CN116555054A - 一株高产dha的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用 - Google Patents
一株高产dha的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116555054A CN116555054A CN202310682522.3A CN202310682522A CN116555054A CN 116555054 A CN116555054 A CN 116555054A CN 202310682522 A CN202310682522 A CN 202310682522A CN 116555054 A CN116555054 A CN 116555054A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- recombinant
- schizochytrium
- dgat
- gpat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 241000003595 Aurantiochytrium limacinum Species 0.000 title claims description 10
- 241000233671 Schizochytrium Species 0.000 claims abstract description 63
- 108010001348 Diacylglycerol O-acyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 108010036824 Citrate (pro-3S)-lyase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 101710091951 Glycerol-3-phosphate acyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 22
- 101150077374 lipR gene Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 241001491289 Schizochytrium sp. ATCC 20888 Species 0.000 claims abstract description 5
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 53
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 claims description 15
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 13
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 101000819355 Arabidopsis thaliana Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase 2, chloroplastic Proteins 0.000 claims description 9
- 101150017311 GPAT gene Proteins 0.000 claims description 9
- 101100054598 Hordeum vulgare ACL1.2 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 101150039504 6 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- 101100449516 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) grg-1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000863430 Shewanella Species 0.000 claims description 4
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 claims description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 4
- 101150049032 ACL1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100448894 Arabidopsis thaliana GLR3.1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101000930943 Arabidopsis thaliana Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase 1, chloroplastic Proteins 0.000 claims description 3
- 101000819376 Arabidopsis thaliana Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase 3, chloroplastic Proteins 0.000 claims description 3
- 101100434038 Hordeum vulgare ACL1.3 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150023061 acpP gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 108050004099 Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Proteins 0.000 claims 11
- 102100036869 Diacylglycerol O-acyltransferase 1 Human genes 0.000 claims 9
- 102100039239 Amidophosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims 6
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 4
