CN117210508B - 一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法。包括以下步骤：将野生型裂殖壶菌菌株经过同源重组处理；将同源重组处理后的裂殖壶菌菌株进行筛选性平板培养基定向初筛，平板上能够生长出来形态大的菌落视为可能高产的菌株；将初筛的菌株进行指标测定，筛选后获得高产EPA菌株。本发明所述方法是增强裂殖壶菌中不饱和脂肪酸积累更加有效，而且该发明没有增加额外设备、操作简单、成本低、生产周期短，是有效提高EPA积累的有效实施策略。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法。
背景技术
裂殖壶菌（Schizochytrium limacinum）是一种海洋真菌，属于破囊壶菌科（Thraustochytriaceae），是一类海洋异养微生物，显微镜观察呈单细胞、球形，常分布于海洋、盐水湖、河口以及红树林等地区。裂殖壶菌可通过异养繁殖生产，其生长繁殖快，生产不受季节影响，且适宜发酵罐大规模培养。裂殖壶菌能够大量积累对人类有益的物质，如：油脂、色素、非皂化物等，其中油脂占生物量比例达50-70％，多不饱和脂肪酸占总油脂的40-70％。裂殖壶菌合成的多不饱和脂肪酸主要包括二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等。
EPA是一种具有 20 个碳原子和 5 个顺式双键的多不饱和脂肪酸，对高等动物和人体的重要性，在临床和流行病理学等研究中已经得到验证，对于抗炎、抗癌、预防心血管疾病和糖尿病有重要作用。EPA因其重要的生理功能而广泛地应用于食品、医药、饲料行业等各个领域。
人们对 n-3 多不饱和脂肪酸的高度关注，特别是对其中的 DHA 和 EPA 做了大量研究，发现其功能有抗癌、抗炎作用，促进神经系统和视觉系统的发育，防止心血管疾病等重要作用。因此，从裂殖壶菌中提取 n-3 多不饱和脂肪酸也逐渐成为备受关注的一个新研究热点。
裂殖壶菌作为生产DHA和EPA的新生生物资源，如何提高其DHA和 EPA产量成为人们研究的热点。关于裂殖壶菌生产多不饱和脂肪酸的研究主要集中在DHA的生物合成、培养基及培养条件的优化和工业化大规模生产工艺的探索上，对于EPA产量研究相对较少。
发明内容
为解决上述技术问题，故本发明主要利用现代生物科学技术，通过生物工程方法对裂殖壶菌进行遗传改造，为从根本上提高其合成能力，进而提高EPA产量。
本发明提供一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法，利用同源重组的方法对裂殖壶菌中的seipin基因进行敲除，seipin基因序列如SEQ ID NO .7所示，
包括以下步骤：
1）将野生型裂殖壶菌菌株经过同源重组处理；
2）将同源重组处理后的裂殖壶菌菌株进行筛选性平板培养基定向初筛，平板上能够生长出来形态大的菌落视为可能高产的菌株；
3）将初筛的菌株进行指标测定，筛选后获得高产EPA菌株。
其中步骤1)中所述的同源重组处理方法对裂殖壶菌中的seipin基因进行敲除，seipin基因序列如SEQ ID NO .7所示，
包括以下步骤：
（1）以SchizochytriumSGY基因组DNA为模板，
SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、 SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6示的序列为引物，PCR扩增出seipin基因的上游SEIUP（SEQ ID NO 1/ SEQ ID NO 2）和下游SEIDOWN（SEQ ID NO 5/SEQ ID NO 6）基因；
（2）以ZEOCIN质粒为模板，
SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4为引物，PCR扩增出BloR基因；
（3）以上游SEIUP、下游SEIDOWN以及BloR基因为模板，SEQ ID NO 1/ SEQ ID NO 6为引物，PCR扩增三基因连接片段up-zeo-down；
（4）将up-zeo-down基因用电转化的方法将其转入裂殖壶菌SchizochytriumSGY中，获得敲除后的裂殖壶菌基因工程菌株。
