KR101540741B1

KR101540741B1 - 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산의 증진된 생산방법

Info

Publication number: KR101540741B1
Application number: KR1020130144395A
Authority: KR
Inventors: 문명희; 조예슬
Original assignee: 롯데케미칼 주식회사
Priority date: 2013-11-26
Filing date: 2013-11-26
Publication date: 2015-08-06
Also published as: KR20150060221A

Abstract

본 발명은 pH 7 내지 8의 배지에서 미세조류(microalgae)를 배양한 후, 상기 배지의 pH를 5.5 내지 6.5, 또는 8.5 내지 9.5로 조절하는 단계를 포함하는, 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA)의 생산방법에 관한 것이다.

Description

미세조류를 이용한 도코사헥사엔산의 증진된 생산방법{Methods for enhanced production of microalgal DHA}

오메가-3 불포화 지방산(ω-3 unsaturated fatty acid)은 오메가-3 고도 불포화 지방산(ω-3 highly unsaturated fatty acid)라고도 불리며, 대표적으로는 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid, EPA), 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA), 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic acid, DPA), 및 α-리놀렌산 등이 알려져 있다. 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산은 체내에서 합성되지 않는 필수 지방산의 일종으로서, 주로 식품을 통해서 섭취하여야 한다.

도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA)은 인간이나 동물의 망막, 정액 및 두뇌조직에 풍부하게 존재하며, 특히 두뇌 지방의 60%를 구성하고 있는 필수 지방산이다. 도코사헥사엔산은 아라키돈산(arachidonic acid, ARA)과 함께 유아의 두뇌, 눈, 신경체계의 건강한 발달을 위해 중요한 것으로 알려져 있다. 또한 최근에는 암부터 관절염에 걸친 수많은 질병과 심혈관 질환 및 정신적인 장애의 예방과 치료에 효과가 있음이 보고되고 있다(박덕천, 식품세계, 5, 87-93(2004)).

도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산의 주요 공급원은 청어, 연어, 다랑어 등의 생선에서 추출한 어유(漁油)이다. 그러나 지속적인 어유 공급의 어려움과 어유의 중금속 및 유기화학 물질에 의한 오염이 문제되어, 미생물 배양에 의한 도코사헥사엔산을 포함한 오메가-3 불포화 지방산의 제조방법에 대한 연구가 진행되고 있다.

미생물을 이용한 오메가-3 불포화 지방산 제조와 관련하여, 아세트산(Acetic acid)을 이용하여 배양 중 pH를 6.5로 유지하여 98시간 후 최대 3 g/L의 DHA를 생산한 것에 대해 C. Ratledge 등 (C. Ratledge et al., Lipids (2001) 36(11):1241-1246)에 의해 개시된 바 있으며, E. Ganuza 등은 배양 중 pH를 7로 유지하여 DHA를 생산하는 미세조류의 균체 농도를 높이는 것에 대한 개시를 한 바 있으나, DHA 축적량 증가에 대한 개시는 나타나있지 않다(E. Ganuza et al., Biotechnol Lett (2008) 30:1559-1564). 또한, 한국공개특허 제2013-0041366호는 고농도 DHA를 얻기 위해 염소, 칼륨의 농도를 조절해야 하며, 낮은 pH에서의 생산하는 방법에 대한 개시가 있으나, 생산 속도가 지연되는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산의 생산을 증대시킬 수 있는 방법에 대해 연구를 지속한 결과, 미세조류 배양 배지 내 pH를 조절하여 도코사헥사엔산의 생산량을 증가시킬 수 있는 방법을 개발하였다.

본 발명의 목적은 pH 7 내지 8의 배지에서 미세조류를 배양하는 단계; 및

상기 배지의 pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 단계를 포함하는, 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA)의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 pH 7 내지 8의 배지에서 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 배지의 pH를 8.5 내지 9.5로 조절하는 단계를 포함하는, 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA)의 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 pH 7 내지 8의 배지에서 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 배지의 pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 단계를 포함하는, 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA)의 생산방법에 관한 것이다.

상기 배지의 pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 단계에 있어서, pH가 5.5 미만으로 조절되는 경우, 균체의 성장이 저해되어 도코사헥사엔산의 생산량이 감소되는 문제점이 있을 수 있고, pH가 6.5 초과로 조절되는 경우 스트레스 효과가 낮아 도코사헥사엔산의 생산량이 감소될 수 있는 문제점이 있을 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 pH 7 내지 8의 배지에서 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 배지의 pH를 8.5 내지 9.5로 조절하는 단계를 포함하는, 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA)의 생산방법에 관한 것이다.