- 102000010705 glucose-6-phosphate dehydrogenase activity proteins Human genes 0.000 claims 3
- 108040005050 glucose-6-phosphate dehydrogenase activity proteins Proteins 0.000 claims 3
- 210000003936 merozoite Anatomy 0.000 claims 2
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N docosahexaenoic acid Natural products CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 47
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 46
- 102000002148 Diacylglycerol O-acyltransferase Human genes 0.000 description 20
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 17
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 14
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 10
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 10
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 10
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 6
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 6
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 6
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 101100083507 Caenorhabditis elegans acl-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150028469 G6PDH gene Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 101001117112 Leucoagaricus meleagris Pyranose dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150116295 CAT2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100326920 Caenorhabditis elegans ctl-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 101100126846 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) katG gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 235000020667 long-chain omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
- C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01049—Glucose-6-phosphate dehydrogenase (1.1.1.49)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01015—Glycerol-3-phosphate O-acyltransferase (2.3.1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/0102—Diacylglycerol O-acyltransferase (2.3.1.20)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12Y301/01007—Acetylcholinesterase (3.1.1.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
- C12Y401/01001—Pyruvate decarboxylase (4.1.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供高产DHA的重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌是在裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20888中通过敲除lipR蛋白同时过表达甘油‑3‑磷酸酰基转移酶基因(GPAT)、二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)、柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)构建而成的。本发明还提供上述重组裂殖壶菌的构建方法，并验证了该重组裂殖壶菌发酵产DHA的产量，通过发酵合成的总油含量达到16.6g/L，DHA含量达到10.3g/L，在原始菌株ATCC20888的基础上提高了2.1倍，显著高于现有技术水平。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种高产DHA的重组工程菌株，还涉及所述重组菌株的构建方法，及其在生产DHA中的应用。
技术背景
二十二碳六烯酸(decosahexaeonic acid，DHA)是一种重要的ω-3长链多不饱和脂肪酸，传统的DHA生产原料主要来源于鱼油，但难以实现高价值产品在食品和医药行业中的广泛应用。为满足DHA不断增长的市场需求，近年来，科学工作者开展了利用海洋微生物发酵生产DHA的研究。裂殖壶菌因其生长速度快、油含量高、DHA比例高，是当前DHA产业化的主要生产菌。
