KR20070041573A - 신규한 세포 보존 기술을 이용한 폴리불포화 지방산의 생산방법 - Google Patents

신규한 세포 보존 기술을 이용한 폴리불포화 지방산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

폴리불포화 지방산 또는 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물의 미생물 생산이 가능한 미생물의 보존 방법으로서, (a) 무기염 및 당류를 포함하는 영양원을 함유하는 pH 4-7의 포자-형성 배지에서 포자를 형성하고; (b) 포자 현탁액을 제조하기 위하여 상기 (a)에서 수득한 포자를 멸균수 또는 계면활성제 및/또는 무기염을 함유하는 멸균수로 현탁시키고, 저온 보존되는 포자 현탁액을 제조하기 위하여 5-15%의 항냉동제를 첨가하고; 및 (c) 상기 (b)에서 수득한 저온 보존되는 포자 현탁액을 -100℃와 -20℃사이에서 보존하는 것을 포함하는 것인 방법이다.
폴리불포화 지방산, 미생물 보존 방법

Description

신규한 세포 보존 기술을 이용한 폴리불포화 지방산의 생산 방법{METHOD FOR POLYUNSATURATED FATTY ACID PRODUCTION USING NOVEL CELL PRESERVATION TECHNIQUE}
본 발명은 지방산 성분으로써 폴리불포화 지방산을 포함하는 화합물을 생산하는 미생물을 포함하는 미생물체총량(microbial biomass)과 바이오매스로부터 추출하여 수득한 크루드 오일(crude oil) 및/또는 크루드 인지질, 크루드 오일 및/또는 크루드 인지질을 정제하여 수득한 정제된 지방 및 오일 및/또는 정제된 인지질, 뿐만 아니라 그 바이오매스 및 지방 또는 오일 (크루드 오일 및/또는 정제된 오일) 및/또는 인지질(크루드 인지질 및/또는 정제된 인지질)을 포함하고 있는 식품 및 음료, 치료적 영양 보충제, 동물 사료 및 약제의 생산 방법에 대한 것이다.
인간에서 폴리불포화 지방산(여기에서부터 약어 "PUFA"로 표시)의 생합성은 두 개의 대표적인 시리즈인, ω3 및 ω6 시리즈로 발생하고(여기에서 ω는 지방산의 메틸기 말단으로부터 계수된, 첫 번째 이중 결합을 갖는 탄소 원자의 수를 대표한다), ω6 지방산의 경우에 있어서, 예를 들어 리놀레산(linoleic acid, 18:2 ω6)은 반복된 불포화 및 탄소 사슬 신장에 의해 γ-리놀레산(18:3 ω6), 디호모-γ-리놀레산(20:3 ω6), 아라키돈산(20:4 ω6) 및 4, 7,10,13,16-도코사펜타에노 산(docosapentaenoic acid, 22:5 ω6)으로 전환된다.
이와 유사하게, ω3 지방산의 경우에는, α-리놀렌산(18:3 ω3)은 반복된 불포화 및 탄소 사슬 연장에 의해 에이코사펜타에노산(eicosapentaenoic acid, 20:5 ω3), 7, 10, 13, 16, 19-도코사펜타에노산(22:5 CG3) 및 4, 7, 10, 13, 16, 19-도코사펜타에노산(22:6 ω3)으로 전환된다. 특히, ω3 PUFAs 에이코사펜타에노산 (여기에서부터, "EPA"이라 함) 및 도코사펜타에노산(여기에서부터, "DHA"이라 함)은 학습 강화 효과(learning reinforcement effects) 뿐만 아니라 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis) 및 혈전증(thrombosis)과 같은 성인병에 대한 예방 효과 또는 항암 효과를 포함하는 다양한 생리적인 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있고, 약학 및 특정 건강 식품에 있어서 이들을 이용하려는 많은 시도들이 있었다. 그러나, ω3 타입보다 PUFA(이를 테면, ω6과 ω9)의 생리적인 기능이 최근 주목받고 있다.
아라키돈산은 혈액 및 간과 같은 생체 기관의 지방산 성분의 약 10%를 구성하고 있고(예를 들어, 인간의 혈액에 있어서 지방산의 인지질에 대한 구성성분의 비율은 11% 아라키돈산, 1% 에이코사펜타에노산, 3% 도코사펜타에노산이다), 세포막의 주요 구조적 성분으로서, 그것은 막 유동성을 조절하고, 신체에서 다양한 대사기능을 수행하고, 그와 동시에 또한 프로스타글란딘의 직접적인 전구체로서 중요한 기능을 한다. 최근 양육중인 유아의 영양성분 및 신경 작용 효과를 나타내는 내생적인 칸나비노이드(2-아라키도닐 모노글라이세롤 및 아난다마이드)의 지방산 구성성분으로의 역할이 알려졌다. 보통, 리놀렌산-풍부한 식품의 섭취는 그것들의 아 라키돈산으로의 전환을 유도하지만, 그것의 생합성에 관련된 효소들의 기능이 유아 또는 노년층뿐만 아니라 성인병 또는 초기 증상을 갖고 있는 환자들에 있어서 감소되었고, 그런 개인들은 아라키돈산이 부족한 경향이 있다; 그러므로 지방 또는 오일 (트리글라이세라이드)의 지방산 형태로 직접적인 섭취 수단이 제공되는 것이 바람직하다.
비록 생선 오일이 EPA 및 DHA와 같은 ω3 PUFAs의 풍부한 원천이 되지만, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 4, 7, 10, 13, 16-도코사펜타에노산(22:5 ω6)과 같은 ω6 PUFAs은 전통적인 지방 또는 오일 원천으로부터 사실상 수득하기 힘들고, 그러므로 미생물의 발효에 의해 수득되는 지방산 성분으로서 PUFAs를 포함하는 지방 및 오일 (여기에서부터 "PUFAs-함유 지방 및 오일"로 표시함)이 현재 가장 일반적으로 이용된다. 예를 들어, 지방산 성분으로서 아라키돈산을 포함하는 지방 및 오일(여기에서부터 "아라키돈산-함유 지방 및 오일"로 표시함)을 수득하는 방법을 제공하고, 이는 아라키돈산-함유 지방 및 오일을 생산할 수 있는 다양한 미생물을 배양함으로써 가능하다.
