CN104394702B - 用于不断富集由微藻产生的、具有dha乙酯的一种油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于制备由发酵微生物产生的、富含DHA乙酯的油的方法,其特征在于所述方法包括通过所谓的“短路径”分子蒸馏进行的纯化步骤。
Description
本发明涉及一种连续方法,该方法使得在工业上能够获得一种油,该油富含来自微藻的一种天然脂肪酸:二十二碳六烯酸或DHA的乙酯。
更具体地,本发明涉及从一种微藻衍生的油生产富含DHA乙酯的一种油,该微藻衍生的油最初:
-中等富含DHA并且
-包含大量的不可皂化的、基本由角鲨烯组成的化合物。
为了本发明的目的,术语“微藻衍生的油”旨在意指从破囊壶菌目(Thraustochytriales sp.)家族的微藻提取的油。
为了本发明的目的,术语“破囊壶菌目家族的微藻”旨在意指属于裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)、橙黃壶菌属(Aurantiochytrium sp.)和破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)物种的微藻。
为了本发明的目的,术语“中等富含DHA的油”旨在意指包含按总脂肪酸的质量计30%至45%的DHA的一种油(为了简化,使用了术语总脂肪酸的“重量”)。
为了本发明的目的,表述“包含大量的不可皂化的、基本由角鲨烯组成的化合物的油”同样旨在意指包含按不可皂化的化合物的重量计约10%至30%、包括15%至25%的角鲨烯的一种油。
最后,表述“使一种油富含衍生自微藻的DHA乙酯”旨在意指一种方法,该方法使得能够将该油的DHA含量增加到1.5至2倍,在这种情况下从最初的按总脂肪酸的重量计30%和45%之间的DHA含量到具有按总脂肪酸的重量计60%和70%之间的DHA的DHA乙酯含量的一种油。
脂质与蛋白质和碳水化合物一起构成了大量营养元素的三个主要家族。
在脂质中,甘油三酸酯和磷脂是特别突出的。
甘油三酸酯代表大约95%的摄取的食物脂质。在生物中,它们主要存在于脂肪组织并构成能量存储的主要形式。
磷脂是结构性脂质,因为他们是细胞膜的组分,在细胞膜中它们尤其提供流动性。
甘油三酸酯和磷脂主要由脂肪酸组成,它们都是由饮食提供,对于它们中的一些,是由生物合成的。
“必需”多不饱和脂肪酸的饮食来源是植物油(即ω6和ω9脂肪酸)以及特别包含大量ω3脂肪酸的鱼油。
多不饱和脂肪酸是根据第一双键的位置(从最终甲基官能开始)归类的。
因此,在命名中对于ω“x”或“nx”,“x”对应于第一不饱和的位置。
生物学上感兴趣的多不饱和脂肪酸的大部分属于ω6(花生四烯酸或ARA)或ω3(二十碳五烯酸或EPA,二十二碳六烯酸或DHA)家族。
此外,在命名中,构成该链的碳的数目也被定义:从而EPA被描述为C20:5并且DHA被描述为C22:6。
该“5”和“6”从而对应于该碳链的不饱和数目,该碳链分别由EPA和DHA呈现。
ω3脂肪酸家族的DHA是生物可以从α-亚麻酸合成的或通过消耗脂质鱼(金枪鱼、鲑鱼、鲱鱼等)提供的一种脂肪酸。
DHA在膜结构中以及在脑和视网膜发育和功能中发挥重要作用。
鱼油主要用作ω3型脂肪酸例如DHA和EPA的来源,但DHA和EPA也在微藻的油(从其中它们是作为一种混合物或分开地提取的)中看到,如在这种情况下,例如该油衍生自某些选择的菌株,例如裂殖壶菌属的那些,其仅包含痕量的EPA,但包含高DHA含量。
用于使鱼油富含DHA和/或EPA的常规方法基于针对该油的长链的组分脂肪酸或其饱和度的选择性。
第一必要的是分离连接到甘油酯骨架的脂肪酸,为了能够随后分离DHA和/或EPA链。