裂殖壶菌是一种含油量极高的海洋微藻，菌体含油量最高可达到50％以上，且其脂肪酸组成简单，DHA可占总脂肪酸含量的35％以上。裂殖壶菌发酵生产DHA的工艺已相对成熟，如何进一步提高DHA生产效率、降低生产成本是近年来研究的重点。裂殖壶菌发酵生产DHA的工艺过程可分为菌种筛选、发酵控制、高密度发酵、细胞获取、油脂提取和纯化。为了提高裂殖壶菌的发酵水平，目前的研究主要集中在菌种性能的改良、结合DHA合成途径借助分子操作进行代谢调控、发酵过程的优化和油脂的提取纯化等方面。
本发明通过在裂殖壶菌中敲除lipR蛋白的同时过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)达到提高裂殖壶菌中三酰甘油含量的目的，然后再过表达柠檬酸裂解酶(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)以提高乙酰辅酶A和NADPH的含量，从而提高DHA含量，得到一株能高产DHA的裂殖壶菌重组菌株。
发明内容
本发明的目的是提高裂殖壶菌中DHA含量，通过对三酰甘油合成途径中关键基因的过表达提高裂殖壶菌中油脂含量，进一步过表达乙酰辅酶A和NADPH合成途径中关键基因从而提高DHA合成所需要的前体物质，提供一种高产DHA的重组工程菌株，以及该重组菌株的构建方法和应用。
本发明的思路是通过在裂殖壶菌中调控关键基因的表达来调节总油脂和前体物质乙酰辅酶A和NADPH的合成，敲除lipR蛋白的同时过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)达到提高裂殖壶菌中三酰甘油含量的目的，然后再过表达柠檬酸裂解酶(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)以提高乙酰辅酶A和NADPH的含量，从而提高裂殖壶菌中DHA的含量，得到一株能高产DHA的裂殖壶菌重组菌株，其合成路线如图1所示。
基于此，本发明提供高产DHA的重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌是在裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20888中通过敲除lipR蛋白同时过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)、二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)、柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)构建而成的。
在本发明中，所述甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)的序列如SEQ ID No.1所示，二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)的序列如SEQ ID No.2所示，柠檬酸裂解酶基因(ACL2)的序列如SEQ ID No.3所示，6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH2)的序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供上述重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建GPAT基因和DGAT基因过表达质粒
根据测序获得的lipR蛋白基因序列设计引物lipRup-F和lipRup-R以及lipRdown-F和lipRdown-R扩增得到裂殖壶菌(Schizochytriumsp.ATCC20888)的上下游同源臂并连接到pJN44载体上，分别得到重组质粒pJN44-lipRup和pJN44-lipRdown，然后通过酶切将胶回收的lipRup片段和lipRdown片段连接到PBS-Zeo载体上，得到重组质粒PBS-Zeo-lipR，经验证正确后用于后续实验。
获取并合成来源于解脂亚罗酵母的GPAT基因和DGAT基因序列，以及ccg1启动子和终止子片段，将ccg1启动子、GPAT基因片段、DGAT基因片段和ccg1终止子依次连接到载体pJN44的多酶切位点SpeI/SmaI、SmaI/MfeI、MfeI/BstEⅡ和BstEⅡ/BamHI上，构建得到含有GPAT和DGAT表达盒的质粒pJN44-GPAT/DGAT，然后将重组质粒pJN44-GPAT/DGAT中含目的基因的表达盒用SpeI/BamHI酶切并连接至载体PBS-Zeo-lipR上，得到重组质粒PBS-Zeo-GPAT/DGAT-lipR，经验证正确后用于后续实验。
其中，lipR基因序列如SEQ ID No.5所示；
(2)构建含有甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)的重组工程菌株
将上述验证正确的重组质粒PBS-Zeo-GPAT/DGAT-lipR线性化后取10μg转化到100μL裂殖壶菌感受态中，置于0.1cm间隙的电转杯中进行电穿孔(1.5KV，200Q，50uF，两次)。然后加入1mL种子培养基，28℃孵育4h，取300μL菌液均匀涂于含100μg/mL zeocin的博莱霉素种子筛选培养基，28℃避光培养48h待长出单菌落后做菌落PCR验证及测序验证，正确的重组菌命名为裂殖壶菌AT-GD。
裂殖壶菌感受态制备：裂殖壶菌细胞在种子培养基中培养24h，离心(5900g，4℃，5min)收获菌体细胞，用预冷的无菌水和1M山梨醇洗涤3次，随后在1M山梨醇中重悬。
(3)构建含有柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)的重组工程菌株
从NCBI上获取来源于裂殖壶菌、解脂亚罗酵母和希瓦氏菌的柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)序列信息，添加酶切位点送生工合成，将合成片段ACL1，ACL2，ACL3，G6PDH1，G6PDH2，G6PDH3与质粒pPICZαA分别经酶切连接获得重组质粒pPICZαA-ACL1，pPICZαA-ACL2，pPICZαA-ACL3，和pPICZαA-G6PDH1，pPICZαA-G6PDH2，pPICZαA-G6PDH3。经验证正确后用于后续实验。
将上述验证正确的重组质粒酶切线性化处理后，分别转化裂殖壶菌AT-GD感受态细胞(感受态制备方法同上)，28℃孵育4h，取300μL菌液均匀涂于含100μg/mL zeocin的博莱霉素种子筛选培养基，28℃避光培养48h待长出单菌落后做菌落PCR验证及测序验证，正确的重组菌分别命名为AT-GDA1，AT-GDA2，AT-GDA3，AT-GDG1，AT-GDG2，AT-GDG3。
(4)含有柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)的重组工程菌株筛选
