KR100700486B1 - 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 균주 및 이를 이용한오메가-3 불포화 지방산의 제조방법 - Google Patents

오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 균주 및 이를 이용한오메가-3 불포화 지방산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 쉬조키트리움 sp. RT0100P1(Schizochytrium sp. RT0100P1)(KCTC-10937BP) 또는 쉬조키트리움 sp. SEK-228(Schizochytrium sp. SEK-228)(KCTC-10938BP)을 제공한다. 또한, 본 발명은 (a) 상기 균주를 배양하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 얻어진 균체(biomass) 또는 배양액으로부터 오메가-3 불포화 지방산을 추출하는 단계를 포함하는 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 균주는 해수와 염화나트륨이 제외된 배지에서 생육이 우수할 뿐만 아니라 도코사헥사엔산이 고농도로 포함된 오메가-3 불포화 지방산을 생산할 수 있다.
쉬조키트리움, 도코사헥사엔산, 오메가-3 불포화 지방산

Description

오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 균주 및 이를 이용한 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법{Microorganism producing omega-3 unsaturated fatty acid and processes for preparing omega-3 unsaturated fatty acid using the same}
도 1은 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1)(KCTC-10937BP)의 광학현미경 사진이다.
도 2는 쉬조키트리움 sp. SEK-228(Schizochytrium sp. SEK-228)(KCTC-10938BP)의 광학현미경 사진이다.
본 발명은 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 균주 및 이를 이용한 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법에 관한 것이다.
오메가-3 불포화 지방산(ω-3 unsaturated fatty acid)은 오메가-3 고도 불포화 지방산(ω-3 highly unsaturated fatty acid)라고도 불리우며, 대표적으로는 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic aicd, EPA). 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA), 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic aicd, DPA), 및 α-리놀렌산 등이 알려져 있다. 도코사헥사엔 산 및 에이코사펜타엔산은 체내에서 합성되지 않는 필수 지방산의 일종으로서, 주로 식품을 통해서 섭취하여야 한다.
도코사헥사엔산은 인간이나 동물의 망막, 정액 및 두뇌조직에 풍부하게 존재하며, 특히 두뇌 지방의 60%를 구성하고 있는 필수 지방산이다. 도코사헥사엔산은 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)과 함께 유아의 두뇌, 눈, 신경체계의 건강한 발달을 위해 중요한 것으로 알려져 있다. 또한 최근에는 암부터 관절염에 걸친 수많은 질병과 심혈관 질환 및 정신적인 장애의 예방과 치료에 효과가 있음이 보고되고 있다(박덕천, 식품세계, 5, 87-93(2004)).
도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산의 주요 공급원은 청어, 연어, 다랑어 등의 생선에서 추출한 어유(漁油)이다. 그러나 지속적인 어유 공급의 어려움과 어유의 중금속 및 유기화학 물질에 의한 오염이 문제되어, 미생물 배양에 의한 도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법에 대한 연구가 진행되고 있다.
미생물을 이용한 오메가-3 불포화 지방산 제조와 관련하여, 해양 미세조류의 일종인 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)속 및 쉬조키트리움(Schizochytrium)속 미생물에 의한 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법이 Ellenbogen 등 (Ellenbogen B. B., S. Aaronson, S. Goldstein and M. Belsky, Comparative Biochemistry and Physiology, 29, 805-811(1969))에 의해 개시된 바 있다.
또한, 마르텍(Martek)사는 쉬조키트리움속 미생물인 쉬조키트리움 sp . ATCC 20888(Schizochytrium sp . ATCC 20888) 및 쉬조키트리움 sp . ATCC 20889(Schizochytrium sp . ATCC 20889)를 이용하여 오메가-3 불포화 지방산을 제조하는 방법을 개시한 바 있다(미국특허 제5,130,242호 및 미국특허 제5,340,742호). 또한, 산토리(Suntory)사는 도코사헥사엔산 생산성이 우수한 미생물로 쉬조키트리움 리마시눔 SR21(Schizochytrium limacinum SR21)을 보고한 바 있다(일본공개특허 1997-000284　, 미국특허 제6,582,941호).　