지방산 부분을 구성하는 아라키돈산을 고비율로 갖는 지방 및 오일(여기에서부터 "아라키돈산-풍부 지방 및 오일"이라 함)은 몰티에렐라(Mortierella, 일본특허공개공보 소화 63-44891호, 일본특허공개공보 소화 63-12290호) 속에 속하는 미생물을 이용함으로써 수득될 수 있다. 최근 수년간, 아라키돈산의 필수적인 이용 중의 하나는 양육중인 유아의 영양물 분야로서, 예를 들어, 변형된 우유의 발효에 의해 수득되는 아라키돈산-함유 지방 및 오일의 특이적 이용이 도입되었다. 아라키 돈산-함유 지방 및 오일의 새로운 효과가 증명되었고(일본특허공개공보 제2003-48831호: Composition with prophylactic or ameliorative effect on symptoms and conditions associated with brain function impairment), 이들은 미래에 수요가 클 것으로 기대된다.
몰티에렐라 미생물을 배양함으로써 수득되는 지방 및 오일은 크게 트리글라이세라이드 (약 70% 또는 그 이상) 및 인지질로 구성되어 있다. 식용가능한 지방 및 오일은 트리글라이세라이드 형태로 되어 있고, 상기에서 언급한 용도의 목적을 위해, 그 세포에 의해 생산된 오리지날 지방 및 오일("크루드 오일"로서 알려진, 세포로부터의 추출에 의해 수득된 지방 및 오일)은 그 미생물을 배양함으로써 생산된 세포 바이오매스로부터 추출된 것이고, 그때 크루드 오일은 인지질을 뺀 정제된 지방 및 오일을 수득하기 위하여, 식용이 가능한 지방/오일 정제 단계(탈검, 탈산, 탈취, 탈색)가 수행된다.
몰티에렐라 미생물을 배양함으로써 수득된 PUFA-함유 지방 및 오일은 균사(hyphae)에 축적되기 때문에, 배양액 당 PUFA-함유 지방 및 오일의 수율을 증가시키기 위해서, 배양은 반드시 고 농도에서 수행되어야만 하고, 이것이 지방/오일 생산의 경제성을 증대시킨다. 배양액 당 PUFA-함유 지방 및 오일의 수율은 세포 농도 및 세포 당 PUFA-함유 지방/오일 함유량의 산물이고, 그러므로 세포 농도 및 세포 당 PUFA-함유 지방/오일 함유량을 모두 증가시킬 필요가 있다. 세포 농도는 배지의 질소원의 농도를 증가시킴으로써 증가될 수 있고, 이는 보통 세포 성분으로 전환된다.
세포 당 PUFA-함유 지방/오일 함유량은 오직 세포 형태를 만족스럽게 조절함으로써, 그리고 적절히 산소를 공급하여 배양함으로써만이 증가시킬 수 있다. 세포 형태를 조절하기 위한 알려진 방법은 최적의 배지 염 조성물을 포함하는 것이고(일본 국내 재공개 제98/029558호), 산소를 공급하는 방법은 가압 배양 방법 및 산소가 풍부한 호기성 배양 방법을 포함한다(일본특허공개공보 평성 06-153970호). 그러나, 이들 방법은 배양 조건에 있어서의 미차에 의해 영향을 받기 때문에, 배양의 재현성을 확보하는 것은 어렵고, 결과적으로 안정한 생산 산출을 성취하기란 불가능하다.
특허 서류 1: 일본특허공개공보 소화 63-44891호
특허 서류 2: 일본특허공개공보 소화 63-12290호
특허 서류 3: 일본특허공개공보 제2003-48831호
특허 서류 4: 일본국내재공개 제98/029558호
특허 서류 5: 일본특허공개공보 평성 06-153970호
그러므로, 미생물에 의한 PUFA-함유 지방 및 오일의 안정한 생산을 확보하기 위하여, 배양의 재현성을 확보하기 위한 방법의 개발이 요구된다.
본 발명자들은 미생물을 배양함으로써 PUFA-함유 지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 PUFA-함유 인지질을 생산하는 동안 배양된 세포 성장 단계에 영향을 미치는 초기 배양 상태 조건에 대하여 조사한 결과, 전 단계로부터 균사 또는 포자로의 이식 상태를 개선함으로써, 배양의 재현성을 증가시키고 PUFA-함유 지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 PUFA-함유 인지질을 안정하게 생산할 수 있는 것이 가능함을 발견하였다.
그러므로, 본 발명에 따르면, PUFA-함유 지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 PUFA-함유 인지질 및/또는 PUFA-함유 세포를 생산하는 방법을 제공할 수 있고, 이 방법은 개선된 배양의 재현성 및 PUFA-함유 지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 PUFA-함유 인지질의 안정한 생산에 근거하며, 그 방법은 전단계에서 균사 또는 포자로의 이식 상태를 개선함을 특징으로 한다.
특히, 본 발명은 폴리불포화 지방산 또는 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물의 미생물 생산이 가능한 미생물의 보전을 위한 방법으로서, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 무기염 및 당류(saccharide)를 포함하는 영양원을 함유하는 pH 4-7의 포자-형성 배지에서 포자 형성; (b) 포자 현탁액을 준비하기 위하여 상기 (a)에서 수득한 포자를 살균한 물, 또는 계면활성제 및/또는 무기염을 함유하는 살균된 물에서 현탁하고, 포자 현탁액을 저온에서 보존하기 위하여 5-15%로 항냉동제를 첨가; 및 (c) 상기 (b)에서 수득한 저온 보존되는 포자 현탁액을 -1000℃와 -20℃ 사이에서 보존.
