KR20200074047A - Epa, dha 및 아라키돈산 고함량 기능성 유지 생산 방법 - Google Patents
Epa, dha 및 아라키돈산 고함량 기능성 유지 생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 EPA, DHA 아라키돈산을 함유한 기능성 유지 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 기탁번호(KCTC18721P)인 미세조류 PB75를 특정 배양방법으로 배양 후 추출하여 기능성 성분이 함유된 유지를 생산하는 방법을 제시하며, 이것은 건강기능식품 및 의약품 원료로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 EPA, DHA 및 아라키돈산을 다량 함유한 기능성 유지 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 기탁번호 KCTC18721P인 미세조류 PB75를 특정 배양방법으로 배양 후 추출하여 기능성 성분이 함유된 유지를 생산하는 방법을 제시하며, 이것은 건강기능식품, 의약품 또는 화장품의 원료로 활용될 수 있다.
본 발명을 위해서, 용어 "미세조류 유래 오일"은 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum)에 속하는 PB75 미세조류로부터 추출되는 오일을 의미한다.
추출된 오일은 Omega-3 LCPUFA (Long-Chain Poly Unsaturated Fatty Acids)라고 하며, 고도 불포화 지방산으로 어유 및 해양 미생물에 존재하는 필수 지방산이다. 인체의 뇌, 신경세포, 안구의 중요 구성요소이며 신경전달, 면역 등 중요 대사에 관여하는 영양물질이다.
DHA(Docosahexaenoic acid, 22:6n-3)는 EPA(Eicosapentaenoic acid, 20:5n-3)와 함께 대표적인 오메가-3이다. 오메가-3는 불포화지방산의 일종으로 알킬사슬의 메틸기로부터 세번째 원자에 최초의 이중 결합이 시작하는 지방산을 말한다. DHA는 22개의 탄소원자와 여섯 개의 이중결합으로 구성된 고도불포화지방산이다. EPA(Eicosapentaenoic acid, 20:5n-3)는 오메가-3 지방산으로 timnodonic acid라고도 불리운다. 화학구조상으로 EPA는 20개의 탄소사슬과 5개의 이중결합을 갖는 카르복실산으로 고도불포화지방산이다.
이들은 인체 내에서 생합성이 용이하지 못하여 천연물에서 섭취해야 하는 필수지방산(essential fatty acid)이다. 미생물에서 PUFAs의 합성은 고등생물에서 발견되는 동일한 효소기구에 의해 올레산(oleic acid)으로부터 합성되며, 사슬 신장(chain elongation)과 사슬 불포화화(chain desaturation)의 두 반응으로 이루어져 있다. α-LAN이나 EPA, DHA등의 영양학적, 약리학적 연구는 1970년대 Needleman등의 선구적인 연구결과가 발표된 이후로 광범위하게 진행되었다(P.A. Needleman et al., 1979).
DHA는 화학합성이 곤란하여 천연물로부터 획득해야 하는데 현재 공업적으로는 이들 지방산을 어유(魚油)에서 추출하여 분리정제 후 사용하고 있다. DHA의 주요 공급원인 어류로는 청어, 고등어, 정어리 등을 사용하는데, 이들의 어류는 오메가-3계 지방산이 풍부하여 전체 지방산 중 30%이상의 DHA를 함유하고 있다(Galli and Simopoulos, 1989). 그러나 어유는 불쾌한 맛과 냄새를 가지며, 산화가 쉽게 일어나고, 무엇보다 지방산의 조성이 매우 복잡하여 추출 정제하는데 많은 시간과 비용이 소요되는 등 많은 문제점을 가지고 있다. 따라서 어유를 대체할 DHA의 원료를 찾는 연구가 활발히 진행중이며, 많은 연구자들에 의해 DHA의 상업적 대체원으로 많은 미생물이 제안되었다(A. P. Bimbo et al. 1987).
어류의 지방산은 이들의 먹이인 해양미생물이나 조류, 식물성 플랑크톤으로부터 기원하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 미세조류는 오메가-3 생산능력을 가지고 있고, 지방산 조성이 어유와 비교해서 매우 단순하여 추출 및 정제가 용이하다는 이점을 가지고 있다. (Yongmanitchai et al., 1989) 미세조류를 이용하여 오메가-3를 상업적으로 생산하기 위해서는 미세조류의 환경조건에 따른 높은 성장률과 오메가-3를 고함량 생산하는 것이 무엇보다 중요하다.
현재 해양 오메가-3 생산균주 중 스키조키트리움 속(Scizochytrium sp.)과 크립테코디니움 코니이(Crypthecodinium cohnii)가 종속영양형 DHA 생산공정에 사용되고 있다. 조류와 유사한 스키조키트리움 속(Scizochytrium sp.)은 총 무게의 70%에 해당하는 지질을 함유하고, 총 지방산의 35%에 해당하는 오메가-3를 함유하고 있다. 이 균주는 Martec Biochemical industries사에 의해 발견되었다. 본 발명의 목적은 원료 물질인 오메가-3를 지방산 조성비가 간단하여 정제가 수월한 미세조류를 통해 얻어내는 것이다. 이를 위해 해당 미세조류를 스크리닝을 통해 선정 및 고농도 배양, 추출 및 정제에 이르는 일련의 과정을 정례화하였다.
어유는 30여 가지의 다양한 지방산으로 구성되어 목적하는 지방산의 고함량화 과정에서 여러 단계의 분리 공정이 필요하다. 반면 미세조류 유래 오일은 7~8가지의 지방산으로 구성되어 있어서 정제과정이 매우 간단하다. 또한 미세조류 추출유는 어유보다 오메가-3 함량이 매우 높고 지방산 조성이 간단하여 기존 제품보다 오메가-3 함량이 높은 제품을 발명할 수 있었다.