分别测定步骤(3)中各重组菌株生物量、总油含量以及DHA含量，筛选出生物量、总油含量及DHA含量较高的菌株，确定菌株对应的基因来源，得到柠檬酸裂解酶基因和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因最佳来源。
(5)高产DHA的裂殖壶菌重组工程菌株构建
将步骤(4)中筛选到的来源于解脂亚罗酵母菌的柠檬酸裂解酶基因(ACL2)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH2)同时整合到裂殖壶菌AT-GD中，得到重组菌株AT-GDAG经发酵后测定其生物量、总油含量和DHA含量。
在本发明中，所述重组菌株是选用裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC-20888为底盘细胞构建而成，可以从购买于上海研生实业有限公司购买获得。
在本发明中，PBS-Zeo载体是根据中国发明专利申请CN 201510417269.4公开的方法的构建得到的，质粒pPICZαA购于淼灵质粒平台。
本发明中的甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)均从解脂亚罗酵母中克隆所得。
本发明中的柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)分别来源于裂殖壶菌、解脂亚罗酵母和希瓦氏菌。
在本发明中，所述重组菌株转化方式为：将线性化后的重组质粒取10μg加入100μl裂殖壶菌感受态细胞，混匀后转移至预冷的0.1cm间隙电转杯中，冰上静置30min后进行电击，电击条件为1.5KV，200Q，50uF，两次，结束后立即加入1ml种子培养基，28℃孵育4h，取300μL菌液均匀涂于含100μg/mL zeocin的平板上(种子培养基添加2％琼脂)，28℃避光培养48h待长出单菌落后做菌落PCR验证及测序验证。
在本发明中，所述重组菌株培养条件为：在种子培养基中200rpm、28℃恒温摇床里培养48h，然后接入发酵培养基中，200rpm、28℃恒温摇床里培养96h。
本发明通过调控关键基因的表达来调节总油脂和前体物质乙酰辅酶A和NADPH的合成，敲除lipR蛋白的同时过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶(DGAT)达到提高裂殖壶菌中三酰甘油含量的目的，然后再过表达最佳来源的柠檬酸裂解酶(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)以提高乙酰辅酶A和NADPH的含量，从而提高裂殖壶菌中DHA的含量，得到一株能高产DHA的裂殖壶菌重组菌株，采用本发明的裂殖壶菌重组菌株AT-GDAD进行发酵合成的总油含量达到16.6g/L，DHA含量达到10.3g/L，在原始菌株ATCC20888的基础上提高了2.1倍。
附图说明
图1为本发明的高产DHA的裂殖壶菌重组菌株的DHA合成路线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度的“％”为重量百分比，“：”为重量比。
本发明涉及以下培养基：
种子培养基含有：葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、KH2PO4 4g/L、NaCl15g/L、MgCl2 3g/L、CaCl2·2H2O 1g/L、KCl 2g/L、MgSO4·7H2O 5g/L、FeCl3 0.1g/L；
发酵培养基含有：葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、KH2PO4 4g/L、NaCl15g/L、MgCl2 3g/L、(NH4)2SO4 6g/L、KCl 2g/L、MgSO4·7H2O 5g/L、FeCl3 0.1g/L。
固体种子培养基：在种子培养基的基础上，添加1.5-2％琼脂，灭菌，在超净台内倒入灭菌的平板中。
博莱霉素种子筛选培养基：1.5％固体种子培养基灭菌后，当培养基降温至50℃，加入终浓度为100μg/ml的博莱霉素(Z-cin)，立即倒平板，4℃冰箱避光保存。
在本发明中，裂殖壶菌ATCC20888来自购买于上海研生实业有限公司。
在本发明中，菌株的生物量检测方法如下：
准确量取搅拌均匀的发酵液200ml，倒入干净无水的离心筒中，在4000r/min的转速下离心10min，取出离心筒，弃去上清液，将离心筒底部的菌体用药勺全部取出，放入已恒重的称量盘中，均匀铺平，并划成有规则的方块；于105℃的干燥箱中烘干，期间不时翻动菌体，3h后取出，恒重称量并记录，生物量即为烘干菌体质量(W)除以发酵液体积(V)再乘1000。
计算公式为：
总油含量测定方法如下：
油脂含量的测定方法：取一定体积的发酵液(100ml)，将其在50℃预热，用NaOH溶液将pH调至10-12之间，按3‰(g/l)的比例添加破壁酶，50℃下搅拌并保温2h；按1:1:1(发酵液：乙醇：正己烷)(v/v)比例分别添加乙醇、正己烷，搅拌、分层、萃取，连续萃取2-3次，取正己烷相，真空旋转蒸干溶剂，获取油脂。将烧瓶放在烘箱中105℃烘至恒重，冷却后称重。
油脂中DHA含量检测方法如下：
采用常规方法将提取的油脂进行甲酯化，然后利用日本岛津高效气相色谱仪检测油脂中DHA含量。气相分析条件：色谱柱：DB-23(60m*0.25mm*0.25μm)；检测器：FID；载气：氮气；分流比：30/1；进样口温度：250℃；检测器温度：280℃；进样量：1μl；升温程序：初始柱温为100℃，先以25℃/min的速度升至196℃，再以2℃/min的速度升至220℃，保持12min。柱流速：3.0ml/min；尾吹流速：30ml/min；氢气流速：40ml/min；空气流速：400ml/min。
实施例1构建含有甘油-3-磷酸酰基转移酶基因(GPAT)和二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT)的重组工程菌株
表1GPAT和DGAT基因序列信息
表2实施例1涉及的引物
1、构建GPAT基因和DGAT基因过表达质粒
根据测序获得的lipR蛋白基因序列(其核酸序列如SEQ ID No.5所示)设计带酶切位点引物lipRup-F和lipRup-R以及lipRdown-F和lipRdown-R，扩增得到裂殖壶菌ATCC20888的上下游同源臂片段，并以NotⅠ/XbaI为酶切位点双酶切载体PBS-Zeo，并将上游片段连接到质粒PBS-Zeo中Zeocin(博莱霉素)抗性基因片段的上游获得重组质粒PBS-Zeo-lipRup，同样以SalⅠ/XhoⅠ双酶切载体PBS-Zeo-lipRup，并将下游片段连接到质粒PBS-Zeo中Zeocin(博莱霉素)抗性基因片段的下游获得重组质粒pJN44-lipR；