이 방법에 있어서, 무기염들은 질산나트륨(sodium nitrate), 제2인산칼륨(dipotassium hydrogen phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 염화칼륨(potassium chloride) 및 황산 제1철(iron (I) sulfate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 무기염이 바람직하고, 그 포자-형성 배지는 pH 4-7로 조절된 크자펙 아가 배지(Czapek agar medium) 또는 크자펙-독스 아가 배지(Czapek-Dox agar medium)가 바람직하다.
이 방법에서 사용한 항냉동제는 글라이세린이 바람직하다.
폴리불포화 지방산 또는 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물의 예는 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 트리글라이세라이드 및 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 인지질을 포함하고, 여기에서 그 폴리불포화 지방산은 ω6 불포화 지방산, ω3 폴리불포화 지방산 또는 ω9 폴리불포화 지방산, 또는 이들의 조합이 바람직하다.
상기에서 언급한 ω6 불포화 지방산은 9,12-옥타데카디에노산(리놀렌산) 18:2ω6, 6, 9, 12-옥타데카트리에노산(γ-리놀렌산) 18:3ω6, 8, 11, 14-에이코사테트라에노산(아라키돈산) 20:4ω6, 7, 10, 13, lβ-도코사테트라에노산 22:4ω6 또는 4, 7, 10, 13, 16-도코사펜타에노산 22:5ω6이 바람직하다.
상기 ω3 불포화 지방산은 9, 12, 15-옥타데카트리에노산(α-리놀렌산) 18:3ω3, 6, 9, 12, 15-옥타데카테트라에노산(스테아리돈산) 18:4ω3, 11, 14, 17-에이코사트리에노산(디호모-α-리놀렌산) 20:3ω3, 8,11,14,17-에이코사테트라에노산 20:4ω3, 5,8,11,14,17-에이코사펜타에노산 20:5ω3, 7,10,13,16,19-도코사펜타에노산 22:5ω3 또는 4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노산 22:6ω3이 바람직하다.
상기 언급한 ω9 불포화 지방산은 6, 9-옥타데카디에노산 18:2ω9, 8,11- 에이코사디에노산 20:2ω9 또는 5, 8, 11-에이코사트리에노산 (미드 산, Mead acid) 20:3ω9이 바람직하다.
상기에서 기재한 방법에 이용된 미생물은 몰티에렐라 알피나(Mortierella alpina)와 같은 몰티에렐라 속 미생물 바람직하다.
본 발명은 폴리불포화 지방산 또는 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물의 생산방법으로서, 상기에서 기재한 방법에 의해 보존되는 미생물을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시를 위한 최선의 방식
좀더 특별하게, 액체 배양에 있어서 몰티에렐라 곰팡이(filamentous fungi)의 시간-의존적 변화의 양상 중 하나는 세포 증식(세포 성장 단계)에 의한 세포 매스(cellular mass)에 있어서 증가이다. 세포 매스에 있어서의 증가가 중지된 후에야 PUFA-함유 지방 및 오일의 세포내 축적이 증가하고, 이는 PUFA-함유 지방 및 오일의 풍부한 세포내 축적을 초래한다. 본 발명자들은 약 2일의 세포 성장 단계로 배양하고, 지방/오일 축적 단계를 6일 동안 수행하였음을 이미 발표하였다(J. Biosci. Bioeng., 87:489- 494, 1999).
또한 세포 형태는 세포 성장기 동안에 필수적으로 결정되는데, 초기 배양 조건의 세팅 및 관리가 가장 중요한 것임을 제시하였다. 그러나, 초기 배양 조건을 세팅하고 관리하는 것이 중요한 것처럼 보인다 할지라도, 초기 배양 조건의 세팅에 대한 자료는 없으며, 특히 균사 또는 포자로의 이식 조건에 대한 자료 역시 없다. 여기에 초점을 맞추어, 본 발명자들은 배양 결과에 지대한 영향을 미치는 이식 방법 및 이식 방법이 PUFA-함유 지방 및 오일의 생산성을 개선시키는데 현저하게 기여하는 이식 방법을 개선하는 방법을 발견하기 위한 자료 조사를 수행하였다.
미생물을 액체 배양함으로써 지방산을 구성성분으로서 폴리불포화 지방산을 포함하는 화합물 (PUFA-함유 지방 및 오일, 및/또는 PUFA-함유 인지질)을 수득하기 위하여, 적은 양의 보전된 균주 세포를 배양액에 최초로 씨딩(seeding)하고 증식하도록 하였다(첫 번째 종균 배양 단계). 그 다음, 대-규모 배지로의 성공적으로 옮겨 규모를 증대시키고, 주배양은 미생물 매스가 PUFA-함유 지방 및 오일의 수득을 커버가 되는 배양의 최종 단계이다. 종균 배양(seed cultureing)은 성공적인 계대배양(subculturing)에 의해 규모를 확대시키는 동안 각 단계에의 배양을 의미한다.
이미 알려진, 세포를 보존하는 방법은 아가 사면 배양(agar slant medium)에서 배양된 세포가 5℃ 냉장고 또는 -20℃ 냉동기에서 보존되는 것인 방법, 곰팡이 포자 현탁은 5℃ 냉장고에서 보존되는 것인 방법, 항냉동제가 첨가되고 그 세포는 액체 질소 냉동고에서 보존되거나 -150℃와 액체 질소에 의해 형성된 -196℃사이의 초저온에서 보존되는 것인 방법, 세포가 토양 배양되고 건조되는 것인 방법, 및 세포가 냉동-건조 및 냉동되는 것인 방법을 포함한다("Hakko Kogaku no Kiso [Fundamentals of Fermentation Engineering]" 1988, translated by Ishizaki, F. , Center for Academic Publications, Japan).
또한, "바이오기술 및 산업을 위한 배양액 유지(Maintaining cultures for Biotechnology and Industry)" (edited by J.C. Hunter-Cevera & A. Belt, Academic Press, 1996)은 사면에서 -20℃ 보존, 액체 질소 보존 및 냉동-건조된 보존을 비교하고, 생존 비율 및 생산력의 유지에 대한 효과를 개괄하였다. 이 자료에 의하면, 사면에서 -20℃ 보존의 방법이 가장 만족스러운 생존 비율 및 생산력 유지를 제공한다고 한다(p.25).
