KR101521274B1

KR101521274B1 - 신규 미세조류 오란티오키트리움（Aurantiochytrium sp.) LA3（KCTC12685BP) 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법

Info

Publication number: KR101521274B1
Application number: KR1020140135586A
Authority: KR
Inventors: 박중민; 김창국; 라연화; 서영빈
Original assignee: 에스케이이노베이션 주식회사
Priority date: 2014-10-08
Filing date: 2014-10-08
Publication date: 2015-05-22
Also published as: US9745606B2; US20160102328A1; US20170327851A1

Abstract

본 발명은 신규 트라우스토키트리드(Thaustochytride) 계 미세조류 및 이를 이용한 바이오오일(bio-oil) 생산방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이오오일 생산능을 가지는 오란티오키트리움(Aurantiochytrium) sp. LA3 (KCTC12685BP) 및 상기 미세조류를 배양하는 것을 특징으로 하는 바이오오일, 특히 오메가(omega)-3 불포화 지방산의 함량이 전체 지방산의 30 중량% 이상인 바이오오일의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)은 포도당을 탄소원으로 배양 시 당소모 속도가 빠르고 오일 함량이 높으며 세포를 고농도 배양이 가능하여 오일을 고생산성 및 고수율로 얻을 수 있어, 보다 경제적이고 환경친화적으로 바이오오일을 생산할 수 있다.

Description

신규 미세조류 오란티오키트리움（Aurantiochytrium sp.) LA3（KCTC12685BP) 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법{Novel Microalgae Aurantiochytrium sp. LA3（KCTC12685BP) and Method for Preparing bio-oil Using Thereof}

본 발명은 신규 트라우스토키트리드(Thaustochytride) 계 미세조류 및 이를 이용한 바이오오일(bio-oil) 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바이오오일 생성능을 가지는 오란티오키트리움(Aurantiochytrium) sp. LA3 (KCTC12685BP) 및 상기 미세조류를 배양하는 것을 특징으로 하는 바이오오일, 특히 오메가(omega)-3 불포화 지방산의 함량이 전체 지방산의 30 중량% 이상인 바이오오일의 제조방법에 관한 것이다.

불포화 지방산(unsaturated fatty acid)은 고도 불포화 지방산(highly unsaturated fatty acid 또는 poly unsaturated fatty acid(PAUF)) 이라고도 불리우며, 특히 인체에 유용한 불포화 지방산은 오메가-3(ω-3)와 오메가-6(ω-6)인데, 오메가-3 류는 3번째 탄소에 이중결합을 포함하며, 오메가-6 류는 6번째 탄소에 이르기까지 이중결합을 가지지 않는다. 이러한 오메가-3 불포화 지방산의 대표적인 예로는 메틸 말단으로부터 세번째 탄소로부터 시작되는 6개의 이중 결합을 가진 22개의 탄소쇄 길이를 가지며 "22:6n-3"으로 표시되는 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 20:5n-3"으로 표시되는 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic aicd, EPA), 22:5n-3으로 표시되는 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic aicd, DPA) 및 16:3n-3으로 표시되는 α-리놀렌산(linolenic acid) 등이 매우 유용한 오메가-3 불포화 지방산 종류로 알려져 있으며, 오메가-6 류에는 20:4n-6으로 표시되는 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA) 등이 있다.

상기와 같은 불포화 지방산은 체내에서 매우 중요한 역할을 수행하는데, 오메가-3 불포화 지방산은 동맥경화증 및 관상심장질환을 예방하고, 염증성 상태를 완화시키고, 또한 종양세포의 성장을 지연시키는 역할을 수행하며, 오메가-6 불포화 지방산은 인체에서 구조적 지질로서 작용할 뿐만 아니라 프로스타글란딘, 류코트리엔 및 옥시리핀(oxylipins)과 같은 염증에서의 수많은 인자들의 전구체로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 특히, 도코사헥사엔산(DHA)은 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 개발에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있으며 인간이나 동물의 망막, 정액 및 두뇌조직에 풍부하게 존재한다. 특히 DHA는 두뇌 지방의 60%를 구성하고 있는 필수 지방산으로, 도코사헥사엔산은 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)과 함께 유아의 두뇌, 눈, 신경체계의 건강한 발달을 위해 중요한 것으로 알려져 있으며, 암부터 관절염에 걸친 수많은 질병과 심혈관 질환 및 정신적인 장애의 예방과 치료에 효과가 있음이 보고되고 있으며, 최근에는 노안의 황반변성 억제 등 다양한 항노화 기능들이 새롭게 밝혀지고 있다.