从该甘油链分离这些脂肪酸的操作是通过乙醇转酯(乙醇分解)进行的。
最常见地随后使用的针对这样的脂肪酸或其酯实施的富集方法是:
-结晶、
-逆流萃取、
-分子蒸馏、或
-制备型层析。
通常,为了获得有力的富集,会将各种方法进行组合。
然而,这些方法具有以下缺点:
-高温富集方法引起脂肪酸的热降解(异构化、过氧化、低聚化)。
-层析技术的缺点是保留大量常常是有毒的溶剂的使用。
此外,使用这些技术的大规模生产常常极不易。
因为这些原因,已经开发和研究了替代方法,所述方法基于使用超临界流体,特别是通过用超临界CO2进行的分级方法。
在使用超临界CO2使鱼油富含DHA和/或EPA之前使用的一个步骤是使用甲醇或乙醇对这些脂肪酸进行转酯。
使用超临界CO2将脂肪酸的乙酯分级的方法已经例如在文献中充分地描述。
然而,应注意大部分引用的方法尤其描述了联合富集EPA和DHA乙酯,而不仅是DHA。
此外,这些方法的绝大多数:
-是分批方法,
-过度地使用大量的超临界流体,
-具有低产率,
-并且最后具有低生产力。
此外,在许多情况下,柱中应用的100℃温度可引起脂肪酸降解。
应用的压力也太强,并且降低它们直接导致超临界CO2的消耗增加。
换句话说,这些方法在经济上可行的条件下不可用于工业规模。
一种用于使鱼油富含EPA和DHA乙酯的方法是例如描述于专利申请JP 2005-255971。
温度与压力范围分别是从35℃至200℃和从100×105Pa至500×105Pa。
作者建议为了获得高含量进行两次连续提取。
第一次提取是在原料上进行,并且第二次提取在来自第一次操作的残余物上进行。
使用的柱是3m高,直径是50mm。它包括6个不同的加热室。
用于获得高DHA百分比的、定义为超临界CO2的流速与所处理的油的流速的比率的溶剂水平保持高水平。
这两次连续提取液使该方法复杂并使它不可在工业上应用。
似乎,在阅读这些元素时,使用超临界流体使油富集脂肪酸的技术是优选的选择,但仍需要优化研究。
如上所述,ω3脂肪酸的另一个来源是微藻。
然而,在来自微藻的油的领域中该情况更加复杂,因为存在另外的困难,这与来自微藻的油中不可皂化的化合物的存在有关。
因此,尽管通常在鱼油上进行的转酯操作不构成任何重大技术问题,对于来自微藻的油这变得有问题,因为大规模的粗制油转酯从实用的观点上看实际上是不可能的。
这种技术不可能性和可变(但通常是高的)含量的不可皂化的化合物(例如角鲨烯)的存在有关。
因此,显著损失可利用化合物受到批判。
角鲨烯是在医药、美容和饮食上感兴趣的一种多不饱和的烃,特别存在于来自微藻的油中。
其中发现按某些选择的菌株(例如裂殖壶菌属的那些)的质量计的超过15%的可变含量(时常是高的)。
在现有技术中,已知如果目的是从该油中提取该角鲨烯并且随后生产仅包含痕量的角鲨烯的一种油的话,角鲨烯可从脂质(基本上由甘油三酸酯组成)例如通过分子蒸馏而花费几个连续步骤获得。
因为所有来自微藻的油的组分对热特别敏感,这种方法常规地必须在非常强的真空下进行,考虑到其非常低的生产力,需要配备非常大的容积。
因此,可建议提出其他方法:
-更高效的(如果希望的是使用分子蒸馏而不是常规实施的操作的话)的方法,或
-在中等温度下操作并确保保护对氧化非常不稳定的不饱和的产物和空气没有任何接触,而同时可以容易地工业化直到每年加工成百上吨所处理的油的能力。
就本申请人公司的知识所及,目前对于本领域的普通技术人员来说没有可得的用于使用微藻通过分子蒸馏技术使油富集DHA乙酯的高效和可工业化的方法。
关于开发用于富集由微藻产生的DHA的高效方法,本申请人公司已经开发了它自身的研究并已成功改进分子蒸馏技术以确保富集超过两倍的初始油的含量的DHA。
本发明因此涉及一种用于制备富含由发酵微生物产生的DHA乙酯的油的方法,其特征在于它包括通过“短路径”分子蒸馏进行的纯化步骤。