进一步的，所述seipin上游序列如SEQ ID NO .8所示和下游序列如SEQ ID NO .9所示，BloR基因如SEQ ID NO .10所示。
进一步的，所述野生型裂殖壶菌为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.ATCC 20888)，购自美国典型培养物保藏中心。
进一步的，所述步骤（4）中电转化方法的电击参数为0.75kV，200Ω，50µF。
进一步的，所述步骤2）中筛选性平板培养基是在基础培养基的基础上加入博莱霉素抗生素。
进一步的，上述筛选性平板培养基的博莱霉素抗生素浓度为80µg/ml。
进一步的，上述基础培养基成分包括：2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母粉、2%海盐。
本发明的有益效果在于：裂殖壶菌的培养简单、生长繁殖快，其表达载体的构建方法简单，相比于通过培养基配方等常规筛选方法，本发明所述方法是增强裂殖壶菌中不饱和脂肪酸积累更加有效，而且该发明没有增加额外设备、操作简单、成本低、生产周期短，是有效提高EPA积累的有效实施策略。
附图说明
图1：基因敲除片段构建简易图；
图 2：野生型（WT）与转化子（ScY）部分甘油三酯中C20:5在脂质组学中分布图；
图 3：野生型（WT）与转化子（ScY）在发酵培养条件下的生物量、油脂产量以及EPA产量；
图4：野生型（WT）气相分析图；
图5：野生型（WT）峰表中7号峰(EPA)质谱分析图；
图6：转化子（ScY）气相分析图；
图7：转化子（ScY）峰表中5号峰(EPA)质谱分析图。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明作进一步的说明，本发明的实例是为了使本领域的技术人员更好的理解本发明，并不对本发明作任何的限制。
实施案例1
裂殖壶菌的培养
裂殖壶菌裂殖壶菌(Schizochytrium sp.ATCC 20888)，购自美国典型培养物保藏中心。
裂殖壶菌（SchizochytriumSGY）菌株由本实验室-80℃保存。活化的SchizochytriumSGY菌株在GPY培养基中作为种子培养。其GPY液体培养基配方是：2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母粉、2%海盐。固体培养基：2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母粉、2%海盐、2%琼脂粉。1×105Pa、115℃灭菌30 min。在无菌超净台中，利用接种环挑取生长状态良好的裂殖壶菌单菌落，接种于装有50mLGPY液体培养基的锥形瓶中，于28℃、180 rpm摇床中培养24-48h。然后通过镜检将生长状态良好的菌株作为种子液传代培养，保证裂殖壶菌的新鲜生长状态。
实施例2
裂殖壶菌的对博莱霉素（Zeocin）敏感实验
（1）菌悬液制备：取2%上述种子液接种于装有50mL灭菌的GPY液体培养基的锥形瓶中，于28℃、180 rpm摇床中培养24-48h。取适量菌液稀释后，调整细胞OD660nm 值为0.3-0.4之间。用无菌去离子水清洗三次，最后一次用500µl重悬，待用。
（2）浓度梯度抗生素培养基：用GPY固体培养基为基础性培养基，所用筛选试剂为Zeocin，浓度梯度（µg/ml）为0，20，30，40，50，60，70，80，90，110。
（3）敏感实验：用上述制备的菌悬液和抗性平板，取50µl菌悬液涂布于不同浓度的抗性平板中，放于28℃培养箱中避光培养24-48h。
经抗性平板培养基定向筛选后，得出该裂殖壶菌对zeocin存在一定抗性，并在0-70µg/ml之间还有会存在一部分的生长，在80µg/ml之后致死率可达95%以上，因此，我们选用80µg/ml浓度作为我们的筛选性培养基。
实施例3
利用同源重组的方法对裂殖壶菌中的seipin基因进行敲除，seipin基因序列如SEQ ID NO .7所示，