이러한 오메가-3 또는 오메가-6 불포화 지방산은 인체 내에서 매우 중요한 기능을 수행하므로 국제보건기구(WHO)는 2000 칼로리 식사 섭취를 기준으로 매일 약 2.2 내지 4.4g에 상당하는 오메가-3 불포화 지방산으로부터 1일 섭취 에너지의 1 내지 2%를 커버하도록 권장하고 있으며, 각국의 공인 기관들에서는 DHA를 하루 1 g 이상 꾸준히 섭취할 것을 권장하고 있다. 때문에 DHA는 건강기능성 식품 등 다양한 제품으로 상용화되고 있으며, 의약품 원료로도 활용 가능성 높아 DHA의 상업적 가치는 매우 높다고 할 수 있다.

하지만, 이러한 오메가-3 또는 오메가-6 불포화 지방산은 인체 내에서는 자연적으로 합성되지 않으므로 주로 식품을 통해서 섭취하여야만 하는 어려움이 있다.

기존에는 식물성 오일, 해양 동물 오일(marine animal oil), 어유 (fish oils) 및 오일시드(oilseeds) 등을 통해 이를 섭취하여 왔으며, 대표적으로는 어류에 포함된 어유(fish oils)의 직접 섭취 방식을 통해 오메가-3 또는 오메가-6 불포화 지방산을 공급받았는데, EPA 및 DHA를 고함량 포함하는 어류는 고등어, 청어 및 연어 등이며, 대구류(cod), 북대서양산 대구(haddock) 등의 몇몇 어류는 간에 대부분의 지방을 비축한다. 그럼에도 불구하고, 최상의 공급원은 참치, 고등어, 정어리, 청어 및 송어 등의 냉수어이다. 그러나, 어유로부터 DHA를 효율적으로 공급받기 위해서는 어류를 생으로 먹거나 끓여서 먹는 것이 바람직하고, 나아가서는 복부를 따라 그리고 지느러미 둘레의 아가미 뒤쪽의 껍질을 먹을 필요가 있는데, 그 이유는 이들 부분에는 오일의 대부분이 축적되어 있기 때문이다. 하지만, 어유는 신속하게 부패하며, 부패한 어류는 비린내가 나므로 그다지 식욕을 돋구지 못한다는 단점이 있고, 어유의 중금속 및 유기화학 물질에 의한 오염 문제가 심각하며, 특히 인체에 충분한 양의 어유를 획득하기 위해서는 다량의 어류를 필요로 하기 때문에 현실적으로 이러한 요구를 경제적이고 산업적인 규모로 충족시키기는 매우 어려운 실정이다.

이러한 문제점을 해결하고자, 조류를 포함한 다양한 미생물 배양에 의한 도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산의 생산방법에 대한 연구가 진행되어 왔다. 특히 트라우스토키트리드류라 불리는 미세-종속영양균에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이들은 난균류 (oomycetes) 및 라비린툴리드류(labyrinthulids)와 함께 스트라메노필라 킹덤(Stramenophila kingdom)로 분류된 비광합성(non-photosynthetic), 종속영양 미생물 군이다. 트라우스토키트리드류에는 쉬조키트리움(Schizochytrium), 오란티오키트리움(Aurantiochytrium) 및 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속(屬)등이 있는데 이들 구성 종들은 그들의 높은 지질함량 및 높은 레벨의 DHA로 인해 산업상 이용을 위해 잠재적인 오메가-3 공급원으로서 각광받고 있다. 트라우스토키트리드는 부생균류(saprobe)로서, 혹은 경우에 따라 기생 생물로서 공급되는 미세 종속영양균의 관용명이다. 트라우스토키트리드류는 남극 대륙, 북해, 인도, 일본 및 오스트레일리아로부터 분리된 균주와 함께 넓은 지리학적 분포를 가진다. 이들은 살아있는 식물에서 드물게 발견되고 식물 항균제에 의해 억제되는 것으로 보인다. 이들 군의 구성 종은 때로는 거대 조류 및 수생 맨그로브(Mangrove) 잎 등의 죽은 토착성뿐만 아니라 이지성 식물 소재에 풍부하게 존재한다. 이들은 통상 연안 및 심해를 비롯한 원양 수주(water column) 및 침전물에 존재한다.