这些微生物优先地是属于破囊壶菌目家族的微藻,甚至更优先地是属于裂殖壶菌属、橙黃壶菌属和破囊壶菌属物种的微藻。
分子蒸馏的实施
在根据本发明的用于制备富含DHA乙酯的油的方法中,实施了一种方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:
1)通过发酵破囊壶菌目家族的微藻制备包含以下物质的混合物的粗制油:富含DHA的甘油三酸酯和基本上由角鲨烯组成的不可皂化的化合物,
2)任选地通过脱胶、脱酸、褪色和脱臭的一系列步骤,精炼所得到的粗制油,
3)通过“短路径”分子蒸馏提取该角鲨烯,以获得不含角鲨烯的提余液,
4)在碱性或酶催化剂、优选酶催化剂的存在下通过醇转酯将所得到的提余液进行转酯,
5)通过“短路径”分子蒸馏将步骤4)中的脂肪酸酯的混合物进行分级,以获得富含短链脂肪酸酯的提取物以及极富含长链脂肪酸酯的提余液,
6)通过“短路径”分子蒸馏将步骤5)中获得的长链脂肪酸酯的混合物进行纯化,以获得极富含长链酯的不含杂质的提取物,
7)任选地,通过褪色和脱臭的一系列步骤,精炼极富含长链酯级分的该提取物,
8)收集所得到的富含DHA乙酯的化合物。
根据本发明的这种方法的第一步在于通过发酵破囊壶菌目家族的微藻制备包含以下物质的混合物的粗制油:富含DHA的甘油三酸酯和基本上由角鲨烯组成的不可皂化的化合物。
作为属于破囊壶菌目家族的微藻,例如以下菌株是可商购的:
-裂殖壶菌,参考号为ATCC 20888,
-橙黃壶菌,参考号ATCC PRA 276,
此外,本申请人公司还拥有自己生产的菌株,裂殖壶菌,于2011年4月14日保藏在法国巴斯德研究所的国家微生物保藏中心[Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes],保藏号为CNCMI-4469,并且还保藏在中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心,中国武汉,430072,保藏号为M 209118。
该培养在异养条件下进行。总的来讲,该培养步骤包括预培养步骤(为了使该菌株复苏),并且然后是实际培养或发酵步骤。后一步骤对应于生产感兴趣的脂类化合物的步骤。
用于培养这些微藻的条件在本领域是熟知的。然后处理该生物质以获得包含DHA和基本上由角鲨烯组成的不可皂化的化合物的混合物的粗制油。
此外,这些处理可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行。
这使得能够获得由甘油酯(主要是甘油三酸酯)和不可皂化的化合物(主要是角鲨烯)和任选的较低比例的游离脂肪酸和磷脂组成的粗制油。如将在后文示例的,可从上述的CNCM I-4469菌株容易地获得按总脂肪酸的重量计30%和45%之间的DHA和按重量计10%和30%之间的不可皂化的化合物(包括15%至25%角鲨烯)的含量。
根据本发明的这种方法的第二步在于任选地通过脱胶、脱酸、褪色和脱臭的一系列步骤,精炼所得到的粗制油。
因此,在提取角鲨烯之前,事先将富含角鲨烯的粗制油经历粗精炼。
可设想以下步骤中的一个或多个:
-脱胶:在酸性介质中通过沉淀去除磷脂,
-脱酸:使用碱中和这些游离脂肪酸。为了避免夹带角鲨烯,似乎应禁用用于去除该游离脂肪酸的分子蒸馏的使用,
-褪色:通过用活性炭处理,
-脱臭(真空蒸馏、汽提等)。
这些精炼步骤是在植物油的精炼中专业人士常用的步骤。
根据本发明的这种方法的第三步在于通过“短路径”分子蒸馏提取该角鲨烯,以获得不含角鲨烯的提余液。
该粗制的(或部分纯化的)油的角鲨烯是通过分子蒸馏提取的。
对于少于0.1毫巴的真空,该角鲨烯的沸点是大约200℃。
这种高真空使得能够限制该温度并且因此限制该角鲨烯以及这些多不饱和脂肪酸的降解/聚合风险。