본 발명에서 이용하는 미세조류 균주(PB75로 명명)의 경우 오메가-3 함량이 (조지방 중) 40~50%의 함량을 나타냈다. PB75는 울릉도 근해에서 발굴함 미세조류로 자연종 미세조류로는 매우 특이하게 EPA, DHA, ARA를 동시에 생산한다. 다만 그 배양 조건에 따라 생산되는 유지의 양과 질의 차이가 커, 이를 최적화하기 위한 연구개발이 필요하였다.
한편, 본 발명에서 PSP 배양기술은 출원인이 개발한 고효율 미세조류 배양기술로 미세조류 배양 과정에서의 빛 조건에 관한 것이며, 기술내용은 관련한 미국 특허(Microalgae Fermentation using controlled illumination, 미국출원번호 10-2012-7009781) 내용에 따른다. PSP 배양기술은 극히 일부의 제한된 미세조류종에만 적용 가능하던 기존 발효방식의 문제점들을 해결하고, 광합성에 의존하는 기존의 open-pond나 photobioreactor에 비하여 20배 이상 그리고 전통적 발효방식에 비하여서도 2-4배 이상 높은 생산성을 제공한다.
본 발명의 목적은 미세조류를 이용하여 EPA와 DHA 및 아라키돈산이 고함량으로 포함된 기능성 유지를 상업적 수준으로 생산하는 방법을 제시하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 기탁번호 KCTC18721P인 미세조류 PB75의 배양조건을 배지조성을 통해 조정하여 EPA와 DHA 및 아라키돈산이 고함량으로 포함된 기능성 유지를 상업적 수준으로 생산할 수 있는 배지 조성을 제공하는 것이다.
본 발명은 EPA, DHA 및 아라키돈산을 함유한 기능성 유지 생산 방법에 대한 내용으로서 PB-75 균주의 최적 배양을 위한 조건을 제시한다.
본 발명의 목적 달성을 위하여, 본 발명의 일 실시예에서는 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum) 미세조류의 배양을 위한 인공해수 배지에 있어서, 질소 공급원으로 효모, 카세인, MSG(monosodium L-glutamate), 질산나트륨(NaNO3) 중 선택된 두개 이상을 혼합하여 사용하며; 탄소원으로 글루코오즈를 사용하며; 인산염의 함량을 낮춘 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지를 제시한다.
상기 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum) 미세조류는 기탁번호 KCTC18721인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 질소공급원은 효모, 카세인, MSG, 질산나트륨이 모두 혼합된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 질소공급원의 혼합비는 효모 3:카세인 3:MSG 4:질산나트륨 6 인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 탄소공급원인 글루코오즈의 농도는 인공해수 1리터당 20g 내지 50g인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 탄소공급원인 글루코오즈의 농도는 인공해수 1리터당 40g인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 인산염의 함량은 1mM 내지 8mM인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 질소 공급원으로 효모, 카세인, MSG(monosodium L-glutamate), 질산나트륨(NaNO3) 중 선택된 두개 이상을 혼합하여 사용하며; 탄소원으로 글루코오즈를 사용하며; 인산염의 함량을 낮춘 인공해수 배지를 이용하여 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum) 미세조류를 배양하는 방법을 제시한다.
상기 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum) 미세조류는 기탁번호 KCTC18721인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 질소공급원은 효모, 카세인, MSG, 질산나트륨이 모두 혼합된 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 질소공급원의 혼합비는 효모 3:카세인 3:MSG 4:질산나트륨 6 인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 탄소공급원인 글루코오즈의 농도는 인공해수 1리터당 20g 내지 50g인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 탄소공급원인 글루코오즈의 농도는 인공해수 1리터당 40g인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 인산염의 함량은 1mM 내지 8mM인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 배지 조성은 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류를 효율적으로 배양함으로써 EPA, DHA, 오메가3 및 아라키돈산의 함량이 높은 지방산을 생산할 수 있도록 한다. 본 발명에서 제시한 배지조성 및 방법으로 배양한 미세조류로부터 수득한 고품질의 지방산은 건강기능식품, 의약품 또는 화장품 등으로 활용될 수 있다.
도 1은 탄소원에 따른 미세조류 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 pH 조건에 따른 미세조류 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 염도 조건에 따른 미세조류 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 질소원에 따른 미세조류 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 100ml flask 조건에서 기능성 지방산 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 5L 대량배양 조건에서 기능성 지방산 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (8차 실험결과)
도 7은 5L 대량배양 조건에서 기능성 지방산 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (9차 실험결과)
도 2는 pH 조건에 따른 미세조류 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 염도 조건에 따른 미세조류 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 질소원에 따른 미세조류 배양 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 100ml flask 조건에서 기능성 지방산 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 5L 대량배양 조건에서 기능성 지방산 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (8차 실험결과)
도 7은 5L 대량배양 조건에서 기능성 지방산 함량을 분석한 결과를 나타낸 것이다. (9차 실험결과)
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
제조예 1: 균주배양 기본 조건
1) PB75
본 발명에서 사용된 균주 PB-75는 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum)에 속하며, 한국생명공학연구원에 기탁번호 KCTC18721P로 기탁하였다.
2) 균주의 배양
균주 배양에 사용한 배지의 조성은 다음과 같이 세분화하여 시험을 진행하였다. 실험의 결과는 DCW(dry cell weight)로서 우선 판별하였으며, DCW가 가장 우수한 실험군의 결과물을 가지고 조지방을 추출하여 지방산 조성비를 확인하였다.