이미 해양 미세조류의 일종인 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 및 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속 미생물에 의한 오메가-3 불포화 지방산의 생산방법은 60년대 말부터 알려져 있었으며(Ellenbogen B. B. et al., , Comp. Biochem. Physiol., 29:805-811, 1969), 가장 앞선 기술을 보유하고 있는 것으로 평가되는 마르텍(Martek)사는 쉬조키트리움속 미생물인 쉬조키트리움(Schizochytrium) sp. ATCC 20888 및 쉬조키트리움(Schizochytrium) sp. ATCC 20889를 이용하여 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 방법을 개발하였다(미국등록특허 5,130,242B 및 미국등록특허 5,340,742B). 또한, 산토리(Suntory)사는 도코사헥사엔산 생산성이 우수한 미생물로 쉬조키트리움 리마시눔 SR21(Schizochytrium limacinum SR21)을 보고한 바 있다(일본특허공개 1997-000284A, 미국등록특허 6,582,941B).　

지금도 다수의 연구가 진행되고 있지만, 여전히 높은 생산성 및 공정 효율성, 특히 환경친화적으로 바이오오일을 대량생산할 수 있는 능력을 가지는 새로운 미세조류에 대한 요구는 절실한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 높은 불포화 지방산 생성능을 가지면서도, 배양공정의 효율성이 높은 미세조류를 개발하고자 예의 노력한 결과, 온도가 높고 유기물이 풍부한 해안지역 습지 또는 온천지역 습지로부터 신규 Thaustochytride 계 미세조류를 분리하고, 상기 신규 미세조류를 이용하는 경우, 효율적이고 경제적으로 오메가-3 및 추가적으로 오메가-6 불포화 지방산을 생산할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 높은 불포화 지방산 생산성을 가지며, 배양 공정의 효율성을 제고함으로써 경제적으로 바이오오일을 생산할 수 있는 신규 미세조류를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 미세조류를 이용한 바이오오일 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이오오일 생성능을 가지는 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC 12685BP)을 제공한다.

본 발명은 또한, (1) 상기 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC 12685BP)를 배양하는 단계; 및 (2) 배양된 미세조류로 부터 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 추출 및 분리하는 단계를 포함하는 바이오오일의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)은 포도당을 탄소원으로 배양 시 당소모 속도가 빠르고 오일 함량이 높으며 세포를 고농도 배양이 가능하여 오일을 고생산성 및 고수율로 얻을 수 있어, 보다 경제적이고 환경친화적으로 바이오오일을 생산할 수 있다.

도 1은 본 발명의 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리된 7개의 미세조류 콜로니의 배양시간에 따른 바이오오일 수율, 생산성 및 전체 지방산 중 DHA 분율을 나타낸 그래프이다.

본 발명에서는 높은 불포화 지방산 생성능을 가지는 미세조류를 개발하기 위하여, 온도가 높고 유기물이 풍부한 해안지역 습지 또는 온천지역 습지로부터 신규 Thaustochytride 계 미세조류를 분리하였다.

따라서, 일 관점에서 본 발명은 바이오오일 생성능을 가지는 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC 12685BP)에 관한 것이다.

본 발명의 신규 미세조류인 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)는 Thaustochytride 계 미세조류로 오메가-3 및 오메가-6 불포화 지방산 생산능을 가진다.

본 발명의 신규 미세조류는 해안지역 습지 또는 온천지역 습지의 부유물에서 분리한 미세조류로, 서열번호 1로 표시되는 18S rRNA유전자의 DNA 염기서열을 가지며, NCBI (미국 국립생물정보센터) Blast를 통해 검색한 결과, 새로운 Thraustochytrium 계 미세조류인 것으로 확인되었으며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2014년 9월 26일자로 Aurantiochytrium sp. LA3, 기탁번호 (KCTC12685BP)로 기탁하였다.

