KR101147451B1 - Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ계 미세조류의 배양방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Thraustochytrid계 미세조류의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류를 콩분말이 함유된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 Thraustochytrid계 미세조류의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류를 콩분말을 질소원으로 사용하여 배양하여, 효율적이며, 경제적으로 바이오오일을 제조할 수 있다. 또한, 식용가능한 콩분말을 배지로 사용함으로, 배양산물을 식품 및 사료 등의 제조원료로 활용할 수 있다.

Description

Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ계 미세조류의 배양방법{Method for Culturing Microalgae Thraustochytrid}
본 발명은 Thraustochytrid계 미세조류의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류를 콩분말이 함유된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 Thraustochytrid계 미세조류의 배양방법에 관한 것이다.
최근 각광 받고 있는 바이오디젤을 제조하는데 사용되는 바이오오일의 주요한 공급원은 식물성 유지 혹은 미세조류 오일 등 광합성 오일이다. 바이오오일의 대량 생산 방법으로 최근에는 유기영양 미생물의 발효배양법이 주목을 받고 있다. 폐기물, 부산물 및 잉여 바이오매스 자원으로부터 생산된 미생물 발효오일은 광합성오일과 함께 바이오디젤의 원료로 활용될 것으로 기대된다. Chlorella protothecoides, Yarrowia lipolytica, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis 등이 대표적인 유지성 미생물이며, 이들의 발효 공정 연구가 활발하게 진행 중이다.
이들 유지성 미생물 중, Thraustochytrid 계열 미세조류는 DHA(docosahexaenoic acid)와 같은 고도불포화지방산 (polyunsaturated fatty acid)를 고농도로 함유하는 유지성 미생물이다. DHA는 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 개발에 중요한 기능을 하는 것으로 알려졌다. 또한 치매 환자 뇌에서는 그 양이 현저하게 줄어드는 것으로 보고되었으며, 노안의 황반변성 억제 등 다양한 항노화 기능들이 새롭게 밝혀지고 있다. 이러한 유용한 생리적 기능에도 불구하고, 인체는 자체적으로 충분한 량의 DHA를 합성할 수 없기 때문에 외부로부터 공급되어야 하는 필수 영양소로 인식되어 세계보건기구를 비롯한 각국의 공인 기관들이 DHA를 하루 1 g 이상 꾸준히 섭취할 것을 권장하고 있다. 때문에 DHA는 건강기능성 식품 등 다양한 제품으로 상용화되고 있으며, 의약품 원료로도 활용 가능성 높아 DHA의 상업적 가치는 매우 높다고 할 수 있다. 따라서 DHA를 고농도로 함유하는 Thraustochytrid 미세조류의 오일은 식품, 사료 등 고부가가치 산업원료로 주목을 받고 있으며, Thraustochytrid 미세조류에서 고효율로 DHA를 생산할 수 있는 방법들이 요구되고 있다.
한편, 콩은 식물성 단백질 및 지방의 공급원으로 오래 전부터 된장, 두부, 간장 등의 식품 원료로 활용되어 왔다. 최근에는 암 예방을 비롯한 다양한 생리적 효능을 지닌 이소플라본이 풍부하게 함유되어 있는 것이 밝혀져 건강기능성 식품으로 각광을 받고 있으며, 대량재배를 통한 대량생산이 가능하여, 함유하규 영양성분에 비해 제조 단가가 낮은 작물이기도 하다.
이에, 본 발명에서는 Thraustochytrid 계열 미세조류의 고효율 배양방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 콩 분말을 영양원으로 활용하여, Thraustochytrid 계열 미세조류를 배양할 경우, DHA를 고농도로 함유한 Thraustochytrid 계열 미세조류를 배양할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 Thraustochytrid 계열 미세조류를 고효율로 배양하여 경제적으로 바이오오일을 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류를 콩분말이 함유된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 Thraustochytrid계 미세조류의 배양방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류를 콩분말이 함유된 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균체 또는 배지에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 바이오오일의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류를 콩분말을 질소원으로 사용하여 배양하여, 효율적이며, 경제적으로 바이오오일을 제조할 수 있다. 또한, 식용가능한 콩분말을 배지로 사용함으로, 배양산물을 식품 및 사료 등의 제조원료로 활용할 수 있다.