3) 기본 인공해양수(Artificial Sea Water) 조성
세포배양 배지의 기본이 되는 인공해양수 조성은 아래와 같다.
| Component | 1L 당 | |
| 1 | NaCl | 15g |
| 2 | MgSO4 7H2O | 2.58g |
| 3 | NaNO3 | 1g |
| 4 | CaCl2 2H2O | 0.3g |
| 5 | HEPES | 2.38 |
| 6 | P-II metal solution | 10ml |
| 7 | Chelated Iron solution | 1ml |
| 8 | NH4Cl | 0.027g |
| 9 | Yeast extract | 3g |
| 10 | pH | 7.6-8 |
| 11 | glucose | 20g |
| 12 | 0.1M Phosphate buffer | 80mL |
| 13 | vitamin solutions | 4ml |
| P-II metal | 100ml 당 | |
| 1 | Na2EDTA·2H2O | 0.1 g |
| 2 | H3BO3 | 0.114 g |
| 3 | FeCl3 ·6H2O | 4.9 mg |
| 4 | MnCl2 4H2O | 1.92mg |
| 5 | ZnSO4 ·7H2O | 2.2 mg |
| 6 | CoCl2 ·6H2O | 0.48 mg |
| Chelated Iron solution | 100ml 당 | |
| 1 | Na2EDTA | 1g/50ml |
| 2 | O.1M HCl | dilute from 1M then bring up the volume to 50ml |
| 3 | FeCl3 6H2O | 0.081g/50ml |
실험예 1. 탄소원의 최적화
1)
탄소원 특정
PSP 조건에서 탄소원별 실험 결과 아래와 같은 배양 결과를 확인하였다.
| condition | O.D. 680nm | O.D. 750nm | 680nm | 750nm | O.D. 680nm | 680nm | O.D. 750nm | 750nm | ave | sd | |
| 1 | glucose | 0.905 | 0.877 | 0.858 | 0.829 | 9.05 | 8.58 | 8.77 | 8.29 | 8.53 | 0.3394113 |
| 2 | arabinose | 0.637 | 0.597 | 0.609 | 0.569 | 1.274 | 1.218 | 1.194 | 1.138 | 1.166 | 0.039598 |
| 3 | glucose + arabinose | 0.821 | 0.792 | 0.815 | 0.786 | 8.21 | 8.15 | 7.92 | 7.86 | 7.89 | 0.0424264 |
| 4 | xylose | 0.364 | 0.343 | 0.363 | 0.343 | 0.728 | 0.726 | 0.686 | 0.686 | 0.686 | 0 |
| 5 | glucose + xylose | 0.665 | 0.637 | 0.637 | 0.61 | 6.65 | 6.37 | 6.37 | 6.1 | 6.235 | 0.1909188 |
| 6 | sucrose | 0.817 | 0.769 | 0.805 | 0.757 | 1.634 | 1.61 | 1.538 | 1.514 | 1.526 | 0.0169706 |
| 7 | fructose | 0.632 | 0.588 | 0.614 | 0.57 | 1.264 | 1.228 | 1.176 | 1.14 | 1.158 | 0.0254558 |
| 8 | mannose | 0.503 | 0.461 | 0.505 | 0.463 | 1.006 | 1.01 | 0.922 | 0.926 | 0.924 | 0.0028284 |
| 9 | galactose | 0.83 | 0.794 | 0.822 | 0.786 | 1.66 | 1.644 | 1.588 | 1.572 | 1.58 | 0.0113137 |
| 10 | sodium acetate | 0.242 | 0.23 | 0.247 | 0.233 | 0.44 | 0.494 | 0.46 | 0.466 | 0.463 | 0.0042426 |
| 11 | Glycerol | 0.978 | 0.938 | 0.988 | 0.949 | 1.956 | 1.976 | 1.876 | 1.898 | 1.887 | 0.0155563 |
| 12 | no carbon source | 0.43 | 0.392 | 0.434 | 0.396 | 0.86 | 0.868 | 0.784 | 0.792 | 0.788 | 0.0056569 |
배양 결과, 10가지의 다른 carbon source에서 PB75 균주를 배양시 optical density를 보면 다른 carbon source에 비해 glucose가 섞여 있는 조건의 경우 성장에 도움이 됨을 알 수 있다.
즉, PB75 배양에 최적의 carbon source조건은 오직 glucose만 사용하는 것이 성장조건에 가장 적합함을 확인하였다.
2) 글루코오즈 함량 최적화
100ml 플라스크를 기준으로 기본 인공해양수 조성에서 글루코오즈 함량을 독립변수로 하여 최적 함량을 도출하고자 하였다.
| Glucose | O.D 750nm | DCW(mg/ml) | |
| 1 | 1 | 8.7 | 12.6 |
| 2 | 2 | 13.9 | 18.1 |
| 3 | 2.5 | 12.25 | 16.1 |
실험결과 O.D 값과 DCW 값에서 기본 함량 대비 글루코오즈 함량을 2배정도 증가시켰을때 배양 결과가 우수함을 확인할 수 있었다.