본 발명에 따른 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)이 생산하는 바이오오일은 오메가(omega)-3 불포화 지방산의 함량이 전체 지방산의 30 중량% 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 제공되는 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)은 포도당을 탄소원으로 배양 시 당 소모 속도가 빠르고 오일 함량이 높으며 세포를 고농도로 배양 가능하여 오일을 고생산성 및 고수율로 얻을 수 있다는 장점이 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 (1) 상기 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC 12685BP)를 배양하는 단계; 및 (2) 배양된 미세조류로 부터 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 추출 및 분리하는 단계를 포함하는 바이오오일의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 단계 (1)에서의 배양은 회분식, 유가식 또는 연속식 배양 방식에서 선택되는 방법으로 수행될 수 있으며, 상기 단계 (2)에서 단계는 세포 파쇄 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 세포 파쇄는 초음속 분산기를 이용한 세포 파쇄, 펄스 전자장(pulsed electric field)을 이용한 세포 파쇄, 효소를 이용한 세포 파쇄, 삼투압을 이용한 세포 파쇄, 전자선을 이용한 세포 파쇄 방법 또는 유기 용매를 이용한 세포 파쇄 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 바이오오일 제조방법은 (3) 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오오일을 정제하는 단계; 를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 정제는 바이오오일을 포함하는 오일층(oil phase)과 세포 파쇄물을 포함하는 물층(aqueous phase) 중에서 오일층만을 회수하는 것을 포함할 수 있으며, 또한, 상기 정제는 응고되는 유분을 제거하는 단계, 블리칭 클레이(bleaching clay) 또는 활성탄을 이용한 탈색(bleaching) 단계, 필터링(filtering) 단계 및 탈취(deodorizing) 단계 중 하나 이상의 단계를 포함하여 수행할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 탈취단계는 감암증기탈취 공정을 통해 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서, 상기 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)을 이용한 오메가-3을 포함하는 바이오오일의 생산방법은 하기 단계를 포함하여 이루어진다.

(1) Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)을 배양하는 단계;

(2) 배양된 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)을 회수하고, 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 추출 및 분리하는 단계;를 포함하며,

추가적으로

(3) 분리된 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 정제하는 단계.

를 포함할 수 있다.

이하 각 단계를 보다 상세히 설명한다.

상기 단계 (1)에서의 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)의 배양은 회분식(batch), 유가식(fed-batch) 및 연속식(continuous) 배양 방식에서 선택된 형태로 진행될 수 있으며, 유가식 배양 또는 연속식 배양 방식을 사용하는 것이 바람직하다.

단계 (1)에서 유가식 또는 연속식 배양을 통해 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)을 배양하기 위해서는 탄소원(carbon source)을 공급하는 것이 바람직하다. 이때 사용될 수 있는 탄소원은 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)이 이용하여 성장할 수 있는 탄소원이라면 제한없이 사용가능하며, 포도당(글루코스 : glucose), 푸룩토스(fructose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(galactose), 글리세롤(glycerol), 바이오 디젤 폐기물인 조 글리세롤(crude glycerol) 등이 바람직하지만 이에 제한되는 것은 아니며, 글루코스가 가장 바람직하다. 탄소원은 적절한 농도가 유지될 수 있도록 연속식 또는 유가식으로 공급되는 것이 바람직하며 필요에 따라 pH-stat 또는 DO-stat 등의 방법이 사용될 수 있고, 각 탄소원의 농도를 실시간으로 측정하여 필요시 공급하는 방식 등도 이용될 수 있다. 또한, Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)의 성장을 위해 필요한 영양 성분이 배지(medium) 내에 포함될 수 있는데, 각종 질소원(nitrogen source), 인원(phosphate source) 및 기타 성분 등이 포함될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이며, 복합배지(complex medium) 또는 한정배지(defined medium) 등이 사용될 수 있다는 점 또한 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 질소원으로는 효모 추출물(Yeast extract), corn steep liquor, beef extract, malt extract, peptone, tryptone 등의 유기질소원이나 ammonium acetate, ammonium nitrate, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea 등의 무기질소원도 사용가능하다.

특히, 염분 농도를 적절한 농도 수준으로 설정하여 그 범위 내에서 배양을 진행하는 것이 바람직하다.