그러나, 상기한 종래의 미생물을 이용한 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법은, 미생물의 생육을 위하여, 성분의 제어가 어려운 해수나 다량의 염화나트륨을 배지에 함유하여야 한다. 즉, Iida 등(Iida I., T. Nakahara, T. Yokochi, Y. Kamisaka, H. Yagi, M. Yamaoka, and O. Suzuki, J. Ferment . Bioeng., 81, 76-78(1996))에 따르면, 도코사헥사엔산 생산균주인 트라우스토키트리움 아우리움(Thraustochytrium aureum)은 해수의 0.5배 염도(salinity)에서 가장 높은 균체량과 포도당 소모 속도를 나타나며, 염도가 없거나 해수의 2배인 배지에서는 생육의 저해를 받는다. 또한 Yokochi 등(Yokochi T., D. Honda, T. Higashihara,and T. Nakahara, Appl Micro , Biotech. 49, 72-76(1998))에 따르면, 해수가 제외된 배지에서 쉬조키트리움 리마시눔 SR21(Schizochytrium limacinum SR21)의 생육은 50% 해수가 공급된 배지의 절반 수준으로 균체의 생육에 해수가 요구된다.
따라서, 성분의 제어가 곤란하고, 발효조의 부식을 초래하는 해수 또는 염화나트륨을 사용하지 않고, 오메가-3 불포화 지방산을 효과적으로 생산할 수 있는 생산 균주의 확립 및 이를 이용한 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법을 개발하는 것이 당업계에 요구된다.
본 발명자들은 상기 종래기술의 문제점을 해결하고자 다량의 해양미생물을 분리하여 생리학적 특성을 연구하던 중, 놀랍게도 일본 오키나와 이리오모테 섬(Iriomote island) 수중에서 분리한 2종의 미생물이 해수 및 염화나트륨을 함유하지 않는 배지에서 효과적으로 오메가-3 불포화 지방산을 고농도로 생산할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 상기 오메가-3 불포화 지방산을 고농도로 생산할 수 있는 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하여, 오메가-3 불포화 지방산을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 쉬조키트리움 sp. RT0100P1(Schizochytrium sp. RT0100P1)(KCTC-10937BP) 또는 쉬조키트리움 sp. SEK-228(Schizochytrium sp. SEK-228)(KCTC-10938BP)이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 상기 균주를 배양하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 얻어진 균체(biomass) 또는 배양액으로부터 오메가-3 불포화 지방산을 추출하는 단계를 포함하는 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 쉬조키트리움 sp. RT0100P1(Schizochytrium sp. RT0100P1)(KCTC-10937BP) 또는 쉬조키트리움 sp. SEK-228(Schizochytrium sp. SEK-228)(KCTC-10938BP)이 제공된다.
본 발명자들은 다량의 해양미생물을 분리하여 생리학적 특성을 조사하였으며, 그 중 탄소원 농도가 높은 배지에서도 생육이 우수하고 도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산의 함량이 높은 균주를 일본 오키나와 이리오모테 섬(Iriomote island) 수중에서 분리하였다. 분리된 다수의 미생물들을 대상으로 생리적 특성들을 조사한 결과, 해수와 염화나트륨을 첨가하지 않은 인공 합성 배지 조건하에서 생육이 우수하였고, 오메가-3 불포화 지방산 중에서 특히 도코사헥사엔산 생산성이 높은 미생물 2종을 분리하였다.
상기 분리된 미생물 2종은 도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산을 생산할 수 있는 신규 쉬조키트리움(Schizochytrium)속 미생물로 크로미스타(Chromista) 계, 사제니타(Sagenista) 문, 라비린츄리아(Labyrintuhulea) 강, 라비린츄라레스(Labyrinthulales) 목, 트라오스토키트리아시아에(Thraustochytriaceae) 과에 속하는 것으로 판단되며, 과 이하의 분류는　Honda(Honda D, 海洋と生物, 132, 7-18(2001))가 제시한 균의 생리 형태학적 성질을 기본으로 분류하였다.