상기 배지의 pH를 8.5 내지 9.5로 조절하는 단계에 있어서, pH가 8.5 미만으로 조절되는 경우, 스트레스 효과가 낮아 도코사헥사엔산의 생산량이 감소되는 문제점이 있을 수 있고, pH가 9.5 초과로 조절되는 경우 균체의 성장이 저해되어 도코사헥사엔산의 생산량이 감소되는 문제점이 있을 수 있다.

바람직하게, 상기 pH 7 내지 8의 배지에서 미세조류를 40시간 이상 50시간 이하 동안 배양하는 것일 수 있다. 미세조류를 40시간 미만 배양하는 경우, 균체 성장이 저해되는 문제점이 있을 수 있고, 50 시간을 초과하여 배양하는 경우, 도코사헥사엔산 생산량이 증가되는 효과가 낮아지는 문제점이 있을 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예는 상기 제2단계 배양 후, DHA를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.

보다 상세하게, 미세조류는 원심분리, 응집 또는 여과와 같이 당업계의 기술자에게 알려진 통상적인 수단으로 회수할 수 있으며 또한 곧바로 가공 처리하거나 또는 추가의 가공을 위해 건조할 수 있다. 각각의 경우에 지질을 추출할 수 있다. 여기서 사용되는 용어 '지질' 은 인지질, 유리 지방산, 지방산 에스테르, 트리아실글리세롤, 디아실글리세라이드, 모노아실글리세라이드, 리소포스포리피드, 비누, 포스파타이드, 스테롤 및 스테롤 에스테르, 카로테노이드, 크산토필 (예, 옥시카로테노이드), 탄화수소, 및 기타 당업자에게 알려진 지질을 포함한다.

당업자에게 잘 이해되는 바와 같이, 본 발명에서 언급된 DHA는 이들 다양한 지질 형태일 수 있으며, 또한 유리 지방산으로 제한되지 않는다. 상이한 유형의 지질성분은 사용되는 추출기술에 따라 추출할 수 있다. 지질은 유효한 양의 용매로 추출할 수 있다. 적절한 용매는 당업자들에 의해 결정할 수 있다. 극성 지질 (예, 인지질)은 일반적으로 극성 용매 (예, 클로로포름/메탄올)로 추출하며 또한 중성지질 (예, 트리글리세롤)은 일반적으로 비극성 용매 (예, 헥산)으로 추출할 수 있다. 바람직한 용매는 순수 헥산일 수 있다. 헥산 대 건조 바이오매스의 적절한 비는 건조 바이오매스의 킬로그램당 약 4 리터의 헥산을 예시할 수 있다. 헥산은 바람직하게 약 50℃의 온도에서 약 2시간 동안 교반 반응용기 중에 바이오매스와 함께 혼합할 수 있다. 혼합 후, 바이오매스는 여과하며 오일을 함유하는 헥산으로부터 분리하고, 헥산은 당업자들에게 공지된 증류기술에 의해 오일로부터 제거할 수 있다. 통상적인 지유종자 가공처리 장치는 여과, 분리 및 증류를 수행하는데 적합할 수 있다. 당업자들에게 공지된 추가적인 가공처리 단계는 특별한 적용에 필요하거나 적합한 경우 수행할 수 있다.

본 발명에서, '미세조류(microalgae)'란 광합성 색소를 가지고 광합성을 하는 단세포 생물들에 대한 통칭으로서, 담수 또는 해수에 서식하며 엽록소를 가지고 광합성을 하며, 고도불포화지방산을 생산하기도 한다. 상기 고도불포화지방산으로서, 대표적으로는 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 에이코사펜타엔산(Eicosapentaenoic acid, EPA), 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA), 도코사펜타엔산(Docosapentaenoic acid, DPA) 및 α-리놀렌산 등이 있다.