단계 (1)에서 유가식 또는 연속식 배양을 통해 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)을 배양하는 동안 pH 및/또는 온도를 미리 설정한 범위에서 유지하여 주는 것이 바람직하다. 배양 중에 pH 및/또는 온도를 일정하게 유지하는 방법은 당업계에서 잘 알려진 방법을 사용할 수 있는데, 냉각수를 이용한 cooling jacket를 이용하는 방법, pH controller를 이용하여 산 또는 염기를 자동 공급하는 방법 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 단계 (1)에서 상기 유가식 또는 연속식 배양을 통한 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)의 배양은 적절한 공기의 공급(aeration) 및 교반(agitation) 하에서 이루어지는 것이 바람직하다. 공기의 공급속도 및 교반 속도는 통상의 기술자가 공정 조건에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 보다 구체적으로 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)은 호기성이며 교반에 의한 전단응력에 약한 특성이 있어서 교반속도는 50~300 rpm, 바람직하게는 100~300rpm에서 선택될 수 있고, 공기의 공급속도는 0.5~5 vvm, 바람직하게는 1~3 vvm에서 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 단계 (1)의 배양을 통해 생산되는 바이오오일에서 오메가-3 불포화 지방산의 함량은 전체 지방산의 30 중량% 이상, 바람직하게는 40 중량% 이상, 가장 바람직하게는 50 중량% 이상이다.

단계 (2)에 따라 배양된 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)을 회수하고, 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 추출 및 분리하는 단계는 단계 (1)에서의 배양이 완료된 후, 세포를 파쇄하는 단계를 포함한다. 세포 파쇄단계는 펄스 전자장(pulsed electric field)을 이용한 세포 파쇄, 효소를 이용한 세포 파쇄, 전자선을 이용한 세포 파쇄 방법 등을 통해 세포의 파쇄를 유도할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 헥산(hexane) 등의 유기 용매(solvent)를 이용하여 세포 파쇄 및 오일 추출을 하는 방법도 사용될 수 있음은 통상의 기술자에게는 자명한 것이다. 특히, 삼투압을 이용한 세포 파쇄 후, 상기의 파쇄기술을 사용할 경우 세포파쇄 효과를 높일 수 있다.

세포 파쇄가 진행되면 오일층(oil phase)과 세포 파쇄물을 포함하는 물층(aqueous phase)의 상분리가 일어나게 되는데, 이때 오일층만을 회수하여 단계 (3)에서의 정제 단계를 통해 최종 바이오오일 제품을 수득할 수 있게 된다.

단계 3)에 따른 바이오오일의 정제 단계는 -5~0℃에서 5-20시간 동안 방치하여 응고되는 유분을 제거하는 단계, bleaching clay 및/또는 활성탄을 이용한 탈색(bleaching) 단계, 필터링(filtering) 단계 및 탈취(deodorizing) 단계에서 선택된 하나 이상의 단계를 포함하여 이루어지며, 바람직하게는 상기 단계가 순차적으로 수행될 수 있다.

필터링은 기공 크기 0.5~1 μm의 기공크기를 가지는 필터를 이용하여 수행되는 것이 바람직하며, 탈취 단계는 감압증기탈취 공정을 통해 이루어지는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

실시예 1. 미세조류의 분리

바이오오일 생성능이 뛰어난 신규 미세조류를 스크리닝하고자, 해안지역 습지 또는 온천지역 습지의 부유물로부터 아래와 같은 방법을 이용하여 Thraustochytrid 계 미세조류를 분리하였다.

부유물 샘플을 포도당(glucose) 10 g/L, 효모추출물(yeast extract) 2 g/L, 펩톤(peptone) 2 g/L, KH₂PO₄ 1 g/L, Sea salt 30 g/L가 함유된 50 ml 배지에 넣고 1일 배양하였다. 얻어진 배양액 50ㅅl를 포도당(glucose) 10 g/L, 효모추출물(yeast extract) 2 g/L, 펩톤(peptone) 2 g/L, KH2PO4 1 g/L, Sea salt 30 g/L 및 아가(agar) 15 g/L가 함유된 고체배지에 도말한 후, 28 ℃에서 5 일간 배양하여 7개의 콜로니를 얻고, 얻어진 7개 콜로니들을 4회 계대배양하여 순수 분리하였다.