상기 분리한 미생물 2종은 단세포 진핵생물로 생리적으로 포자낭(zoosporangium)에서 형성된 유주자(zoospore)는 연속적인 이분열에 의해 영양세포를 형성하는 생활사를 특징으로 한다. 또한 광학현미경 관찰 결과, 형태학적으로 쉬조키트리움(Schizochytrium)속 균주의 특징을 보였다(도 1 및 도 2 참조).
본 발명자들은 상기 도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산 생산 능력을 갖는 미생물을 각각 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)로 명명하였다.
Honda 등(Honda D., T. Yokochi, T. Nakahara, S. Raghukumar, A. Nakagiri, K. Schaumann, and T. Higashihara, J. Eukaryot . Microbiol., 46, 637-647(1999))에 따르면, 18S rRNA 유전자 염기서열을 기초로 494-504 부위와 1712-1739 부위의 염기서열 차별성에 기인하여 분자계통학적으로 라비린츄라시아에(Labyrinthulaceae) 과와 트라우스토키트리아시아에(Thraustochytriaceae) 과를 분류하고 있다.
본 발명자들은 염기서열 분석을 위해 분리한 균주를 포도당 20 g/L, 펩톤 10 g/L, 효모엑기스 5 g/L, 인공해수 50%(시그마사의 sea salt 20 g/L) 배지에 접종하여 25 ℃에서 140 rpm으로 24시간 배양한 대수증식기의 균체를 회수하였으며, 프로메가(Promega)사 총 염색체 정제시스템을 이용하여, 총 DNA를 추출하였다. 취득된 DNA를 이용하여 18S rRNA를 하기 표 1의 프라이머(primer)를 이용하여 PCR 증폭하여, 다량의 DNA를 확보하였으며, 이를 정제하여 염기서열 분석하였다.
염기서열 분석에 이용한 프라이머
방향 서열
정방향 프라이머 1 5'-TACCTGGTTGATCCTGCCAG-3'
정방향 프라이머 2 5'-AAGTCTGGGGATCGAAGATG-3'
역방향 프라이머 1 5'-TGAACCCATCAGTGTAGCGC-3'
역방향 프라이머 2 5'-CCTTCCGCAGGTTCAACCTAC-3'
Honda 등(Honda D., T. et al., J. Eukaryot . Microbiol., 46, 637-647(1999))이 제시한 트라우스토키트리아시아에(Thraustochytriaceae) 과의 특정 염기서열인 TPG I 그룹 (Thraustochytrids phylogenetic group I : 494-504 부위)과 TPG II 그룹 (Thraustochytrids phylogenetic group II : 1712-1739 부위)의 염기서열을 비교한 결과는 하기 표 2 및 표 3과 같다.
TPG I그룹 (Thraustochytrids phylogenetic group I : 494-504) 비교
S. limacinum SR21 Schizochytrium sp . ATCC 20888 Schizochytrium sp . RT0100P1 Schizochytrium sp . SEK-228 CACT GTGGACTCCAC GAGGTAGTGA CAAT GTGGACTCCAC GAGGTAGTGA CAAT GTGGACTCCAC GAGGTAGTGA CAAT GTGGACTCCAC GAGGTAGTGA
TPG II그룹 (Thraustochytrids phylogenetic group II : 1712-1739) 비교
S. limacinum SR21 ATCC 20888 RT0100P1 SEK-228 GGGTT CATC GGGTT TTAATT----C-A-TTTTAT----GGAA--TTGAG TGCTTGGTC GGAA GGGTT CAGC GGGTT TTTGTT-----G--TGTTTT-----GCA-CAGCGT TGCTTTGTC GGAA GGGTT CAGC GGGTC TTTGTT-----G--TGTTT----ACTCA-CAGCGT TGCTTTGTC GGAA GGGTT CAGC GGGTG AATTAT-----GG-TCTTT-------GACTGTATT TGCTTTGTC GGAA
쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)의 경우 TPG I 그룹에서는 기 보고된 도코사헥사엔산 생산 균주인 쉬조키트리움 리마시눔 SR21(Schizochytrium limacinum SR21) 및 쉬조키트리움 sp . ATCC 20888(Schizochytrium sp . ATCC 20888)과 상동성을 보이고 있으나, TPG II 그룹에서는 균주간 차이점을 보이고 있다. 이를 기준으로 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)은 쉬조키트리움 리마시눔 SR21(Schizochytrium limacinum SR21) 및 쉬조키트리움 sp . ATCC 20888(Schizochytrium sp . ATCC 20888)과 다른 종으로 구분됨을 추정할 수 있다.