도 1은 신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101의 현미경 관찰 사진을 나타낸 것이다.
일 관점에서, 본 발명은 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류를 콩분말이 함유된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 Thraustochytrid계 미세조류의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 Thraustochytrid계 미세조류는 KRS101(KCTC11686BP)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 콩분말을 단일 질소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 (a) 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류를 콩분말이 함유된 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균체 또는 배지에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 바이오오일의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, Thraustochytrid계 미세조류는 KRS101(KCTC11686BP)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 콩분말을 단일 질소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 바이오오일은 DHA(docosahexaenoic acid)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 사용된 미세조류 KRS101은 말레이시아 맹그로브지역의 나뭇잎, 토양 시료에서 채취한 것으로, Thraustochytrid 미세조류 분리용 B1 배지 (1 g/L yeast extract, 1 g/L peptone, 10 g/L agar를 300 mg/L Penicillin G와 500 mg/L streptomycin sulfate를 첨가한 천연해수 1 L에 녹임) 에서 배양하여, 순수분리한 후, Thrasustochytrid 미세조류의 전형적인 특징인 유주자 (zoospore)낭을 형성하는 균주를 분리하여 수득하였다.
상기 KRS101는 균체 성장은 질소원(예를 들면, yeast extract)의 농도가 높을수록 우수하지만, 균체내에 축적되는 바이오오일의 함량은 반대로 질소원(예를 들면, yeast extract)의 농도가 낮을수록 우수하며, 최대 건조균체량의 70%까지 오일의 함량이 증가하였다.
본 발명의 일 양태에서, 미세조류 KRS101 균주는 질소원으로 콩분말을 함유한 배지에서 높은 균체성장율을 나타내었으며, DHA를 포함하는 바이오오일의 생산율 또한 높았다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 신규 DHA 함유 유지성 미세조류의 분리, 동정
말레이시아 맹그로브지역의 나뭇잎, 토양 시료를 50ml falcon tube를 이용하여 채취하고, 생리식염수 10ml을 가하여 현탁한 후 적당히 희석하여 Thraustochytrid 미세조류 분리용 B1 배지 (1 g/L yeast extract, 1 g/L peptone, 10 g/L agar를 300 mg/L Penicillin G와 500 mg/L streptomycin sulfate를 첨가한 천연해수 1 L에 녹임) (Burja et al. 2006)에 도말하였다. 28℃에서 200rpm으로 2-4일간 배양하여 얻어진 콜로니들을 B1 배지에 재접종하여 순수분리한 후 현미경으로 관찰하여 Thrasustochytrid 미세조류의 전형적인 특징인 유주자 (zoospore)낭을 형성하는 30개의 콜로니를 분리하였다 (도 1).
분리한 30개의 콜로니들을 50 mL marine broth (Sigma-Aldrich) (250-mL 플라스크)를 이용하여 28℃에서 120rpm으로 3일간 배양한 후, 균체를 회수하여 60℃에서 12시간 동안 감압원심분리기로 건조하였다. 건조된 균체를 5% 메탄올-황산 (methanolic sulfuric acid) 용액 3 mL에 재현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 생성된 지방산에스테르를 0.6 mL의 핵산으로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 균체에는 고농도의 고도불화지방산이 함유되어 있는 것으로 나타났으며, 특히 DHA의 함량은 전체 지방산의 49.5%에 달하는 것으로 나타났다. 조사한 30개의 콜로니가 유사한 지방산 조성을 보이는 것으로 확인되었다.