상기 각 콜로니들을 5 ml 액체배지(Glucose 60 g/L, Corn steep liquir 14.4 g/L, Sea salt 10 g/L, Potassium phosphate monobasic 1 g/L, Glutamic acid 3 g/L, Sodium sulfate 5 g/L, Ammonium sulfate 1 g/L, Calcium chloride 0.4 g/L, Magnesium sulfate 2 g/L, Ferric sulfate 1 mg/L, Zinc sulfate 1 mg/L, Manganese(II) chloride 3 mg/L, Cobalt(II) chloride 0.04 mg/L, Sodium molybdate 0.04 mg/L, Copper(II) sulfate 2 mg/L, Nickel(II) sulfate 2 mg/L, Thiamin 1 mg/L)를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 50 mL 진탕배양기(shaking incubator)에서 4일 배양, 50 ml액체배지를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 250 mL 진탕배양기(shaking incubator)에서 3일배양, 400 ml액체배지를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 1000 mL 진탕배양기(shaking incubator)에서 1일 배양한 후, 2 L액체배지를 이용하여 28℃에서 200 rpm, 0.7 vvm, 초기 pH 7.0으로 5 L 배양기 (5L jar fermentor)에서 배양하였다. 배양 균체를 각각 회수하여 초음속파쇄기로 파쇄하여 100 ml 헥산으로 오일을 추출한 후 추출된 오일을 AOCS(American Oil Chemists' Society)법으로 오일 중 지방산 조성을 분석하였다.

분리된 7개 콜로니 중에서 오일 생산성 및 수율이 가장 높고 또한, 전체 지방산 중 30 중량% 이상의 오메가-3 지방산을 가지는 4번 균체를 선별하였다(도 1 및 도 2).

실시예 2. 18S DNA 분석을 통한 동정(identification)

최종 선별된 4번 균주의 분자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA유전자 서열을 분석하였다. 하나의 콜로니로부터 염색체 DNA를 분리한 후, 이로부터 Thraustochytrid 계 미세조류 18s rRNA 유전자 증폭용 프라이머 F: 5'-AACCTGGTTGATCCTGCCAG-3'(서열번호 2) 와 R: 5'-TTGTTACGACGACTTCACCTTCCT-3'(서열번호 3)을 이용하여 PCR법으로 18S rRNA유전자 DNA를 증폭하였다. 증폭된 반응액은 염 제거 후 마크로젠㈜에 의뢰하여 염기서열을 분석하고, 서열번호 1로 나타내었다. NCBI (미국 국립생물정보센터) Blast를 통해 검색한 결과 선별된 균주는 새로운 Thraustochytrium 계 미세조류인 것으로 확인되었으며, 한국생명공학연구원 유전자은행에 2014년 9월 26일자로 Aurantiochytrium sp. LA3, 기탁번호 (KCTC12685BP)로 기탁하였다.

실시예 3. Batch 배양 조건에서 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP) 의 성장 및 바이오오일 생산 특성 분석

실시예 1에서 분리된 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)의 성장 및 바이오오일 생산 특성을 batch 배양 조건에서 조사ㅇ분석하였다.

고체배지에 배양한 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP) 단일 콜로니를 따서 5 ml 액체배지{(Glucose 40 g/L, Yeast extract 4.8 g/L, Potassium chloride 1 g/L, Potassium phosphate monobasic 2 g/L, Glutamic acid sodium salt 3 g/L, Sodium sulfate 12 g/L, Calcium chloride 0.5 g/L, Magnesium sulfate 2 g/L, 미량원소류(thylenediaminetetraacetic acid 18 mg/L, Ferric sulfate 0.87 mg/L, Boric acid 20.52 mg/L, Zinc sulfate 0.711 mg/L, Manganese(II) chloride 2.58 mg/L, Cobalt(II) chloride 0.078 mg/L, Sodium molybdate 0.015 mg/L, Copper(II) sulfate 0.006 mg/L, Nickel(II) sulfate 0.156 mg/L)와, 비타민류(Thiamin 0.6 mg/L, Biotin 0.0015, Cobalamin 0.015 mg/L, Calcium pantothenate 0.6 mg/L)}를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 4일 배양, 50 ml액체배지를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 3일배양, 400 ml액체배지를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 1일 배양한 후, 2 L액체배지(Glucose 120 g/L, Corn steep liquor 28.8 g/L, Potassium chloride 1 g/L, Potassium phosphate monobasic 2 g/L, Glutamic acid sodium salt 3 g/L, Sodium sulfate 12 g/L, Calcium chloride 0.5 g/L, Magnesium sulfate 2 g/L, 미량원소류 및 비타민류)를 이용하여 28℃에서 200 rpm, 0.7 vvm, 초기 pH 7.0으로 5 L 발효조에서 batch로 배양하였다. 배양 균체를 각각 회수하여 초음속파쇄기로 파쇄하여 100 ml 헥산으로 오일을 추출한 후 추출된 오일을 AOCS(American Oil Chemists' Society)법으로 오일 중 지방산 조성을 분석하였다.