该申请人公司已发现,重要的是在该设备上将滞留时间调节到少于1分钟的非常短的时间。在本申请中,通常优选理解的是,“短路径”意指少于1分钟的接触时间。
从而从氮惰性进料池中,通过用恒温器控制的在从25℃到150℃范围中的一个第一回路将该油泵到排气器(去除水和溶剂的痕迹)。
在排气器出口,将该油泵入(“短路径”)蒸发室以通向用恒温器控制的在从50℃到150℃、优选从100℃到140℃、特别是大约120℃的温度范围中的一个回路。
在从150℃到250℃、优选从200℃到240℃、特别是大约220℃的范围中调节该蒸发器的温度。
在从0到50℃、优选10℃和30℃之间、特别是大约20℃的温度范围中调节该冷凝器。
将该蒸发室中的压力调节到少于10-2毫巴、优选少于10-3毫巴的高真空。
通过这些收集回路将主要包含角鲨烯的蒸馏物和主要包含甘油三酸酯的残余物运送到惰性的储存槽中。
该提余液中的角鲨烯含量少于5%,优选少于2%。
去除角鲨烯使得能够获得感兴趣的纯化的级分(富含DHA的甘油三酸酯)(提余液),然后其可进入用于富集处于乙酯形式的DHA的操作的链中。
该提余液具有包含按重量计的大约40%的DHA的氨基酸谱。
根据本发明的这种方法的第四步在于在碱性或酶催化剂、优选酶催化剂的存在下通过醇转酯将所得到的提余液进行转酯。
为了能够富集DHA,必要的是分离连接到甘油酯骨架的脂肪酸,为了能够随后分离DHA链。
从该甘油链分离这些脂肪酸的操作是优先通过酶促乙醇转酯(乙醇分解)进行的。
该转化伴随着甘油的释放。
酶促乙醇分解是用来自诺维信公司的商业酶N 435(南极假丝酵母(Candidaantartica))在50℃以化学计量比例的乙醇分批操作进行的。
在这些条件下,在大约8h的反应中获得大于90%的转化度。
在反应结束时,这些脂肪酸主要分布在转化为乙酯(超过90%)的级分中,剩下的保持残余的甘油酯(单-二-三甘油酸酯)的形式。
在进行乙酯的分级之前,使在酶转化结束时的反应混合物经历过滤步骤,以提取该酶。
通过沉析或离心分离该甘油。还可将该混合物用水洗涤,以去除残余的甘油。
如果乙醇的残余浓度高,可在真空下通过蒸发去除后者。
根据本发明的这种方法的第五步在于通过“短路径”分子蒸馏将步骤4)中获得的脂肪酸酯的混合物进行分级,以获得富含短链脂肪酸酯的提取物以及极富含长链脂肪酸酯的提余液。
如步骤4中所述获得的乙酯的混合物具有对应于起始的油并且因此除了感兴趣的DHA之外还包括脂肪酸的脂肪酸谱。
该分级操作的目标是去除具有短于(<C 22)DHA的链的最大量的脂肪酸。
用来进行这一操作的蒸馏技术利用了这些乙酯的挥发性上的不同(这取决于它们的分子量以及它们的脂肪链的长度)。
如以上解释的,高真空以及还有该技术的非常短的滞留时间(少于一分钟)使得能够限制该温度并且因此限制这些多不饱和脂肪酸的降解/聚合风险。
对于少于0.1毫巴的真空,这些乙酯的沸点通常在250℃以下的温度范围内。
该操作实际上以两步进行:
-分子蒸馏的第一步是照这样的分级,目标是分离该“短链”乙酯级分,以相对于多不饱和脂肪酸浓缩该残余物,
-第二步代替地是纯化步骤,在此意义上,相对于多不饱和脂肪酸浓缩的乙酯是从重杂质(残余的甘油酯、甾醇、颜料、不可皂化的化合物等)分离的。
从氮惰性进料池中,通过用恒温器控制的在从25℃到100℃、例如从70℃到100℃、特别地大约100℃范围中的一个第一回路将从该乙醇分解中得到的混合物送到排气器(去除乙醇的痕迹)。
在排气器出口,通过用恒温器控制的在从50℃到100℃、例如从70℃到90℃、特别是大约85℃的温度范围中的一个回路将该油泵入(“短路径”)蒸发室。
将该蒸发室中的压力调节到少于10-2毫巴、优选少于10-3毫巴的高真空。