곰팡이(filamentous fungi)를 위해, 이 자료는 살아 있는 순수한 상태로 세포를 안정적으로 유지하는 것은 매우 어렵다고 교시하고, 비록 모든 곰팡이에 넓게 적용할 수 있는 방법이 없더라도 액체 질소에서의 보존이 가장 이상적으로 고려될 수 있음을 교시하고 있다(ibid, p.105). 다양한 항냉동제를 이용하는 예의 목록이 또한 주어졌고, 모든 선행 기술은 액체 질소 보존 또는 냉동-건조의 조합이다 (ibid, p.118, Table 4). 1 기압에서의 액체 질소의 녹는점은 -195.8℃이기 때문에, 액체 질소 저장에서의 온도는 약 -196℃에서 유지된다. 몰티에렐라 속 곰팡이의 경우, 보존 방법 및 종균 배양으로의 트랜스퍼 방법은 크자펙 아가 배지에서 사면 냉장 보존을 하는 것으로 이는 본 발명자들의 논문에 기재되어 있다(J. Am. Oil Chem. Soc, 75:1501-1505(1998)). 박 등의 논문(Biotechnol. Bioprocess Eng., 6:161-166(2001))에서, 여기에서 이용된 방법은 아가 사면 배지에 의해 103 포자/㎖에서의 포자 현탁 보존 및 그것의 배지로의 트랜스퍼에 대한 것이다.
초기 배양을 위한 조건의 세팅 및 관리의 중요성에 비추어, 본 발명자들은 또한 초기 배양에 영향을 미치는 세포 보존의 중요성에 초점을 맞추어 리서치를 하였다. 그 결과, 항냉동제를 첨가하고, -100℃와 -20℃ 사이에서의 혼합물을 보존하는 방법이 기존 논문에서 발표된 사면 보존, 액체 질소 보존 또는 냉동-건조 보존과 구별되는 새로운 방법으로 효과적인 것임을 발견하였으며, 최상의 포자 현탁액을 준비하기 위한 방법 또한 발견하였다.
본 발명의 목적은 PUFA-함유 지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 PUFA-함유 인지질 및/또는 PUFA-함유 세포를 생산하는 방법을 제공하는 것이며, 여기에서 PUFA-함유 지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 PUFA-함유 인지질은 배양의 개선된 재현성을 갖는 안정한 방법으로 생산되고, 그 방법은 신규한 보존된 세포 세포를 제조하는 방법 및 보존 방법에 의해 보존된 계대배양된 세포에 의한 것임을 특징으로 한다.
본 발명은 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물(지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 인지질)의 생산 및 신규한 보존된 세포를 제조하는 방법 및 보존 방법에 의해 보존된 세포의 계대배양에 의해 그 화합물(지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 인지질)을 생산하는 미생물 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
그러므로, 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물(지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 인지질)을 생산할 수 있는 미생물의 배양이 필수적이다. 이와 관련된 미생물은 트리글라이세라이드 및/또는 인지질의 지방산의 주요 성분으로서 18 또는 그 이상의 탄소수 및 3개 이상의 이중 결합을 갖고 있는 ω6 폴리불포화 지방산, 18 또는 그 이상의 탄소수 및 2개 이상의 이중결합을 갖는 ω9 폴리불포화 지방산 및 18 또는 그 이상의 탄소수 및 3개 이상의 이중 결합을 갖는 ω3 폴리불포화 지방산 중에서 적어도 한 가지의 폴리불포화 지방산을 생산하는 미생물이 바람직하다.
18 또는 그 이상의 탄소수 및 3개 이상의 이중 결합을 갖는 ω6 폴리불포화 지방산으로서는, γ-리놀렌산(6,9,12-옥타데카트리에노산), 디호모-γ-리놀렌산(8,11,14-에이코사트리에노산), 아라키돈산(5,8,11,14-에이코사테트라에노산), 7, 10, 13, 16-도코사테트라에노산 (22:4 ω6) 및 DPAω6 (4, 7, 10, 13, 16-도코사펜타에노산)이 있다.
18 또는 그 이상의 탄소수 및 두개 이상의 이중 결합을 갖는 ω9 폴리불포화 지방산으로는, 6, 9-옥타데카디에노산, 8,11-에이코사디에노산 및 미드 산(5,8,11-에이코사트리에노산)이 있으며,
18 또는 그 이상의 탄소수 및 3개 이상의 이중 결합을 갖는 ω3 폴리불포화 지방산으로는, α-리놀렌산(9,12,15-옥타데카트리에노산), 6,9,12,15-옥타데카테트라에노산(18:4ω3), 8,11,14,17-에이코사테트라에노산(20:4ω3), EPA(5,8,11,14,17-에이코사펜타에노산), DPAω3(7,10,13,16,19-도코사펜타에노산) 및 DHA(4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노산)이 있다.
그러므로, 본 발명에 따르면, 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물 (지방/오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 인지질)을 생산할 수 있는 미생물은 어느 것이라도 이용될 수 있다. 지방산 성분으로서 아라키돈산을 함유하는 오일 및 지방 (트리글라이세라이드)를 생산할 수 있는 미생물의 예로서, 몰티에렐라(Mortierella) 속, 코니디오볼루스(Conidiobolus) 속, 피시움(Pythium) 속, 피토프토라(Phytophthora) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 클라도스포리움(Cladosporium) 속, 뮤코(Mucor) 속, 푸사륨(Fusarium) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 로도토룰라(Rhodotorula) 속, 엔토모프토라(Entomophthora) 속, 에치노스포란지움(Echinosporangium) 속 및 사프로레그니아(Saprolegnia) 속에 속하는 곰팡이가 있다. 몰티에렐라 속, 몰티에렐라 아속(subgenus)에 속하는 곰팡이의 예로는, 몰티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua), 몰티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) 및 몰티에렐라 알피나(Mortierella alpina)가 있다. 더욱 특이하게는, 몰티에렐라 에롱가타(Mortierella elongata) IFO8570, 몰티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 몰티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 및 몰티에렐라 알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68, 등이 있다.