실험예 2. pH 조건의 최적화
PSP 조건에서 pH별 실험 결과 아래와 같은 배양 결과를 확인하였다.
| pH | O.D. 680nm | O.D. 750nm | adj 680nm | adj 750nm | adj 680nm | adj 680nm | adj 750nm | adj 750nm | AVE | SD |
| 4.81 | 0.041 | 0.038 | 0.035 | 0.031 | 0.041 | 0.035 | 0.038 | 0.031 | 0.0345 | 0.0049497 |
| 5.63 | 0.146 | 0.135 | 0.147 | 0.136 | 0.146 | 0.147 | 0.135 | 0.136 | 0.1355 | 0.0007071 |
| 6.27 | 0.628 | 0.602 | 0.601 | 0.576 | 6.28 | 6.01 | 6.02 | 5.76 | 5.89 | 0.1838478 |
| 7.00 | 0.886 | 0.855 | 0.858 | 0.827 | 8.86 | 8.58 | 8.55 | 8.27 | 8.41 | 0.1979899 |
| 8.00 | 0.922 | 0.895 | 0.916 | 0.886 | 9.22 | 9.16 | 8.95 | 8.86 | 8.905 | 0.0636396 |
| 9.00 | 0.714 | 0.685 | 0.702 | 0.674 | 7.14 | 7.02 | 6.85 | 6.74 | 6.795 | 0.0777817 |
6가지의 pH 조건에서 PB75 균주를 배양한 결과 pH 7과 8에서 성장이 잘 됨을 알 수 있다. 즉, PB-75의 배지의 pH가 8일 때 최적의 성장이 이루어짐을 알 수 있다.
실험예 3. 염도 조건의 최적화
PSP 조건에서 100ml 플라스크에 Sodium Chloride의 양을 세가지 조건으로 실험한 결과 아래와 같은 결과를 확인하였다.
| salinity | O.D. 680nm | O.D. 750nm | adj 680nm | adj 750nm | adj 680nm | adj 680nm | adj 750nm | adj 750nm | AVE | SD |
| 7.5g/L | 0.284 | 0.271 | 0.265 | 0.252 | 2.84 | 2.65 | 2.71 | 2.52 | 2.615 | 0.1343503 |
| 15g/L | 0.896 | 0.868 | 0.921 | 0.893 | 8.96 | 9.21 | 8.68 | 8.93 | 8.805 | 0.1767767 |
| 30g/L | 0.252 | 0.235 | 0.248 | 0.231 | 2.52 | 2.48 | 2.35 | 2.31 | 2.33 | 0.0282843 |
PB75의 배지조성의 sodium chloride의 양을 3가지 조건으로 나누어 PB75 균주를 배양한 결과 15g/L의 sodium chloride 양을 넣은 배지에서 다른 조건에 비해 확연히 성장수준이 높음을 알 수 있다.
즉, 앞에 기재한 것처럼 15g/L의 sodium chloride의 양이 PB75 균주의 성장에 최적의 조건임을 알 수 있다.
실험예 4. 질소원 조건의 최적화
PSP 조건하에 100ml flask에서 N source로 NaNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4, MSG, Yeast, Tryptone, Peptone, Casein을 아래에 나타난 배지 조성의 농도로 적용하여 15가지 조건에서 실험하였으며, 이때 Yeast, Tryptone, Peptone, Casein의 농도는 동일하다.
| N source | O.D 680nm | O.D 750nm | |
| 1 | NO3+MSG+NH4Cl | 2.15 | 2.08 |
| 2 | (NH4)2SO4+MSG | 3.71 | 3.54 |
| 3 | NO3+YE+NH4Cl | 10.66 | 10.32 |
| 4 | NO3+MSG+YE+NH4Cl | 10.76 | 10.38 |
| 5 | NO3+Try+NH4Cl | 6.75 | 6.54 |
| 6 | NO3+PEP+NH4Cl | 4.76 | 4.59 |
| 7 | NO3+Cas+NH4Cl | 6.53 | 6.29 |
| 8 | (NH4)2SO4+YE | 3.46 | 3.3 |
| 9 | (NH4)2SO4+Try | 1.63 | 1.56 |
| 10 | (NH4)2SO4+Pep | 1.05 | 0.99 |
| 11 | (NH4)2SO4+Cas | 2.12 | 2.04 |
| 12 | MSG+YE | 11.4 | 11.06 |
| 13 | NO3+1/2YE+1/2Try+NH4Cl | 10.28 | 9.92 |
| 14 | NO3+1/2YE+1/2Pep+NH4Cl | 9.1 | 8.8 |
| 15 | NO3+1/2YE+1/2Cas+NH4Cl | 12.06 | 11.5 |
실험의 결과 (NH4)2SO4를 N source로 사용한 조건에서 O.D의 수치가 현저히 낮은 것을 볼 수 있으며, NH4Cl, NaNO3, 1/2 Yeast, 1/2 Tryptone의 조건이 O.D 수치로 가장 높은 값을 나타내고 있다. 즉, PB75균주의 N source로 (NH4)2SO4는 적합하지 않으며, NaNO3, Yeast, Casein, MSG가 적합한 것으로 보여 진다.
실험예 5. Phosphate 농도 최적화
다른 조건을 고정하고, Phosphate 농도를 기준 ASW 대비 1, 1/2, 1/8로 조정하여 최적 농도를 도출하기 위한 실험을 수행하였다.
| 0 day | 5 day | 6 day | 7 day | DCW(mg/ml) | |
| 1 | 0.134 | 3.24 | 5.22 | 5.68 | 8.3 |
| 1/2 | 0.134 | 3.12 | 6.04 | 7.16 | 11.6 |
| 1/8 | 0.134 | 4.18 | 6.20 | 6.66 | 10.2 |
3가지 조건에서 모두 동일한 초기 O.D(750nm)농도에서 각각 5일, 6일, 7일 O.D값을 측정한 결과 5일, 6일에는 1/8의 조건에서 가장 높은 수치의 O.D값을 보였으나 7일에는 1/2의 조건에서 가장 높은 수치를 나타내었다. 또한 1/2 Phosphate 조건에서 DCW 수치가 가장 높게 나타남을 알 수 있다. 즉, Phosphate 함량을 기존농도에서 50%를 감소시킬 경우 biomass함량 증가에 도움이 되는 것을 알 수 있다.
실험예 6. 최적 배양조건 도출
반복적인 실험 결과 탄소원, 질소원, Phosphate 함량이 PB75의 배양에 주요 조성물임을 확인할 수 있었으며, 이들 값을 조정하여 최적 배양조건을 도출하고자 하였다.
| Nitrogen | Phosphate | Glucose | O.D 750nm | DCW(mg/ml) | |
| 1 | Casein | 1 | 1 | 12.6 | 15.2 |
| 2 | Yeast | 1 | 1 | 10.2 | 14.1 |
| 3 | Casein, MSG | 1 | 1 | 13.6 | 16.5 |
| 4 | Casein, MSG | 1/2 | 1 | 17.7 | 22.4 |
| 5 | 1/2 Casein +1/2 Yeast, MSG | 1/2 | 1 | 13.9 | 17.8 |
| 6 | Casein, MSG | 1/2 | 2 | 21.5 | 25.2 |
실험결과 기본 ASW 조성에서 2배의 Glucose, 1/2 Phosphate, Nitrogen source의 경우 Casein, MSG, NH4Cl, NaNO3을 최적 배양배지의 성분으로 확립하였다.
실험예 7. 균주배양
1) Flask 배양(종균 배양)
-80℃ deep freezer에 보관된 PB31 vial 균주를 2개 준비한 후 flask 목 부분에 물기를 제거한 후 PB31 배지 400ml 배양액이 포함된 1L flask하나에 vial 2개를 접종하여 115RPM, 28℃, PSP 조건에서 46~47시간 진탕 배양한다. 이때, Spectrophotomet를 이용해 종균 배양액 Optical density가 O.D 680nm/750nm에서 3-4가 되면 PB31 배지 800ml 배지가 포함된 2L Flask에 종균 배양액10%(v/v) (80ml)로 4개의 flask에 접종하여 120RPM, 28℃, PSP 조건에서 41~42h 진탕 배양하였다.
2) PSP를 이용한 fermenter 배양
당사의 선행특허 "조절되는 조명을 사용하는 미세조류 발효"(미국출원번호 10-2012-7009781)기술(당사의 고유기술로서 PSP라 명명함)은, 극히 일부의 제한된 미세조류종에만 적용 가능하던 기존 발효방식의 문제점들을 해결하고, 광합성에 의존하는 기존의 open-pond나 photobioreactor에 비하여 20배 이상 그리고 전통적 발효방식에 비하여서도 2-4배 이상 높은 생산성을 제공한다. 상기의 PSP방식을 본 발명에도 적용하여 배양을 진행하였다.
500L fermenter에 PB31 배지 조성에 맞게 working volume 350L로 멸균 배지를 만든 후 RPM, Air, 온도, pH등 물리적인 조건을 초기 배양 조건으로 맞춘 후 PB31 배지800ml 배지가 포함된 2L Seed flask에서 배양액 sample을 1ml채취하여 광학 현미경으로 오염 여부를 판단하고, 오염이 없을 경우 Spectrophotometer를 이용하여 Optical density 측정하여 O.D (680nm/ 750nm) 3~4일때 500L seed 배양기에 접종한다. 초기 RPM 100, Air 200, Temp. 28℃ pH7.6~7.8, PSP조건으로 배양을 시작하여 최대 RPM 150, Air 260으로 약25~26시간 배양한다.
실험예 8. 유효물질의 수확
1)
동결건조
SUS plate에 배양액을 일정량 부어 냉동한다. 동결건조 시작 버튼을 누르고 챔버 온도를 -80도까지 낮춘 후 챔버에 배양액 냉동시료를 넣는다. 진공펌프를 가동하여 진공도 0을 확인하고 72시간 후 동결건조 작업이 완료되면 진공버튼을 눌러 압력을 빼고 냉각을 종료한다.
2) 초임계 유체의 추출 공정
초임계 유체기술은 높은 용해력, 물질이동 및 열이동이 빠르고, 낮은 점도, 높은 확산계수 그리고 낮은 표면장력으로 인한 빠른 침투성 등과 같은 초임계 유체의 장점을 이용해 추출, 분리, 정제뿐만 아니라 결정화, 흡수, 세정 등 여러 공정에 응용되는 기술이다. 본 공정에서 따른 초임계 유체 추출법은 초임계 유체로서 이산화탄소를 사용하며 추출공정은 다음과 같다.
동결건조를 통해 확보한 미세조류 분말을 밀링기에 통과시켜 미세조류의 셀을 파괴한다. 이는 초임계 추출시에 추출 수율을 높이고 추출시간을 줄이기 위한 과정이다.
준연속식(Semi-continuous) 초임계 추출기의 덮개를 열고 내부 공간에 동결건조를 통해 얻은 미세조류 건조분말을 투입한 후 추출기의 상부 덮개를 결합하여 체결한다. 추출기 내부의 온도를 50도까지 승온하고, 고압용 기체펌프를 이용하여 추출조에 이산화탄소를 일시적으로 공급하고, 장비의 밸브를 확인 후 고압펌프를 가동하여 추출 장비를 300Bar까지 승압한다. 온도 와 압력 도달시 추출 작업을 시작한다. 추출조는 50℃의 온도에서 300bar까지 압력을 유지하며, 온도와 압력도달시 추출작업은 6시간 이상 진행한다. 추출물 회수량이 시간당 100g이하로 추출물이 회수 될 때 추출 종료시점으로하여 이산화탄소는 대기로 방출하고, 포집기 내로 추출물인 오일을 회수함으로써 각 샘플의 초임계 추출물을 얻는다.