ATGGACATGGACTACGACCACATTGACGCCAACGATGGCCTCCTTGGCGGCGGCGCCAGGGCGTACGAAAACGAGCCCGGCGCAGGCGCCCGTTCAGGACCACCAGGACTTCGTTCGAGAATTAGTGGTCAACCGTTTGCGTCCGAAGGCGGCCTGCGAGGAGGGCCTCGCGACGGATTCAGGCCTCGACAAGCGCAGGTGTCCAGACAGTACAAACCATGGATTCCGCTGGGCGTGAGGCAAATCGTGCTCCGCTCAACAGCAGCCTACGGAGTCGCATCAATGCTAATGCTACTTTCTGTCTCCATTGCCATATTCTTGTATGCGTTCGTGTACTACCAGGTCATGCCAGACAAGCTTGCTTTGGAAGCAAAGCTGTATTTTGACTACGATCCCAGCGATGACGGCCAAAGAGGTCTCGACAGCATTGCACGAAGAGAAGGTCAACTCGTACCCGTCTCTATGCCGCTTGCTGAGCTGGATCTGCACCGCGCCTCACGCCAATGGACATCTTCCAAATCTACGCACGACGATGCTCATGAGAACCCCGCGCCCGACGTCATGCTCGCGCCCGGATTCTCGTACGATATTGCACTCCAGCTTGCCCTTCCTGCGGCTGAAGATCGATTACGTAACATTGGCAATTTCATGGTGGCTGCTAAATTGAGCTCTCGTCGAAAATATGAGCTCGCCCGCTCCAAACGACCCGCCCTGGCGCTGGCGCGCCCTAAACCCAAGGCATGGCGCCCGCGCTCCTGGCTTAGCGTCTTTATTCCCTTTTCCTTTTTCCAAACGTGGCATAGCGAGGAGTACGATCCGGCCTTGGAGGAGGCGATCGCAATGGAAGCCGACCAACTCGTCTGGATCGAACTCTTCGAAGGATACCGCGAGCGATATGAGCACGAAGGCCGCGTCCGCTTTGTTAACGTACATTTGTCAAGCCCCCTTGTACAGCTGCACGGTGCCACTTTACACATGCACTGCCGTCTCGAGGGACTTGCATTTTACATGTACCATTATTTTGTCACAGCCTTTGCGGTCTACCTCTTTGTAGTAAGCAGCGTTATTGCATTCGGTCTCTATGGCGTGGCTACCGCTTTTAGTCTCTTTAGCGCATTTTCCGCCTTTGCTGGCGGCGAGGACGATACGATAGACGAGGATGAGTCTATGCCGCCCGAATACGAGATCCACGCCACGCAGCGAGGATTTGGCGACAATGATGAAAACCTTGGGGGAAACTATGGATTCGGTCCGCCGAATCCGTTTGCAGACGCTGCGGATGACCTTGATGAAGATGGCGTCAATCTCGGGGACGATGCACTCGACTTTGGGACCGGCACAAACTTGTTACAGCCTCATAGACAGCACTCCGGGGGCCGTTTGCGGCAGCACTCTCGTAGCCTGCGGCGTTCGCAGACGGGGAGTCGGAGTCGGAGTCGGAGTCGAAGTCGCGGCCGAAGTACTCGCCGTCGCGAACAAAGATCTTCTCCCTATCGGACCATCGGACAAATGCCAGACGAAAGTGAGAGGCAGCTTCCCGAACCGCCCACGCCGCCGCCATCGCCCCTTGACACTCCTGCTATATAG
上游序列如SEQ ID NO .8所示，
ATCATTAAATTTTTGGCCTGGACAAGATGCAACCGGAGCGTACCAACGCCTAGCGTACGGCGCTGATGCGGTGAAAGTAGAGTATCCTCCTCGCGAAACACCGTTATCAAAACATTGAGGTGCCCTGCCGCGTGCCCCTCTAGCCACAAGGGAATCCACAAGTTGTGCACATAGTTTGGCGTGAGCAGCGCTGTGTCAACCGCGGCTCGGCCCATTTCGTCGTCGGAAGAAAATACGTCTCGATCCAATACGTTGAACTCGAGCGTCGAATCCGCCACCGCCTCACCCGTCTTGACACCAAATTCAAATCGCTGCTTCCATTTGGGAAAAAGAGATCGCGAGGCAACGCGACTCGTCCGGGTCTCTTTATTCAGCTTTAGTTGCACATAAGGGTCGCTGAGCCCGTTGGAGTCCTTGGCCAAGAGGTCGCGCCCGCATATTAGCTCCACCACCACTGTGCGCCGCTCACCGAGACGTACCCATTCGTTCTTACGGTCGCGTGGCGTCAGCTCTTCAAGTGCGCGCGAGCTCCGCGCGATGCGAAACACAAGAGTACCAGCTTCCAAGAAGGACTCGCTCTCCCCCTCACCCTTGTCCTCACCCTCGGTTTCAGGTCGGTCTTCCTTGGTCTTGACAAGCTTGTTGAGCGGCCACTTCCCGAAAACGCGGACTTTTTCATGGCAAAGTCGAGATCGCCTCGCGTGCAGCACAACCTCCACAGTCTCGAATTCACCCATCTCACGTCTGTAGAGTTGCTTATCCAGAGAAATCTCGGCGCGACCCAAAAAGTCGTCGAAAAAGGTATCCCTGTCCCATACCTCAACGACTAAAGGCAAAGACGTGTGTTCTGGGACCGGAACAAAAAGCTCTTCGCCATTCCAATCTGGATTGAGCGTCTTCTTGCGCGTCGAGGACTTTTGTTTGGTGATACGTCCGTGTCGAAACACGACGTACGGATCGGAAAATCCATTTCTATCCGAGGCTGGCAGGTCCTTGGCATAGTCGAGGCGAATCTCAAAGCCACTCACCGCTACGTCTGGATGCTCTTGCTCTGCGGGAACTTCATTATCAGCGTCCTCGGCAAAAGAGCCTTTTCTTGCTGCGTTTAGATGATTTGTCTCCTCTTCATCGAGCCTTGACTCGGCATCGGCTGATAATACGGTGTTCTCCGCCTCTTGCTGGTTGCTGTTTCCAGAGGTACTACGATCCTTTTCACAATGTCGTAAGAGCACACGATCCTTCACCTTTCCCAGTGTAGCACGTAGGCCGTGGTGATGCTTAGCATGTCTCGATCTGGTCGCATCGGATCGCCGCGATGGCGACACGGGTGGGGACTGCGAAGATGACGACAACAACGACGACGATGAAGACAACAACGATGACGACGACGAGGCATTTCCGGATCCCGACTCGCCTCTCCTTGCAATGCTCGATCCCTCCTCCACGCGGGTGTCGTCGTCCTGGGTTCTGAGGGTCGCCATGACGACGCCTTAGCAGCTCAGCAGCCGCTCGCTGGCCTCTGGATTCCTCTTGTCGCGCCCGGACTCCGGACGAGCTCGCGCGAAGCACGAGGCGCCCGTCCCGGTCTCGGACGAGGTCCCGATTCCAGCTGCCCGCTCGCTGCCGGCGCCGCGCGAGCCCGCCGTCGGGCGCTCTGGGTCTGAAGACTTGGGTTCGTCTGCTTTTGAAAAAACTTCGCTTGACTTGATCGAGACTCTGAAGCCTCAGAGCCAGAGCCAGAAGCTGGAGCGAGCACCTCGCGTGCGCGTAGCGAGCCCTCTCGCGCACGGCGCGCGCGGGACACGCCGCTCGTCCGAAGGCGGGCGGGTGTACACGCTCTTTGCATAGGAGTCCCTTCCGCTGGACCGCTTGGGACGGCCGAAGAGGGTGAAGCTCGGAT
下游序列如SEQ ID NO .9所示，
CTCATCTTTGCGAGCAGAGCAACTACACATTTGCATCCGCACCTGCAATCCAGCATTTCAAGTTGCGCTGTCCAAGCGGAGCGCTCGACGTACCGCGATCCATGCGGGTTGCTCAACGTTGATGATTCACTTGTATAACGTTAGCCACACCGATTCTTCTCAACCAAGGCGTTTCGCCAGAGAGTTCAGTGAACAATAGTTTGAAAATTTCAGCAAAATCAACCGTTGAGAGACGGGCAGAGTCCTTTTTGCTCAACCAAAAAGAAAGGAGAAAAGAAGGCAAGAAAGTGGCGCTCCAGCCAATGTTAGGCCCTAGGCCTAGATCTTTTCGTGCTCTTGTCTCGCTCACAGGACGGATATAAAGCTTAGTTATTTCTTCTTTGTCTTTGTATTCTTCTTCTGTTTTCTTTTTACCTTTTATCTTCACTTTTGACGCTCCTTTGCTACGAGCATGCTCCCGATTGTCAGCGATGAAGGGCGAGATAAATGAACTGCCTTGGAGTCAAAGGGAATCTGCATCCATAAGAAAAAGCACAGAGCTTCATTGATCGCACATAGTTCCATTCCACCTTGCGGGAAGCCCTTGTACTGGTCGTGAGCGTGAATCTTGCTGATTTTGTATTTCGACCTCGATCAAAACCGCCATACTTGTTGTCTTTGTTCGTACTCCACACACGAATGAGGCCTCGACGGAAGCACACCGGCGACTCAAAACACTTTTCGGGGTGCCGCGCTGGGTGGGCCCGGCGACGCAAGTTTTGGTCTGCTATCCTCGGCTTTTGGCTTCACCTCGCGAGACTTGGCATACGCATACATCGCGCCCGCGATGAGCGAGACAAAAATGAACGTCGTCGACGAGGCGCTCAGCCGCGTTTGAAAAATGATCACGCCCATCACAGCGAGCGGAATTTTGTTCATGGCCCCGACCATGGCGTAGGTGGTCGGCGAGGTCAGCTGGACACAATGAAAGGAGCTGAGACTGAGAAAAAAGCCGATGCAACCGCTCGTCACCATGCACAGGACAAAGCCAAAATCAATCGAGGTCATCATTGTGATCTCCGTCGTCAAGATTTTGCCGAGATCATTGGAGCTGAAGAGATCCATGCCAACGATGAGAGGCAGTGAAAGCAGGTTGTTGTAGTAGACGCGGCCGAAAGCGTTCAGCTTGGAGTCCGACATGGCCCTTGGCATGTACAACACGTATGCTGCCGTAATGCAGCAGTTGGCGCCGGCCCAGAAGTAGCCCCAAGGATCGAACTCCAGGTCCGAGCGACCTGCCATGATGGCGCCAAAGAGCATAATCAAGAGGCTGCCAACGATCGGACGCGACACCTCGCGGCCATAAAAGAAATAGTCACCTGCCGTGACCAGAATGTTGGTCGTGTTCTTGAAAATGGTGGCCATGGGAACCGAGAGAAGTCCGAGGCTGAGAAAGGAGGTCAGGAGCATGCCAACAAAGAGAAAGTCGAGCGGAATCCAGGCAATGATTTGGCTTCGGTTCAGGTTGGCAAAGTCGACGAGACCCATGCAGCGCGCCCCTTGGAGAAGCAAAACGCTGACGGCGTTCTGGTAAAGAAGCAGCGCCATGTGATATGGGAACCCGTAGCTCGTGAGGATGAGCTTGTTGATGAGCGTCATTCCAATGGAGCAGGCGCTATAGAGAAGACAGGCCAGCACGGCTTTGCTAAAGAAAATCGAAAGCGGAGCCGGGAGGCGAGCACTCAGTTTCGCAGAGGCTTTGGCCTCCTCCTCCGAGAGGAATCGGTCTTCTTCGGCCTCACCAAAACCTGCATCCGAGAGGCTCGAAGACCGTCTGCGG
BloR基因序列如SEQ ID NO .10所示，
ATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGA
基因目的片段的制备（如图1所示）
（1）以SchizochytriumSGY基因组DNA为模板，
SEQ ID NO 1: ATCATTAAATTTTTGGCCTGGAC
SEQ ID NO 2: GAAGCTATGGTGTGTGGATCCGAGCTTCACCCTC
SEQ ID NO 5: TCGAAGGCTTTAATTTGCCTCATCTTTGCGAGCAG
SEQ ID NO 6: CCGCAGACGGTCTTCGAGCCTCT所示的序列为引物，PCR扩增出SPNSI基因的上游SEIUP（SEQ ID NO 1/ SEQ ID NO 2）和下游SEIDOWN（SEQ ID NO 5/ SEQ ID NO6）基因；
（2）以ZEOCIN质粒为模板，