Huang 등(Huang J., T. Aki, T. Yokochi, T. Nakahara, D. Honda, S. Kawamoto, S. Shigeta, K. Ono, and O. Suzuki, Mar . Biotechnol. 5. 450-457(2003))에 따르면, 염기서열 분석 이외에 트라우스토키트리아시아에(Thraustochytriaceae) 과의 불포화 지방산(아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사펜타엔산, 및 도코사헥사엔산) 조성비에 따라서도 균 종의 분류가 가능하다. 본 발명자들은 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)의 불포화 지방산의 조성비를 분석하기 위해 오메가-3 고도불포화 지방산 생산배지인 OF-12배지에 배양한 뒤, 균체를 수집하여 지방산을 분석하였다.
상기 분석을 위한 종배지인 GPY배지 및 OF-12배지의 조성은 다음과 같다.
GPY배지 : 포도당 20 g/L, 펩톤 10 g/L, 효모엑기스 5 g/L, 인공해수 50%(시그마사의 sea salt 20 g/L).
OF-12배지 : 포도당 120 g/L, 글루타민산 나트륨 10 g/L, 황산암모늄 2 g/L, 염화칼륨 1 g/L, 황산마그네슘(MgSO4 7H2O) 10 g/L, 탄산수소나트륨 0.2 g/L, 인산이수소칼륨 5 g/L, 미량 성분Ⅰ 5 ml/L, 미량 성분Ⅱ 5 ml/L, 염화칼슘 3 g/L.
미량 성분Ⅰ : 염산티아민 200 mg/L, 바이오틴 0.5 mg/L, 비타민 B12 50 ㎍/L, 니코틴산 100 mg/L, 판토텐산칼슘 100 mg/L, 리보플라빈 5 mg/L, 염산피리독신 40 mg/L, 파라아미노벤조산 10 mg/L, 이노시톨 1000 mg/L, 오로트산 260 mg/L, 엽산 2.5 mg/L (pH 7.2).
미량 성분Ⅱ: 이디티에이 나트륨 6 g/L, 염화철(FeCl3 6H2O) 0.29 g/L, 붕산 6.84 g/L, 염화망간(MnCl2 4H2O) 0.86 g/L, 염화아연(ZnCl2) 0.06 g/L, 염화코발트(CoCl2 6H2O) 0.026 g/L, 황산동(CuSO4 5H2O) 0.002 g/L (pH 7.2).
상기 GPY배지 10ml을 100 ml 엘렌마이어 플라스크에 분주하여 균주를 접종하고 25 ℃에서 140 rpm으로 24시간 진탕배양하여 종균 배양액으로 하였다. OF-12 배지 30 ml을 300 ml 엘렌마이어 플라스크에 분주하고 미리 준비한 종균 배양액 0.6 ml을 접종하여 25 ℃에서 140 rpm으로 96시간 진탕 배양하였다.
상기와 같이 배양한 균체를 원심분리하여 수집하고 Folch용액(클로로포름 : 메탄올 = 2:1비율)으로 30 ℃에서 1시간 추출하여 Alltech사의 Meth-PrepⅡ로 메틸에스터화 시킨 뒤, HP사의 기체크로마토그래피(Medel 6890)를 이용하여 표준지방산과 머무름 시간이 동일한 피크의 면적비로 각 지방산의 성분비를 계산하였으며, 그 결과는 하기 표4와 같다.
