碼轉譯該DNA序列。
步驟4：使用標準基因密碼及適當的密碼子偏倚表來逆轉譯該經轉譯的蛋白質序列。在此實施例中，使用從530個大油菜蛋白質編譯區域所匯編的偏倚密碼子表，及每個所產生的序列以“nap”(代表“大油菜(napus)”)加上版本數字來編譯命名。因此，重覆1之第一逆轉譯的密碼子偏倚序列命名為“rpt1 nap1”。在此闡明中，進行此方法10次，以產生10個編碼出重覆1的蛋白質序列之DNA序列版本。
步驟5：將該10個序列版本匯出進入相應數字的文字檔案中。
步驟6：對每個其它重覆的序列區段重覆步驟3-5。在此闡 明中，總共產生90個“nap”序列版本(每個重覆元素10個)。
步驟7：將該90個序列檔案匯入Clustal W程式Mega 3.1(在Megasoftware下存取)中，及使用全部90個序列作為輸入來執行多重序列排比。因為這些序列係蛋白質編譯區域的斷片，以允許無間距進行該排比。在Clustal W排比後，組合及具體化鄰接樹(neighbor-joining tree)，及視覺地挑選在該蛋白質中九個重覆區段每個之十個密碼子最佳化序列之一。每個所選擇的序列版本係選自於該樹最深分枝的部分。
步驟8：在每個特別的重覆之適合的位置中，將每個重覆區段所選擇的序列併入該編碼出整個蛋白質之經密碼子最佳化的DNA序列中。
步驟9：進行整個密碼子最佳化序列(包括分別設計的分歧重覆元素)的最後分析以保證缺乏不希望得到的基序、限制酶識別位置等等。
使用此方法與該PUFA合成酶OrfA編譯序列之密碼子最佳化產生足夠分歧之重覆的脯胺酸-丙胺酸序列之選擇，以避免重覆序列不穩定性。這些序列係選自於鄰接樹的最深分枝(即，在此序列組中最略微地彼此相關)。對全部成對組合進行史密斯(Smith)-瓦蛇曼(Wasserman)總排比，及同源性的範圍係74-81%具有76-77%的可能中點(表2)。
9個重覆區段之所選擇的9個新設計的編譯區域之Clustal W排比(Vector NTI，因維錯俊，卡爾斯貝得，CA)顯示在圖1中。整體來說，如與100%同源及89.7%相同的原始序列比較，該序列係93.1%同源，61.7%相同。可使用多於10次序列迭代及使用電腦程式或數學演算法從這些序列選擇(取代視覺選擇序列)，達成較大的序列分歧度。然而，所例示的序列係高度分歧，及產生安定的聚核苷酸片段。
新設計之油菜籽最佳化的PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI DNA序列各別列出在SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中。這些密碼子最佳化序列遍及本專利說明書鑑別為版本3(v3)，然而未經密碼子最佳化的序列遍及本專利說明書指為版本2(v2)。
所產生的DNA序列具有較高程度的密碼子多樣性、想要的鹼基組成物、包括策略性放置的限制酶識別位 置、及缺乏會干擾基因轉錄或產物mRNA之轉譯的序列。表3、表4、表5、表6及表7顯現出在原始基因中發現的PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI蛋白質之編譯區域的密碼子組成物、該植物最佳化版本、及植物最佳化序列之密碼子組成物推薦(如從表1-1的D及H列計算)的比較。
在編譯區序列之密碼子最佳化完成後，將額外的核苷酸序列加入至該最佳化的編譯區序列。將促進選殖的限制區、寇日克(Kozak)序列及額外的終止密碼子加入至該植物已最佳化的編譯序列。此外，設計出第二系列之PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI編譯序列，其包含一來自擬南芥核酮糖雙磷酸羧化酶小鏈1A的葉綠體標的序列(基因銀行ID：NM_202369.2)。將此序列(SEQ ID NO：28)加入至先前描述用於PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC及磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI的編譯序列。移除來自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：10的初始甲硫胺酸及以葉綠體標的序列置換。包含該葉綠體標的序列之序列遍及該專利說明書鑑別為版本4(v4)。
將第二葉綠體運送胜肽加入至該PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI編譯序列。將這些編譯序列設計成包含來自醯基-ACP-硫酯酶之葉綠體標的序列(基因銀行ID：X73849.1)。將此序列(SEQ ID NO：29)加入至先前描述用於PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC及磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI的編譯序列。移除來自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：10的初始甲硫胺酸及以該葉綠體標的序列置換。包含該葉綠體標的序列之序列遍及本 專利說明書鑑別為版本5(v5)。
另一種來自裂壺菌的醯基-CoA合成酶基因版本係藉由改造該天然基因序列以移除多餘的開放性讀碼區而產生。此版本標記為“SzACS-2v4’及列出如為SEQ ID NO：30。所產生的基因係使用來置換醯基-CoA合成酶表現性基因序列(上述為“SzACS-2 v3”)。
一旦已經在紙上或電腦內設計出植物最佳化的DNA序列，可在實驗室中合成實際的DNA分子以在序列中與所設計的序列精確地相應。此合成的DNA分子可經選殖及其它方面精確地操控，如若它們係來自自然或天然來源般。由商業供應者(珍拿特(Geneart)Ag，雷根斯堡(Regensburg)，德國)進行包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10包含上述的額外序列之DNA片段之合成。然後，將合成的DNA選殖進表現載體中及轉形進農桿菌屬及大豆中，如在實施例2及3中所描述般。
實施例2
pDAB7362的質體構建(plasmid construction)
使用多位置蓋特威(Gateway)L-R重組反應建構pDAB7362二元質體(圖2；SEQ ID NO：11)。pDAB7362包括三種PUFA合成酶PTU(其表現出上述PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC基因)、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI PTU及一種草胺膦(phosphinothricin)乙醯基轉移酶PTU。特 別是，該第一PUFA合成酶PTU包括截斷的四季豆植物血球凝集素-L基因啟動子(PvDlec2啟動子v2；基因銀行登錄編號X06336)、擬南芥AT2S3基因5’未轉譯的區域(2S 5’ UTR；基因銀行登錄編號NM_118850)、裂壺菌多元不飽和脂肪酸合成酶開放讀碼區A(SzPUFA OrfA v3)及擬南芥2S白蛋白基因3’未轉譯的區域終止子(At2S SSP終止子v1；基因銀行登錄編號M22035)。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、裂壺菌多元不飽和脂肪酸合成酶開放讀碼區B(SzPUFA OrfB v3)及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、裂壺菌及破囊壺菌多元不飽和脂肪酸合成酶開放讀碼區C(hSzThPUFA OrfC v3)及At2S SSP終止子v1。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、裂壺菌醯基-CoA合成酶(SzACS-2 v3)及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、念珠藻4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI(NoHetI v3)及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7339及pDAB7333以形成pDAB7362。特別是，以頭對尾取向將五種上述PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動(Overdrive)(托洛(Toro)等人，PNAS 85(22)：8558-8562；1988)及T股邊界 序列(border sequence)(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B；加德納(Gardner)等人，Science 231：725-727；1986及國際公告案號WO 2001/025459 A1)外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：樹薯葉脈鑲嵌病毒(Cassava vein Mosaic Virus)啟動子(CsVMV啟動子v2；伏大郭(Verdaguer)等人，Plant Molecular Biology 31：1129-1139；1996)、草胺膦乙醯基轉移酶(PAT v5；侯列班(Wohlleben)等人，Gene 70：25-37；1988)及農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)ORF1 3’未轉譯的區域(AtuORF1 3’ UTR v4；黃(Huang)等人，J.Bacteriol.172：1814-1822；1990)。然後，對該五種PTU之併入來說，使用限制酶切(restriction enzyme digestion)及DNA定序分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例2.1：額外質體的構建，其使用PvDlec2啟動子來驅動表現性
設計及建立額外的建構體，其使用PvDlec2啟動子來驅動PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI轉殖基因的表現性。已經對這些建構體製得多種改變以增加表現性程度。這些改變包括使用未密碼子最佳化的基因序列、併入葉綠體運送胜肽及移除醯基-CoA合成酶PTU。
使用新建構的質體來穩定地轉形大豆植物。分離及分子標出轉殖基因的大豆植物特徵。使用這些其它建構體產生包括較大量的DHA及LC-PUFA之大豆植物。測量所 產生的LC-PUFA累積及鑑別該大豆植物生產0.01%至15%的DHA或0.01%至15%的LC-PUFA。
實施例2.2：pDAB7361之構建
pDAB7361係一二元質體，其經建構以包括天然、未密碼子最佳化的SzPUFA OrfA v2版本，剩餘的基因序列經密碼子最佳化(SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3及NoHetI v3)。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7361質體(圖3；SEQ ID NO：31)。pDAB7361包含三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v2及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzACS-2 v3基因及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7355、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7339及pDAB7333以形成pDAB7361。特別是，以頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。除了其它調控元素(諸如，超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，該基因 的順序為：SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3NoHetI v3。pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuORF1 3’ UTR v4。然後，對六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該六種PTU的重組質體。
實施例2.3：pDAB7363之構建
pDAB7363係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA v4、SzPUFA OrfB v4、hSzThPUFA OrfC v4、及NoHetI v4版本，其全部皆包括核酮糖雙磷酸羧化酶小鏈1A(標記為SSU-TP v1)，其融合至該編譯序列的胺基終端。此外，此質體包括重建、密碼子最佳化的SzACS-2 v3版本。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7363質體(圖4；SEQ ID NO：32)。pDAB7363包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v4及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v4及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v4及At2S SSP終止子v1。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzACS-2 v3基因及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v4及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7340、pDAB7341、pDAB7342、pDAB7344及pDAB7333以形成pDAB7363。特別是，以頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v4、SzPUFA OrfB v4、hSzThPUFA OrfC v4、SzACS-2 v3、NoHetI v4。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuORF1 3’ UTR v4。然後，對該六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該六種PTU的重組質體。
實施例2.4：pDAB7365之構建
pDAB7365係一二元質體，其經建構以包括天然、未密碼子最佳化的SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、hSzThPUFA OrfC v2、SzACS-2 v2及NoHetI v2版本。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7365質體(圖5；SEQ ID NO：33)。pDAB7365包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v2及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v2及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfC v2及At2S SSP終止子v1。該醯基 -CoA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzACS-2 v2基因及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v2及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7355、pDAB7356、pDAB7357、pDAB7360及pDAB7333以形成pDAB7365。特別是，以頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、SzPUFA OrfC v2、SzACS-2 v2、NoHetI v2。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuORF1 3’ UTR v4。然後，對六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例2.5：pDAB7368之構建