DHA를 생산할 수 있는 미생물의 예로서는, 크립테코데니움(Crypthecodenium) 속, 트라우토카이트리움(Thrautochytrium) 속, 시조카이트리움(Schizochytrium) 속, 울케니아(Ulkenia) 속, 자포노카이트리움(Japonochytrium) 속 및 할리프토로스(Haliphthoros) 속이 있다. 이들 모든 균주들은 특별한 제한이 없이도 IFO(Institute for Fermentation, Osaka), ATCC(American Type Culture Collection), 또는 CBS(Centralbureau voor Schimmelcultures)로부터 입수할 수 있다. 본 발명의 리서치 그룹에 의해 토양으로부터 분리한 몰티에렐라 알피나 1S-4 및 몰티에렐라 에론가타 SAM0219(FERM-P 8703) (FERM-BP 1239) 균주 또한 사용될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 균주의 배양을 위해, 수득된 균주의 보존된 세포들을 우선 준비하는 것이 필요하다. 보존된 세포들의 준비 방법은 첫째 포자-형성 배지를 준비하는 것과 관련되어 있다. 포자-형성 배지는 다음 성분들의 일부 또는 전부를 포함하는 배지를 준비함으로써 생산된다: 당류와 함께, 질산 나트륨, 제이인산칼륨, 황산마그네슘, 염화칼륨 및 황산제일철, pH 4-7, 바람직하게는 pH 5-6.5로 조정한다. 아가를 준비된 배지에 첨가하고 열살균을 수행한 후에, 차가운 고체 배지가 포자-형성 배지로 이용된다. 포자-형성 배지는 균사 성장 및 포자 형성이 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않고, 다만 포자 형성에 적절한 pH 4-7의 범위를 갖는 것을 특징으로 한다.
특정예에서처럼, 염산 또는 황산을 pH 6.0으로 조정하기 위하여 크자펙 아가 배지(2 g/ℓ 질산나트륨, 1 g/ℓ제이인산칼륨, 0.5 g/ℓ황산마그네슘 7수화물, 0.5 g/ℓ 염화칼륨, 0.01 g/ℓ 황산 제1철 7수화물, 30 g/ℓ 수크로오스, 13 g/ℓ 아가)에 첨가함으로써 수득된 배지이다.
이 방법은 사면배지 또는 플레이트 배지를 제조하는데 이용되고, 균사 또는 포자는 호기성 상태에서 고체배양을 위한 배지로 접종된다. 배양 온도는 세포 성장 및 포자 형성을 위해 0-40℃에서 유지되고, 바람직하게는 10-35℃, 더욱 바람직하게는 15-30℃로 유지된다. 배양 온도는 배양이 되는 동안 변할 수 있으며, 예를 들어, 25℃에서의 성장 후에 5℃에서 배양할 수 있다.
포자 형성을 확인한 후에, 멸균수가 고체 배양된 균사에 첨가되고, 그 혼합물은 포자 현탁액을 수득하기 위한 통상의 방법에 의해 교반된다. 첨가된 멸균수에 있어서 첨가제에 대한 특별한 제한은 없고, 대신 정제된 물 대신에 부가적인 계면활성제, 무기염 또는 그와 유사한 것을 함유하는 물 또는 생리식염수가 사용가능하다. 교반 방법은 고체 배양관으로 외부의 힘을 적용하는 것과 관련되어 있거나, 멸균된 브러쉬 또는 그와 유사한 것으로 균사에 직접적으로 힘을 작용시킬 수 있다.
이 방법으로 수득되는 포자 현탁액 또는 포자와 균사의 현탁액은 보전 표준 원액(stock solution)으로서 이용된다. 보존 표준 원액은 최종 보존 표준 원액을 준비하기 위하여 멸균수 또는 계면활성제 도는 무기염을 함유하는 용액으로 희석될 수 있다. 그 후, 항냉동제가 그 보존 표준 원액에 첨가된다. 그 항냉동제는 일반적으로 사용되는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 아가 분말, 소태아 혈청, DMSO, 글라이세린, 이노시톨, 폴리비닐 알콜, 탈지유(skim milk)와 그와 유사한 것 중에서 선택되는 어느 하나 이상이 첨가될 수 있다. 특정예로서, 글라이세린은 보존 용액에서 10% 글라이세린 농도로 그 항냉동제에 첨가될 수 있다.
그 항냉동제(cryoprotectant)를 첨가한 후에, 보존 용액은 보존 용기에 넣어둔다. 그 용기는 적절하게 멸균된 플라스틸 튜브 또는 그와 유사한 것이다. 특정예로서, 보존 용액은 멸균 과정에 의해 1.2㎖ 부피의 냉동 유리병(cryogenic vial)에 넣어둔다. 그 다음, 보존 용액은 극저온 냉동고에서 저장한다. 극저온 냉동고 내부의 온도는 -100℃와 -20℃사이의 범위에서 조절되고, 바람직하게는 -90℃에서 -30℃사이의 온도, 더욱 바람직하게는 -85℃에서 -50℃사이의 온도에서 조절된다.
이 방법으로 극저온 냉동고에서 저장된 세포들은 오랜 기간 동안 안정하게 보존될 수 있다.
보존된 세포들이 배양을 위해 사용될 때, 그 보존 용액이 처음으로 해동된다. 해동은 가능한한 빠르게 수행되어야만 하고, 바람직하게는 40℃ 이하의 온도에서 30초내에, 더욱 바람직하게는 30℃ 이하의 온도에서 30초 이내에, 가장 바람직하게는 30℃ 이하의 온도에서 10초 내에 수행되어야 한다.
이 방법으로 해동된 보존 용액은 배양을 위해 액체 배지로 옮겨진다. 사용된 탄소원은 글루코오스, 프룩토오스, 자일로오스, 수크로오스, 말토오스, 가용성 녹말, 당밀(molasses), 글라이세롤, 만니톨 또는 당화 녹말과 같은 일반적인 것이 사용될 수 있고, 이에 어떤 제한은 없다.