균주별 고도불포화 지방산의 조성비
지방산 S. limacinum SR21 ATCC 20888 Schizochytrium sp. RT0100P1 Schizochytrium sp. SEK-228
ARA(C20:4) 1% 0% 1% 1%
EPA(C20:5) 1% 1% 2% 2%
DPA(C22:5) 18% 27% 29% 28%
DHA(C22:6) 80% 72% 68% 69%
본 발명자들이 분리한 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp. SEK-228)는 비교 균주인 쉬조키트리움 리마시늄 SR21(Schizochytrium limacinum SR21)과 비교하여 불포화 지방산 중 도코사헥사엔산의 비율은 10% 정도 낮지만 모유와 물개 등에 함유되어 있는 것으로 알려진 도코사펜타엔산의 비율이 10% 정도 높다. 또한 다른 비교 균주인 쉬조키트리움 sp . ATCC 20888(Schizochytrium sp. ATCC 20888)은 아라키돈산이 생산되지 않지만, 본 발명자들이 분리한 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)은 아라키돈산을 생산하는 것으로 나타나, 기 보고된 도코사헥사엔산 균주와 차별된 특징을 갖는다.
상기의 결과들을 근거로 본 발명자들은 새롭게 분리한 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)을 2006년 4월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 유전자은행(KCTC)에 기탁하였으며, 각각 KCTC 10937BP　및 KCTC　10938BP의 수탁번호를 부여받았다.
본 발명은 또한 (a) 쉬조키트리움 sp. RT0100P1(Schizochytrium sp. RT0100P1)(KCTC-10937BP) 또는 쉬조키트리움 sp. SEK-228(Schizochytrium sp. SEK-228)(KCTC-10938BP)을 배양하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 얻어진 균체(biomass) 또는 배양액으로부터 오메가-3 불포화 지방산을 추출하는 단계를 포함하는 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 균주를 배양하는 단계(단계 (a))는 탄소원 및 질소원을 포함하고 해수 및 염화나트륨을 포함하지 않는 배지에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 탄소원으로는 포도당, 과당, 갈락토스, 글루코스, 글리세롤, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 질소원으로는 글루타민산나트륨, 펩톤, 트립톤, 효모엑기스, 옥수수 침지액, 황산암모늄, 구연산 암모늄, 질산나트륨, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 탄소원은 총 배지 중에 2∼20 %(w/v), 바람직하게는 9∼15 %(w/v)의 농도로 함유될 수 있으며, 상기 질소원은 총 배지 중에 0.1∼5 %(w/v), 바람직하게는 1∼2.5 %(w/v)의 농도로 함유될 수 있다.
본 발명의 제조방법은 얻어진 균체(biomass) 또는 배양액으로부터 오메가-3 불포화 지방산을 추출하는 단계를 포함한다. 상기 추출용매로는 펜탄, 헥산, 헵탄, 사이클로 헥산, 톨루엔, 메틸렌 클로라이드, 메틸 아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 헥산을 사용할 수 있다.
상기 추출 단계는 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거하여 균체를 회수하고, 회수한 균체를 분무건조 등의 건조방법으로 수분함량을 약 5.0% 이하로 낮추는 것이 바람직하고, 필요할 경우 산패를 방지하기 위해 항산화제를 첨가할 수도 있다.　상기 추출용매의 사용량은 건조 균체 1 kg에 대하여 약 5 L의 비율로 사용하는 것이 바람직하다.
추출과정은 통상의 방법 즉, 상기 추출용매를 가하고 균질화한 뒤, 균체를 파쇄하여 오메가-3 불포화 지방산을 추출할 수 있다. 추출 후에는 원심분리하여 균체 파쇄물을 제거하고 추출용매는 감압증류 등의 방법으로 제거하면, 원유 상태의 오메가-3 불포화 지방산을 얻을 수 있다. 이때, 추출용매는 회수하여 재사용할 수 있다.
상기 본 발명의 제조방법은 통상의 정제공정을 포함할 수 있다. 즉, 공지의 방법(미국특허 제6,812,009호)에 따라 탈납(winterization) 공정을 수행함으로써 포화지방산을 제거하는 공정을 수행할 수 있으며, 또한, 공지의 방법(미국특허 제6,750,048호)에 따라 탈검, 중화, 탈색, 탈취 등의 유지 제조공정을 수행함으로써 인지질, 유리 지방산, 색소, 잔존하는 비누화 물질, 냄새를 유발하는 저분자 휘발성 물질 등을 제거할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 포도당 농도에 따른 영향
탄소원인 포도당 농도를 30 - 150 g/L로 달리하여 제조한 OF-12배지 30 ml을 300 ml 엘렌마이어 플라스크에 분주하고 미리 배양한 종균 배양액 0.6 ml을 접종하여 25 ℃에서 140 rpm으로 진탕배양하였다. 이때 포도당을 제외한 나머지 성분은 상기한 OF-12배지의 조성과 같다. 배양시간은 포도당 농도에 따라 72시간, 96시간, 120시간 동안 배양하였다. 배양 후 포도당 농도는 YSI Model 2700 SELECT(YSI사, USA)로 분석하였으며, 건조 균체량은 통상의 미생물 분석방법에 따라 배양액을 세척하여 105℃에서 건조한 후 무게를 측정하였다. 지방산 분석은 상기에 언급된 지방산 분석방법에 따라 실시하였다. 탄소원인 포도당 농도에 따른 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)의 생육 및 도코사헥사엔산 생산성은 하기 표 5와 같다.
포도당 농도에 따른 영향
균 주 포도당 농도(g/L) 배양 시간(hrs) 최종 pH 배양후 포도당 농도(g/L) 배양액당 DHA농도 (g/L) 건조 균체량 (g/L) 건조균체당 DHA 농도(%) Yp/s (%)*
Schizochytrium sp. RT0100P1 30 72 7.1 0.0 0.13 25.6 0.5 0.4
60 72 7.0 0.2 2.75 34.4 8.0 4.6
90 96 7.4 0.2 6.10 47.6 12.8 6.8
120 96 7.3 0.2 8.65 60.2 14.4 7.2
150 120 7.3 4.9 8.64 57.4 15.0 6.0
Schizochytrium sp. SEK-228 30 72 6.8 0.1 0.99 24.6 4.0 3.3
60 72 6.8 0.2 3.47 34.3 10.1 5.8
90 96 6.8 0.2 7.60 47.0 16.2 8.5
120 96 6.5 0.4 9.72 54.2 17.9 8.1
150 120 6.8 12.7 10.72 54.4 19.7 7.8
* Yp/s(%) : 소모한 포도당 농도에 대비 생산된 DHA 농도의 백분율
쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228) 두 균주 모두 포도당 120 g/L 농도까지 포도당 농도에 비례하여 건조 균체량이 증가하였으며, 특히, 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1)은 120 g/L의 포도당 농도에 비해 150 g/L의 포도당 농도에서 건조 균체량은 거의 증가하지 않았으나, 건조균체당 도코사헥사엔산 농도는 증가하는 특징을 보였다.
실시예 2. 글루타민산 나트륨 농도에 따른 영향
실시예 1과 동일한 OF-12배지(포도당 120 g/L) 중에서 황산암모늄을 제외시키고 글루타민산 나트륨의 농도를 달리하여 25 ℃에서 140 rpm으로 96시간 진탕배양하였다. 배양된 균체는 실시예 1과 동일하게 균체를 수집하여 건조 균체량 및 지방산을 분석하였다. 질소원인 글루타민산 나트륨 농도에 따른 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)의 생육 및 도코사헥사엔산 생산성은 하기 표 6과 같다.
글루타민산 나트륨 농도에 따른 영향
균 주 글루타민산 나트륨(g/L) 최종 pH 배양후 포도당 농도(g/L) 배양액당 DHA농도(g/L) 건조 균체량(g/L) 건조균체당 DHA 농도(%)
Schizochytrium sp. RT0100P1 5 6.4 75.0 3.24 22.7 14.3
10 7.8 33.6 5.41 37.4 14.5
15 8.3 0.1 7.12 58.5 12.2
25 8.5 0.1 6.92 60.2 11.5
Schizochytrium sp. SEK-228 5 6.1 74.0 3.36 24.8 13.5
10 7.8 34.1 5.57 37.7 14.8
15 8.1 5.0 7.34 54.8 13.4
25 8.6 0.1 7.46 55.4 13.5
질소원으로 공급된 글루타민산 나트륨의 농도가 15 g/L까지 증가함에 따라 건조 균체량이 증가하고 이에 따라 배양액당 도코사헥사엔산의 농도도 증가하였다. 글루타민산 나트륨의 농도가 25 g/L일 때는 공급된 질소원에 비해 탄소원이 부족하여 균체 생육 및 도코사헥사엔산의 생산이 공급된 질소원에 비례하여 증가하지 않은 것으로 생각된다.
실시예 3. 염화나트륨 농도에 따른 영향
실시예 1과 동일한 OF-12배지(포도당 120 g/L) 중에서 염화나트륨의 농도를 달리하여 25 ℃에서 140 rpm으로 96시간 진탕배양하였다. 배양된 균체는 실시예 1과 동일하게 균체를 수집하여 건조 균체량 및 지방산을 분석하였다. 염화나트륨 농도에 따른 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)의 생육 및 도코사헥사엔산 생산성은 하기 표 7과 같다.
염화나트륨 농도에 따른 영향
균 주 염화나트륨 농도(g/L) 최종 pH 배양후 포도당 농도(g/L) 배양액당 DHA농도(g/L) 건조 균체량(g/L) 건조균체당 DHA 농도(%)
Schizochytrium sp . RT0100P1 0 7.3 0.2 8.65 60.2 14.4
5 7.4 0.1 8.12 51.7 15.7
12.5 7.4 0.2 7.63 48.5 15.7
25 6.7 68.0 3.35 34.0 9.9
Schizochytriu m sp . SEK-228 0 6.5 0.4 9.72 54.2 17.9
5 7.0 8.0 7.91 47.6 16.6
12.5 7.0 11.3 7.50 46.1 16.3
25 6.8 48.0 4.92 38.9 12.7
상기 표7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1) 및 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)은 염화나트륨이 제외된 배지에서 생육이 가장 우수하였다. 해양미생물의 생육에 해수가 요구되며, 해수가 포함된 배지를 사용할 경우 성분의 제어가 어렵고 발효조의 부식을 초래한다는 어려움이 있음을 감안할 때, 본 발명에 따른 상기 신규 미생물은 해수와 염화나트륨이 제외된 배지에서 생육이 가장 우수하여 산업적인 이용이 기대된다.
실시예 4. 해수 및 염화나트륨이 첨가되지 않은 종배지의 확립
실시예 3의 결과를 바탕으로 해수와 염화나트륨을 첨가하지 않은 종배지로서, OF-2배지를 확립하였으며, 그 조성은 다음과 같다.
OF-2배지 : 포도당 20 g/L, 글루타민산 나트륨 10 g/L, 황산암모늄 2 g/L, 염화칼륨 1 g/L, 황산마그네슘(MgSO4 7H2O) 10 g/L, 탄산수소나트륨 0.2 g/L, 인산이수소칼륨 5 g/L, 미량 성분Ⅰ 5 ml/L, 미량 성분Ⅱ 5 ml/L, 염화칼슘 3 g/L (미량성분Ⅰ과 미량성분Ⅱ는 상기 OF-12배지와 동일하다).
해수가 첨가된 종배지인 GPY배지(glucose 20 g/L)와 해수 및 염화나트륨이 첨가되지 않은 종배지인 OF-2배지(glucose 20 g/L)에서 각각 배양한 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1)의 종배양액을 실시예 1과 동일한 OF-12 배지(glucose 120 g/L)에 접종하여 25 ℃에서 140 rpm으로 96시간 진탕배양하였다. 배양된 균체는 실시예 1과 동일하게 균체를 수집하여 건조 균체량 및 지방산을 분석하였다. 종배지에 따른 생육 및 도코사헥사엔산의 생산성은 하기 표 8과 같다.
해수 및 염화나트륨이 첨가되지 않은 종배지의 영향
종배지 생산배지 최종 pH 배양후 포도당 농도(g/L) 배양액당 DHA농도(g/L) 건조 균체량(g/L) 건조균체당 DHA 농도(%)
GPY 배지 OF-12배지 7.28 0.0 6.18 46.04 13.40
OF-2 배지 OF-12배지 6.90 0.0 6.42 46.71 13.70
상기 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1)은 해수 및 염화나트륨이 첨가되지 않은 종배지에서 종균을 배양하여 해수와 염화나트륨이 첨가되지 않은 생산 배지에서 배양하였을 때 생육과 도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산의 생산성이 우수하였다. 쉬조키트리움 sp . SEK-228(Schizochytrium sp . SEK-228)도 상기 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1)과 유사한 결과를 얻었다.