pDAB7368係一二元質體，其經建構以包括天然、未密碼子最佳化的SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、hSzThPUFA OrfC v2及NoHetI v2版本。此建構體不包括SzACS-2編譯序列。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7368質體(圖6；SEQ ID NO：34)。pDAB7368包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v2及At2S SSP終止子v1。該 第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v2及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfC v2及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v2及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7355、pDAB7356、pDAB7357、pDAB7359及pDAB7333以形成pDAB7368。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、SzPUFA OrfC v2、NoHetI v2。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuORF1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含五種PTU的重組質體。
實施例2.6：pDAB7369之構建
pDAB7369係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3及NoHetI v3版本，此建構體不包括SzACS-2編譯序列PTU。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7369質體(圖7；SEQ ID NO：35)。pDAB7369包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶 PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7338及pDAB7333以形成pDAB7369。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuORF1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例2.7：pDAB7370之構建
pDAB7370係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA v4、SzPUFA OrfB v4、hSzThPUFA OrfC v4及NoHetI v4版本，其包括核酮糖雙磷酸羧化酶小鏈1A(標記為SSU-TP v1)，其融合至該編譯序列的胺基終端。此建構體不包括SzACS-2編譯序列PTU。使用 多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7370質體(圖8；SEQ ID NO：36)。pDAB7370包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v4及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v4及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v4及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v4及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7340、pDAB7341、pDAB7342、pDAB7343及pDAB7333以形成pDAB7370。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v4、SzPUFA OrfB v4、hSzThPUFA OrfC v4、NoHetI v4。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuORF1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包括該五種PTU的重組質體。
實施例2.8：pDAB100518之構建
pDAB100518係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA v5、SzPUFA OrfB v5、 hSzThPUFA OrfC v5及NoHetI v5版本，其包括來自醯基-ACP-硫酯酶的葉綠體運送胜肽(標記為硫酯酶運送胜肽)，其融合至該編譯序列的胺基終端。此外，該質體包括不擁有葉綠體運送胜肽的SzACS-2 v3編譯序列PTU。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB100518質體(圖9；SEQ ID NO：37)。pDAB100518包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v5及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v5及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v5及At2S SSP終止子v1。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzACS-2 v3基因及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v5及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB100517、pDAB100514、pDAB100511、pDAB100515及pDAB7333以形成pDAB100518。特別是，以頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v5、SzPUFA OrfB v5、hSzThPUFA OrfC v5、SzACS-2 v3、NoHetI v5。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及 T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuORF1 3’ UTR v4。然後，對六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該六種PTU的重組質體。
實施例2.9：pDAB101476之構建
pDAB101476係一二元質體，其係建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3及NoHetI v3版本。SzACS-2 v2基因序列係天然、未密碼子最佳化的版本。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB101476質體(圖10；SEQ ID NO：38)。pDAB101476包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzACS-2 v2基因及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB101471及pDAB7333以形成pDAB101476。特別是，以 頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v2、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuORF1 3’ UTR v4。然後，對六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該六種PTU的重組質體。
實施例2.10：pDAB101477之構建
pDAB101477係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3及NoHetI v3版本。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB101477質體(圖11；SEQ ID NO：39)。pDAB101477包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzACS-2v4基因及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺 基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB101472及pDAB7333以形成pDAB101477。特別是，以頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2v4，NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuORF1 3’ UTR v4。然後，對六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該六種PTU的重組質體。
實施例3
大豆轉形
透過大豆子葉節外植體之農桿菌屬介導性轉形產生轉殖基因的大豆(黃豆)。使用攜帶上述的二元載體(如為pDAB7362)之解除的農桿菌屬菌株DA2552(美國申請案案號61/368,965，2010年7月29日提出)來開始轉形。
使用曾(Zeng)等人之改造的½子葉節程序來進行農桿菌屬介導性轉形(曾P.，維德內斯(Vadnais)D.A.，張Z.，波拉寇(Polacco)J.C.，(2004)，Plant Cell Rep.，22(7)：478-482)。簡單地說，大豆種子(cv.馬貝利克(Maverick))係在基礎媒質上發芽，及分離子葉節並以農桿菌屬感染。幼 芽開始、幼芽伸長及以孢頭泰新(cefotaxime)、特泯菌(timentin)及萬古黴素(vancomycin)補充生根媒質，用以移除農桿菌屬。使用固殺草(glufosinate)選擇來抑制未轉形的幼芽生長。將所選擇的幼芽轉移至生根媒質用於根成長，然後轉移至土壤混合物用以讓苗水土適應。
以固殺草局部處理所選擇的苗之頂生嫩葉(塗葉技術)以篩選推定的轉形株。將所篩選的苗轉移至溫室，允許適應，然後以固殺草塗葉再確認耐受性。對這些推定轉形的T0 植物進行取樣及使用分子分析證實PAT、及PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI轉殖基因存在。允許T0 植物在溫室中自身施肥以生產T1種子。
使用第二大豆轉形方法來生產額外的轉殖基因大豆植物。使用攜帶上述二元載體(如為pDAB7362)之解除的農桿菌屬菌株DA2552(美國臨時專利申請案案號61/368,965)來起始轉形。
使用佩日(Paz)等人之改造的半種子程序來進行農桿菌屬介導性轉形(佩日M.，馬汀內日(Martinez)J.，卡微格(Kalvig).，方爵(Fonger)T.，及王(Wang)K.，(2005)Plant Cell Rep.，25：206-213)。簡單地說，以氯氣消毒成熟的大豆種子過夜，及在農桿菌屬介導性植物轉形前吸入無菌H2 O二十小時。藉由沿著臍縱切割，將種子切半以分離種子及移除種子外層。切除胚胎軸及從子葉節移除任何軸幼芽/芽。以農桿菌屬感染所產生的半種子外植體。幼芽初始、 幼芽伸長，及以孢頭泰新、特泯菌及萬古黴素補充生根媒質以移除農桿菌屬。使用固殺草選擇來抑制未轉形的幼芽生長。將所選擇的幼芽轉移至用於根成長的生根媒質，然後轉移至土壤混合物用以讓苗水土適應。
以固殺草局部處理(塗葉技術)所選擇的苗之頂生嫩葉以篩選推定的轉形株。將經篩選的苗轉移至溫室，允許適應，然後以固殺草塗葉以再確認耐受性。對這些推定的轉形T0 植物進行取樣及使用分子分析來證實PAT、及PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI轉殖基因存在。七件事件經鑑別係包含來自pDAB7362的轉殖基因。這些T0 植物經拓展用於進一步分析及允許在溫室中自身施肥以產生T1 種子。
實施例4
大豆事件的分子分析
使用比較性定量即時PCR(qPCR)方法來定量所選擇的pDAB7362大豆事件之轉殖基因複製品數量。從成熟的大豆植物之頂端及底部葉子採取葉組織樣品，結合這些樣品及分離該基因組DNA。使用BioSprint 96 DNA Plant Kit及BioSprint 96磁性顆粒自動化平台(奎阿金(Qiagen)，瓦倫西亞(Valencia)，CA)每種的製造者用法說明來分離基因組DNA。使用ddH20以1：5稀釋所萃取的基因組DNA，用以使用在定量即時PCR反應(qPCR)中作為模板。
qPCR分析經設計，以使用羅趣分析設計中心 (Roche Assay Design Center)(www.universalprobelibrary.com)來偵測在pDAB7362大豆植物中的SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hThSzPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、NoHetI v3及PAT v5轉殖基因。在該分析中所使用的引子及探針描述在表8中。以經螢光黃-亞醯胺鹽(amidite)(FAM)標記的UPL探針(羅趣診斷(Roche Diagnostics)，印第安那波璃斯(Indianapolis)，IN)偵測標的基因之存在。在含有大豆內部參考GMFL01-25-J19(基因銀行：AK286292.1(在表8中提出如為GMS116)，其以花青-5(Cy-5)螢光性染料標記)的雙重反應中執行這些分析。
使用標準方法，在LC480II即時PCR熱循環裝置(羅趣，印第安那波璃斯，IN)上進行即時PCR反應。使用533奈米發射濾波器及483奈米激發信號，收集經FAM標記的分析物之SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hThSzPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、NoHetI v3及PAT v5資料。使用660奈米濾波器及618奈米激發信號，收集經GMS116 Cy5標記 的參考分析物之資料。使用LC480II軟體的“先進相對定量(Advanced Relative Quantification)”分析工作流來自動計算交叉點值(Cp值)及標的對參考之比率。使用標準“δ-δ-Ct”方法來計算每個樣品之標的對參考比率。藉由以大豆內部參考GMFL01-25-J19之標的-參考比率來常態化樣品標的-參考比率，來決定所估計的複製品數目。
測量在來自七個pDAB7362事件的T1 植物中之PAT v5可選擇的標誌及廿二碳六烯酸(DHA)轉殖基因(SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hThSzPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、及NoHetI v3)之估計的複製品數目。來自二個事件(7362[710]-71006及7362[710]-71010)的植物不包括該PAT v5可選擇的標誌或該DHA基因標的序列。來自剩餘事件(7362[710]-70903、7362[710]-71005、7362[710]-71008及7362[710]-71009)的植物包括該PAT v5可選擇的標誌及五種具有複製品數目範圍1-10的DHA轉殖基因。事件7362[708]-70801生產含有0、1或2個指示出單一分離位點的PAT v5基因複製品之T1植物；及事件7362[710]-71005生產具有PAT v5複製品數目在0至4間的T1植物，其建議二個未連結的位點分離。