질소원으로는, 요소(urea)를 포함하는 유기 질소원 또는 질산 나트륨, 질산 암모늄 및 황산 암모늄과 같은 무기 질소원뿐만 아니라 펩톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 고기엑스, 카사미노산(casamino acid), 콘 스팁 리퀴르(corn steep liquor), 대두 단백질, 탈지대두 및 면실박(cotton seed meal)과 같은 천연 질소원이 사용될 수 있고, 그 중에서 특히 대두로부터 수득된 질소원으로, 특히 대두, 탈지 대두, 대두 플레이크(soybean flakes), 식용 대두 단백질, 오카라(okara), 대두유, 콩가루 및 그와 유사한 것으로부터 수득된 질소원이 있다. 열 변성된 탈지 대두를 이용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 약 70-90℃에서 열 처리되고 에탄올-가용 성분들이 제거된 탈지 대두의 하나 이상의 다른 타입들이며, 임의적으로 상기에서 언급된 질소원들을 조합하여 사용할 수 있다.
만약 필요하다면, 인산염 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 또는 칼슘 이온, 철, 구리, 아연, 망간, 니켈 또는 코발트와 같은 금속 이온들을 포함하는 미량 원소들, 또는 비타민이 첨가될 수 있다. 그런 배지 성분들은 미생물의 성장을 방해하지 않는 한 특별한 제한이 없다. 특정 구체예에서, 탄소원은 일반적으로 총 농도의 0.1-40wt%, 바람직하게는 1-25wt% 첨가되고, 질소원은 총 농도의 2-15wt%, 바람직하게는 2-10wt% 첨가되고, 특히 1-5wt%의 초기 탄소원 및 3-8wt%의 초기 질소원이 첨가되고, 배양하는 동안 탄소원 및 질소원 (바람직하게는 탄소원 단일)을 더 피딩한다.
PUFA-함유 지방 또는 오일의 수율은 불포화 지방산 전구체를 이용함으로써 증가될 수 있고, 예를 들어, 헥사데칸(hexadecane) 또는 옥타데칸(octadecane)과 같은 탄화수소; 올레산 또는 리놀렌산 또는 그들의 염과 같은 지방산, 에틸 에스테르, 글라이세린 지방산 에스테르 또는 솔비탄 지방산 에스테르와 같은 지방산 에스테르, 지방 또는 올리브 오일, 대두 오일, 유채유(rapeseed oil), 면실유(cottonseed oil) 또는 코코넛 오일과 같은 오일, 이들 중 단독 또는 조합이 있다. 기질의 첨가는 배지에 대해 0.001-10%에서, 바람직하게는 0.05-10%으로 첨가된다. 그런 기질들은 배양을 위한 단독 탄소원으로서 이용될 수도 있다.
PUFA-함유 지방 또는 오일을 생산하는 미생물을 위한 배양 온도는 사용된 미생물에 따라 다를 것이며, 5-40℃, 바람직하게는 20-30℃가 될 것이고, 20-30℃에서 배양되어 성장된 세포들은 PUFA-함유 지방 및 오일을 생산하기 위하여는 그 후에 5-20℃에서 배양되어야 한다. 그러한 온도 조절은 PUFA-함유 지방 및 오일에서 지방산 성분의 PUFAs의 부분을 증가시킬 수 있다. 종균 배양은 발효조 배양(jar fermenter culturing), 교반 배양(shake culturing) 또는 고정상 액체 배양(stationary liquid culturing)에 의해 수행될 수 있고, 발효조 배양은 주배양으로 수행된다. 주배양의 출발 배지 pH(종균 배양을 옮겼을 때)는 5-7로 조절하고, 바람직하게는 5.5-6.5로 조절한다. 종균 배양의 단계를 위한 배양 기간은 일반적으로 1-10일, 바람직하게는 1-5일, 더욱 바람직하게는 1-3일이다. 주배양을 위한 배양기간은 일반적으로 2-30일, 바람직하게는 5-20일, 더욱 바람직하게는 5-15일이다.
몰티에렐라 속 몰티에렐라 아속에 속하는 미생물은 지방산 주성분으로서 아라키돈산을 함유하는 화합물(지방 및 오일(아라키돈산-함유 트리글라이세라이드) 및/또는 아라키돈산-함유 인지질)을 생산하는 것으로 알려져있으나, 상기 균주의 돌연변이 생성을 통해, 본 발명자들은 지방산 주성분으로서 디호모-γ-리놀렌산을 함유하는 지방 및 오일을 생산할 수 있는 미생물을 수득하는데 성공하였고(일본특허공개공보 제5-91887호), 지방산 주성분으로서 ω9 폴리불포화 지방산을 함유하는 지방 및 오일을 생산할 수 있는 미생물을 수득하는데 성공하였다(일본특허공개공 평성 5- 91888호).
추가로, 우리는 고농도 탄소원에 저항성을 갖는 미생물들을 수득하였으며(일본특허공개공보 평성 5-9188호, 일본특허공개공보 평성 10-57085호, 일본특허공개공보 평성 5-91886호), 몰티에렐라 속 몰티에렐라 아속에 속하는 곰팡이며, 본 발명에 따른 배양 방법, 특히 신규한 보존된 세포 제조 방법 및 저장 방법에 의해 저장된 보존된 균주를 이용하여 배양함으로써 PUFA-함유 지방 및 오일 및/또는 PUFA-함유 인지질을 생산할 수 있다. 그러나, 본 발명은 몰티에렐라 속 몰티에렐라 아속에 속하는 곰팡이에 한정되지 않고, 본 발명의 배양 방법은 목적으로 하는 미생물 바이오매스, 크루드 오일 및/또는 크루드 인지질, 정제된 지방 및 오일 및/또는, 크루드 오일 및/또는 크루드 인지질을 정제함으로써 수득되는 정제된 인지질을 수득하기 위하여 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물(지방 및 오일(트리글라이세라이드) 및/또는 인지질)을 생산할 수 있는 미생물에 적용될 수 있다.
세포에 축적된 지방 또는 오일을 가지고 있는 미생물로부터 크루드 오일 및/또는 크루드 인지질을 수득하는 방법은 직접적으로 전체 배양된 용액을 처리하거나 또는 살균, 농축 및 산성화 후에 처리하거나, 그 후에 천연 침전, 원심분리 및/또는 여과와 같은 보통의 고체/액체 분리 수단에 의해 배양된 세포를 회수하는 것을 포함한다. 고체/액체 분리는 응집제(aggregating agent) 또는 여과기(filtering aid)를 첨가하여 보조될 수 있다. 응집제의 예로는 염화 알루미늄, 염화 칼슘, 알긴산(algin) 및 키토산을 포함한다. 규조토(Diatomaceous earth)는 여과기로서 언급될 수 있다. 배양된 세포들은 세척하고, 파열하여 건조시키는 것이 바람직하다. 건조는 냉동 건조, 통풍 건조(blow drying), 유동상 건조(fluidized bed drying) 또는 그와 유사한 것에 의해 수행된다.
건조된 세포로부터 크루드 오일 및/또는 크루드 인지질을 재생시키는 수단은 유기 용매 추출법 또는 압축법이 있으며, 그러나 질소 분위기 하에서 유기 용매로 추출하는 것이 바람직하다. 유기 용매로서는, 에탄올, 헥산, 메탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 석유에테르(petroleum ether), 아세톤 및 그와 유사한 것이 있으며, 또는 메탄올과 석유에탄올 또는 클로로포름-메탄올-물의 단층 용매 시스템으로 교차 추출을 할 수 있다. 그러나, 크루드 오일 및/또는 크루드 인지질을 수득하기 위해 사용된 추출방법은 상기에 기재된 방법에 한정되지 않고, 대신에 세포 지방 및 오일 (트리글라이세라이드) 및/또는 인지질의 효과적인 추출을 성취하는 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 초임계 CO2 흐름으로의 추출이 효과적인 방법이다.
유기 용매 또는 초임계 흐름을 이용한 추출에 의해 수득된 추출물로부터 유기 용매 또는 초임계 흐름 성분의 감압 이동에 의해, 표적 크루드 오일 및/또는 크루드 인지질을 획득할 수 있다. 뿐만 아니라, 이 경우에, 크루드 오일 및/또는 크루드 인지질은 건조된 세포로부터 동일한 방법에 의해 추출되고, 그러나 추출 효율은 메탄올, 에탄올 또는 아세톤, 또는 물 및/또는 다른 용매로 이들 중 어느 것을 포함하는 친수성 혼합물과 같은 친수성 용매를 사용함으로써 더 증대된다.
본 발명에 따라 수득된 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유한 미생물 바이오매스, 또는 크루드 오일 및/또는 크루드 인지질은 동물 사료에 직접적으로 통합되어 사용될 수 있다. 그러나, 식품에 적용하기 위하여는, 일반 지방/오일 정제 공정을 사용하는 것이 바람직하다. 여기에 사용되는 지방/오일 정제 공정은 탈검, 탈산, 탈취, 탈색, 컬럼 처리, 분자 증류(molecular distillation), 냉동( wintering) 또는 그와 유사한 일반적인 공정인 것이다.
본 발명의 미생물 바이오매스, 크루드 오일, 정제된 지방 및 오일(트리글라이세라이드), 크루드 인지질 및 정제된 인지질의 수많은 용도가 존재한다: 예를 들어, 식품, 음료, 화장품 및 약제의 출발물질 및 첨가제로서 사용된다. 용도의 목적 및 용도의 범위는 또한 거의 무제한 적이다.
식품 조성물의 예로서, 전술한 일반 식품뿐만 아니라, 기능 식품, 영양 보충제, 미숙아를 위한 변형된 우유, 출생 유아를 위한 변형된 우유, 양육중인 유아의 변형된 우유, 유아 식품, 어머니용 식품 또는 노인용 식품이 있다. 지방/오일-함유 식품의 예로는, 전술한 고기, 생선 및 견과류와 같은 천연 지방/오일-함유 식품, 수프와 같이 제조 동안 지방/오일이 첨가된 식품, 도넛과 같이 가열 처리에 의해 지방/오일이 함유되는 식품, 버터와 같은 지방 및 오일 식품, 쿠키와 같이 가공 동안 지방/오일이 첨가되는 가공식품, 또는 하드 비스킷과 같이 마감처리에서 지방/오일이 분무 또는 코팅되는 식품이 있다. 그러한 조성물들은 지방 또는 오일이 함유되지 않은 농업용 식품, 발효식품, 생가축 사료, 해양 식품 및 음료에 또한 첨가될 수 있다. 또한 기능 식품 또는 약제의 형태가 될 수 있으며, 그 예로, 장 영양제, 분말, 과립제, 정제(lozenges), 경구 용액, 부유물(suspensions), 에멀젼, 시럽 및 그와 유사한 것의 형태로 제조된다.
본 발명은 하기 예들에 의해 더욱 상세하게 설명될 것이고, 본 발명은 거기에 제한되지 않는다.
실시예 1. 포자 현탁액의 저온 보존 방법
몰티에렐라 알피나 1S-4를 아라키돈산-생산 균주로 이용하였다. 고정상 배양(Stationary culturing)은 테스트 튜브의 크자펙 아가 배지(pH 6.0으로 조절되고 멸균된 것임)에서 사면으로 25℃에서 7일 동안 수행하였고, 그 후 균사 성장을 확인한 후에, 테스트 튜브는 10일 동안 냉장고(4℃)에서 저장되었다.
멸균수를 그 테스트 튜브에 첨가하고, 그 혼합물은 포자 현탁액 준비하기 위해 교반되었다. 포자 현탁액은 적절히 희석하고, 감자 덱스트로즈 아가 배지 플레이트에 도말하고, 콜로니 계수법을 이용하여 포자 현탁액에서 포자를 계수하였으며, 그 결과는 1×106 포자/㎖ 이었다. 그 후, 포자 현탁액은 멸균수로 100배 희석하였다. 그 희석된 포자 현탁액, 글리세린 및 물을 다음의 비율로 혼합하였다: 희석된 포자 현탁액:글리세린:물=1:1:8 (부피비)(그 물 및 글리세린은 미리 혼합하여 멸균시켰다). 그 혼합물의 1㎖는 1.2㎖ 부피의 멸균된 냉동 유리병에 담고, -80℃의 극초저온 냉동고 에서 저온보존하였다.