从NCBI上获取各序列信息，添加酶切位点合成来源于解脂亚罗酵母的GPAT基因和DGAT基因，以及ccg1启动子和终止子片段，启动子序列如SEQ ID No.6所示，终止子序列如SEQ ID No.7所示，将ccg1启动子、GPAT基因片段、DGAT基因片段和ccg1终止子分别用SpeI/SmaI，SmaI/MfeI，MfeI/BstEⅡ，BstEⅡ/BamHI酶切后依次连接到载体pJN44的多克隆酶切位点上，构建得到含有GPAT和DGAT表达盒的质粒pJN44-GPAT/DGAT，然后将重组质粒pJN44-GPAT/DGAT中含目的基因的表达盒用SpeI/BamHI酶切并连接至载体PBS-Zeo-lipR上，得到重组质粒PBS-Zeo-GPAT/DGAT-lipR。将获得的重组质粒热激转化大肠杆菌感受态细胞中，在含有100μg/ml博来霉素抗性的LB平板上培养筛选单菌落，提取质粒进行测序验证。
2、制备裂殖壶菌感受态细胞
挑取平板上已活化好的裂殖壶菌ATCC20888单菌落至50ml种子培养基中28℃，200r/min培养48h；按4％的接种量再次转接至50ml种子培养基中28℃，200r/min培养48h取20ml菌液，5900g，4℃，离心5min，弃上清收集菌体，用预冷的无菌水和1M山梨醇洗涤3次，随后在1M山梨醇中重悬菌体，分装于1.5ml无菌离心管中。
3、重组菌株AT-GD构建
将上述验证正确的重组质粒PBS-Zeo-GPAT/DGAT-lipR酶切线性化处理后，取10μl加入100μl裂殖壶菌ATCC 20888感受态细胞，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置30min后进行电击，电击条件为1.5KV，200Q，50uF，两次，结束后立即加入1ml种子培养基，28℃孵育4h，取300μL菌液均匀涂于含100μg/mL zeocin的博莱霉素种子筛选培养基平板上，28℃避光培养48h待长出单菌落后做菌落PCR验证及测序验证。
将平板上长出的单菌落接种至种子培养基，28℃，200rpm培养48h后提取基因组DNA进行PCR验证。结果显示抗性筛选标记已重组至裂殖壶菌的基因组，实现了外源基因的同源重组，获得重组菌株AT-GD。
实施例2构建含有柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)的重组工程菌株
表3ACL基因和G6PDH基因序列信息
表4实施例2涉及以下引物
1、构建ACL基因和G6PDH基因过表达质粒
从NCBI上获取来源于裂殖壶菌、解脂亚罗酵母和希瓦氏菌的柠檬酸裂解酶基因(ACL)和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH)序列信息，添加酶切位点送生工合成，将合成片段ACL1，ACL2，ACL3，G6PDH1，G6PDH2，G6PDH3与质粒pPICZαA分别经KpnI/XbaI，酶切后进行连接获得重组质粒pPICZαA-ACL1，pPICZαA-ACL2，pPICZαA-ACL3，和pPICZαA-G6PDH1，pPICZαA-G6PDH2，pPICZαA-G6PD3H。将获得的重组质粒热激转化大肠杆菌感受态细胞中，在含有100μg/ml博来霉素的LB平板上培养筛选单菌落，提取质粒进行测序验证。
2、重组质粒的转化
将上述验证正确的重组质粒酶切线性化处理后，分别转化裂殖壶菌AT-GD感受态细胞(感受态制备方法同实施例1中步骤2)，28℃，200rpm培养4h后，取300μL菌液均匀涂于含100μg/mL博来霉素的固体平板，置于28℃培养箱培养48h。将平板上长出的单菌落接种至种子培养基，28℃，200rpm培养48h后做菌落PCR验证。结果显示目的基因已转化至裂殖壶菌中游离表达，获得重组菌株AT-GDA1，AT-GDA2，AT-GDA3，AT-GDG1，AT-GDG2，AT-GDG3。
3、重组菌株的筛选
将上述重组菌株分别在28℃，200rpm培养48h后分别测定其生物量、总油含量以及DHA含量，筛选出生物量、总油含量及DHA含量较高的菌株，确定菌株对应的基因来源，得到柠檬酸裂解酶基因和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因最佳来源。
检测各菌株的生物量、总有含量和DHA含量，结果如表5显示：重组菌株AT-GDA2和AT-GDG2的生物量、总油含量以及DHA含量均最高，分别达到22.5DWg/L、16.5g/L、9.2g/L和22.8DWg/L、16.7g/L、9.5g/L，因此确定解脂亚罗酵母菌是ACL基因和G6PDH的最佳来源。
表5各重组菌株发酵液中生物量、总油含量及DHA含量
5、高产DHA的裂殖壶菌重组工程菌株AT-GDAG构建
将步骤4中筛选到的来源于解脂亚罗酵母菌的柠檬酸裂解酶基因和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因同时整合到裂殖壶菌AT-GD中，重新设计带酶切位点引物，从质粒pPICZαA-ACL2上扩增ACL2片段，利用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切质粒pPICZαA-G6PDH2，然后将ACL2片段与pPICZαA-G6PDH2载体片段连接，获得含有ACL2和G6PDH2基因的重组质粒pPICZαA-ACL2/G6PDH2，然后将获得的重组质粒热激转化大肠杆菌感受态细胞中，在含有100μg/ml博来霉素抗性的LB平板上培养筛选单菌落，提取质粒进行测序验证。
将上述验证正确的重组质粒pPICZαA-ACL2/G6PDH2酶切线性化处理后，转化到裂殖壶菌AT-GD感受态细胞(感受态制备方法同实施例1中步骤2)，28℃，200rpm培养4h后，取300μL菌液均匀涂于含100μg/mL博来霉素的固体平板，置于28℃培养箱培养48h。将平板上长出的单菌落接种至种子培养基，28℃，200rpm培养48h后提取基因组做PCR验证。结果显示目的基因ACL2和G6PDH2已已转化至裂殖壶菌中游离表达，获得重组菌株AT-GDAG。
实施例3重组裂殖壶菌AT-GDAG在产DHA中的应用
将得到的重组菌株AT-GDAG在发酵培养基中，220rpm、28℃条件下恒温摇床里培养96h，然后取样测定其生物量、总油含量以及DHA含量。
结果如表6显示，比较各菌株的生物量、总油含量以及DHA含量，发现重组菌株AT-GDAG的生物量达到22.2DWg/L，总油含量达到16.6g/L，DHA含量达到10.3g/L，在原始菌株ATCC20888的基础上提高了2.1倍。
表6重组菌株发酵液中生物量、总油含量及DHA含量
Claims (10)