상기 미세조류는 통상적으로 DHA를 함유하는 미세조류를 모두 포함하며, 바람직하게는 치조키트리움(Schizochytrium)속, 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales)속, 울케니아(Ulkenia)속, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)속, 자포노키트리움(Japonochytrium)속, 크립테코디니움(Crypthecodinium)속, 할리프토로스(Haliphthoros)속, 클라미도모나스(Chlamydomonas)속, 오란쇼키트리움(Aurantiochytrium)속 및 포르피리디움(Porphyridium)속으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. DHA 생산을 극대화하기 위해 바람직하게는 상기 미세조류는 치조키트리움(Schizochytrium)속일 수 있으며, 가장 바람직하게는 Schizochytrium limacinum SR21 (ATCC MYA-1381) 일 수 있다.

본 발명의 미세조류를 배양하기 위한 배지의 성분들은 상업적으로 실시 가능한 수준으로 DHA의 성장 및 생산을 촉진하는 것으로 알려진 성분을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로 탄소 공급원, 예를 들어 글루코오스, 다양한 전분, 당밀, 및 분쇄 옥수수 등이 사용될 수 있다. 친화성 유기 또는 무기 질소 공급원이 또한 배양 배지에 포함된다. 상기 질소 공급원은 질산염, 우레아, 암모늄염, 및 아미노산 등을 포함할 수 있다. 친화성 인의 공급원(source of assimilable phosphorous)이 또한 제공될 수 있다. 배지는 또한 단세포 미생물의 종속영양생물 성장을 증진시키는 화합물들인 미생물 성장인자의 공급원을 함유할 수 있으며, 또한 효모 또는 미생물의 추출물, 및 토양 추출물 등을 포함할 수 있다. 일례로 상기 배지는 탄소원으로서 글루코스(glucose) 60 내지 100 g/L 및 질소원으로서 CSL(corn steep liquor) 10 내지 50 g/L를 포함할 수 있다.

또한 상기 배양방법의 다른 최적조건은 당업자들에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 요컨대, 배양은 적절한 발효기, 바람직하게 교반 탱크 발효기 또는 에어 리프트 발효기에서 수행할 수 있으며, 이는 미세조류에 산소 공급원을 제공한다. 미세조류의 교반은 용해된 산소농도가 배양물의 성장 및 DHA의 생산을 지지하는데 충분하면서, 교반이 미세조류를 절단 또는 그렇지 않으면 손상시키지 않는 수준에서 유지시켜야 한다. 바람직한 수준의 용해 산소는 포화 농도의 적어도 10%이다. 더욱 바람직하게, 용해산소의 농도는 약 10% 내지 약 50%의 공기 포화 농도로 유지된다.

상기 미세조류의 배양은 특정한 생명 지속 온도에서 수행할 수 있다. 일반적으로 미세조류는 약 15℃내지 약 34℃의 온도에서 성장한다. 바람직하게 온도는 약 20℃ 내지 약 28℃에서 유지될 수 있다.

보다 바람직하게 상기 미세조류는 포도당, 효모추출물 및 해수염을 포함하는 배지에서 전배양 될 수 있다. 상기 전배양은 본배양 전 미세조류의 활성화를 위한 것으로서, 당업자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 전배양의 배지 조성은 상기에 제한되는 것은 아니며, 미세조류를 배양할 수 있는 배지로서 적절한 탄소원 및 질소원을 포함하는 것이면 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 미세조류의 배양 방법은 기존 공정과 달리 산 또는 염기를 첨가하여 pH를 변화시키는 간단한 방법으로 배양함으로써 DHA 생산성을 늘리며, 경제성 있는 미세조류 DHA의 생산을 가능하게 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오란쇼키트리움 속 균주의 산성 pH 스트레스 적용 배양