實施例5
轉殖基因的大豆植物之T1 子葉的脂質分析
為了避免破壞性分析有限量的T1 種子，在T1 植物之發芽後綠色子葉上進行脂肪酸甲基酯(FAMEs)分析。已經描述出FAMEs的純化及分析方法(例如，奈汀加雷 (Nightingale)，ZD等人，(1999)藉由高性能液相層析法純化脂肪酸甲基酯，J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.732(2)：495-500；及“氣相層析法及脂質：實施指南”，由W.W克麗斯帝(Christie)，1989，歐義利出版社(Oily Press))。在T1 子葉中的油曲線特徵係在乾T1 種子中的油曲線之象徵(威爾森氏(Wilson)，RF及夸尼袁(Kwanyuen)，P.，(1986)在發芽大豆子葉中的甘油三酯合成及新陳代謝，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-脂質及脂質新陳代謝，877(2)：231-237)。
實施例5.1：經由分析轉殖基因的油菜籽，確認發芽後在T1 子葉中之DHA偵測
以生產DHA的油菜籽種子進行在發芽後綠色子葉中之長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)的確認及偵測，來評估在T1 子葉中的油曲線特徵是否係在成熟的T1 種子內之油曲線存在的象徵。懷有二元質體(pDAB7362)之轉殖基因的油菜籽種子係在室溫下於飽含水的紙毛巾上發芽，及在3天後採集經冷凍乾燥的組織。讓該組織直接轉甲基化及不預先以己烷萃取。計算LC-PUFA含量(FAMEs%，以重量計)及與成熟種子比較。來自30顆油菜籽出頭的子葉之平均DHA含量係0.71%(總LC-PUFA=0.97%)，且油含量係53.0%。48顆成熟油菜籽種子在發芽前之平均DHA含量係0.49%(總LC-PUFA=0.73%)，且油含量係44.3%。此研究闡明可在發芽後出頭的綠色子葉中偵測到LC-PUFA，及在出頭的綠色子葉之LC-PUFA偵測指示出LC-PUFA係存在於該 種子中。
實施例5.2：發芽後在T1 大豆子葉中之DHA偵測
在種植後3至5天，對每株大豆幼苗取樣，在一個切除的綠色子葉上進行FAME分析。冷凍乾燥該植物物質，使用鋼球及球磨機均質化及以己烷去除脂肪3次。蒸發混合的己烷餾分及稱重該乾殘餘物及在庚烷中再構成。在甲醇中，於代用品十七烷酸甘油三酯(triheptadecanoin)(Nu-Chek Prep，伊里金(Elysian)，MN)存在下，以0.25M新鮮製備的甲醇鈉(西格瑪亞得富(Sigma-Aldrich)，聖路易斯(ST.Louis)，MO)轉甲基化已知量的油殘餘物。在適度熱(40℃)下進行反應及固定搖晃，且以庚烷萃取所產生的FAMEs。已藉由回收已反應的十七酸酯甲基酯代用品證實反應完全。藉由GC-FID，使用安捷侖(AgIlent)6890氣相層析(安捷侖技術(Agilent Technologies)，聖克拉拉，CA)及來自SGE(奧斯丁(Austin)，TX)之15公尺x0.25毫米x0.25微米BPX70毛細管管柱來分析FAMEs萃取物。每個FAME波峰藉由其滯留時間來鑑別及藉由注射來自美崔亞(Matreya)LLC的油菜籽油參考混合物(普萊森特加普(Pleasant Gap)，PA)定量。校正標準物包含各別加入來自Nu-Chek的標準DHA、EPA及DPA(n-6)甲基酯。使用ChemStation4軟體(安捷侖)進行資料分析。來自二種事件的T1 子葉(pDAB7362[708]-70801.001及pDAB7362[710]-71005.001)皆包括DHA(表9)。
讓來自事件pDAB7362[708]-70801.001的四十顆種子發芽及對在切除的綠色子葉中的LC-PUFA之存在篩 選。來自四十顆種子的六顆之子葉包含範圍0.78%至1.58%(平均1.12%)的LC-PUFA。DHA含量範圍係0.48%至0.93%(平均0.68%)，及DPA(n-6)含量範圍係0.3%至0.65%(平均0.44%)。
讓來自事件pDAB7362[710]-71005.001的三十九顆種子發芽及對在切除的綠色子葉中的LC-PUFA之存在篩選。來自三十九顆種子的三十七顆之子葉包含範圍0.70%至11.98%(平均3.91%)的LC-PUFA。在總LC-PUFA中，DHA含量範圍係0.36%至8.00%(平均2.24%)，及DPA(n-6)含量範圍係0.34%至3.98%(平均1.68%)。
使用帕格薩斯(Pegasus)III GC-TOF-MS(里可(Leco)，聖約瑟夫(St.Joseph)，MI)來評估標準PUFA甲基酯(Nu-Chek Prep，伊里金，MN)的特定片段，與負對照比較證實LC-PUFA之鑑別。
實施例6
來自轉殖基因的大豆事件之成熟T2 種子的脂質分析
讓來自二種事件(7362[708]-70801.001及7362[710]-71005.001)的T1 植物在溫室中生長至成熟。選擇在T1 子葉中包含高LC-PUFA程度及一或二種PAT v5的複製品及伴隨著五種用於DHA生產基因的植物。這些植物係自身施肥及在成熟時採集所產生的T2 種子。經由FAMEs GC-FID分析單一種子以測量在T2 大豆種子中的LC-PUFA及DHA含量。藉由加壓機壓碎種子及使用鋼球與球磨機均化來各別分析每株植物十二顆完整的成熟種子。該組織以己烷去除脂肪三次，將混合的己烷餾分蒸發至乾燥及稱重殘餘物，及在庚烷中再構成用以如在先前實施例中所描述般進行FAME分析。
來自事件7362[708]-70801.001的T1 植物之單一T2 種子(在圖12中描述為7362[708]-70801.Sx.021)擁有單一PAT v5複製品，其包含0%至0.73%的DHA(0%至1.19%的總LC-PUFA)。來自事件7362[710]-71005.001的二個T1 植物之單一T2 種子(在圖12中描述為7362[710]-71005.Sx.006及7362[710]-71005.Sx.0.35)擁有單一PAT v5複製品，其包含0%至2.08%的DHA(0%至3.56%的總LC-PUFA)。來自事件7362[710]-71005.001的七個T1 植物之單一T2 種子(在圖12中描述為7362[710]-71005.Sx.010、7362[710]-71005.Sx.012、7362[710]-71005.Sx.013、7362[710]-71005.Sx.016、7362[710]-71005.Sx.018、7362[710]-71005.Sx.025及 7362[710]-71005 Sx.031)包括二個PAT v5複製品，其包含0%至2.84%的DHA(0%至4.77%的總LC-PUFA)。來自最高DHA生產株的T2 種子(7362[710]-71005.Sx.025)之平均DHA含量為1.83%(3.11%的總LC-PUFA)。來自各別的T1 植物之每個T2 種子之DHA含量顯示在圖12中。
在包含LC-PUFA的那些T2 種子中，包含總LC-PUFA含量之60%的DHA。在T2 大豆種子中僅偵測到二種新穎的LC-PUFA(DHA及DPA(n-6))。預計在大豆種子中發現的脂肪酸經偵測係呈正常程度，除了總C18脂肪酸由於LC-PUFA存在而成比例地降低外。在這些轉殖基因的大豆種子中，除了DHA及DPA(n-6)外，沒有偵測到其它不同脂肪酸。該轉殖基因種子的油含量(各別的FAME之質量總和除以種子質量)及由該轉殖基因的T1 株所生產之種子數目，與在相同條件下之相同時間處於溫室中栽培生長的非基因轉殖威廉斯82對照未明顯不同。
來自大豆事件7362[708]-70801.001及7362[710]-71005.001的各別T2 種子之完全FAME曲線顯示在表10中。
實施例6.1：來自二種轉殖基因的大豆事件之成熟T3 種子的脂質分析
讓二種T2 大豆植物事件(7362[708]-70801.001及7362[710]-71005.001)在溫室中生長至成熟。在溫室中生長每種事件的多重植物，及進行篩選以鑑別出在T2 子葉中生產高LC-PUFA程度及包括該轉殖基因的單一、同型接合插入的各別植物。經鑑別的植物係自身施肥及當種子到達成熟時採集所產生的T3 種子。經由FAMEs GC-FID分析單一成熟的T3 種子，以決定在T3 大豆種子中的DHA及LC-PUFA含量(圖12a)。藉由加壓機壓碎種子及使用鋼球與球磨機均質化壓碎的種子物質，各別分析每種植物十二顆全成熟種子。該組織以己烷去除脂肪三次，將混合的己烷餾分蒸發至乾燥及稱重殘餘物，且在庚烷中再構成，用以如在先前實施例中所描述般進行FAME分析。測量來自T3 種子的DHA程度及與先前已經分析的T2 DHA程度比較(表11)。
如在表11中指示出，在大豆種子中的DHA相對百分比保持固定或在隨後的大豆代(來自T2 及T3 )中增加。經 由FAMEs分析來分析從事件7362[708]-70801.001的T2 植物(此株已分子標出特徵及發現擁有PAT的單一半合子複製品)之自身施肥所生產的單一T3 種子，及該種子經測量包含0%至0.93%的DHA(0%至1.37%的總LC-PUFA)。比較上，經由FAMEs分析來分析從事件7362[708]-70801.001所生產的T2 種子，及該種子經測量包含0%至0.73%的DHA。經由FAMEs分析來分析來自T2 植物事件7362[710]-71005.001-1-35(此株已分子標出特徵及發現擁有PAT的單一半合子複製品)的自身施肥之單一T3 種子，及該種子經測量包含0%至3.10%的DHA(0%至5.45%的總LC-PUFA)。比較上，經由FAMEs分析來分析從事件7362[710]-71005.001-1-35所生產的T2 種子，及該種子經測量包含0%至2.84%的DHA。此外，從事件7362[710]-71005.001-1-13、7362[710]-71005.001-1-18及7362[710]-71005.001-1-25所生產的單一T3 種子(每種事件經測量皆包括PAT的單一、同型接合複製品)包含0.79%至4.24%的DHA(1.26%至6.5%的總LC-PUFA)。比較上，經由FAMEs分析來分析從事件7362[710]-71005.001-1-13、7362[710]-71005.001-1-18及7362[710]-71005.001-1-25所生產的T2 種子，及該種子經測量包含0.79%至2.84%的DHA。該轉殖基因的事件係與該對照植物比較，在與轉殖基因株類似的條件下，已發現每植物的產率(種子數目)及總油含量(%)類似於威廉斯82對照。
對全部測試的株來說，在T2 及T3 代的大豆種子中所生產及測量之DHA及LC-PUFA百分比係一致，或從T2 代 至T3 代的程度增加。這些結果指示出該特性可遺傳，及該特性之輸傳至進一步代不造成DHA生產減低。
實施例7
在轉殖基因大豆種子中之PUFA合成酶蛋白質的西方墨點法偵測
藉由西方墨點分析來偵測在成熟轉殖基因種子樣品中之PUFA合成酶OrfA(由SzPUFA OrfA v3基因編碼)、PUFA合成酶OrfB(由SzPUFA OrfB v3基因編碼)、PUFA合成酶嵌合OrfC(由hThSzPUFA OrfC v3基因編碼)及HetI(來自念珠藻PCC 7120，基因銀行ID：P37695，GI：20141367)。保留在己烷萃取後剩餘的大豆T2 種子餅樣品用於FAME分析。將粉狀種子餅放置在含有單一4.5毫米不銹鋼球的管中，及加入萃取緩衝液(50 mM Tris，10 mM EDTA，2%SDS)。溫和地搖動該樣品管30分鐘，以3,000 rcf離心15分鐘及將上層液使用於分析。藉由660奈米蛋白質分析(熱費希爾(Thermo Fisher)，洛克福特(Rockford)，IL)測量在種子萃取物中的總可溶蛋白質量。將樣品常態化至1.25毫克/毫升的總可溶蛋白質，及對每條跑道16.25微克的總可溶蛋白質之常態化負載來說，在含有50 mM DTT的LDS樣品緩衝液(因維錯俊，卡爾斯貝得，CA)中製備。讓樣品在3%-8%的Tris-醋酸酯凝膠(因維錯俊，卡爾斯貝得，CA)中電泳，及轉移至硝基纖維素薄膜用於PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB及PUFA合成酶嵌合OrfC之偵測。讓樣品在4%-12%的Bis-Tris凝膠(因維錯俊，卡爾斯貝得，CA)中電 泳，及轉換至硝基纖維素薄膜用於HetI之偵測。
在阻斷緩衝液中培養墨點，然後以對抗不同PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC及Het I多胜肽的抗體探測。使用針對裂壺菌屬PUFA合成酶OrfA(SzPUFS-A)的A2區域之兔抗-A2-A、針對裂壺菌屬PUFA合成酶OrfB(SzPUFS-B)的B3區域之兔抗-B3-A及針對最大長度的HetI多胜肽之兔抗-HetI。區域B3包括OrfB的烯醯基還原酶(ER)區段。如亦在PUFA合成酶嵌合OrfC中有一同源ER區段，此抗血清在西方墨點法上識別出PUFA合成酶OrfB及PUFA合成酶嵌合OrfC二者。使用經抗兔螢光性標記的二級抗體(山羊抗-兔AF 633(因維錯俊，卡爾斯貝得，CA))來偵測。墨點在颱風三歐加(Typhoon Trio Plus)螢光成像器(GE保健(GE Healthcare)，紐伯朗士威(New Brunswick)NJ)上顯現。
當以PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC及HetI特定的抗血清探測時，來自事件7362[708]-70801及7362[710]-71005的成熟T2 種子之蛋白質萃取物的SDS-PAGE西方墨點顯示出適當大小的帶(圖13)。PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB及PUFA合成酶嵌合OrfC的帶亦可藉由以考馬斯藍(Coomassie Blue)直接染色而看見。
實施例8
使用另一種啟動子的海藻PUFA合成酶基因套組之表現性
使用額外的轉錄調控元素來表現出編碼出PUFA 合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI蛋白質之基因可進一步增加在大豆種子內的LC-PUFA及DHA含量。在甘油三酯生物合成及沉積期間於發育時較早表現出的轉錄調控元素之鑑別及使用且為了延長一段時間，可藉由在種子發育的較早階段處(例如，在15至25 DAP處)促進LC-PUFA及DHA生物合成基因的轉錄，增加在大豆種子內的LC-PUFA及DHA程度，因此延長LC-PUFA及DHA生產時間。此轉錄調控區域的實施例包括(但不限於)雷斯克懶勒(Lesquerella fendleri)KCS(LfKCS3)啟動子(美國專利案號7,253,337)及FAE 1啟動子(美國專利案號6,784,342)及甘藍(Brassica oleracea)醯基載體蛋白質(BoACP)啟動子(International Publ.No.WO 1992/18634)。此外，可在種子發育期間使用其它種子專一性啟動子(諸如來自四季豆的菜豆蛋白啟動子，美國專利案號5,504,200)來強烈地驅動異種基因之表現性一段延長的時間，以增加在大豆種子內的LC-PUFA及DHA程度。最後，可使用強組成型啟動子(諸如，樹薯葉脈鑲嵌病毒啟動子(CsVMV啟動子v2))來遍及發育的全部階段驅動異種基因之表現性，因此增加在大豆種子及其它植物組織內的LC-PUFA及DHA程度。
這些啟動子係單一或組合著使用，以驅動PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶嵌合OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI表現匣(expression cassettes)之表現性(其先前在質體pDAB7362 中描述)。在質體內置換轉錄調控區域的方法在技藝中熟知。就此而論，從pDAB7362(或前述使用來建立pDAB7362的質體)移除包含PvDlec2啟動子v2的多核苷酸片段，及以新的啟動子區域置換。使用新建構的質體來穩定轉形大豆植物。轉殖基因的大豆植物經分離及分子標出特徵。使用描述於本文的方法來分析脂質曲線(FAMEs)來測量所產生的LC-PUFA累積，及鑑別出生產0.01%至15% DHA(以總脂肪酸的重量計)、0.01%至10% DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)或0.01%至10%EPA(以總脂肪酸的重量計)的大豆植物。
使用在種子發育時較早表現出的啟動子