1.一株高产DHA的重组裂殖壶菌，其特征在于所述重组裂殖壶菌是敲除lipR蛋白并过表达甘油-3-磷酸酰基转移酶基因GPAT、二酰甘油酰基转移酶基因DGAT、柠檬酸裂解酶基因ACL和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH的裂殖壶菌。
2.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述重组裂殖壶菌的出发菌株是裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20888。
3.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述甘油-3-磷酸酰基转移酶基因GPAT和二酰甘油酰基转移酶基因DGAT来源于解脂亚罗酵母Yarrowia lipolytica，所述柠檬酸裂解酶基因ACL和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH分别来源于裂殖壶菌、解脂亚罗酵母或希瓦氏菌。
4.根据权利要求1所述的重组裂殖壶菌，其特征在于所述甘油-3-磷酸酰基转移酶基因GPAT、二酰甘油酰基转移酶基因DGAT、柠檬酸裂解酶基因ACL和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH来源于解脂亚罗酵母；所述甘油-3-磷酸酰基转移酶基因GPAT的核酸序列如SEQ IDNo.1所示，二酰甘油酰基转移酶基因DGAT的核酸序列如SEQ ID No.2所示，柠檬酸裂解酶基因ACL2的核酸序列如SEQ ID No.3所示，6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH2的核酸序列如SEQID No.4所示。
5.高产DHA的重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建GPAT基因和DGAT基因过表达质粒
根据lipR蛋白基因序列设计引物lipRup-F和lipRup-R以及lipRdown-F和lipRdown-R扩增得到裂殖壶菌的上下游同源臂并连接到pJN44载体上，分别得到重组质粒pJN44-lipRup和pJN44-lipRdown，然后通过酶切将胶回收的lipRup片段和lipRdown片段连接到PBS-Zeo载体上，得到重组质粒PBS-Zeo-lipR；
获取并合成来源于解脂亚罗酵母的GPAT基因和DGAT基因序列，以及ccg1启动子和终止子片段，将ccg1启动子、GPAT基因片段、DGAT基因片段和次连接到载体pJN44的多酶切位点上，构建得到含有GPAT和DGAT表达盒的重组质粒pJN44-GPAT/DGAT，然后将重组质粒pJN44-GPAT/DGAT中含目的基因的表达盒用SpeI/BamHI酶切并连接至载体PBS-Zeo-lipR上，得到重组质粒PBS-Zeo-GPAT/DGAT-lipR；
(2)构建含有甘油-3-磷酸酰基转移酶基因GPAT和二酰甘油酰基转移酶基因DGAT的重组工程菌株
经验证正确的重组质粒PBS-Zeo-GPAT/DGAT-lipR线性化后转化到裂殖壶菌感受态中，然后在28℃避光培养48h，待长出单菌落后，所得菌落经PCR验证及测序验证，得到验证正确的重组裂殖壶菌AT-GD；
(3)构建含有柠檬酸裂解酶基因ACL和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH的重组工程菌株
分别获取来源于裂殖壶菌、解脂亚罗酵母和希瓦氏菌的柠檬酸裂解酶基因ACL与6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH序列信息，添加酶切位点送生工合成，分别得到合成片段ACL1、ACL2、ACL3、G6PDH1、G6PDH2和G6PDH3，所得片段与质粒pPICZαA分别经酶切连接获得重组质粒pPICZαA-ACL1、pPICZαA-ACL2、pPICZαA-ACL3、pPICZαA-G6PDH1、pPICZαA-G6PDH2和pPICZαA-G6PDH3；所得重组质粒经验证正确；
上述重组质粒酶切线性化处理后，分别转化裂殖壶菌AT-GD感受态细胞，再在28℃避光培养48h，待长出单菌落后进行菌落PCR验证及测序验证，得到验证正确的重组菌AT-GDA1，AT-GDA2，AT-GDA3，AT-GDG1，AT-GDG2，AT-GDG3；
(4)高产DHA的裂殖壶菌重组工程菌株构建
将步骤(3)的柠檬酸裂解酶基因和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因同时整合到步骤(2)得到的裂殖壶菌AT-GD中，得到重组菌株经验证正确后即为高产DHA的重组裂殖壶菌。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于步骤(1)的裂殖壶菌是裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC20888。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：
步骤(3)中，获取来源于解脂亚罗酵母的柠檬酸裂解酶基因ACL与6磷酸葡萄糖脱氢酶基因G6PDH序列信息，添加酶切位点送生工合成，分别得到合成片段ACL2和G6PDH2，所得片段与质粒pPICZαA分别经酶切连接获得重组质粒pPICZαA-ACL2和pPICZαA-G6PDH2；所得重组质粒经验证正确；
上述重组质粒酶切线性化处理后，分别转化裂殖壶菌AT-GD感受态细胞，再在28℃避光培养48h，待长出单菌落后进行菌落PCR验证及测序验证，得到验证正确的重组菌AT-GDA2和AT-GDG2；
步骤(4)中，将AT-GDA2和AT-GDG2的柠檬酸裂解酶基因和6磷酸葡萄糖脱氢酶基因同时整合到步骤(2)得到的裂殖壶菌AT-GD中，得到重组菌株经验证正确后即为高产DHA的重组裂殖壶菌。
8.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于步骤(1)的lipR基因序列如SEQ IDNo.5所示。
9.权利要求1所述的重组裂殖壶菌在生产DHA中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所得重组裂殖壶菌在种子培养基中，200rpm、28℃恒温摇床里避光培养48h，然后接种至发酵培养基中，200rpm、28℃恒温摇床里避光培养96h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310682522.3A CN116555054B (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一株高产dha的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310682522.3A CN116555054B (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一株高产dha的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116555054A true CN116555054A (zh) | 2023-08-08 |