在从0到50℃、优选10℃和30℃之间、特别是大约20℃的温度范围中调节该冷凝器。
在从100℃到200℃、优选100℃和150℃之间、特别是大约110℃的范围中调节该蒸发器的温度。
调节该温度以获得一种提余液/馏出物,重量比率对应于理论预测,允许优化多不饱和脂肪酸纯度和产率的分离。
通过这些收集回路将主要包含“短链”乙酯的馏出物和主要包含“长链”乙酯的提余液以及还有杂质运送到惰性的储存槽中。
该提余液中的DHA乙酯含量(重量百分比)是大于45%,优选大于50%。
该馏出物中的DHA含量少于20%,优选少于10%。
根据本发明的这种方法的第六步在于通过“短路径”分子蒸馏将步骤5)中获得的长链脂肪酸酯的混合物进行纯化,以获得极富含长链酯的不含杂质的提取物。
从氮惰性进料池中,通过用恒温器控制的在从25℃到100℃、优选从70℃到100℃、特别地大约100℃范围中的一个第一回路将在步骤5)结束时获得的提余液送到排气器。
在排气器出口,通过用恒温器控制的在从50℃到150℃、例如从70℃到90℃、特别是大约85℃的温度范围中的一个回路将该油泵入(“短路径”)蒸发室。
将该蒸发室中的压力调节到少于10-2毫巴、优选少于10-3毫巴的高真空。
在从0到50℃、优选10℃和30℃之间、特别是大约20℃的温度范围中调节该冷凝器。
在从100℃到250℃、优选180℃和220℃之间、特别是大约200℃的范围中调节该蒸发器的温度。调节该温度以获得一种残余物/馏出物,重量比率对应于理论预测,允许高效分离杂质。
通过这些收集回路将主要包含纯化的“长链”乙酯的馏出物和包含杂质的残余物运送到惰性的储存槽中。
该馏出物中的DHA乙酯含量(重量百分比)是大于50%,优选大于55%。
该残余物中的DHA含量少于30%,优选少于20%。从而该残余物浓缩了这些杂质(不可皂化的化合物、残余的甘油酯、颜料等)。
根据本发明的这种方法的第七步在于任选地通过褪色和脱臭的一系列步骤,精炼极富含长链酯级分的该提取物。
尽管在第六步中纯化了,如果必要可使富含DHA乙酯的提取物经历额外的精炼,该额外的精炼由一个褪色步骤和一个脱臭步骤组成:
-一个褪色步骤,为了减少浅黄色的颜色。
这一褪色步骤是经漂白土例如活性炭,以类似于在精炼植物油中常规使用的褪色的方式进行。
-一个脱臭步骤,通过在真空下的汽提进行。
最后,根据本发明的方法的此第二优先模式的第八步骤在于收集富含DHA乙酯的、所得到的组合物。
在控制气氛(理想地用氮惰化的)下储存由此纯化的DHA乙酯。
添加抗氧化剂可有利于这一级分的稳定。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的富含DHA乙酯的组合物在食品行业中的用途。
本发明将通过以下实例更清楚地被理解,这些实例意为说明性的和非限制性的。
实例1:从裂殖壶菌CNCM I-4469菌株制备包含按总脂肪酸的重量计30%和45%之间的DHA和按重量计10%和30%之间的不可皂化的化合物(包括15%至25%角鲨烯)的一种油。
这个实例说明了用于获得一种粗制油的方法,该油包含DHA和基本上由角鲨烯组成的不可皂化的化合物的混合物,该油通过发酵属于本申请人公司的微藻裂殖壶菌(于2011年4月14日保藏在法国巴斯德研究所的国家微生物保藏中心[Collection Nationalede Cultures de Microorganismes],保藏号CNCM I-4469)产生。
在这种情况下,发酵在20l反应器中实际培养/生产阶段之前以两个先前的连续的预培养阶段进行。
为了本实验,在第一个预培养介质内添加了维生素类,但是在第二个预培养介质中和在生产中添加维生素类是任选的。
因此预培养介质具有下面表I和II中示出的组成:
表I
第一次预培养的介质 | % |
葡萄糖 | 3 |
酵母提取物 | 0.4 |
谷氨酸钠 | 6.42 |
NaCl | 1.25 |
MgSO4 | 0.4 |
KCl | 0.05 |
CaCl2 | 0.01 |
NaHCO3 | 0.05 |
KH2PO4 | 0.4 |
维生素混合物 | 0.14 |
痕量元素 | 0.8 |
表II
第二次预培养的介质 | % |
葡萄糖 | 8.57 |
谷氨酸钠 | 6.42 |
酵母提取物 | 0.64 |
NaCl | 2 |
KH2PO4 | 0.64 |
MgSO4 | 2.29 |
CaCl2 | 0.03 |
NaHCO3 | 0.03 |
Na2SO4 | 0.03 |
维生素混合物 | 0.14 |
痕量元素 | 0.2 |
通常,以1ml/l使用Clerol“FBA3107”消泡剂。任选地,使用50mg/l的青霉素钠(penicillin G sodium salt)以便阻止污染菌的生长。
葡萄糖用KH2PO4灭菌并且从介质的其他部分分离,因为这样避免了形成一个沉淀物(磷酸镁铵)。在灭菌过滤之后加入维生素混合物和痕量元素。培养/生产介质的组成在下面表III中给出。
表III
% | |
在T0添加葡萄糖 | 7.5 |
脲 | 1 |
酵母提取物 | 1.2 |
NaCl | 0.25 |
KH2PO4 | 0.96 |
MgSO4 | 1.2 |
CaCl2 | 0.12 |
NaHCO3 | 0.12 |
KCl | 0.08 |
添加维生素混合物 | 0.4 |
痕量元素 | 0.56 |
维生素混合物的组成和痕量元素的组成在下面表IV和表V中给出:
表IV
表V
痕量元素 | g/l |
MnCl2.2H2O | 8.60 |
CoCl2.6H2O | 0.2 |
NiSO4.6H2O | 7.50 |
Na2MoO4.2H2O | 0.15 |
ZnSO4.7H2O | 5.70 |
CuSO4.5H2O | 6.50 |
FeSO4.7H2O | 32.00 |
ZnCl2 | 1.50 |
预培养条件
第一预培养在带有挡板的500ml的锥形瓶中制备,向该锥形瓶中添加一滴由杜塞尔多夫的科宁公司(Cognis GmbH Dusseldorf)销售的Clerol FBA 3107消泡剂。
在其组分完全溶解之后过滤培养介质,并且任选地以0.25mg/l的比例补充青霉素钠。
通过对在皮氏培养皿中培养的微藻菌落进行取样(以一个10μl接种环的比例)来接种。
接种持续24至36小时,温度为28℃,以100rpm振荡(在一个定轨振荡器上)。
由于生物质沉降(或者粘附在壁上),在充分振荡锥形瓶之后特别小心去除3至5ml。
对于第二次预培养,使用了配备管路的带挡板的2l锥形瓶。
将一滴消泡剂和酵母提取物添加至100ml水中。
在介质的所有组分溶解在300ml的去离子水之后过滤。任选地有可能添加青霉素钠并且在灭菌之前预先向锥形瓶中加入一滴消泡剂。
随后用3至5ml第一次预培养物进行接种。
孵育在28℃下再进行24至36小时,伴随在100rpm下的振荡。
在20l反应器中的生产
在一个20l的反应器内按以下方式进行实际培养。
-灭菌反应器内的一部分介质,并且分开灭菌另一部分以避免形成沉淀物,
-使用在第二次预培养结束时产生的生物质进行接种,比例为0.5%v/v的培养介质,
-培养维持在30℃,
-氧转移速率固定在35-40mmol/l/h,
-从0.2至0.3VVM通气,
-最初pH>5.5,
-一旦浓度>20%立即供应葡萄糖,以便维持葡萄糖浓度在15和70g/l之间。
下表IV示出了用本申请人公司的裂殖壶菌属物种获得的结果。
表IV:
测试 | E |
预培养温度(℃) | 28 |
培养温度(℃) | 30 |
在培养结束时的角鲨烯滴定度(g/l) | 4.4 |
生物质(g/l) | 54 |
角鲨烯相对干生物质,g/100g | 8.2 |
生物质回收
将从该发酵罐中提取的生物质进行洗涤以通过连续的两个浓缩系列(通过离心进行(5分钟,5000g))去除间质可溶性物质,并稀释该生物质(以1/3V球粒/V水的比例)。
干细胞浓度相对于总粗制干物质是95%。
然后将该干物质调节至12%。
获得该粗制油
将洗涤的生物质在配备有海洋推进器和挡板的2l发酵罐型(例如由国际科学公司(Interscience)销售的那些)的实验反应器中进行搅拌。
这个系统使得能限制所产生的细胞裂解产物的乳化而同时允许良好混合,这对于裂解酶的作用是必不可少的。
温度被调节为60℃,并且pH被氢氧化钠调节到大约8。
这些条件对于以基于干重按1%的量添加的碱性蛋白酶(alcalase enzyme)(诺维信公司)的活性是最佳的。
裂解时间被固定在4h。
在裂解结束时,向该反应混合物(水包油乳剂)中添加10%乙醇(V乙醇/V裂解产物),保持搅拌另外15min。
然后获得包含按重量计大约35%的DHA和按重量计大约15%的角鲨烯的粗制油。
实例2:通过分子蒸馏使油富含DHA乙酯
使用根据从实例1的操作条件推测的那些培养在1m3发酵罐中的由裂殖壶菌属藻类产生的来自裂殖壶菌属藻类的油。
甘油三酸酯级分具有以下脂肪酸谱:
**该化合物相对于总脂肪酸级分的百分比(通过GC的表面分布)
该不可皂化的级分基本上由角鲨烯组成(约21.8%/粗制油)。
步骤1:为了去除角鲨烯的目的处理该粗制油
使用一种VTA VK 83-6-SKR-T短路径蒸馏装置。
从氮惰化的进料池中,在120℃的温度下以3.5kg/h将8kg油泵入排气器中。
在排气器出口,通过维持在120℃的一个回路,该油经过(“短路径”)蒸发室。
将该蒸发器的温度调节至220℃。
将该冷凝器设定到20℃的温度。该蒸发室中的真空尽可能高(<10-3毫巴)。
通过这些收集回路将包含角鲨烯的蒸馏物和包含甘油三酸酯的残余物运送到惰性的储存槽中。
在此阶段,回收大约1.5kg的馏出物和6kg的残余物。
该馏出物中的角鲨烯含量等于94%。
该残余物的角鲨烯含量低于2%。
步骤2:将处理的油进行转酯
使用来自步骤1的6kg残余物分批进行该转酯。在50℃,在一个氮惰性的闭合的搅拌式夹套反应器中,以600g的诺维信435和680g的无水乙醇进行该反应。
将该反应混合物在这些条件下维持8h。
在该反应结束时,通过在10μm尼龙布上过滤分离该酶。离心该滤液(5min,在10000G),以去除甘油。回收了大约6kg的油,其甘油三酸酯级分已被90%转化为乙酯。
组成如下:
*该化合物在该粗制混合物中的重量百分比
**该化合物相对于乙酯级分的百分比(通过GC的表面分布)
步骤3:酯的分级
使用一种VTA VK 83-6-SKR-T短路径蒸馏装置。
从氮惰化的进料池中,在100℃的温度下以1kg/h将在步骤2中获得的6kg的转化产物泵入排气器中。
在排气器出口,通过维持在85℃的一个回路使这些乙酯经过(“短路径”)蒸发室。
将该蒸发器的温度调节至110℃。
将该冷凝器设定到20℃的温度。该蒸发室中的真空尽可能高(<10-3毫巴)。
通过这些收集回路将包含短链(主要是C14和C16)乙酯的馏出物和包含长链脂肪酸乙酯的残余物运送到惰性的储存槽中。
在此阶段,回收大约2.6kg的馏出物和3.6kg的残余物。
乙酯组成如下:
*该化合物在该粗制混合物中的重量百分比
**该化合物相对于乙酯级分的百分比(通过GC的表面分布)
来自这一步骤中所述的分离的DHA产率是大约84%(相对于该馏出物中的DHA损失)。
步骤4:酯的纯化:
使用一种VTA VK 83-6-SKR-T短路径蒸馏装置。
从氮惰化的进料池中,在100℃的温度下以5kg/h将3.6kg乙酯泵入排气器中。
在排气器出口,通过维持在85℃的一个回路使这些乙酯经过(“短路径”)蒸发室。
将该蒸发器的温度调节至200℃。
将该冷凝器设定到20℃的温度。该蒸发室中的真空尽可能高(<10-3毫巴)。
通过这些收集回路将包含PUFA乙酯的蒸馏物和包含杂质的残余物运送到惰性的储存槽中。
在此阶段,回收大约2.9kg的馏出物和0.4kg的残余物。
乙酯组成如下:
*该化合物在该粗制混合物中的重量百分比
**该化合物相对于乙酯级分的百分比(通过GC的表面分布)
来自这一步骤中所述的分离的DHA产率是大约97%(相对于该馏出物中的DHA损失)。
Claims (11)
1.一种用于从发酵液制备富含二十二碳六烯酸(DHA)乙酯的油性组合物的方法,所述发酵液由属于破囊壶菌目(Thraustochytriales)的微藻产生,所述方法包括以下步骤:
1)从破囊壶菌目家族的微藻的发酵液制备包含以下物质的混合物的粗制油:富含DHA的甘油三酸酯和不可皂化的化合物,其中作为一种不可皂化的化合物的角鲨烯占所述粗制油的15重量%至25重量%,
2)任选地通过脱胶、脱酸、褪色和脱臭的一系列步骤,精炼所得到的粗制油,
3)通过“短路径”分子蒸馏提取该角鲨烯,以获得不含角鲨烯的提余液,
4)在碱性或酶催化剂的存在下通过醇转酯将所得到的提余液进行转酯,
5)通过“短路径”分子蒸馏将步骤4)中的脂肪酸酯的混合物进行分级,以获得富含短链脂肪酸酯的提取物以及极富含长链脂肪酸酯的提余液,
6)通过“短路径”分子蒸馏将步骤5)中获得的长链脂肪酸酯的混合物进行纯化,以获得富含长链酯的不含杂质的提取物,
7)任选地,通过褪色和脱臭的一系列步骤,精炼富含长链酯的该提取物,
8)回收所得到的富含DHA乙酯的油性组合物,
其中所述“短路径”分子蒸馏是指接触持续时间少于1分钟的分子蒸馏。
2.权利要求1的方法,其中所述微藻选自以下物种:裂殖壶菌属(Schizochytriumsp.)、橙黄 壶菌属(Aurantiochytrium sp.)以及破囊壶菌属(Thraustochytrium sp.)。
3.权利要求1的方法,其中步骤3)中蒸发器的温度在从200℃到240℃的范围。
4.权利要求1的方法,其中步骤5)中蒸发器的温度在从100℃到150℃的范围。
5.权利要求1的方法,其中步骤6)中蒸发器的温度在从180℃到220℃的范围。
6.权利要求1至5任一项的方法,其特征在于步骤3)、5)和6)的“短路径”分子蒸馏是在少于0.1毫巴的值的高真空下进行。
7.权利要求6的方法,其中步骤3)、5)和6)的“短路径”分子蒸馏是在少于0.01毫巴的值的高真空下进行。
8.权利要求1的方法,其中所述“短路径”分子蒸馏步骤中的蒸发室的压力被调节到少于0.1毫巴的值,并且其中:
步骤3)的“短路径”分子蒸馏中蒸发器的温度在从200℃到240℃的范围;
步骤5)的“短路径”分子蒸馏中蒸发器的温度在从100℃到150℃的范围;以及
步骤6)的“短路径”分子蒸馏中蒸发器的温度在从180℃到220℃的范围。
9.权利要求8的方法,其中步骤3)、5)和6)的“短路径”分子蒸馏中的冷凝器的温度被调节到0到50℃的范围。
10.通过权利要求1至9任一项中所限定的方法获得的富含二十二碳六烯酸乙酯的油性组合物。
11.权利要求10的油性组合物,所述组合物适用于食品行业。
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Legal Events
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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