그 결과, 36 시간만에 배지내의 포도당을 모두 소모하였으며 이때 49.7 g/L의 균체가 수득되었다(표 1). 수득한 균체로부터 미세조류 내 오일을 추출한 결과 미세조류 건조중량 대비 오일의 함량은 51.2 중량%이었고, 지방산 대비 DHA의 함량은 33.6 중량%이었다.

Cell 농도(g/L)	Oil함량(%)	DHA(%FAME)	수율	생산성
49.7±5.4	51.2±7.5	33.6±2.9	20.7±3.1	17.0±3.0

실시예 4. Fed-batch 배양 조건에서 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP) 의 성장 및 바이오오일 생산 특성 분석

실시예 1에서 분리된 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP)의 성장 및 바이오오일 생산 특성을 fed-batch 배양조건에서 조사ㅇ분석하였다.

고체배지에 배양한 Aurantiochytrium sp. LA3 (KCTC12685BP) 싱글콜로니를 따서 5 ml 액체배지{(Glucose 40 g/L, Yeast extract 4.8 g/L, Potassium chloride 1 g/L, Potassium phosphate monobasic 2 g/L, Glutamic acid sodium salt 3 g/L, Sodium sulfate 12 g/L, Calcium chloride 0.5 g/L, Magnesium sulfate 2 g/L, 미량원소류(thylenediaminetetraacetic acid 18 mg/L, Ferric sulfate 0.87 mg/L, Boric acid 20.52 mg/L, Zinc sulfate 0.711 mg/L, Manganese(II) chloride 2.58 mg/L, Cobalt(II) chloride 0.078 mg/L, Sodium molybdate 0.015 mg/L, Copper(II) sulfate 0.006 mg/L, Nickel(II) sulfate 0.156 mg/L)와, 비타민류(Thiamin 0.6 mg/L, Biotin 0.0015, Cobalamin 0.015 mg/L, Calcium pantothenate 0.6 mg/L)}를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 4일 배양, 50 ml액체배지를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 3일배양, 400 ml액체배지를 이용하여 28℃에서 150 rpm으로 1일 배양한 후, 1 L액체배지(Glucose 60 g/L, Corn steep liquor 14.4 g/L, Potassium chloride 1 g/L, Potassium phosphate monobasic 2 g/L, Glutamic acid sodium salt 3 g/L, Sodium sulfate 12 g/L, Calcium chloride 0.5 g/L, Magnesium sulfate 2 g/L, 미량원소류 및 비타민류)를 이용하여 28℃에서 250 rpm, 0.7 vvm, 초기 pH 7.0으로 5 L 발효조에서 fed-batch로 배양하였다. 당잔량이 10~20 g/L 되는 시점에서 Glucose 420 g/L를 0.5 L씩 2회 feeding하여 최종 2 L의 배양액을 얻었다. 배양 균체를 각각 회수하여 초음속파쇄기로 파쇄하여 100 ml 헥산으로 오일을 추출한 후 추출된 오일을 AOCS(American Oil Chemists' Society)법으로 오일 중 지방산 조성을 분석하였다.

그 결과, 60 시간만에 배지내의 포도당을 모두 소모하였으며 이때 109.9 g/L의 균체가 수득되었다(표 2). 수득한 균체로부터 미세조류 내 오일을 추출한 결과 미세조류 건조중량 대비 오일의 함량은 60.2 중량%이었고, 지방산 대비 DHA의 함량은 30.7 중량%이었다.