신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101의 지방산 조성
Fatty acids 14:0 15:0 16:1 16:0 17:0 18:3 18:2 18:1 20:5 22:5
(n6)		 22:6 22:5
(n3)
Marine - 17.39 - 8.89 3.1 - 0.93 - 2.18 8.12 49.59 0.86
Basal 2.73 14.09 0.43 24.60 2.72 0.26 - 0.91 0.48 10.00 39.49 0.35
분리한 콜로니의 분자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA 유전자 서열을 분석하였다. 하나의 콜로니로부터 전형적인 Phenol-chloroform법으로 염색체 DNA를 분리한 후, 이로부터 Thraustochytrid 미세조류 18S rRNA 유전자 증폭용 프라이머 5'-ATGAACATCAAAAA-3'(P1, 서열번호 2)와 5'-ATGAACATCAAAAA-3'(P2, 서열번호 3) 을 이용하여 PCR법으로 18S rRNA 유전자 DNA를 증폭하였다. PCR 증폭은 EF Taq polymerase(Takara)(2.5 U), polymerase buffer, dNTP 혼합물(각 1 mM), 각 프라이머(100 pmol) 1μl, 주형 DNA 500ng을 함유하는 PCR 반응용액(50μl)을 준비한 후, 유전자 증폭기(Takara, Japan)로 96℃ 30초, 43℃ 1분, 72℃ 3분 조건으로 30회간 수행하였다. PCR 반응액을 1% 아가로즈겔에서 전기 영동하여 예상되는 크기의 DNA 단편이 증폭된 것을 확인하고 pGEM-TEasy 벡터(Promega, USA)를 이용하여 대장균 DH5α으로 형질도입하였다. 형질 전환된 재조합 대장균들로부터 플라스미드 DNA를 추출(Qiagen, USA)하고, 제한효소 EcoRI을 처리하여 원하는 크기의 DNA 단편이 클로닝된 것을 확인하였으며, 염기서열을 결정하였다 (서열번호 1). 염기서열 상동성 분석 결과, Aurantiochytrium sp. BL11 및 Schizochytrium sp. BURABQ 133의 18S rRNA 유전자와 99%의 상동성을 보이는 새로운 Thraustochytrid계열 미세조류로 확인되어 KRS101로 명명하고, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2010년 4월 22일자로 기탁번호 KCTC11686BP로 기탁하였다.
실시예 2: 콩 분말을 첨가한 배지에서 신규 DHA 고함유 Thraustochytrid 미세조류의 배양
다양한 농도의 콩 분말가루 (5g/L, 10g/L 및 20 g/L)를 첨가한 기본배지 (포도당 60 g/L, Corn steep solid 5 g/L, Ammonium acetate 5 g/L, KH2PO4 3 g/L, 인공해수염 15 g/L)를 사용하여 신규 DHA 고함유 Thraustochytrid 미세조류 KRS101을 배양하였다. 단일콜로니를 기본배지 15 mL을 이용하여 28℃에서 120 rpm으로 3일간 전배양한 후 배양액 1 mL을 상기의 배지에 각각 접종하여 28℃에서 120 rpm으로 3일간 배양하였다.
상기 배양액을 원심분리법으로 회수하여 PBS 버퍼 (phosphate buffered saline, pH 7.2)로 3회 세척한 후 60℃에서 12시간 건조하여 건조중량을 측정하였다. 하기의 수정된 Bligh-Dyer법 (Burja et al., 2007)에 의해 오일 중량을 분석하였다.
먼저, 건조 중량 125 mg에 클로로포름 6.25 mL, 메탄올 12.5 mL, 50 mM K2HPO4 버퍼 (pH 7.4) 5 mL을 가하여 28℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 반응한 후 클로로포름 6.25 mL, K2HPO4 버퍼 6.25 mL을 첨가하여 30회 정도 섞어준 후 30분 동안 방치하여 수층과 오일이 함유된 유기용매층으로 분리되도록 하였다. 미리 무게를 측정해둔 알루미늄 접시로 클로로포름 층을 조심스럽게 옮긴 후 80℃에서 30분 동안 건조한 후 오일의 무게를 측정하였다. 전체 오일 함량은 아래와 같이 산출하였다.