| CN116555054B CN116555054B (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=87503622
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310682522.3A Active CN116555054B (zh) | 2023-06-09 | 2023-06-09 | 一株高产dha的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116555054B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117210508A (zh) * | 2023-11-07 | 2023-12-12 | 青岛农业大学 | 一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013016546A2 (en) * | 2011-07-26 | 2013-01-31 | Dow Agrosciences Llc | Production of dha and other lc-pufas in plants |
| CN103249834A (zh) * | 2010-08-26 | 2013-08-14 | 纳幕尔杜邦公司 | 生产高水平二十碳五烯酸的重组微生物宿主细胞 |
| CN104480152A (zh) * | 2014-11-20 | 2015-04-01 | 武汉华士特工业生物技术开发有限公司 | 一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法 |
| CN110951769A (zh) * | 2011-12-27 | 2020-04-03 | 联邦科学技术研究组织 | 产生脂质的方法 |
| CN113512100A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-10-19 | 中国农业大学 | LipR蛋白及其编码基因在调控DHA和油脂合成中的应用 |
| CN114958627A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-08-30 | 陕西海斯夫生物工程有限公司 | 一株高产生育酚的重组裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用 |
-
2023
- 2023-06-09 CN CN202310682522.3A patent/CN116555054B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103249834A (zh) * | 2010-08-26 | 2013-08-14 | 纳幕尔杜邦公司 | 生产高水平二十碳五烯酸的重组微生物宿主细胞 |
| WO2013016546A2 (en) * | 2011-07-26 | 2013-01-31 | Dow Agrosciences Llc | Production of dha and other lc-pufas in plants |
| CN110951769A (zh) * | 2011-12-27 | 2020-04-03 | 联邦科学技术研究组织 | 产生脂质的方法 |
| CN104480152A (zh) * | 2014-11-20 | 2015-04-01 | 武汉华士特工业生物技术开发有限公司 | 一种提高裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸含量的方法 |
| CN113512100A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-10-19 | 中国农业大学 | LipR蛋白及其编码基因在调控DHA和油脂合成中的应用 |
| CN114958627A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-08-30 | 陕西海斯夫生物工程有限公司 | 一株高产生育酚的重组裂殖壶菌工程菌的构建方法及应用 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| JAN KORBECKI等: "Biosynthesis and Significance of Fatty Acids, Glycerophospholipids, and Triacylglycerol in the Processes of Glioblastoma Tumorigenesis", 《CANCERS》, vol. 15, 6 April 2023 (2023-04-06), pages 1 - 37 * |
| LUJING REN等: "Transcriptomic Analysis of the Regulation of Lipid Fraction Migration and Fatty Acid Biosynthesis in Schizochytrium sp.", 《SCIENTIFIC REPORTS》, vol. 7, 15 June 2017 (2017-06-15), pages 5, XP055788944, DOI: 10.1038/s41598-017-03382-9 * |
| RUCKERT, C.等: "Putative ATP-citrate synthase subunit 2 [Yarrowia lipolytica]", 《GENBANK DATABASE》, 8 September 2020 (2020-09-08), pages 98078 * |
| RUCKERT, C.等: "Yarrowia lipolytica strain DSM 3286 chromosome A", 《GENBANK DATABASE》, 8 September 2020 (2020-09-08), pages 061012 * |