Cell 농도(g/L)	Oil함량(%)	DHA(%FAME)	수율	생산성
109.9±3.0	60.2±1.2	30.7±1.3	24.2±0.2	26.4±0.2

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12685BP

20140926

<110> SK innovation Co., Ltd. <120> Novel Microalgae Aurantiochytrium sp. LA3 KCTC12685BP and Method for Preparing bio-oil Using Thereo <130> P14-B306 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 996 <212> DNA <213> Aurantiochytrium sp. LA3 <400> 1 agattaagcc atgcatgtgt aagtataagc gattgtactg tgagactgcg aacggctcat 60 tatatcagta ataatttctt cggtagtttc ttttatatgg atacctgcag taattctgga 120 aataatacat gctgtaagag ccctgtatgg ggctgcactt attagattga agccgatttt 180 attggtgaat catgataatt gagcagattg acttttttag tcgatgaatc gtttgagttt 240 ctgccccatc agttgtcgac ggtagtgtat tggactacgg tgactataac gggtgacgga 300 aagttagggc tcgactccgg aaagggagcc tgaaagacgg ctaccatatc caaggatagc 360 atcaggcgcg taaattaccc actggggact ccacgaggta gtgacgagaa atatcgatgc 420 gaagcgtgta tgcgttttgc tatcggaatg aaagcaatgt aaaaccctca tcgaggatca 480 actggagggc aagtctgggg ccagcagccg cggtaattcc agctcccaaa tgaatgctaa 540 agttgttgca gttaaaaagc tcgtagttga atttctggca agggcgaccg gtgctttccc 600 tgaatgggga ttgattgtct gtgttgcctt ggccctcttt tgcttctctt ttcggggaga 660 aatctttcac ggtaatcaaa gcaaagggtt caagcaggtc gtatgaccgg tatgttatta 720 tgggatgaaa aataggactt gggtgtattt tgtgggttgc cgcctgagaa gggtaatagg 780 aaagttgggg gtatcgtatt aggagctaga gtgaattctg gattccgaag acgactagag 840 cgaggcatta ccagcaggtt tcattatcaa gacgaaggcg gggatcgaga tgatagatac 900 atcgagtcta accgtaacga tgcgactgcg atgttggggc ttttatgggc tcaccgcagc 960 catggaaacc aagctttggg tccgggggga ttggtc 996 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aacctggttg atcctgccag 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttgttacgac gacttcacct tcct 24

Claims

바이오오일 생성능을 가지는 신규 미세조류Aurantiochytrium sp. LA3 KCTC 12685BP.
제1항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 18S DNA 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 KCTC 12685BP.
제1항에 있어서, 오메가-3 불포화 지방산 함량이 전체 지방산의 30 중량% 이상인 바이오오일 생성능을 가지는 것을 특징으로 하는 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 KCTC 12685BP.
다음 단계를 포함하는 바이오오일의 제조방법:
(1) 제1항의 신규 미세조류 Aurantiochytrium sp. LA3 KCTC 12685BP를 배양하는 단계; 및
(2) 배양된 미세조류로 부터 오메가-3 불포화 지방산을 포함하는 바이오오일을 추출 및 분리하는 단계.
제4항에 있어서, 생산된 바이오오일에서 오메가-3 불포화 지방산 함량이 전체 지방산의 30 중량% 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 단계 (1)에서의 배양은 회분식, 유가식 또는 연속식 배양 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 단계 (2)에서 단계는 세포 파쇄 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 세포 파쇄는 초음속 분산기를 이용한 세포 파쇄, 펄스 전자장(pulsed electric field)을 이용한 세포 파쇄, 효소를 이용한 세포 파쇄, 삼투압을 이용한 세포 파쇄, 전자선을 이용한 세포 파쇄 방법 및 유기 용매를 이용한 세포 파쇄 방법으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
(3) 오메가-3 지방산을 포함하는 바이오오일을 정제하는 단계;
를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 정제는 바이오오일을 포함하는 오일층(oil phase)과 세포 파쇄물을 포함하는 물층(aqueous phase) 중에서 오일층만을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 정제는 응고되는 유분을 제거하는 단계, 블리칭 클레이(bleaching clay) 또는 활성탄을 이용한 탈색(bleaching) 단계, 필터링(filtering) 단계 및 탈취(deodorizing) 단계로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 탈취단계는 감암증기탈취 공정을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.