3) 정제공정
정제공정은 5단계로 진행되는데, 탈검(Degumming). 탈산 (Deacidification). 탈색(Bleaching). 탈취 (Deodorization) 단계로 진행되며, 항산화제 (Antioxidant) 처리로 오일의 안정성을 높이는 처리공정이 있다.
본 공정에서 정제 공정은 다음과 같다.
탈검(Degumming)공정은 미세조류 원유내 존재하는 인지질을 제거하는 공정으로 250L SUS 반응기에 진공상태를 유지하여 차압이 생기면 crude oil 이송한다. 이송 완료 후 진공을 해제하고 상압 상태에서 오일 내부 온도를 75℃까지 setting 한다. 교반은 80rpm 유지하고 75도까지 승온한다. 인산 (0.5%/oil) / 물 (2%/oil) (1 : 4) 비율로 준비하고 반응기 내 oil 온도 도달시 인산용액을 5분 내외로 적가한다. 적가 후 교반시간 30sec 유지하고 교반을 정지한다. 인산과 반응된 인지질이 침전되면 2시간가량 정체하고 인산층을 분리한다. 분리된 oil내 남아있는 미량의 인지질 및 인산을 온수로 세척한다. 교반(rpm 40) 상태에서 온수 95℃ 적가하고 완료되면 교반 정지하고 2시간이상 정치한다. 분리된 수층을 제거하고 탈산작업을 진행한다.
탈산(Deacidification)공정은 유리지방산 제거 공정으로 추출 작업시 공기에 노출되어 산폐된 지방산을 제거하는 공정을 진행한다.
반응기 내 오일을 교반(rpm 50) 유지하고 내부온도를 75℃까지 승온한다.
오일의 산가를 측정하여 산가에 맞는 NaOH를 적가량 준비한다. oil 온도가 도달시 1min 이내로 NaOH를 적가한다. 적가 후 교반시간 30sec 유지한 뒤 교반 정지한다. 유리지방산이 수산화나트륨과 반응하여 침전되어 가라앉게 된다. 1hr이상 정체한 뒤 비누(soap)는 층분리를 통해 제거한다.
온수를 준비하여 교반(rpm 60) 상태에서 온수(95℃)를 적가하고(30~50%/oil) 적가 완료시 교반 정지한다. 1hr이상 정체 후 수층 분리한다.
수층 분리 상태 및 색깔을 확인 후 온수 세척 작업 반복한다.
탈색(Bleaching) 공정은 색소성분의 물질을 흡착제로 흡착시키는 흡착법으로 탈산 반응이 완료 된 오일을 내부온도를 110℃까지 승온하고 교반은 100 rpm 유지하면서 진공상태 50torr 이하 유지한다. oil 내부의 수분증발이 완료되면 백토 투입 준비한다. 활성백토 3~5% 투입 후 탈색반응 1hr 진행한다.
탈색반응이 완료되면 내부온도를 70℃ 냉각하고 감압플라스크로 탈색제를 필터링한다.
탈취(deodrization) 공정은 오일 내 이취물질을 제거하여 제품의 품질을 높이는 과정이다. 탈취공정장비 셋업 후 스팀발생기(70도) 및 냉동기(-40도), 진공펌프(2~3torr)를 가동한다. 2L 유리 탈취반응기에 PB-75 탈색유를 넣고 진공상태를 유지한다. 반응기 내 온도를 60도까지 승온한 후 스팀발생기 밸브를 열어 수증기를 투입하여 스트리핑 한다. 온도를 170도까지 승온하며 스트리핑의 상태를 확인하여 밸브를 조절한다. 내부 온도가 170도에 도달하면 진공도를 체크하여 2torr로 유지한다. 탈취시 스팀량을 조절하며(1회당/oil 5% 소모) 3시간 탈취작업을 유지한다. 히팅맨틀을 제거하고 냉각하여 오일 온도를 70도까지 냉각하고, 감암필터하여 불순물을 제거한다.
실험예 9. 지질 특성의 분석
오일 시료를 메탄올성 수산화나트륨용액으로 처리하여 알칼리염을 만든 후 트리플루오로보란메탄올용액을 가하고 가열하여 에스테르화 한다. 생성된 지방산에스테르를 이소옥탄에 녹여 분석을 행한다. 개별 지방산의 함량 및 대표적인 지방산의 합을 계산하여 포화지방, 단일불포화지방, 다중불포화지방 함량을 분석한다.
1)
지질특성 분석을 위한 시약 및 장비
지질 특성 분석을 위해 필요한 시약 및 장비는 아래와 같다.
| 시약 | 장비 |
| 1.
염산(HCl)2.
에테르(Ethyl ether) 3. 석유 에테르(Petroleum ether) 4. 무수황산나트륨(Sodium sulfate Anhydrous) 5. 이소옥탄(Isooctane) 6. 14% 트리플루오로보란메탄올 용액 7. 염화나트륨(Sodium chloride) 8. 수산화나트륨(Sodium Hydroxide) 9. 메탄올(Methyl alcohol) |
1.
가스크로마토그래피(GC-FID) 2. Balance 3. vortex 4. 원심분리기 5. Heating Block 6. Rotavapor 7. Heating Bath 8. Vacuum Pump 9. Low Temperature Circulator 10. Water Bath |
2)
시약 조제
지방산 분석을 위한 시약 조제는 아래와 같은 순서로 진행한다.
a. 8.3M 염산용액 : 염산 302.95g을 증류수 1L에 녹인다.
b. 내부표준용액 : undecanoic acid(C11:0) 0.1g을 이소옥탄용액에 녹여 100㎖가 되게 한다.
c. 표준용액 : 각 지방산 메틸 에스테르와 내부표준물질 undecanoic acid 메틸에스테르를 이소옥탄에 녹여 각각 0.5㎎/㎖이 되도록 조제한다.
d. 포화 염화나트륨용액 : 염화나트륨을 증류수에 포화상태로 녹인다.
e. 메탄올성 수산화나트륨용액(0.5N) : 수산화나트륨 2g을 메탄올 100㎖로 조제한다.
3)
지방산 메틸에스테르화법
지방산 분석을 위한 메틸에스테르화 공정은 아래와 같다.
a. 검액 약 25㎎을 12㎖ vail에 정밀히 취하고 내부표준용액 1㎖를 첨가한다.
b. 0.5N 메탄올성 수산화나트륨용액 1.5㎖를 가하고 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합한다.
c. 100℃ Heating Block에서 약 5분간 가온한다.
d. 이를 냉각한 후 14% 트리플루오로보란메탄올 용액 2㎖를 가하고 다시 질소를 불어넣은 후 즉시 뚜껑을 덮고 혼합하고 100℃ Heating Block에서 약 30분간 가온한다.
e. 30~40℃로 냉각하여 이소옥탄용액 1㎖를 가하여 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 이 온도에서 30초간 격렬히 진탕한다.
f. 즉시 포화 염화나트륨용액 5㎖를 가하고 질소를 불어넣은 후 뚜껑을 덮고 진탕한다.
g. 상온으로 냉각한 후 수층으로부터 분리된 이소옥탄층을 무수황산나트륨으로 탈수하여 시험용액으로 한다.
4)
지질 특성 분석 결과
위 조건에서 배양한 PB75의 지질 함량을 가스크로마토그래피로 분석한 결과 아래와 같은 결과를 확인하였다.
| Fatty acids | 대조군 | PB-75 |
| C14:0 | 5.44 | 3.68 |
| C16:0 | 27.04 | 21.02 |
| C18:0 | 4.9 | 5.72 |
| C18:1 | 4.57 | 5.29 |
| C22:1 | 6.95 | 1.86 |
| C20:4(ARA) | 1.55 | 3.58 |
| C20:5(EPA) | 12.94 | 15.98 |
| C22:5 | 3.02 | 8.27 |
| C22:6(DHA) | 29.75 | 32.51 |
즉, PB75는 대조군의 미세조류 오일 대비 셀 지질함량이 높으며, 특히 EPA, DHA, ARA의 함량이 높음을 확인할 수 있었다.
실험예 10. 5L 대량 배양 조건에 따른 지질함량
위 실험과정에서 확인한 방법을 기초로 5L 대량배양 조건을 변형하며 지질함량을 분석하였다. 10차에 거쳐 실험한 조건은 아래와 같다.
| 차수 | media | 광조건 | 온도 (℃) |
Seed volume |
Working volume | Seed O.D |
| 1 | ASW media, 17g/L NaCl, 3g/L Yeast, No Na Glutamate | PSP (white) 60 μ mol s-1m-2 | 25 | 10% (400ml(10%)) | 4L | 0.139/0.129 |
| 2 | ASW media, 3g/L Tryptone, NO Na Glutamate | PSP (white) 60 μ mol s-1m-2 | 25 | 10% (360ml(20%) | 3.5L | 1.23/1.15 |
| 3 | ASW media, 15g/L NaCl, 3g/L Yeast, NO Na Glutamate | PSP (white) 60 μ mol s-1m-2 | 25 | 10% (360ml(20%) | 3.5L | 1.09/1.01 |
| 4 | ASW media, 3g/L Tryptone, NO Na Glutamate | PSP (red light) 1.5 μ mol s-1m-2 | 25 | 10% (360ml(10%)) | 3.5L | 1.21/1.13 |
| 5 | ASW media, 3g/L Tryptone, NO Na Glutamate | PSP (red light) 16.66 μ mol s-1m-2 | 25 | 10% (360ml(10%)) | 3.5L | 1.24/1.16 |
| 6 | ASW media, 3g/L Tryptone, NO Na Glutamate | PSP (red light) 1.5 μ mol s-1m-2 | 25 | 10% (360ml(10%)) | 3.5L | 4.03/3.96 |
| 7 | ASW media, 5g/L Tryptone, NO Na Glutamate | PSP (red light) 1.5 μ mol s-1m-2 | 25 | 10% (360ml(10%)) | 3.5L | 3.25/3.18 |
| 8 | ASW media, 3g/L Tryptone, NO Na Glutamate | PSP (white light) 2 μ mol s-1m-2 | 25 | 10% (360ml(10%)) | 3.5L | 4.10/3.94 |
| 9 | ASW media, 3g/L Tryptone, NO Na Glutamate | PSP (white light) 2 μ mol s-1m-2 | 25 | 10% (360ml(20%)) | 3.5L | 1.86/1.74 |
| 10 | ASW media, 3g/L Tryptone, NO Na Glutamate | No PSP | 25 | 10% (360ml(20%)) | 3.5L | 1.53/1.42 |
위 실험을 통해 확인한 배양 결과물은 아래와 같다.