| RUCKERT, C.等: "Yarrowia lipolytica strain DSM 3286 chromosome E", 《GENBANK DATABASE》, 8 September 2020 (2020-09-08), pages 061016 * |
| XIAO HAN等: "Enhancement of docosahexaenoic acid production by overexpression of ATP-citrate lyase and acetyl-CoA carboxylase in Schizochytrium sp.", 《BIOTECHNOL BIOFUELS》, vol. 13, no. 131, 21 July 2020 (2020-07-21), pages 10 * |
| XIAO HAN等: "Zinc Finger Protein LipR Represses Docosahexaenoic Acid and Lipid Biosynthesis in Schizochytrium sp.", 《GENETICS AND MOLECULAR BIOLOGY》, vol. 88, no. 6, 22 March 2022 (2022-03-22) * |
| YUMEI FENG等: "Construction of Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase Overexpression Strain of Schizochytrium sp. H016 to Improve Docosahexaenoic Acid Production", 《MAR. DRUGS》, vol. 21, no. 17, 26 December 2022 (2022-12-26) * |
| 胡学超;任路静;胡耀池;纪晓俊;黄和;: "裂殖壶菌制备二十二碳六烯酸油脂的研究历程及发展前景", 食品与发酵工业, no. 11, 25 November 2018 (2018-11-25), pages 311 - 316 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117210508A (zh) * | 2023-11-07 | 2023-12-12 | 青岛农业大学 | 一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法 |
| CN117210508B (zh) * | 2023-11-07 | 2024-03-15 | 青岛农业大学 | 一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116555054B (zh) | 2024-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112831427B (zh) | 一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母及其应用 | |
| CN116555054B (zh) | 一株高产dha的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用 | |
| CN110117601A (zh) | 灰树花葡聚糖合成酶、其编码基因及应用 | |
| CN105647822B (zh) | 一株过表达来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶的重组高山被孢霉、其构建方法及应用 | |
| CN111471602A (zh) | 一种利用纤维素高效合成γ-亚麻酸的卷枝毛霉工程菌株的构建方法及应用 | |
| CN112080452B (zh) | 一种高产苯乳酸地衣芽孢杆菌基因工程菌、生产苯乳酸的方法和应用 | |
| CN112375723B (zh) | 生产马来酸的工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN112126615B (zh) | 一种产丁酸的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN114958636B (zh) | 一株高产石榴酸的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用 | |
| CN111334459A (zh) | 一种提高1,3-丙二醇产量的克雷伯氏工程菌构建方法及应用 | |
| CN115058374B (zh) | 一种利用丙酮酸合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 | |
| CN109136120B (zh) | 微生物及其用途 | |
| WO2022105841A1 (zh) | 一种脂肪酸延长酶基因和酯化酶基因在酵母合成神经酸和油脂中的应用 | |
| CN115927147A (zh) | 一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用 | |
| CN113832087B (zh) | 一种利用大肠杆菌全生物合成丙二酸的方法 | |
| CN113136382B (zh) | 基于CRISPRi调控的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法 | |
| CN106148432B (zh) | 一种α-酮基丁酸的发酵生产工艺 | |
| CN116814519B (zh) | 一种利用蔗糖生产肌醇的大肠杆菌工程菌株、及其构建方法和应用 | |
| CN114891822B (zh) | 高产γ-亚麻酸卷枝毛霉重组菌的构建方法、该方法构建的重组菌及应用 | |
| CN114874961B (zh) | 一种利用乙醛合成乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 | |
| CN114015634B (zh) | 高产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用 | |
| CN115125180B (zh) | 一种利用双途径产乙偶姻的重组运动发酵单胞菌及其构建方法与应用 | |
| CN115125179B (zh) | 产雷帕霉素的基因工程菌及其应用 | |
| CN114507696B (zh) | 一种高粱素的制备方法 | |
| CN118028199A (zh) | 一种高产西柏三烯一醇的重组大肠杆菌、构建方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |