KR101654219B1 - 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents

고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 균주, 상기 균주를 배양하여 바이오오일을 생산하고, 회수하는 단계를 포함하는 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 바이오오일의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 바이오오일, 상기 균주를 배양하여 지방산을 생산하고, 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 바이오디젤, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제 및 바이오디젤 생산용 미생물 제제를 제공한다.

Description

고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 균주 및 이의 용도{Thraustochytriidae sp. strain containing high content of polyunsaturated fatty acid and uses thereof}
본 발명은 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 균주, 상기 균주를 배양하여 바이오오일을 생산하고, 회수하는 단계를 포함하는 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 바이오오일의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 바이오오일, 상기 균주를 배양하여 지방산을 생산하고, 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 바이오디젤, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제 및 바이오디젤 생산용 미생물 제제에 관한 것이다.
해양 생태 먹이사슬의 최하위 계급을 차지하는 유기종속영양 원생생물인 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 DHA (docosahexaenoic acid)를 비롯한 다양한 다중불포화지방산(polyunsaturated fatty acid)을 고농도로 함유하는 트리아실글리세롤(Triacylglycerol)의 공급원으로 중요한 역할을 수행한다. 특히 다중불포화지방산 DHA는 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 개발에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 치매 환자 뇌에서는 그 양이 현저하게 줄어드는 것으로 보고되었으며, 노안의 황반변성 억제 등 다양한 항노화 기능들이 새롭게 밝혀지고 있다. 사람을 비롯한 대부분의 고등 동물은 정상적인 생체기능에 필요한 다중불포화지방산을 자체적으로 원활하게 합성하지 못하기 때문에 다중불포화지방산을 필수 영양소로 반드시 섭취하여야 하며, 세계보건기구는 하루 1g 이상의 DHA 함유 다중불포화지방산을 꾸준히 섭취할 것을 권장하고 있다.
전통적으로 DHA 다중불포화지방산의 공급원은 참치, 연어와 같은 해양 생태환경의 상위를 차지하는 심해성 어류들이다. 하지만, 해양환경의 오염이 심해지면서 심해성 어류의 체내에 수은을 비롯한 중금속, 환경호르몬, 방사성물질 등 오염물질 축적으로 인해 심해어류 섭취에 대한 위험이 커지고 있다. 따라서 DHA 다중불포화지방산 오일을 안전하고, 안정적으로 공급할 수 있는 새로운 수단으로 트라우스토키트리드 원생생물이 주목을 받고 있다. 고기능 DHA 다중불포화지방산의 높은 함량 뿐만 아니라 높은 지질 함량으로 인해 바이오디젤 생산을 위한 바이오오일 공급원료(feedstock)의 공급원으로서도 고유지성 트라우스토키트리드 원생생물은 산업적으로 중요한 가치를 지닌다.
바이오디젤의 제조를 위한 바이오오일 원료의 주요한 공급원은 식물성 유지 혹은 미세조류 오일 등 광합성 오일이다. 유지성 식물 및 미세조류의 광합성 오일은 풍부한 태양광을 이용하고 이산화탄소를 재활용을 하는 매우 중요한 장점이 있지만, 시간, 공간, 계절, 기후 등 다양한 환경 요인에 의해 영향을 받는 단점이 있다. 일각에서는 광합성 오일을 원료로 하는 바이오디젤의 보급 확대가 식량 부족 및 원료작물의 대량 재배에 따른 새로운 환경문제를 야기할 수 있기 때문에 그 실효성 자체에 대한 의구심이 제기되고 있는 상황이다.
최근 바이오오일의 대량 생산 방법으로 유기영양 미생물의 발효배양법이 주목을 받고 있다. 폐기물, 부산물 및 잉여 바이오매스 자원으로부터 생산된 미생물 발효오일은 광합성오일과 함께 바이오디젤의 원료로 활용될 것으로 기대된다. 클로렐라 프로토테코이데스(Chlorella protothecoides), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) 등이 대표적인 유지성 미생물이며, 이들의 발효 공정 연구가 활발하게 진행 중이다.
한편, 한국등록특허 제1480051호에서는 '트라우스토키트리드 미세조류의 리보좀 단백질 코딩하는 유전자 변이체를 이용한 형질전환체 선별마커'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1147450호에서는 '신규 유지성 미세조류 ＫＲＳ１０１ 균주 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 우리나라 연안으로부터 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주를 분리하였는데, 상기 균주는 다중불포화지방산(PUFA)을 전체 지방산의 80% 이상 함유하며, 다중불포화지방산 중에서 EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6)는 전체 지방산의 8~15% 및 40~50%를 각각 차지하는 것을 확인하였다. 이는 총 지방산의 35~60%의 다중불포화지방산, 1~2% EPA를 포함하는 기존에 알려진 트라우스토키트리대 속 균주와는 큰 차이가 있는 것으로, 본 발명을 통해 고기능의 다중불포화지방산을 많이 함유하는 고품질 균주를 제공할 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 균주를 배양하여 바이오오일을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 바이오오일의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 바이오오일을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 균주를 배양하여 지방산을 생산하는 단계; 및 (b) 상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 바이오디젤을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 바이오디젤 생산용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 트라우스토키트리드(Thraustochytrid)계의 미세조류에 속하는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주는 DHA 및 EPA를 비롯한 다양한 다중불포화지방산을 총 지방산의 약 80.5%인 고농도로 함유하므로, 본 발명의 효과적인 균주 배양을 통해 생산된 트라우스토키트리대 속 d1c 균주의 바이오오일은 DHA 및 EPA를 활용한 고부가가치 산업과 바이오디젤 산업을 연계함으로써, 일반적인 미생물 오일 혹은 광합성 오일과 달리 바이오디젤의 시장 경쟁력을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에서 분리한 트라우스토키트리대 속 d1c 균주의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 트라우스토키트리대 속 d1c 균주의 분류학적 계통도를 나타낸 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 균주를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 다중불포화지방산은 전체 지방산의 75% 이상을 차지할 수 있으며, 바람직하게는 80% 이상을 차지할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 80~85%를 차지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 다중불포화지방산 중에서 EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6)은 전체 지방산의 각각 8~15% 및 40~50%를 차지하는 것일 수 있고, 바람직하게는 각각 9~10% 및 40~45%를 차지하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 우리나라 연안으로부터 균주를 분리하였고, 그 중 다중불포화지방산 함량이 높은 균주를 분리하였으며, 이를 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) 균주로 동정한 것이다. 상기 트라우스토키트리대 속 균주는 트라우스토키트리대 속 d1c 균주(기탁번호 KCTC12769BP)일 수 있으며, 한국생명공학연구원에 2015년 03월 10일자로 기탁하였다.
또한, 본 발명은
(a) 상기 균주를 배양하여 바이오오일을 생산하는 단계; 및
(b) 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 바이오오일의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (a) 단계는 유기질소원으로 효모 추출물, 무기질소원으로 소듐 나이트레이트(sodium nitrate)를 첨가하여 배양할 수 있고, 바람직하게는 상기 효모 추출물의 농도는 8~12 g/ℓ, 소듐 나이트레이트 농도는 2~3 g/ℓ인 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 상기 효모 추출물의 농도는 10 g/ℓ, 소듐 나이트레이트 농도는 2.6 g/ℓ인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 탄소원으로 프럭토스(fructose), 갈락토스(galactose), 자일로스(xylose), 락토즈(lactose), 말토즈(maltose), 수크로스(sucrose) 또는 글루코스(glucose)를 첨가하여 배양할 수 있고, 바람직하게는 프럭토스, 갈락토스, 자일로스 또는 글루코스를 첨가하여 배양할 수 있고, 가장 바람직하게는 글루코스를 첨가하여 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 (a) 단계의 균주 배양에서 유기질소원, 무기질소원 및 탄소원 첨가 조건 이외의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 의해 제한되지는 않는다.
또한, 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 고 함량의 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하는 바이오오일을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 바이오오일에서, 상기 다중불포화지방산은 전체 지방산의 75% 이상을 차지할 수 있으며, 바람직하게는 80% 이상을 차지할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 80~85%를 차지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 바이오오일에서, 상기 다중불포화지방산 중에서 EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6)은 전체 지방산의 각각 8~15% 및 40~50%를 차지하는 것일 수 있고, 바람직하게는 각각 9~10% 및 40~45%를 차지하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제를 제공한다.
상기 미생물 제제는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 상기 균주를 이용하여 지방산을 생산할 수 있는 것이다. 상기 생산된 지방산은 다중불포화지방산 함량이 전체 지방산의 75% 이상을 차지하므로 상기 미생물 제제는 고품질 지방산을 생산하는데 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 지방산 생산용 미생물 제제는 용액, 분말 또는 현탁액으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은
(a) 상기 균주를 배양하여 지방산을 생산하는 단계; 및
(b) 상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (a) 단계의 균주 배양에서 첨가한 유기질소원, 무기질소원 및 탄소원은 상기한 바와 같다.
본 발명에서 상기 (a) 단계의 균주 배양에서 유기질소원, 무기질소원 및 탄소원 첨가 조건 이외의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 의해 제한되지는 않는다.
또한, 상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 바이오디젤을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 바이오디젤 생산용 미생물 제제를 제공한다.
상기 미생물 제제는 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오디젤 생산에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 바이오디젤 생산용 미생물 제제는 용액, 분말 또는 현탁액으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명의 트라우스토키트리대 속( Thraustochytriidae sp .) d1c 균주의 분리
서해 연안지역의 해수 시료를 50㎖ 팔콘 튜브를 이용하여 채취하고, 생리식염수 10㎖을 가하여 현탁한 후 적당히 희석하여 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 미세조류 분리용 B1 배지 (1 g/ℓ 효모 추출물, 1 g/ℓ 펩톤, 10 g/ℓ 아가를 300 ㎎/ℓ 페니실린 G와 500 ㎎/ℓ 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate)를 첨가한 천연해수 1 ℓ에 녹임)에 도말하였다. 28℃에서 200rpm으로 2-4일간 배양하여 얻어진 콜로니들을 B1 배지에 재접종하여 순수분리한 후 현미경으로 관찰하여 트라우스토키트리드 균주의 전형적인 특징인 유주자(zoospore) 낭을 형성하는 콜로니를 분리하였다.
분리한 콜로니들을 50㎖ 기본배지 (탄소원 포도당 20 g/ℓ, 질소원 효모 추출물 10 g/ℓ, 인공해수염 5 g/ℓ, KH2PO4 9 g/ℓ) (250㎖ 플라스크)를 이용하여 28℃에서 120rpm으로 3일간 배양한 후, 균체를 회수하여 동결건조기에서 12시간 동안 건조하였다. 건조된 균체를 5% 메탄올-황산 (methanolic sulfuric acid) 용액 6㎖에 재현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 생성된 지방산에스테르를 0.2㎖의 헥산으로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 균주는 표 1에 나타낸 바와 같이 균체에 축적된 지질은 다중불포화지방산의 함량이 매우 높은 것으로 관찰되었으며, DHA를 비롯한 다중불포화지방산(20:4, 20:5, 22:5, 22:6)의 함량은 전체 지방산의 80% 이상인 것으로 확인되었다.
본 발명의 트라우스토키트리대 속 d1c 균주의 유지의 지방산 조성
지방산 함량 (%)
15:0 8.79
16:0 2.66
17:0 5.16
18:0 0.88
20:1 0.39
20:2 0.68
20:4 3.56
20:5 (ω3)
: EPA(eicosapentaenoic acid)		 9.38
22:5 (ω6) 21.56
22:6 (ω3)
: DHA(Docohexaenoic acid)		 42.27
22:5 (ω3) 3.76
분리한 콜로니의 분자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA 유전자 서열을 분석하였다. 하나의 콜로니로부터 전형적인 페놀-클로로포름 방법으로 염색체 DNA를 분리한 후, 이로부터 트라우스토키트리드 미세조류 18S rRNA 유전자 증폭용 프라이머 5'-ATGAACATCAAAAA-3'(P1, 서열번호 2)와 5'-ATGAACATCAAAAA-3'(P2, 서열번호 3) 을 이용하여 PCR법으로 18S rRNA 유전자 DNA를 증폭하였다. PCR 증폭은 EF Taq 폴리머라제(Takara)(2.5 U), 폴리머라제 버퍼, dNTP 혼합물(각 1 mM), 각 프라이머(100 pmol) 1㎕, 주형 DNA 500ng을 함유하는 PCR 반응용액(50㎕)을 준비한 후, 유전자 증폭기(Takara, Japan)로 96℃ 30초, 43℃ 1분, 72℃ 3분 조건으로 30회간 수행하였다. PCR 반응액을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 예상되는 크기의 DNA 단편이 증폭된 것을 확인하고 pGEM-TEasy 벡터(Promega, USA)를 이용하여 대장균 DH5α로 형질도입하였다. 형질 전환된 재조합 대장균들로부터 플라스미드 DNA를 추출(Qiagen, USA)하고, 제한효소 EcoRI을 처리하여 원하는 크기의 DNA 단편이 클로닝된 것을 확인하였으며, 염기서열을 결정하였다(서열번호 1). 염기서열 상동성 분석 결과, 트라우스토키트리대 속 NIOS-4과 99.02%의 가장 높은 상동성을 보이는 것으로 나타났으며(도 2), 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주로 명명하였다.
실시예 2 : 본 발명의 트라우스토키트리대 속( Thraustochytriidae sp .) d1c 균주의 영양원 요구 특성 분석
실시예 1에서 분리한 신규 트라우스토키트리드 계열 d1c 균주의 다양한 영양원 이용 능력을 조사하였다. 기본 배지에 다양한 탄소원, 질소원 혹은 비해수염을 첨가하여 배양하여 균체 성장 및 오일 함량을 조사하였다.
기본 배지로는 탄소원 포도당 20 g/ℓ, 질소원 효모 추출물 10 g/ℓ, 인공해수염 5 g/ℓ, KH2PO4 9 g/ℓ을 함유한 배지를 사용하였다. 단일 콜로니를 기본 배지 15㎖을 이용하여 28℃에서 120rpm으로 3일간 전배양한 후 본 배양시에는 초기 접종 OD(optical density)가 1.5 정도 되게 새로운 배지에 접종하여 28℃에서 120rpm으로 3일간 배양하였다. 원심분리법으로 회수한 균체를 PBS 버퍼(phosphate buffered saline, pH 7.2)로 3회 세척한 후 동결건조기에서 12시간 건조하여 건조균체중량을 측정하였다.
DHA 함유 오일함량은 수정된 Bligh-Dyer법에 의하여 분석되었다. 건조 균체량 125mg에 클로로포름 6.25㎖, 메탄올 12.5㎖, 50 mM K2HPO4 버퍼(pH 7.4) 5㎖을 가하여 28℃에서 200rpm으로 1시간 동안 반응한 후 클로로포름 6.25㎖, K2HPO4 버퍼 6.25㎖을 첨가하여 30회 정도 섞어준 후 30분 동안 방치하여 수층과 오일이 함유된 유기용매층으로 분리되도록 하였다. 미리 무게를 측정해둔 알루미늄 접시로 클로로포름 층을 조심스럽게 옮긴 후 90℃에서 30분 동안 건조한 후 오일의 무게를 측정하였다. 전체 오일 함량은 아래와 같이 산출하였다.
총 오일함량 (%, 오일 g/건조균체량 100 g) = (WL-WD) × VC × 100/VP × WS
WL: 알루미늄 접시의 무게, WD: 알루미늄 접시 + 지질의 무게, VC: 클로로포름의 총 부피, VP: 알루미늄 접시에 옮긴 클로로포름의 부피, WS: 사용한 균체의 무게 (건조중량)
한편, 오일 중에 함유된 DHA의 함량은 기체크로마토그래피법으로 측정하였다. 적당량의 건조된 균체를 5% 메탄올-황산 용액 6㎖에 현탁하여 90℃에서 1시간 동안 반응하여 지방산 에스테르를 생성한 다음 헥산 0.2㎖로 추출하여 기체크로마토그래피로 분석하였다. 포도당 대신에 탄소원으로 프럭토스(fructose), 갈락토스(galactose), 자일로스(xylose), 락토즈(lactose), 말토즈(maltose), 수크로스(sucrose), 글리세롤(glycerol), 전분(starch)을 20 g/ℓ로 첨가한 경우, 표 2에 나타난 바와 같이, 포도당에 비해 다소 감소하기는 하였지만 여전히 트라우스토키트리대 속 d1c 균주는 균체 성장이 가능하였다. 특히 전분(starch)을 제외한 다른 탄소원의 경우 글루코스(glucose)를 탄소원으로 이용하였을 때와 유사한 높은 다중불포화지방산 함량을 보였다.
본 발명에서 분리한 트라우스토키트리대 속 d1c 균주의 다양한 탄소원을 이용한 배양
탄소원 세포건조중량
(g/ℓ)		 지질
(% DCW)		 PUFA
(% TFA)
프럭토스 2.50 10 79.19
갈락토스 2.22 9.38 79.86
자일로스 1.68 7.44 80.05
락토즈 1.72 8.48 78.51
말토즈 1.47 8.5 76.69
수크로스 1.7 7.35 77.62
전분 1.58 7.91 72.89
순 글리세롤(pure glycerol) 2.13 8.8 53.10
글루코스 2.55 10.62 80.07
효모 추출물 대신에 유기질소원으로 옥수수 침지액(corn steep liquor), 쇠고기 추출물(beef extract), 맥아추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone)을 10 g/ℓ의 농도로 첨가해준 경우, 표 3에 나타난 바와 같이, 트라우스토키트리대 속 d1c은 균체 성장이 가능하였으나 다중불포화지방산의 함량은 효모 추출물을 사용하였을 때가 가장 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 암모늄 아세테이트(2.3 g/ℓ), 암모늄 나이트레이트(1.2 g/ℓ), 암모늄 설페이트(2.9 g/ℓ), 소듐 나이트레이트(2.6 g/ℓ), 우레아(0.9 g/ℓ)를 첨가하여 다양한 무기 질소염의 영향을 살펴본 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 소듐 나이트레이트를 제외한 다른 무기 질소염은 다중불포화지방산 생산시 적합하지 않음을 확인할 수 있었다.
본 발명에서 분리한 트라우스토키트리대 속 d1c 균주의 다양한 유기질소원을 이용한 배양
유기질소원 세포건조중량
(g/ℓ)		 지질
(% DCW)		 PUFA
(% TFA)
옥수수 침지액 2.14 6.86 29.24
쇠고기 추출물 3.19 8.47 35.34
맥아추출물 2.58 6.80 34.54
펩톤 1.68 5.95 49.94
트립톤 2.41 6.19 63.77
효모추출물 2.55 10.62 80.07
본 발명에서 분리한 트라우스토키트리대 속 d1c 균주의 다양한 무기질소원을 이용한 배양
무기질소원 세포건조중량
(g/ℓ)		 지질
(% DCW)		 PUFA
(% TFA)
암모늄 아세테이트 2.13 6.98 47.06
암모늄 나이트레이트 1.12 5.42 44.76
암모늄 설페이트 1.17 5.98 47.06
소듐 나이트레이트 1.23 6.12 66.28
우레아 2.24 7.83 41.58
한국생명공학연구원 KCTC12769BP 20150310
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Thraustochytriidae sp. strain containing high content of polyunsaturated fatty acid and uses thereof <130> PN15064 <160> 3 <170> KoPatentIn <210> 1 <211> 1789 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Thraustochytriidae sp. d1c <400> 1 tcctgccagt agtcatacgc tcgtctcaaa gactaagcca tgcatgtgta agtataagcg 60 aattatactg tgaaactgcg aacggctcat tatatcagtt ataatccctt cggtagttcc 120 tttacacgga tacctgcagt aattctggaa ttaatacgtg ctgtacgggc ccgactttcg 180 gggagggccg cacttattag gtctaagcca acgttattgg tgagtcatga taattgagca 240 gatcgctttt cggagcgatg aatcgtttga gtttctgccc catcagttgt cgacggtagg 300 gtattggcct acggtgacta taacgggtga cggggagtta gggctcgact ccggagaggg 360 agcctgagag acggctacca catccaagga aggcagcagg cgcgtaaatt acccaatgtg 420 gactccacga ggtagtgacg agaaatatca atgcggggcg cttcgcgtct tgctattgga 480 atgagagcaa tgtaaaaccc tcatcgagga tcaactggag ggcaagtctg gtgccagcag 540 ccgcggtaat tccagctcca gaagcgtatg ctaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag 600 ttgaatttct ggtgtgggag cccaggcctc ggtgcgaatg cgccttgttt tgccttgcgg 660 ctcctttgcc atcctcgttt ttcgtaagaa aggcgtcatt cactgtaatc aaagcagagt 720 gttccaagca ggccgtaggg ccggtatgtt tattatggga tgatcagata ggactcgggt 780 gctattttgt tggtttgcac atctgagtaa tgattaatag gaacagtcgg gggtatccgt 840 atttaggagc tagaggtgaa attctngatt tccgaaagac gaactacagc gaaggcattt 900 accaagcatg ttttcattaa tcaagaacga aagtctgggg atcgaagatg attagatacc 960 atcgtagtct agaccgtaaa cgatgccgac ttgcgattgc gggtggcttg tattgggctt 1020 ccgcagcagc acatgagaaa tcaaagtctt tgggttccgg ggggagtatg gtcgcaaggc 1080 tgaaacttaa aggaattgac ggaagggcac caccaggagt ggagcctgcg gcttaatttg 1140 actcaacacg ggaaaactta ccaggtccag acataggtag gattgacaga ttgagagctc 1200 tttcttgatt ctatgggtgg tggtgcatgg ccgttcttag ttggtggagt gatttgtctg 1260 gttaattccg ttaacgaacg agacctcggc ctactaaata gccgggcgta tggcgacata 1320 tgtgtttgtg gcttcttaga gggacatgtt cggtttacga gcaggaagtt cgaggcaata 1380 acaggtctgt gatgccctta gatgttctgg gccgcacgcg cgctacactg atgggttcag 1440 cgggtgattt atggtctttg actgtagttg ctttgtcgga aggcatggct aatcctttga 1500 acgcccatcg tgctggggct agatttttgc aattattaat ctccaacgag gaattcctag 1560 taaacgcaag tcatcagctt gcattgaata cgtccctgcc ctttgtacac accgcccgtc 1620 gcacctaccg attgaacggt ccgatgaaac catgggacta ccttttgagc gtttgttcgc 1680 gatggaggtg ggaactcggg tgaatcttat tgtttagagg aaggtgaagt cgtaacaagg 1740 tttccgtagg tgaacctgcg gaagaatcac tagtgaattc gcggccgcc 1789 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 atgaacatca aaaa 14 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atgaacatca aaaa 14

Claims (13)

  1. 전체 지방산의 80~85%를 차지하는 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하고, 다중불포화지방산 중에서 EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6)은 전체 지방산의 각각 8~15% 및 40~50%를 차지하며, 기탁번호가 KCTC12769BP인 트라우스토키트리대 속(Thraustochytriidae sp.) d1c 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. (a) 제1항의 균주를 배양하여 바이오오일을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 균체에서 바이오오일을 회수하는 단계를 포함하는 전체 지방산의 80~85%를 차지하는 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하고, 다중불포화지방산 중에서 EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6)은 전체 지방산의 각각 8~15% 및 40~50%를 차지하는 바이오오일의 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계는 유기질소원으로 효모 추출물 또는 무기질소원으로 소듐 나이트레이트(sodium nitrate)를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 효모 추출물의 농도는 8~12 g/ℓ, 소듐 나이트레이트 농도는 2~3 g/ℓ인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항의 방법에 의해 제조된 전체 지방산의 80~85%를 차지하는 다중불포화지방산(PUFA, polyunsaturated fatty acid)을 함유하고, 다중불포화지방산 중에서 EPA(eicosapentaenoic acid, 20:5) 및 DHA(Docohexaenoic acid, 22:6)은 전체 지방산의 각각 8~15% 및 40~50%를 차지하는 바이오오일.
  9. 제1항의 균주를 유효성분으로 포함하는 지방산 생산용 미생물 제제.
  10. (a) 제1항의 균주를 배양하여 지방산을 생산하는 단계; 및
    (b) 상기 생산된 지방산을 바이오디젤로 전환하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (a) 단계는 유기질소원으로 효모 추출물 또는 무기질소원으로 소듐 나이트레이트(sodium nitrate)를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제1항의 균주를 유효성분으로 포함하는 바이오디젤 생산용 미생물 제제.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112513247A (zh) * 2018-06-29 2021-03-16 Cj第一制糖株式会社 新型破囊壶菌属菌株及使用其生产多不饱和脂肪酸的方法
CN112912489A (zh) * 2018-10-23 2021-06-04 玛拉可再生能源公司 微生物在半纤维素衍生碳水化合物中生长的适应和工艺优化

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Appl Microbiol Biotechnol, Vol.98, Issue.23, pp.9643-9652 (2014)* *
Biotechnology Advances, Vol.30, Issue.6, pp.1733-1745 (2012)* *
KASETSART JOURNAL - NATURAL SCIENCE, Vol.41 pp.324-334 (2007)* *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112513247A (zh) * 2018-06-29 2021-03-16 Cj第一制糖株式会社 新型破囊壶菌属菌株及使用其生产多不饱和脂肪酸的方法
CN112513247B (zh) * 2018-06-29 2023-11-14 Cj第一制糖株式会社 破囊壶菌属的新型微藻菌株及使用其生产多不饱和脂肪酸的方法
CN112912489A (zh) * 2018-10-23 2021-06-04 玛拉可再生能源公司 微生物在半纤维素衍生碳水化合物中生长的适应和工艺优化

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