미세조류 Aurantiochytrium limacinum SR21 (ATCC MYA-1381) 균주를 배양하였다. 6~7 g/L 농도의 균주 stock을 전배양 배지 (포도당 30 g/L, 효모추출물 20 g/L, 해수염 27 g/L) 50 ml에 10 v/v% 접종하여 25℃, 교반속도 250 rpm 에서 2일간 진탕 배양 하였다. 본배양 배지 (포도당 60 g/L, 글루타민산 나트륨 10 g/L, 옥수수 침지 고형분 10 g/L, 해수염 20 g/L) 500 ml의 초기 pH를 4N 수산화칼륨 용액을 이용하여 7로 조절한 후 1 L 발효조에 넣고 전배양액 50 ml을 접종하여 25℃, 교반속도 350 rpm, 0.5 vvm의 조건으로 배양 하였다. 접종 42시간 후 2N 황산 용액을 pH 6이 되도록 첨가한 후 지속 배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 상등액을 제거하고 회수한 균체를 건조하여 무게를 측정하였다. 또한 식품의약품안전처에서 기준으로 삼고 있는 지방산 함유 유지 시험법을 이용, 0.5N 메탄올성수산화나트륨과 14% 트리플루오르보란메탄올을 이용하여 메틸에스터화 시킴으로써 상기 균체로부터 DHA를 회수하였고, 지방산을 메틸에스터화 시킨 시료를 가스 크로마토그래피(사용모델명: Agilent 7890A, 사용 컬럼: DB-23)로 분석, 이를 통해 측정한 내부표준물질의 피크 면적과 DHA의 피크 면적을 비교하여 정량함으로써(DHA의 질량은 GC분석 시 내부표준물질의 피크 면적과 DHA의 피크 면적을 비교하여 정량함) DHA 함량을 측정하였다.

실시예 2. 오란쇼키트리움 속 균주의 염기성 pH 스트레스 적용 배양

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 전배양 한 후, 본배양 배지 (포도당 60 g/L, 글루타민산 나트륨 10 g/L, 옥수수 침지 고형분 10 g/L, 해수염 20 g/L) 500 ml의 초기 pH를 4N 수산화칼륨 용액을 이용하여 7로 조절한 후 1 L 발효조에 넣고 전배양액 50 ml을 접종하여 25℃, 교반속도 350 rpm, 0.5 vvm의 조건으로 배양하였다. 본배양 접종 42시간 후 2N 수산화칼륨 용액을 pH 9가 되도록 첨가한 것 이외에는 상기 실시예1과 동일한 방법으로 배양 및 측정을 수행하였다.

비교예 .

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 전배양 한 후, 본배양 배지 (포도당 60 g/L, 글루타민산 나트륨 10 g/L, 옥수수 침지 고형분 10 g/L, 해수염 20 g/L) 500 ml의 초기 pH를 4N 수산화칼륨 용액을 이용하여 7로 조절한 후 1 L 발효조에 넣고 전배양액 50 ml을 접종하여 25℃, 교반속도 350 rpm, 0.5 vvm의 조건으로 배양하였다. 상기 본 배양액의 pH를 7 내지 7.5로 유지하여 상기 실시예1과 동일한 방법으로 배양 및 측정을 수행하였다.

상기 실시예 1, 2 및 비교예의 결과를 표 1에 나타내었다.

구분	균체농도 (g/L)	균체당 DHA 함량 (%)	DHA 생산 농도 (g/L)
실시예1	22.1	7.00	1.55
실시예2	20.3	5.82	1.18
비교예	16.9	5.39	0.91

상기 표 1에 나타난 바와 같이 배양 중 인위적으로 pH를 낮추거나 높여 스트레스를 준 경우 균체농도 및 DHA 함량이 모두 증대되어 결과적으로 pH를 중성으로 유지한 비교예 대비 DHA 생산 농도가 1.3 내지 1.7배 높은 것을 확인하였다.

Claims

pH 7 내지 8의 배지에서 40시간 내지 50시간 동안 미세조류(microalgae)를 배양하는 단계; 및
상기 배지의 pH를 5.5 내지 6.5로 조절하는 단계를 포함하는,
미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA)의 생산방법.
pH 7 내지 8의 배지에서 40시간 내지 50시간 동안 미세조류를 배양하는 단계; 및
상기 배지의 pH를 8.5 내지 9.5로 조절하는 단계를 포함하는,
미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA)의 생산방법.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 미세조류를 배양한 배양물로부터 DHA를 회수하는 단계를 더 포함하는 생산방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 미세조류는 치조키트리움(Schizochytrium)속, 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales)속, 울케니아(Ulkenia)속, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)속, 자포노키트리움(Japonochytrium)속, 크립테코디니움(Crypthecodinium)속, 할리프토로스(Haliphthoros)속, 클라미도모나스(Chlamydomonas)속, 오란쇼키트리움(Aurantiochytrium)속 및 포르피리디움(Porphyridium)속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 생산방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 배지는 탄소원 또는 질소원을 포함하는 것인 생산방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미세조류는 포도당, 효모추출물 및 해수염을 포함하는 배지에서 전배양된 것인 생산방법.