실시예 5. 5 L 발효조 배양
쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1)의 대량배양을 위해 5 L 발효조에서 실시예 1과 OF-12배지(포도당 60 g/L) 2.1 L를 이용하여 300 rpm, 28 ℃, 1.0 vvm의 조건으로 발효를 진행하였다. 배지 중 포도당이 10 g/L의 농도로 잔존되는 상태에서 포도당 농도가 360 g/L인 포도당액 300 ml을 5회 첨가하여 총 포도당 농도가 185 g/L가 되도록 하였다. 배양된 균체는 실시예 1과 동일하게 균체를 수집하여 건조 균체량 및 지방산을 분석하였으며, 그 결과는 표 9와 같다.
5 L 발효조 배양 결과
균주 Schizochytrium sp . RT0100P1
배양시간(hrs) 건조균체량(g/L) 배양액당 DHA농도 (g/L) 건조균체당 DHA 농도(%) 시간당 DHA 생산성(mg/L/hrs) 141 76.5 10.1 13.2 72
실시예 6. 오메가-3 불포화 지방산의 추출 및 정제
실시예 5와 동일한 방법으로 발효를 수행하였으며, 얻어진 발효액을 원심분리하고 분무건조하였다. 얻어진 건조 균체에 헥산을 가하고 균질화한 뒤, 균체를 파쇄하여 오메가-3 불포화 지방산을 추출할 수 있다. 헥산 사용량은 건조 균체 1 kg에 대하여 5 L의 비율로 사용하였으며, 추출 후에는 원심분리하여 균체 파쇄물을 제거하고 헥산은 감압증류로 제거하였다. 미국특허 제6,812,009 및 미국특허 제6,750,048호에 따라, 탈납 및 유지제조 공정을 수행하여, 오메가-3 불포화 지방산을 정제하였다.
본 발명에 따른 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 쉬조키트리움 sp. RT0100P1(Schizochytrium sp. RT0100P1)(KCTC-10937BP) 및 쉬조키트리움 sp. SEK-228(Schizochytrium sp. SEK-228)(KCTC-10938BP)은 해수와 염화나트륨이 제외된 인공합성배지에서 생육이 우수할 뿐만 아니라 도코사헥사엔산이 고농도로 포함된 오메가-3 불포화 지방산을 생산할 수 있다.

Claims (7)

  1. 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 쉬조키트리움 sp . RT0100P1(Schizochytrium sp . RT0100P1)(KCTC-10937BP).
  2. 오메가-3 불포화 지방산을 생산하는 쉬조키트리움 sp. SEK-228(Schizochytrium sp. SEK-228)(KCTC-10938BP).
  3. (a) 쉬조키트리움 sp. RT0100P1(Schizochytrium sp. RT0100P1)(KCTC-10937BP) 또는 쉬조키트리움 sp. SEK-228(Schizochytrium sp. SEK-228)(KCTC-10938BP)을 배양하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 얻어진 균체(biomass) 또는 배양액으로부터 오메가-3 불포화 지방산을 추출하는 단계
    를 포함하는 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단계 (a)가 탄소원 및 질소원을 포함하고 해수 및 염화나트륨을 포함하지 않는 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 탄소원이 포도당, 과당, 갈락토스, 글루코스, 글리세롤, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 질소원이 글루타민산 나트륨, 펩톤, 트립톤, 효모엑기스, 옥수수 침지액, 황산암모늄, 구연산암모늄, 질산나트륨, 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 탄소원이 총 배지에 대하여 2∼20 %(w/v)이고, 상기 질소원이 총 배지에 대하여 0.1∼5 %(w/v)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 단계 (b)의 추출용매가 펜탄, 헥산, 헵탄, 사이클로 헥산, 톨루엔, 메틸렌 클로라이드, 메틸 아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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