實施例8.1：pDAB9166之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9166質體(圖14；SEQ ID NO：40)。pDAB9166包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括LfKCS3啟動子v1、SzPUFA OrfA v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括LfKCS3啟動子v1、SzPUFA OrfB v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括LfKCS3啟動子v1、hSzThPUFA OrfC v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括LfKCS3啟動子v1、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB9161、pDAB9162、pDAB9163、pDAB101484及pDAB7333以形成pDAB9166。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元 pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例8.2：pDAB9167之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9167質體(圖15；SEQ ID NO：41)。pDAB9167包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括LfKCS3啟動子v1、SzPUFA OrfA v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括BoACP啟動子v1、BoACP 5’ UTR v1、SzPUFA OrfB v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括LfKCS3啟動子v1、hSzThPUFA OrfC v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括BoACP啟動子v1、BoACP 5’ UTR v1、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB9161、pDAB9165、pDAB9163、pDAB101485及pDAB7333以形成pDAB9167。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、 NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
包含該菜豆蛋白啟動子的質體
實施例8.3：pDAB7379之構建
pDAB7379係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC及NoHetI版本。SzACS-2基因序列不包含在此建構體中。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7379質體(圖16；SEQ ID NO：42)。
pDAB7379包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB7371、pDAB7372、pDAB7373、pDAB7374及pDAB7333以形成pDAB7379。特別是，以頭對 尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例8.4：pDAB7380之構建
pDAB7380係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC及NoHetI版本。SzACS-2基因序列不包含在此建構體中。在此建構體中所使用的菜豆蛋白啟動子版本基本上如在巴士托斯(Bustos)等人，1989(The Plant Cell，Vol.1；839-853)中所描述般改造，其中該啟動子的5’部分經截斷及菜豆蛋白5’未轉譯的區域完整留下。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7380質體(圖17；SEQ ID NO：43)。
pDAB7380包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA 合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v5、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB7375、pDAB7376、pDAB7377、pDAB7378及pDAB7333以形成pDAB7380。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例8.5：pDAB9323之構建
pDAB9323係一二元質體，其經建構以包括天然、未密碼子最佳化的SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2及NoHetI版本。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9323質體(圖18；SEQ ID NO：44)。
pDAB9323包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第三PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfC v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzACS-2 v2基因、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v2、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。
重組質體pDAB9307、pDAB9311、pDAB9315、pDAB9322及pDAB7333以形成pDAB9323。特別是，以頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v2、SzPUFA OrfB v2、SzPUFA OrfC v2、NoHetI v2。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該六種PTU的重組質體。
實施例8.6：pDAB9330之構建
pDAB9330係一二元質體，其經建構以包括重 建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2及NoHetI版本。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9330質體(圖19；SEQ ID NO：45)。pDAB9330包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3’ UTR及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第三PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzACS-2 v3基因、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。
重組質體pDAB9324、pDAB9325、pDAB9326、pDAB9329及pDAB7333以形成pDAB9330。特別是，以頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、 NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該六種PTU的重組質體。
實施例8.7：pDAB9337之構建
pDAB9337係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC及NoHetI表現性(其由菜豆蛋白啟動子驅動)版本。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9337質體(圖20；SEQ ID NO：46)。
pDAB9337包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第三PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。
重組質體pDAB9324、pDAB9325、pDAB9326、pDAB9328及pDAB7333以形成pDAB9337。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例8.8：pDAB9338之構建
pDAB9338係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC及NoHetI版本。使用菜豆蛋白啟動子來驅動SzPUFA OrfA之表現性，及使用PvDlec2啟動子來驅動其它轉殖基因。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9338質體(圖21；SEQ ID NO：47)。
pDAB9338包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶 PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB9324、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7338及pDAB7333以形成pDAB9338。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例8.9：pDAB9344之構建
pDAB9344係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC及NoHetI版本，其全部包括核酮糖雙磷酸羧化酶小鏈1A(標記為SSU-TP v1)，其融合至該編譯序列的胺基終端。使用菜豆蛋白啟動子來驅動SzPUFA OrfA的表現性及使用PvDlec2啟動子來驅動其它轉殖基因。
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9344質體(圖22；SEQ ID NO：48)。pDAB9344包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺 膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v4、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v4、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第三PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v4、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該膦酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v4，PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。
重組質體pDAB9343、pDAB9342、pDAB9340、pDAB9331及pDAB7333以形成pDAB9344。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v4、SzPUFA OrfB v4、hSzThPUFA OrfC v4、NoHetI v4。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該六種PTU的重組質體。
實施例8.10：pDAB9396之構建
pDAB9396係一二元質體，其經建構以包括重 建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2及NoHetI版本。使用菜豆蛋白啟動子來驅動SzPUFA OrfA及SzPUFA OrfB的表現性。使用PvDlec2啟動子來驅動其它轉殖基因；hSzThPUFA OrfC、SzACS-2及NoHetI。
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9396質體(圖23；SEQ ID NO：49)。pDAB9396包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzACS-2 v3基因、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB9324、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7339及pDAB7333以形成pDAB9338。特別是，以頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、 NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含五種PTU的重組質體。
實施例8.11：pDAB101412之構建
pDAB101412係一二元質體，其經建構以包括重建、密碼子最佳化的SzPUFA OrfA、SzPUFA OrfB、hSzThPUFA OrfC、SzACS-2及NoHetI版本。在此建構體中所使用的菜豆蛋白啟動子版本基本上如在巴士托斯等人，1989(The Plant Cell，Vol.1；839-853)中所描述般改造，其中該啟動子的5’部分經截斷及該菜豆蛋白5’未轉譯的區域完整留下。該經截斷的菜豆蛋白啟動子序列遍及此應用經鑑別如為版本4(v4)、版本5(v5)及版本6(v6)。使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB101412質體(圖24；SEQ ID NO：50)。
pDAB101412包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及 AtuOrf23 3’ UTR v1。該醯基-CoA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、2S 5’ UTR、SzACS-2 v3基因及AtuOrf23 5’ UTR v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v5、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB7375、pDAB7376、pDAB7377、pDAB7398及pDAB7333以形成pDAB101412。特別是，以頭對尾取向將上述五種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzACS-2 v3、NoHetI v3。pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4，除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外。然後，對六種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
使用在種子發育中較早表現出的啟動子之大豆轉形
使用上述方法，使用該等質體來穩定轉形大豆植物。轉殖基因的大豆植物經分離及分子標出特徵。使用另一種建構體產生包含較大的DHA及LC-PUFA量之大豆植物。測量所產生的LC-PUFA累積及該大豆植物經鑑別生產0.01%至15%的DHA或0.01%至15%的LC-PUFA。
實施例9
使用另一種建構體設計之海藻PUFA合成酶基因套組的表現性
引進啟動子多樣性以減低調控元素之重複
基因靜默係一種已經在轉殖基因大豆事件的後裔中觀察到之現象。數篇回顧論文討論到轉錄基因靜默(TGS)及轉錄後基因靜默(PTGS)，諸如瓦特豪斯(Waterhouse)等人，2001(Nature 411：834-842)；伐雀瑞特(Vaucheret)及發加得(Fagard)，2001(Trends in Genetics 17(1)：29-35；及岡本(Okamoto)及洋央(Hirochika)，2001(Trends in Plant Sci.6(11)：527-534)那些。在植物中，基因靜默可藉由重複轉殖基因多核苷酸序列(銜接重覆轉殖基因序列、逆向重覆轉殖基因序列、或多重插入該染色體中)觸發；或當藉由感染植物病毒或藉由農桿菌的T-DNA攜帶與該標的基因序列同源的序列時觸發。
此外，重複轉殖基因多核苷酸序列可作用為建構體不穩定性之觸發。共享高序列類似性程度之多重轉殖基因序列可交疊回另一個上。該重組可經由同源重組發生，其中DNA的介入序列經切除。結果，位於重覆的轉殖基因多核苷酸序列間之DNA片段經切除。
在設計質體載體時的一個對策為藉由併入多重、獨特的種子專一性啟動子(其維持每個轉殖基因的高程度表現性)將啟動子多樣性引進建構體中。將啟動子序列多樣性引進質體載體中可減低基因靜默及改善質體穩定性。多重種子專一性啟動子包括PvDlec2、菜豆蛋白及油菜籽蛋 白(napin)(美國專利案號5,608,152)。這些啟動子在啟動子活性上相對可比較，諸如組織特異性、表現性程度、表現性週期等等。
實施例9.1：pDAB7733之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7733二元質體(圖25；SEQ ID NO：51)。pDAB7733包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及BnaNapinC 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v5、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB7375、pDAB7731、pDAB7336、pDAB7378及pDAB7333以形成pDAB7733。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.2：pDAB7734之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB7734二元質體(圖26；SEQ ID NO：52)。pDAB7734包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及BnaNapinC 3’ UTR v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB7334、pDAB7376、pDAB7732、pDAB7338及pDAB7333以形成pDAB7734。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4，除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.3：pDAB101493之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB101493二元質體(圖27；SEQ ID NO：53)。pDAB101493包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v5、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB7334、pDAB7376、pDAB7336、pDAB7378及pDAB7333以形成pDAB101493。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.4：pDAB109507之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB109507質體(圖28；SEQ ID NO：54)。pDAB109507包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第二PUFA合成酶PTU包括BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及BnaNapinC 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括BoACP啟動子/5’ UTR v1、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB9324、pDAB7731、pDAB7336、pDAB101485及pDAB7333以形成pDAB109507。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.5：pDAB109508之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB109508質體(圖29；SEQ ID NO：55)。pDAB109508包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第二PUFA合成酶PTU包括BnaNapinC啟動子v1、BnaNapinC 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及BnaNapinC 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB9324、pDAB7731、pDAB7336、pDAB7338及pDAB7333以形成pDAB109508。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.6：pDAB109509之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB109509質體(圖30；SEQ ID NO：56)。pDAB109509包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2 啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括BoACP啟動子/5’ UTR v1、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB7334、pDAB7335、pDAB7336、pDAB101485及pDAB7333以形成pDAB109509。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
重新排列該二元建構體PTU之順序以減低長基因序列的片段
將SzPUFA OrfA PTU配置在該二元建構體的3’ 末端處以測試該PTU匣的順序是否可減低在孤立的轉殖基因事件中之片段及重組。SzPUFA OrfA係一包含九個銜接醯基載體蛋白質重覆的大開放讀碼區(~8,700 b.p.)。在所完成的建構體之第一系列中，將該SzPUFA OrfA PTU放置成首先整合進該植物染色體中。當它們的分子尺寸減少時，該SzPUFA OrfA PTU隨後接著剩餘的PTU合成相關基因PTU。該SzPUFA OrfA編譯區的分子分析指示出某些轉殖基因的油菜籽及擬南芥事件包括片段的插入物。另一種建構體設計已描述，其中該PUFA合成酶PTU的順序已經改變成下列組態：hSzThPUFA OrfC PTU、SzPUFA OrfB PTU、NoHetI PTU、SzPUFA OrfA PTU及PATPTU。完成改變該SzPUFA OrfA PTU在該二元建構體上的場所，以減低在孤立的轉殖基因事件中之片段及再排列。
實施例9.7：pDAB9151之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9151質體(圖31；SEQ ID NO：57)。pDAB9151包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。最後的PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、 SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB9148、pDAB7335、pDAB9149、pDAB9150及pDAB7333以形成pDAB9151。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3、NoHetI v3、SzPUFA OrfA v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
改變該二元建構體PTU的轉錄方向以引進建構體多樣性
另一種建構體設計包括改變PUFA合成酶PTU的順序及該基因表現匣的轉錄方向。在所完成的建構體之第一系列中，將每種基因表現匣放置在相同方向中(“頭對尾”，其中一種基因表現匣的啟動子設置成與第二基因表現匣之3’ UTR毗連)。下列建構體描述出一種對策，其中基因表現匣係以不同方向放置，且使用另一種啟動子。在這些實施例中，將該基因表現匣設置成與第二基因表現匣呈反式，如此二者基因表現匣之啟動子設計成彼此毗連。此組態描述為“頭對頭”組態。在實施例中描述其它組態，其中一個基因表現匣設置成與第二基因表現匣呈反式，如此該二者基因表現匣的3’ UTR設計成彼此毗連。此組態描述為“尾對尾”組態。為了減輕此設計的可能通讀 (read-through)，已經在這二種PTU間配置雙向Orf23/24終止子。已建議這些組態會增加轉殖基因的表現性，因此產生較高的LC-PUFA及DHA脂肪酸濃度及含量。
實施例9.8：pDAB108207之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB108207質體(圖32；SEQ ID NO：58)。pDAB108207包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v6、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3、At2S SSP終止子v1及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v6、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3’ UTR及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB7334、pDAB101489、pDAB108205、pDAB108206及pDAB7333以形成pDAB108207。特別是，在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內，以尾對尾取向配置SzPUFA OrfA v3及NoHetI v3；以頭對頭取向配置NoHetI v3及hSzThPUFA OrfC v3；以尾對尾取向配置hSzThPUFA OrfC v3及SzPUFA OrfB。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.9：pDAB108208之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB108208質體(圖33；SEQ ID NO：59)。pDAB108208包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v5、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3’ UTR、PvPhas3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB108200、pDAB101490、pDAB108201、pDAB108202及pDAB7333以形成pDAB108208。特別是，在該植物轉形二元pDAB7333的T 股DNA邊界區域內，以頭對頭取向配置SzPUFA OrfA v3及NoHetI v3；以尾對尾取向配置NoHetI v3及hSzThPUFA OrfC v3；以頭對頭取向配置hSzThPUFA OrfC v3及SzPUFA OrfB。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.10：pDAB108209之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB108209質體(圖34；SEQ ID NO：60)。pDAB108209包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v5、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3’ UTR及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)及隨機DNA間隔子。
重組質體pDAB108200、pDAB108204、pDAB108201、pDAB108202及pDAB7333以形成pDAB108209。特別是，在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內，以頭對頭取向配置SzPUFA OrfA v3及NoHetI v3；以尾對尾取向配置NoHetI v3及hSzThPUFA OrfC v3；以頭對頭取向配置hSzThPUFA OrfC v3及SzPUFA OrfB。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
加倍3’ UTR及包括間隔子DNA以最小化轉錄干擾。
當多重基因呈串列堆疊時可發生轉錄干擾，因此產生下游基因的表現性減低。此現象產生自3’ UTR及終止子的轉錄通讀進入下一個啟動子-轉錄單元中。已描述出另一種由二種策略組成以最小化轉錄干擾的建構體設計。第一對策部署使用二種終止子/3’ UTR，其堆疊在各別的DHA基因表現匣間以限制通讀進入下一個基因表現匣中。第二對策在基因表現匣間插入約一千個間隔子DNA的鹼基配對，因此最小化轉錄干擾。
實施例9.11：pDAB108207之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構 pDAB108207質體(圖32；SEQ ID NO：58)。pDAB108207包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3’ UTR、PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3、At2S SSP終止子v1及AtuOrf23 3’ UTR v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v6、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3、PvPhas 3’ UTR v1及PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)。
重組質體pDAB7334、pDAB101489、pDAB108205、pDAB108206及pDAB7333以形成pDAB108207。特別是，在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內，以尾對尾取向配置SzPUFA OrfA v3及NoHetI v3，及將AtuOrf233’ UTR配置在二個PTU間；以頭對頭取向配置NoHetI v3及hSzThPUFA OrfC v3；以頭對尾取向配置hSzThPUFA OrfC v3及SzPUFA OrfB，及將AtuOrf23 3’ UTR配置在二個PTU間。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草 胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.12：pDAB108208之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB108208質體(圖33；SEQ ID NO：59)。pDAB108208包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v5、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3’ UTR、PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)及AtuOrf23 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB108200、pDAB101490、pDAB108201、pDAB108202及pDAB7333以形成pDAB108208。特別是，在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內，以頭對頭取向配置SzPUFA OrfA v3及NoHetI v3；以尾對尾取向配置NoHetI v3及hSzThPUFA OrfC v3，及將AtuOrf233’ UTR配置在二個PTU間；以頭對頭取向配置hSzThPUFA OrfC v3及SzPUFA OrfB。該基因的 順序為：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.13：pDAB108209之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB108209質體(圖34；SEQ ID NO：60)。pDAB108209包括三種PUFA合成酶PTU、一種醯基-CoA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v5、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3、PvPhas 3’ UTR、PvPhas 3’ MAR v2(在質體圖譜上未加說明)及隨機DNA間隔子。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB108200、pDAB108204、pDAB108201、pDAB108202及pDAB7333以形成pDAB108209。特別是，在該植物轉形二元pDAB7333的T 股DNA邊界區域內，以頭對頭取向配置SzPUFA OrfA v3及NoHetI v3；以尾對尾取向配置NoHetI v3及hSzThPUFA OrfC v3，及將一千個間隔子鹼基對配置在二個PTU間；以頭對頭取向配置hSzThPUFA OrfC v3及SzPUFA OrfB。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3、hSzThPUFA OrfC v3、SzPUFA OrfB v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
使用另一種3’ UTR-終止子來限制轉錄通讀。
在上述許多建構體中，主要使用農桿菌屬Orf23 3’ UTR-終止子來終止轉錄。最近顯示出ZmLipase 3’ UTR-終止子在擬南芥中終止轉錄通讀係更有效。就此而論，一種建構體版本係使用ZmLipase 3’ UTR-終止子與PvDlec2啟動子之組合來測試此3’ UTR是否可減低上游基因的轉錄通讀，因此減低轉錄干擾。
實施例9.14：pDAB9159之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9159質體(圖35；SEQ ID NO：61)。pDAB9159包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及ZmLip 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及ZmLip 3’ UTR v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及ZmLip 3’ UTR v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v3、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及ZmLip 3’ UTR v1。
重組質體pDAB9152、pDAB9153、pDAB9154、pDAB9155及pDAB7333以形成pDAB9159。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.15：pDAB9147之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB9147質體(圖36；SEQ ID NO：62)。pDAB9147包括三種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3、At2S SSP終止子v1及ZmLip 3’ UTR v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP 終止子v1。該第三PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、hSzThPUFA OrfC v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、NoHetI v3及At2S SSP終止子v1。
重組質體pDAB9146、pDAB7335、pDAB7336、pDAB7338及pDAB7333以形成pDAB9147。特別是，以頭對尾取向將上述四種PTU配置在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3、NoHetI v3。pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4，除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外。然後，對五種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
DHA基因在二個分開的T-DNA上之傳遞。
另一種建構體設計由建構二種分開的二元載體組成，該第一載體在一個T-DNA上包括PUFA合成酶基因之子集，及該第二二元載體在第二T-DNA上包括剩餘的PUFA合成酶基因。這些二元載體各別使用來轉形性相交的植物，因此產生包含全部PUFA合成酶基因表現建構體的後裔。另一種生產轉殖基因植物的方法將係共轉形二者二元載體進入大豆組織中，及選擇或篩選包含二者T股的單一植物。
實施例9.16：pDAB108224之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構 pDAB108224質體(圖37；SEQ ID NO：63)。pDAB108224包括一種PUFA合成酶PTU、一種磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfA v3及At2S SSP終止子v1。該磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶PTU包括PvPhas啟動子v4、PvPhas 5’ UTR、NoHetI v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB108216、pDAB108221及pDAB7333以形成pDAB108224。特別是，在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內，以頭對頭取向配置SzPUFA OrfA v3及NoHetI v3。該基因的順序為：SzPUFA OrfA v3、NoHetI v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對三種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
實施例9.17：pDAB108225之構建
使用多位置蓋特威L-R重組反應建構pDAB108225質體(圖38；SEQ ID NO：64)。pDAB108225包括二種PUFA合成酶PTU及一種草胺膦乙醯基轉移酶PTU。特別是，該第一PUFA合成酶PTU包括PvDlec2啟動子v2、2S 5’ UTR、SzPUFA OrfB v3及At2S SSP終止子v1。該第二PUFA合成酶PTU包括PvPhas啟動子v4、SzPUFA OrfB v3及AtuOrf23 3’ UTR v1。
重組質體pDAB108217、pDAB108222及pDAB7333以形成pDAB108225。特別是，在該植物轉形二元pDAB7333的T股DNA邊界區域內，以頭對頭取向配置SzPUFA OrfB v3及hSzThPUFA OrfC v3。該基因的順序為：SzPUFA OrfB v3、hSzThPUFA OrfC v3。除了其它調控元素(諸如超驅動及T股邊界序列(T-DNA邊界A及T-DNA邊界B))外，pDAB7333亦包括該草胺膦乙醯基轉移酶PTU：CsVMV啟動子v2、PAT v5、AtuOrf1 3’ UTR v4。然後，對三種PTU之併入來說，使用限制酶切及DNA定序來分離及測試包含該五種PTU的重組質體。
大豆轉形與包含另一種設計的建構體
使用上述方法，使用這些質體來穩定轉形大豆植物。轉殖基因的大豆植物經分離及分子標出特徵。使用另一種建構體產生包含較大量的DHA及LC-PUFA之大豆植物。測量所產生的LC-PUFA累積及鑑別出該大豆植物生產0.01%至15%的DHA或0.01%至15%的LC-PUFA。
實施例10
使用於擬南芥之轉形及隨後生產LC-PUFA與DHA的另一種建構體設計
以包含pDAB101493、pDAB7362、pDAB7369、pDAB101412或pDAB7380二元載體的農桿菌菌株轉形擬南芥植物。使用由克勞夫及班特所描述的花序浸漬(floral dipping)轉形方法(1998)來轉形。克勞夫及班特，“花序浸 漬：擬南芥(arabidopsis thalia)之簡易農桿菌屬介導性轉形方法”，Plant J.，16：735-743，1998。獲得經轉形的阿拉伯芥屬植物及完成轉殖基因存在的分子確認。讓來自轉殖基因的阿拉伯芥屬事件之T1 植物在溫室中生長至成熟。這些植物自身施肥及成熟時採集所產生的T2 種子。經由FAMEs GC-FID分析T2 種子(10毫克)以測量在T2 阿拉伯芥屬種子中的LC-PUFA及DHA含量。經由FAMEs GC-FID方法，如在先前實施例中所描述般分析該組織。來自阿拉伯芥屬植物的T1 植物之T2 種子包含0%至0.95%的DHA及0%至1.50%的總LC-PUFA。來自各別的T1 植物之T2 種子的LC-PUFA及DHA含量顯示在圖39中。
實施例11
在大豆內DGAT2或ACCase與海藻PUFA合成酶基因套組的共表現性
在大豆植物內的油含量藉由嵌合DNA分子(其編碼及表現出乙醯基CoA羧化酶(ACCase)或型式2二醯基甘油轉醯酶(DGAT2))之轉形進一步改造。這些基因經由育種包含ACCase或DGAT2表現匣的大豆植物與包含PUFA合成酶基因的大豆植物，與上述海藻PUFA合成酶基因共表現；或藉由以包含該ACCase或DGAT2與PUFA合成酶基因之基因堆疊轉形大豆植物。ACCase或DGAT2編譯序列之表現性所需要的調控元素可包括上述那些。亦可使用在技藝中已知的額外調控元素表現序列。使用上述轉形方法將ACCase及DGAT2表現匣轉形進入大豆中。當ACCase或DGAT2表現 匣之分子堆疊與PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI表現匣結合時；或當各自獨立的ACCase或DGAT2表現匣連結至可選擇的標誌，然後隨後與包含PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB、PUFA合成酶OrfC、醯基-CoA合成酶及4’磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶HetI表現匣的大豆植物相交時，可發生轉形。正轉形株經分離及分子標出特徵。大豆植物經鑑別，其包括增加在該植物、植物的種子或植物油濃度中之LC-PUFA累積，與未轉形的對照大豆植物比較。此增加的範圍可係1.2至20倍增加。
ACCase在細胞質中的過度表現性可生產較高的丙二酸單醯基-CoA程度。隨後，當海藻PUFA合成酶基因存在及表現時，包含增加的細胞質丙二酸單醯基-CoA程度之大豆植物或種子可生產較高的長鏈多元不飽和脂肪酸(LC-PUFA)程度。在大豆植物內表現出的DGAT2基因可優先地將明顯量之廿二碳六烯酸(DHA)及廿碳五烯酸(EPA)併入甘油三酯中。DGAT2基因與朝向LC-PUFA的基質較佳物(參見例如，PCT國際公告WO 2009/085169A2)可增加這些脂肪酸併入甘油三酯(TAG)中。此DGAT基因對指導LC-PUFA(特別是DHA)併入TAG中及對增加在植物及其它有機體中的TAG生產有用。
實施例12
在以另一種用於PUFA合成酶基因之表現性的建構體設計轉形之阿拉伯芥屬種子中生產DHA
在控制多種植物表現性元素下，使用基本上如描述在克勞夫及班特(Plant J.，1998 16(6)：735-43)中的花序浸漬方法生產以懷有編碼出PUFA合成酶基因及HetI(及在某些情況中，SzACS-2)的質體之農桿菌轉形的阿拉伯芥屬T1 事件。採集及播種所產生的T1 種子。藉由以草胺膦噴灑來選擇經轉形的T1 植物，以選擇包含功能性PAT基因作為可選擇的標誌之那些植物。對來自存活的T1 植物之葉組織取樣及藉由對PAT基因特定的定量PCR反應進行分析，以鑑別出包括可選擇的標誌之單一複製品(及相關的轉殖基因)之那些植物。讓這些植物生長至成熟，採集T2 種子及分析LC-PUFA含量(如為總可萃取的FAME之%)。來自以多種編碼出PUFA合成酶基因的建構體產生之事件的資料總整理顯示在表12中。
這些資料顯示出某些建構體組態及啟動子組合在T2 種子中產生較高比例之包含LC-PUFA的事件(對pDAB109507來說，全部單一複製品事件的77%生產DHA；及對pDAB108207來說，全部單一複製品事件的86%生產DHA)。同樣地，某些建構體產生較高比例之生產>1%的 LC-PUFA含量之事件(對pDAB109507來說，全部單一複製品事件的33%；及對pDAB108207來說，全部單一複製品事件的34%)。對不同建構體來說，來自多種事件範圍的T2 種子之最大LC-PUFA含量係0.24%-2.03%。同樣地，某些建構體產生較高的Ω-3 LC-PUFA程度。遍及全部產生的建構體及事件，最大DHA含量範圍係0.17%-1.45%及最大EPA含量範圍係0%-0.26%。這些資料指示出啟動子組態改變的建構體設計之改變產生具有增加的LC-PUFA之轉殖基因植物，如與以pDAB7362轉形的轉殖基因植物比較。就此而論，對農作物轉形來說，建構體設計經改變的這些建構體係想要。
種植來自高LC-PUFA生產事件的T2 種子及對來自該生長植物的葉組織取樣，使用定量PCR來分析該PAT基因及其它轉殖基因。鑑別出包含二個轉殖基因複製品(即，同型結合子)的植物及生長至成熟。採集所產生的T3 種子及分析LC-PUFA含量。包含重覆的啟動子/3’ UTR表現性元素之某些建構體(諸如pDAB7362及pDAB109509)顯示出在隨後的T3 種子代中有差的LC-PUFA特性穩定性。但是，以不同建構體組態轉形及/或具有多樣化的表現性元素(例如，pDAB108207、109508及7734)之某些事件明顯產生改良LC-PUFA特性進入T3 種子代中的穩定性，如顯示在表13中。這些資料指示出某些建構體可在隨後代中維持DHA特性的穩定性，及此建構體對農作物轉形較佳。
已經顯現出本發明的前述說明用於闡明及描述之目的。再者，該描述不想要以於本文所揭示的形式限制本發明。
描述於本文的多個觀點、具體實例及選擇全部可以任何及全部變化結合。
在本專利說明書中所提及的全部公告、專利及專利申請案於此以參考方式併入本文至如若每篇各別公告、專利或專利申請案係特別及各別指示出以參考方式併入本文般相同的程度。
圖1描出編碼出PUFA OrfA的9個重覆區段每個之重新設計的DNA序列之Clustal W(在Vector NTI中排比)。
圖2係pDAB7362的質體圖譜。
圖3係pDAB7361的質體圖譜。
圖4係pDAB7363的質體圖譜。
圖5係pDAB7365的質體圖譜。
圖6係pDAB7368的質體圖譜。
圖7係pDAB7369的質體圖譜。
圖8係pDAB7370的質體圖譜。
圖9係pDAB100518的質體圖譜。
圖10係pDAB101476的質體圖譜。
圖11係pDAB101477的質體圖譜。
圖12顯示出來自以pDAB7362轉形的二種大豆事件之T1植物的單一T2大豆種子之DHA及LC-PUFA含量。
圖13顯示出在T2大豆種子蛋白質萃取物中之PUFA合成酶OrfA、PUFA合成酶OrfB及PUFA合成酶嵌合OrfC的西方墨點法(Western blot)偵測。
圖14係pDAB9166的質體圖譜。
圖15係pDAB9167的質體圖譜。
圖16係pDAB7379的質體圖譜。
圖17係pDAB7380的質體圖譜。
圖18係pDAB9323的質體圖譜。
圖19係pDAB9330的質體圖譜。
圖20係pDAB9337的質體圖譜。
圖21係pDAB9338的質體圖譜。
圖22係pDAB9344的質體圖譜。
圖23係pDAB9396的質體圖譜。
圖24係pDAB101412的質體圖譜。
圖25係pDAB7733的質體圖譜。
圖26係pDAB7734的質體圖譜。
圖27係pDAB101493的質體圖譜。
圖28係pDAB109507的質體圖譜。
圖29係pDAB109508的質體圖譜。
圖30係pDAB109509的質體圖譜。
圖31係pDAB9151的質體圖譜。
圖32係pDAB108207的質體圖譜。
圖33係pDAB108208的質體圖譜。
圖34係pDAB108209的質體圖譜。
圖35係pDAB9159的質體圖譜。
圖36係pDAB9147的質體圖譜。
圖37係pDAB108224的質體圖譜。
圖38係pDAB108225的質體圖譜。
圖39顯示出來自以pDAB101493、pDAB7362、pDAB7369、pDAB101412或pDAB7380轉形的各別轉殖基因型阿拉伯芥屬事件之T2種子的DHA及LC-PUFA含量。
<110> 陶氏農業科學公司(Dow AgroSciences LLC) DSM智慧財產有限公司(DSM IP Assets B.V.)
<120> 在植物中生產DHA及其他LC-PUFA之技術
<130> 2715.268TW01
<140> 待委任
<141> 隨函
<150> 61/511,878
<151> 2011-07-26
<160> 64
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 2910
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SzPUFA OrfA v3蛋白質
<400> 1
<210> 2
<211> 2059
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SzPUFA OrfB v3蛋白質
<400> 2
<210> 3
<211> 1493
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSzThPUFA OrfC v3蛋白質
<400> 3
<210> 4
<211> 780
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SzACS-2 v3蛋白質
<400> 4
<210> 5
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NoHetI v3蛋白質
<400> 5
<210> 6
<211> 8733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SzPUFA OrfA v3基因
<400> 6
<210> 7
<211> 6180
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SzPUFA OrfB v3基因
<400> 7
<210> 8
<211> 4482
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSzThPUFA OrfC v3基因
<400> 8
<210> 9
<211> 2343
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SzACS-2 v3基因
<400> 9
<210> 10
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NoHetI v3基因
<400> 10
<210> 11
<211> 33003
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB7362 T-股
<400> 11
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sz ORFA v3順向引子
<400> 12
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sz ORFA v3反向引子
<400> 13
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sz ORFB v3順向引子
<400> 14
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sz ORFB v3反向引子
<400> 15
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hThSzORFCv3順向引子
<400> 16
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hThSzORFCv3反向引子
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SzACS2 v3順向引子
<400> 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SzACS2 v3反向引子
<400> 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NoHetI v3順向引子
<400> 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NoHetI v3反向引子
<400> 21
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT v5順向引子
<400> 22
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT v5反向引子
<400> 23
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAT v5探針
<400> 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMS116順向引子
<400> 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMS116反向引子
<400> 26
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMS116探針
<400> 27
<210> 28
<211> 240
<212> DNA
<213> 擬南芥
<220>
<223> 核酮糖雙磷酸羧化酶小鏈1A
<400> 28
<210> 29
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醯基-ACP-硫酯酶運送胜肽
<400> 29
<210> 30
<211> 2346
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SzACS-2 v4基因
<400> 30
<210> 31
<211> 38794
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7361
<400> 31
<210> 32
<211> 39711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7363
<400> 32
<210> 33
<211> 38811
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7365
<400> 33
<210> 34
<211> 35302
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7368
<400> 34
<210> 35
<211> 35154
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7369
<400> 35
<210> 36
<211> 36102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7370
<400> 36
<210> 37
<211> 39183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB100518
<400> 37
<210> 38
<211> 38742
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB101476
<400> 38
<210> 39
<211> 38760
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB101477
<400> 39
<210> 40
<211> 34862
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9166
<400> 40
<210> 41
<211> 34404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9167
<400> 41
<210> 42
<211> 38762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7379
<400> 42
<210> 43
<211> 35836
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7380
<400> 43
<210> 44
<211> 47165
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9323
<400> 44
<210> 45
<211> 46978
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9330
<400> 45
<210> 46
<211> 41726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9337
<400> 46
<210> 47
<211> 36797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9338
<400> 47
<210> 48
<211> 42674
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9344
<400> 48
<210> 49
<211> 40406
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9396
<400> 49
<210> 50
<211> 39630
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB101412
<400> 50
<210> 51
<211> 36936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7733
<400> 51
<210> 52
<211> 36767
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB7734
<400> 52
<210> 53
<211> 35494
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB101493
<400> 53
<210> 54
<211> 37935
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB109507
<400> 54
<210> 55
<211> 38239
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB109508
<400> 55
<210> 56
<211> 34850
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB109509
<400> 56
<210> 57
<211> 35154
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9151
<400> 57
<210> 58
<211> 38074
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB108207
<400> 58
<210> 59
<211> 36718
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB108208
<400> 59
<210> 60
<211> 36517
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB108209
<400> 60
<210> 61
<211> 36590
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9159
<400> 61
<210> 62
<211> 35499
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB9147
<400> 62
<210> 63
<211> 22042
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB108224
<400> 63
<210> 64
<211> 23255
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pDAB108225
<400> 64

Claims (73)

  1. 一種基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其包含：(i)一包含一編碼出多元不飽和脂肪酸(PUFA)合成酶的核酸序列之核酸分子，其中該合成酶生產至少一種PUFA；及(ii)一包含一編碼出磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)的序列之核酸分子。
  2. 如申請專利範圍第1項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該PUFA合成酶包含一與胺基酸序列SEQ ID NO：1有至少80%相同的胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第2項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該PUFA合成酶包含胺基酸序列SEQ ID NO：1。
  4. 如申請專利範圍第1項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含一與核酸序列SEQ ID NO：6有至少80%相同的核酸序列。
  5. 如申請專利範圍第4項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO：6。
  6. 如申請專利範圍第1至5項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該PUFA 合成酶包含一與胺基酸序列SEQ ID NO：2有至少80%相同的胺基酸序列。
  7. 如申請專利範圍第6項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該PUFA合成酶包含胺基酸序列SEQ ID NO：2。
  8. 如申請專利範圍第1至5項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含一與核酸序列SEQ ID NO：7有至少80%相同的核酸序列。
  9. 如申請專利範圍第8項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO：7。
  10. 如申請專利範圍第1至9項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該PUFA合成酶包含一與胺基酸序列SEQ ID NO：3有至少80%相同的胺基酸序列。
  11. 如申請專利範圍第10項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該PUFA合成酶包含胺基酸序列SEQ ID NO：3。
  12. 如申請專利範圍第1至9項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含一與核酸序列SEQ ID NO：8有至少80%相同的核酸序列。
  13. 如申請專利範圍第12項之基因改造的大豆植物、後代、 細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO：8。
  14. 如申請專利範圍第1項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該PUFA合成酶包含胺基酸序列SEQ ID NOs：1-3。
  15. 如申請專利範圍第1項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該PUFA合成酶的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NOs：6-8。
  16. 如申請專利範圍第1至15項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該PPTase包含一與SEQ ID NO：5有至少80%相同的胺基酸序列。
  17. 如申請專利範圍第16項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該PPTase包含胺基酸序列SEQ ID NO：5。
  18. 如申請專利範圍第1至17項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該PPTase的核酸序列係與核酸序列SEQ ID NO：10有至少80%相同。
  19. 如申請專利範圍第18項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該PPTase的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO：10。
  20. 如申請專利範圍第1至19項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該核酸序列(i)及(ii)係包含在單一重組表現載體中。
  21. 如申請專利範圍第1至20項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該核酸序列(i)或(ii)係與種子專一性啟動子或葉專一性啟動子可操作地連結。
  22. 如申請專利範圍第1至20項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該核酸序列(i)或(ii)係與PvDlec2、LfKCS3、FAE 1、BoACP、BnaNapinC、泛素或CsVMV啟動子可操作地連結。
  23. 如申請專利範圍第1至22項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，更包含：(iii)一包含編碼出醯基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列之核酸分子。
  24. 如申請專利範圍第23項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該ACoAS包含一與SEQ ID NO：4有至少80%相同的胺基酸序列。
  25. 如申請專利範圍第24項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該ACoAS包含胺基酸序列SEQ ID NO：4。
  26. 如申請專利範圍第23項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該ACoAS的核酸序列包含一與核酸序列SEQ ID NO：9有至少80%相同的核酸序列。
  27. 如申請專利範圍第26項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該編碼出該ACoAS 的核酸序列包含核酸序列SEQ ID NO：9。
  28. 如申請專利範圍第23至27項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該核酸序列(i)、(ii)及(iii)係包含在單一重組表現載體中。
  29. 如申請專利範圍第23至27項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該核酸序列(i)、(ii)或(iii)係與種子專一性啟動子或葉專一性啟動子可操作地連結。
  30. 如申請專利範圍第23至27項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該核酸序列(i)、(ii)或(iii)係與PvDlec2、LfKCS3、FAE 1、BoACP、BnaNapinC、泛素或CsVMV啟動子可操作地連結。
  31. 如申請專利範圍第1至30項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，更包含一編碼出乙醯基CoA羧化酶(ACCase)的核酸序列或一編碼出型式2二醯基甘油轉醯酶(DGAT2)的核酸序列。
  32. 一種基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其包含下列之至少一種：pDAB7361、pDAB7362、pDAB7363、pDAB7368、pDAB7369、pDAB7370、pDAB100518、pDAB101476、pDAB101477、pDAB9166、pDAB9167、pDAB7379、pDAB7380、pDAB9323、pDAB9330、pDAB9337、pDAB9338、pDAB9344、pDAB9396、pDAB101412、pDAB7733、 pDAB7734、pDAB101493、pDAB109507、pDAB109508、pDAB109509、pDAB9151、pDAB108207、pDAB108208、pDAB108209、pDAB9159、pDAB9147、pDAB108224及pDAB108225。
  33. 如申請專利範圍第1至32項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含可偵測量的DHA(廿二碳六烯酸(C22：6，n-3))、DPA(n-6)(廿二碳五烯酸(C22：5，n-6))、或EPA(廿碳五烯酸(C20：5，n-3))。
  34. 如申請專利範圍第33項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含0.01%至15%的DHA(以總脂肪酸的重量計)。
  35. 如申請專利範圍第34項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含0.05%至10%的DHA(以總脂肪酸的重量計)。
  36. 如申請專利範圍第35項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含0.05%至5%的DHA(以總脂肪酸的重量計)。
  37. 如申請專利範圍第1至36項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含0.01%至10% 的EPA(以總脂肪酸的重量計)。
  38. 如申請專利範圍第37項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含0.05%至5%的EPA(以總脂肪酸的重量計)。
  39. 如申請專利範圍第38項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含0.05%至1%的EPA(以總脂肪酸的重量計)。
  40. 如申請專利範圍第1至39項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含0.01%至10%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)。
  41. 如申請專利範圍第40項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含0.01%至5%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)。
  42. 如申請專利範圍第1-34及39-47項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含0.01%至1%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)。
  43. 如申請專利範圍第1至33項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含EPA：DHA 比率係1：1至1：30(以總脂肪酸的重量計)。
  44. 如申請專利範圍第43項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含EPA：DHA比率係1：1至1：3(以總脂肪酸的重量計)。
  45. 如申請專利範圍第1至33項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含DPA(n-6)：DHA比率係1：1至1：10(以總脂肪酸的重量計)。
  46. 如申請專利範圍第45項之基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，其中該植物、後代、細胞、組織、種子或其部分包含DPA(n-6)：DHA比率係1：1至1：3(以總脂肪酸的重量計)。
  47. 一種油，其係從如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分獲得。
  48. 一種種子，其係從如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織或其部分獲得。
  49. 一種食物產物，其包含一從如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分獲得之油，或一從如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織或其部分獲得的種子。
  50. 一種功能性食物，其包含一從如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分獲得之油，或一從如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織或其部分獲得之種子。
  51. 一種醫藥產物，其包含一從如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分獲得之油，或一從如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織或其部分獲得之種子。
  52. 一種生產一包含至少一種PUFA的油之方法，包括回收一來自如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分，或來自如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織或其部分之種子的油。
  53. 一種生產一包含至少一種PUFA的油之方法，包括生長如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。
  54. 一種在種子油中生產至少一種PUFA的方法，包括回收來自如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織或其部分之種子的油。
  55. 一種在種子油生產至少一種PUFA的方法，包括生長如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分。
  56. 一種將包含至少一種PUFA的補充品或治療產物提供至個體的方法，包括對該個體提供如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分；如申請專利範圍第47項之油；如申請專利範圍第48項之種子；如申請專利範圍第49項之食物產物；如申請專利範圍第50項之功能性食物；或如申請專利範圍第51項之醫藥產物。
  57. 如申請專利範圍第53至56項之任何一項的方法，其中該PUFA係DHA。
  58. 如申請專利範圍第53至56項之任何一項的方法，其中該PUFA係EPA。
  59. 如申請專利範圍第53至56項之任何一項的方法，其中該PUFA係DPA(n-6)。
  60. 一種生產如申請專利範圍第1至46項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織或其部分之方法，包括以下列轉形一大豆植物或植物細胞：(i)一包含一編碼出海藻PUFA合成酶的序列之核酸分子；及(ii)一包含一編碼出磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)的序列之核酸分子。
  61. 如申請專利範圍第60項之方法，更包括以(iii)一包含一編碼出醯基-CoA合成酶(ACoAS)的序列之核酸分子轉形該大豆植物或植物細胞。
  62. 一種大豆油，其包含0.05%至15%的DHA(以總脂肪酸的重量計)。
  63. 如申請專利範圍第62項之大豆油，更包含0.05%至5%的EPA(以總脂肪酸的重量計)。
  64. 如申請專利範圍第62或63項之大豆油，更包含0.01%至5%的DPA(n-6)(以總脂肪酸的重量計)。
  65. 一種大豆油，其包含EPA：DHA比率係1：1至1：30(以總脂肪酸的重量計)。
  66. 如申請專利範圍第65項之大豆油，包含EPA：DHA比率係1：1至1：3(以總脂肪酸的重量計)。
  67. 一種大豆油，其包含DPA(n-6)：DHA比率係1：1至1：10(以總脂肪酸的重量計)。
  68. 如申請專利範圍第67項之大豆油，包含DPA(n-6)：DHA比率係1：1至1：3(以總脂肪酸的重量計)。
  69. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第47及58至68項之任何一項的油。
  70. 一種生產如申請專利範圍第1至42項之任何一項的基因改造的大豆植物、後代、細胞、組織、種子或其部分之方法，包括以一包含下列的表現匣轉形一大豆植物或植物細胞：(i)一包含一編碼出PUFA合成酶的核酸序列之核酸分子；(ii)一包含一編碼出醯基-CoA合成酶(ACoAS)的核酸序列之核酸分子；及(iii)一包含一編碼出磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)的序列之核酸分子。
  71. 一種油摻合物，其包含如申請專利範圍第47及58至68項之任何一項的油及另一種油。
  72. 如申請專利範圍第71項之油摻合物，其中該另一種油係 植物油、魚油、微生物油或其混合物。
  73. 一種飼料或粗粉組成物，其包含如申請專利範圍第47及58至68項之任何一項的油。
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