총 오일함량 (%, 오일 g /건조균체량 100 g) = (WL-WD)xVCx100/VPxWS
WL: 알루미늄 접시의 무게
WD: 알루미늄 접시 + 지질의 무게
VC: Chloroform의 총 부피
VP: 알루미늄 접시에 옮긴 Chloroform의 부피
WS: 사용한 균체의 무게 (건조중량)
한편, 오일중에 함유된 DHA의 함량은 기체크로마토그래피법으로 측정하였다. 적당량의 건조된 균체를 5% 메탄올-황산 용액 3 mL에 현탁하여 90℃에서 1시간동안 반응하여 지방산에스테르를 생성한 다음 핵산 0.6 mL로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다.
콩 분말가루를 첨가한 기본 배지에서 미세조류를 배양한 결과는 표 2에 보인 바와 같으며, 미세조류를 접종하지 않은 대조구의 경우는 표 3에 보인 바와 같다.
콩 분말을 첨가한 배지에서 신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101배양산물의 분석 결과
콩 분말 (g/L) 건조중량 (g/L) 오일 함량 (%) 지방산 조성
14:0 15:0 16:0 18:0 18:1 18:2 20:5 22:6
(n6)		 22:6
(n3)		 22:5
(n3)
0 29.49 22.66 3.75 0.90 44.12 0.76 nd 0.33 1.10 6.17 32.38 1.54
5 31.21 24.94 3.74 0.90 42.12 1.36 4.97 6.25 1.01 5.76 29.83 1.48
10 35.28 25.32 3.58 0.83 41.37 2.04 7.77 9.43 1.18 4.73 26.61 nd
20 41.24 27.22 2.89 0.63 37.72 2.86 11.33 13.47 1.06 3.83 19.44 nd
20:5, EPA; 22:6(n6), DPA; 22:6(n3), DHA; 22:5(n3), DPA. nd, not detected
미세조류 미접종 콩 분말 기본 배지의 성분 분석 결과
콩 분말 (g/L) 건조중량 (g/L) 오일 함량 (%) 지방산 조성
14:0 15:0 16:0 18:0 18:1 18:2 20:5 22:6
(n6)		 22:6
(n3)		 22:5
(n3)
5 2.82 25.10 nd nd 11.20 4.04 29.85 54.25 nd nd nd nd
10 5.35 24.76 nd nd 11.50 3.76 28.66 55.28 nd nd nd nd
20 12.70 24.16 nd nd 12:08 3.60 25.21 27.60 nd nd nd nd
20:5, EPA; 22:6(n6), DPA; 22:6(n3), DHA; 22:5(n3), DPA. nd, not detected
실시예 3: 탄소원으로 콩 분말을 이용한 배지에서 신규 DHA 고함유 Thraustochytrid 미세조류의 배양
실시예 2의 결과를 토대로 기본배지의 탄소원 혹은 질소원을 콩 분말로 대체한 배지에서 KRS101 미세조류를 배양하였다.
먼저 탄소원인 포도당을 배제한 기본배지에 콩 분말을 각각 5g/L, 10g/L 및 20 g/L을 첨가한 배지에서 신규 DHA 고함유 Thraustochytrid 미세조류 KRS101을 상기와 동일한 방법으로 배양한 후, 건조중량, 오일 함량 및 지방산 조성을 분석하였다.
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, KRS101의 균체 성장이 크게 감소하는 것으로 나타나 탄소원으로서 콩 분말은 적합하지 않은 것으로 확인되었다.
탄소원으로 포도당 대신에 콩 분말을 첨가한 배지에서 신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101 배양 산물의 분석 결과
콩 분말 (g/L) 건조중량 (g/L) 오일 함량 (%) 지방산 조성
14:0 15:0 16:0 18:0 18:1 18:2 20:5 22:6
(n6)		 22:6
(n3)		 22:5
(n3)
0 6.20 3.96 0.94 1.21 18.32 8:36 4.64 1.47 2.54 11.44 47.34 2.41
5 8.24 3.94 3.74 0.56 16.72 23.75 20.59 4.53 1.13 5.80 21.46 1.16
10 10.34 12.59 nd 0.36 15.56 22.66 21.19 7.91 1.36 5.27 18.58 1.24
20 16.54 6.81 nd nd 16.36 23.61 22.04 6.17 1.74 4.84 18.70 4.28
20:5, EPA; 22:6(n6), DPA; 22:6(n3), DHA; 22:5(n3), DPA. nd, not detected
실시예 4: 질소원으로 콩 분말을 이용한 배지에서 신규 DHA 고함유 Thraustochytrid 미세조류의 배양
유기 질소원인 Corn steep solid를 배제한 기본배지에 콩 분말을 5, 10, 20 g/L을 첨가한 배지에서 신규 DHA 고함유 Thraustochytrid 미세조류 KRS101을 상기와 동일한 방법으로 배양한 후, 건조중량, 오일 함량 및 지방산 조성을 분석하였다.
그 결과, 표 5에 나타난 바와 같이 KRS101는 매우 우수한 균체 성장을 보였으며, 예상대로 콩 분말이 효과적인 질소원으로 활용될 수 있는 것으로 확인되었다.
표 5는 전체 지방산중에 차지하는 DHA의 함량을 퍼센트로 나타낸 값으로, 즉, 콩분말의 함량이 증가할수록 콩에 포함된 다른 지방산의 농도가 증가하여 DHA의 비율은 차츰 감소하는 것으로 나타났다.
질소원으로 콩 분말을 첨가한 배지에서 신규 Thraustochytrid 계열 미세조류 KRS101 배양 산물의 분석 결과
콩 분말 (g/L) 건조중량 (g/L) 오일 함량 (%) 지방산 조성
14:0 15:0 16:0 18:0 18:1 18:2 20:5 22:6
(n6)		 22:6
(n3)		 22:5
(n3)
0 2.57 6.71 1.30 4.04 31.51 nd nd 1.40 3.24 10.92 44.86 1.39
5 29.80 27.21 2.01 0.46 35.35 7.76 6.83 1.76 1.42 6.35 30.68 1.16
10 32.02 32.26 3.09 0.64 42.07 9.95 8.16 2.66 0.94 4.92 24.03 nd
20 42.99 35.20 2.48 nd 34.02 9.55 7.80 2.88 0.72 2.94 15.79 nd
20:5, EPA; 22:6(n6), DPA; 22:6(n3), DHA; 22:5(n3), DPA. nd, not detected
한국생명공학연구원 KCTC11686BP 20100422
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Claims (9)

  1. 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류 KRS101(KCTC11686BP)를 질소원으로 콩분말이 함유된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 Thraustochytrid계 미세조류의 배양방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 콩분말을 단일 질소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 Thraustochytrid계 미세조류의 배양방법.
  4. 다음 단계를 포함하는 바이오오일의 제조방법:
    (a) 바이오오일 생성능을 가지는 Thraustochytrid계 미세조류 KRS101(KCTC11686BP)를 질소원으로를 콩분말이 함유된 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 균체 또는 배지에서 바이오오일을 회수하는 단계.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서, 콩분말을 단일 질소원으로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법.
  7. 제4항에 있어서, 바이오오일은 DHA(docosahexaenoic acid)인 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 Thraustochytrid계 미세조류 KRS101(KCTC11686BP)는 서열번호 1의 18S DNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 Thraustochytrid계 미세조류의 배양방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 Thraustochytrid계 미세조류 KRS101(KCTC11686BP)는 서열번호 1의 18S DNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 바이오오일의 제조방법.
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