SEQ ID NO 3: GAGGGTGAAGCTCGGATCCACACACCATAGCTTC
SEQ ID NO 4: CTGCTCGCAAAGATGAGGCAAATTAAAGCCTTCGA为引物，PCR扩增出BloR基因；
（3）以上游SEIUP、下游SEIDOWN以及BloR基因为模板，SEQ ID NO 1/ SEQ ID NO 6为引物，PCR扩增三基因连接片段up-zeo-down。
（4）将up-zeo-down基因用电转化的方法将其转入裂殖壶菌SchizochytriumSGY中，获得敲除后的裂殖壶菌基因工程菌株。
实施例4
制备裂殖壶菌感受态细胞
（1）挑取培养平板上已活化好的SchizochytriumSGY裂殖壶菌单菌落至60mLGPY种子培养基，28℃，150rpm培养48h；
（2）按1%=(v/v)接种量转接至60mLGPY种子培养基，28℃，180rpm培养24h；
（3）取10mL菌液，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清；
（4）用10mL已预冷的无菌水洗涤菌体两次，离心条件均为：4℃，5000rpm，离心10min；
（5）用10mL1M的无菌预冷山梨醇溶液洗涤菌体两次，离心条件均为：4℃，5000rpm，离心10min；重复洗涤一次；
（6）用1mL1M的无菌预冷山梨醇溶液重悬菌体，每管100μL进行分装，得裂殖壶菌感受态细胞，置于冰上备用。
实施例5
同源重组以及产DHA的裂殖壶菌基因工程菌株的筛选
电转化过程
（1）取20μL所制备的线性片段up-zeo-down，加入至100μL裂殖壶菌感受态细胞中，冰浴5min；转移至预冷的电转杯，冰上静置10min，设置电击参数0.75KV，200Ω，50μF，进行电击，电击后加入1mL种子培养基；在28℃，200rpm复苏3h后，将经转化的菌液涂布在含有博莱霉素80μg/mL的筛选平板培养基中，28℃避光培养3天。
（2）在抗性平板上筛选单菌落，通过摇瓶培养后提取基因组，以基因组DNA为模板PCR目的片段，测序验证正确的重组菌命名为ScY。鉴定在筛选平板培养基中，划线传代4次的转化子，为稳定遗传的重组裂殖壶菌。
实施例6
经裂殖壶菌的培养以及电转化，所得到的转化筛选子ScY，并将ScY与野生型进行比较，结果如图2和3所示，野生型WT，ScY摇瓶发酵培养，所用的发酵培养基配方（g/L）：100g葡萄糖、5g酵母粉、3.94g NaCl、0.264g KCl、0.5g (NH4)2SO4、1g KH2SO4、1.43g MgSO4、0.04g CaCl2、10g谷氨酸钠、0.001g生物素B1、0.001g维生素B12。同源重组法对干重的影响不大且油脂含量均可达到30%以上；最终筛选获得一株高产突变株，其中干重为16.24g/L，EPA产量为1.19 g/L，EPA产量比野生型裂殖壶菌提高了112.63%。
生物量的测定以及脂肪酸成分的气质联用分析
将发酵培养基中发酵液的40ml收集于50 ml离心管中，8000 × g离心5 min，弃上清液，蒸馏水冲洗细胞2-3次。菌体连同离心管一同放入80 ℃烘箱烘干至恒重，离心管重量的增加量即为菌株的生物量。
将发酵培养基中发酵液的40ml收集于50 ml离心管中，8000 × g离心5 min，弃上清液，离心管中加入8 ml的50%（v/v）HCl，在80℃下消解4 h。然后加入16ml的萃取液（甲醇：氯仿=1:1），上下颠倒混匀，使之充分萃取。8000 × g离心5 min，将下层转至新的离心管中，加入等体积的0.1M NaCl溶液，离心弃上层，下层转移到烧瓶，使用旋转蒸发仪在80 ℃下蒸干，即可测定所产油脂的重量。
油脂甲酯化之后然后进行GC-MS分析（图4、图6），仪器型号：Agilent 7890A/5975C色谱柱： Agilent HP-INNOWax Polyethylene Glyco（表1、表2）。初始温度为100 °C ，然后以15 °C/min的速率升温 到 240 °C 至 10 min，每一个峰引入质谱，进行分析，然后将质谱图在数据库中比对，得到与每一个峰中物质最接近的结构（图5、图7）。
表1野生型（WT）气相分析图的峰表
。
表2转化子（ScY）气相分析图的峰表
。
经裂殖壶菌的培养以及电转化，所得到的转化筛选子ScY，并将ScY与野生型进行比较，结果如图2和3所示，野生型WT，ScY摇瓶发酵培养，同源重组法对干重的影响不大且油脂含量均可达到30%以上；最终筛选获得一株高产突变株，其中干重为16.24g/L，EPA产量为1.19 g/L，EPA产量比野生型裂殖壶菌提高了112.63%。
对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的范围的情况下，能利用上述公开的技术内容对本发明的技术方案进行多种可能的变更和改，或改为等效变更的等效实施例。因此，在不脱离本发明技术方案内容的前提下，根据本发明的技术实质对上述实施例所作的等效变更和改动，仍属于本发明技术方案的范围。本发明的实施例不应限于以下所述的示例性实施例，但应受权利要求书及其任何等同形式中阐述的限制的控制。
Claims (6)
1.一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法，包括以下步骤：
1）将野生型裂殖壶菌菌株经过同源重组处理；
2）将同源重组处理后的裂殖壶菌菌株进行筛选性平板培养基定向初筛，平板上能够生长出来形态大的菌落视为可能高产的菌株；
3）将初筛的菌株进行指标测定，筛选后获得高产EPA菌株，
其特征在于：其中步骤1)中所述的同源重组处理方法为利用同源重组的方法对裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC 20888中的seipin基因进行敲除，seipin基因序列如SEQ IDNO .7所示，包括以下步骤：
（1）以Schizochytrium sp.ATCC 20888基因组DNA为模板，
SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6所示的序列为引物，PCR扩增出seipin基因的上游SEIUP，所述上游SEIUP由SEQ ID NO 1/ SEQ ID NO 2所示的序列为引物PCR扩增所得，PCR扩增出seipin基因的下游SEIDOWN，所述下游SEIDOWN由SEQ ID NO 5/SEQ ID NO 6所示的序列为引物，PCR扩增所得；
（2）以ZEOCIN质粒为模板，
SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4为引物，PCR扩增出BloR基因，所述BloR基因如SEQ ID NO.10所示；
（3）以上游SEIUP、下游SEIDOWN以及BloR基因为模板，SEQ ID NO 1/ SEQ ID NO 6为引物，PCR扩增三基因连接片段；
（4）将步骤（3）所得的三基因连接片段用电转化的方法将其转入裂殖壶菌Schizochytrium sp.ATCC 20888中，获得敲除后的裂殖壶菌基因工程菌株。
2.如权利要求1所述的一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法，其特征在于：所述seipin基因上游序列如SEQ ID NO .8所示和下游序列如SEQ ID NO .9所示，所述BloR基因如SEQ ID NO .10所示。
3.如权利要求1所述的一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法，其特征在于：所述步骤（4）中电转化方法的电击参数为0.75kV，200Ω，50µF。
4.如权利要求1所述的一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法，其特征在于：所述步骤2）中筛选性平板培养基是在基础培养基的基础上加入博莱霉素抗生素。
5.如权利要求4所述的一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法，其特征在于：所述筛选性平板培养基的博莱霉素抗生素浓度为80µg/ml。
6.如权利要求4所述的一种制备高产二十碳五烯酸裂殖壶菌的方法，其特征在于：所述基础培养基成分包括：2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母粉、2%海盐。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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