| 연번 | O.D(680nm) | cell number*10^6 | DCW(mg/ml) (30g/L이상) |
조지방 (40%이상) |
오메가-3 함량 (40%이상) |
비고 |
| 1차 | 1.45 | 45 | - | 폐기(성장미비) | ||
| 2차 | 5.68 | 264 | 7.2 | - | - | DCW 미비 |
| 3차 | 1.51 | 76.5 | 3.7 | - | - | 폐기(성장미비) |
| 4차 | 2.76 | 100.5 | 4.2 | - | - | 폐기(성장미비) |
| 5차 | 2.94 | 195.5 | 4.7 | - | - | 폐기(성장미비) |
| 6차 | 3.7 | 287.5 | 5.7 | - | - | DCW 미비 |
| 7차 | 3.28 | 149 | 3.2 | - | - | 폐기(성장미비) |
| 8차 | 19.60 | 342 | 31.10 | 42 | 43.96 | 양호 |
| 9차 | 21.65 | 336.5 | 32.40 | 43 | 55.20 | 양호 |
| 10차 | 19.20 | 307 | 27.10 | 32 | 40.48 | 대조군 (NON PSP) |
배양 조건과 결과를 대비하여, 5L 조건에서 세포 배양 효율이 높고, 조지방과 오메가-3 함량이 높은 PB75의 최적 배양 조건은 아래와 같이 정리하였다.
| 연번 | PB75 배지 | 1L | Note |
| 1 | NaCl | 15g | pH 7.8~8.0으로 조절 (Use NaOH pellet to change PH) |
| 2 | MgSO4 7H2O | 2.58g | |
| 3 | NaNO3 | 1.7g | |
| 4 | CaCl2 2H2O | 0.3g | |
| 5 | P-II metal solution (100x) | 10ml | |
| 6 | Chelated Iron solution | 1ml | |
| 7 | NH4Cl | 0.027g | |
| 8 | Tryptone | 3g | |
| 9 | glucose | 20g | |
| 10 | 0.1M P.P.B | 8ml |
Claims (14)
- 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum) 미세조류의 배양을 위한 인공해수 배지에 있어서,
질소 공급원으로 효모, 카세인, MSG(monosodium L-glutamate), 질산나트륨(NaNO3) 중 선택된 두개 이상을 혼합하여 사용하며;
탄소원으로 글루코오즈를 사용하며;
인산염의 함량을 낮춘 것을 특징으로 하는
미세조류 배양용 배지. - 제1항에 있어서,
상기 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum) 미세조류는 기탁번호 KCTC18721인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지. - 제1항에 있어서,
상기 질소공급원은 효모, 카세인, MSG, 질산나트륨이 모두 혼합된 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지. - 제3항에 있어서,
상기 질소공급원의 혼합비는 효모 3:카세인 3:MSG 4:질산나트륨 6 인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지. - 제1항에 있어서,
상기 탄소공급원인 글루코오즈의 농도는 인공해수 1리터당 20g 내지 50g인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지. - 제5항에 있어서,
상기 탄소공급원인 글루코오즈의 농도는 인공해수 1리터당 40g인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지. - 제1항에 있어서,
상기 인산염의 함량은 1mM 내지 8mM인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양용 배지. - 질소 공급원으로 효모, 카세인, MSG(monosodium L-glutamate), 질산나트륨(NaNO3) 중 선택된 두개 이상을 혼합하여 사용하며;
탄소원으로 글루코오즈를 사용하며;
인산염의 함량을 낮춘 인공해수 배지를 이용하여 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum) 미세조류를 배양하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 쉬조키트리움 미누텀 종(Schizochytrium minutum) 미세조류는 기탁번호 KCTC18721인 것을 특징으로 하는 미세조류를 배양하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 질소공급원은 효모, 카세인, MSG, 질산나트륨이 모두 혼합된 것을 특징으로 하는 미세조류를 배양하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 질소공급원의 혼합비는 효모 3:카세인 3:MSG 4:질산나트륨 6 인 것을 특징으로 하는 미세조류를 배양하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 탄소공급원인 글루코오즈의 농도는 인공해수 1리터당 20g 내지 50g인 것을 특징으로 하는 미세조류를 배양하는 방법 - 제12항에 있어서,
상기 탄소공급원인 글루코오즈의 농도는 인공해수 1리터당 40g인 것을 특징으로 하는 미세조류를 배양하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 인산염의 함량은 1mM 내지 8mM인 것을 특징으로 하는 미세조류를 배양하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020180161375 | 2018-12-13 | ||
| KR20180161375 | 2018-12-13 |
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|---|---|---|---|
| KR1020190167275A KR20200074047A (ko) | 2018-12-13 | 2019-12-13 | Epa, dha 및 아라키돈산 고함량 기능성 유지 생산 방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20200074047A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022014824A1 (ko) * | 2020-07-17 | 2022-01-20 | 대봉엘에스 주식회사 | 불포화 지방산을 특정 함량으로 포함하는 유지 조성물 및 이의 용도 |
| WO2023135584A1 (en) * | 2022-01-17 | 2023-07-20 | Phycoil Biotechnology International, Inc. | Novel thraustochytrid strain for the production of biomaterials including long-chain polyunsaturated fatty acids |
| WO2023204396A1 (ko) * | 2022-04-18 | 2023-10-26 | 씨제이제일제당 (주) | 펩신 소화율이 우수한 고단백 미세조류 바이오매스, 배양 방법 및 이의 용도 |
-
2019
- 2019-12-13 KR KR1020190167275A patent/KR20200074047A/ko not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022014824A1 (ko) * | 2020-07-17 | 2022-01-20 | 대봉엘에스 주식회사 | 불포화 지방산을 특정 함량으로 포함하는 유지 조성물 및 이의 용도 |
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