액체 배양에서 M. 알피나를 이용하여기 위해, 저온보존된 균주는 25℃ 인큐베이터에서 재빨리 해동시키고, 액체 배양액으로 옮겼다.
비교예 1. 포자 현탁액의 준비 방법
몰티에렐라 알피나 1S-4를 아라키돈산-생산 균주로 이용하였다. 고정상 배양(Stationary culturing)은 테스트 튜브의 크자펙 아가 배지(pH 6.0으로 조절되고 멸균된 것임)에서 사면으로 25℃에서 7일 동안 수행하였고, 그 후 균사 성장을 확인한 후에, 테스트 튜브는 10일 동안 냉장고에서 저장되었다.
M. 알피나 1S-4를 액체 배양에서 이용하기 위해, 멸균수를 테스트 튜브에 첨가하고, 그 혼합물은 포자 현탁을 준비하기 위하여 교반하였다. 포자 현탁액은 액체 배지로 옮겼다.
실시예 2. 배양 실험, 보존 방법에 의한 재현성에 있어서 차이점
배양은 M. 알피나 1S-4를 이용한 실시예 1 및 비교예 1의 방법에 의해 준비한 종균으로부터 수행하였다.
1.0% 효모 추출액 및 2.0% 글루코오스가 함유된 pH 6.3의 배지로 0.1 vol%의 보존된 종균을 옮긴후, 종균 배양은 28℃에서, 100 rpm 상호 교반(reciprocal shaking)의 조건하에서 개시하였고, 배양은 3일 동안 계속되었다.
그 후, 5.0% 탈지 대두 분말, 0.3% KH2PO4, 0.1% Na2SO4, 0.05% CaCl2·2H2O, 0.05% MgCl2·6H2O, 1.8% 글루코스 및 0.1% 대두 오일을 함유한 pH 6.3의 배지 25ℓ를 50ℓ부피의 발효조에 준비하였고, 그 후 종균 배양 용액 100㎖를 옮겨, 92 rpm 교반, 26℃ 온도, 200 kPa 내부 압력 및 12.5ℓ/min의 공기흐름의 조건하에서 배양을 개시하였다. 배양 동안, 글루코스는 하기 표 1에서 보여진 농도로 첨가되었고, 배양은 10일 동안 지속되었다.
글루코스 피딩의 시간 및 농도 (배양액에 대한 농도)
피딩 시간 피딩 농도
1일 4.5%
2일 4.5%
3일 4%
4일 3%
5일 3%
6일 1%
배양은 동일한 방법으로 종균 보존을 개시한 후에 서로 다른 날에 여러번 수행하였다. 각 배양에서, 10일 째의 배양액에서 수득한 아라키돈산의 수율은 하기 표 2에서 보는 바와 같다. 실시예 1의 방법에 의해 제조되고 보존된 종균의 경우에 있어서, 아라키돈산 수율 재현성은 각 배양마다 만족스러웠다. 그러나 비교예 1의 방법으로 종균을 제조하고 보존하여 이용하였을 때 각 배양마다 낮은 재현성을 보였다.
결과
종균 준비 방법 포자 현탁액 저온 보존 (실시예 1의 방법) 포자 현탁액의 사면에 의한준비(비교예 1의 방법)
종균 보존 방법 포자 현탁액의 저온 보존 크자펙 아가 배지 사면-고체 배양된 균사의 냉장 보관
보존일수 아라키돈산 수율 1일 13.9g/ℓ 1일 13.8g/ℓ
보존일수 아라키돈산 수율 30일 13.0g/ℓ 30일 13.5g/ℓ
보존일수 아라키돈산 수율 30일 14.2g/ℓ 30일 10.5g/ℓ
보존일수 아라키돈산 수율 60일 12.9g/ℓ 60일 14.2g/ℓ
보존일수 아라키돈산 수율 60일 13.6g/ℓ 60일 10.5g/ℓ
보존일수 아라키돈산 수율 90일 13.5g/ℓ 90일 13.5g/ℓ
보존일수 아라키돈산 수율 90일 14.1g/ℓ 90일 10.1g/ℓ
실시예 3. 배양 실험, 장기 보존에 따른 생산성에 있어서의 변화
M. 알피나 1S-4를 이용한 실시예 1 및 비교예 1의 방법에 의해 준비한 종균으로 배양을 수행하였다.
1.0% 효모 추출액 및 2.0% 글루코스를 함유한 pH 6.3의 배지로 보존된 종균 0.1vol%를 옮긴 후에, 종균 배양은 100rpm 상호 교반, 28℃ 온도의 조건하에서 개시하였고, 3일 동안 배양을 지속시켰다.
그 후, 1.0% 효모 추출액, 1.8% 글루코오스 및 0.1% 대두 오일을 함유한 pH 6.3의 배지 25ℓ를 50ℓ 발효조로 넣고, 종균 배양액 100㎖를 옮긴 후, 200 rpm의 교반, 28℃ 온도, 150kpa 내부 압력 및 25ℓ/min의 공기 흐름의 조건하에서 배양을 개시하였다. 배양 동안, 글루코오스는 하기 표 3에서 보여진 농도로 첨가하였고, 배양은 7일 동안 지속시켰다.
글루코오스 피딩의 시간 및 농도(배양액에 대한 농도)
피딩 시간 피딩 농도
1일 1.5%
2일 1.5%
3일 1%
4일 1%
배양은 종균 보존을 개시한 후에 서로 다른 날에 동일한 방법으로 여러번 수행하였다. 각 배양에서 7일 째의 배양액에서 수득한 아라키돈산의 수율은 하기 표 4에서 보는 바와 같다. 실시예 1의 방법에 의해 제조되고 보존된 종균의 경우, 아라키돈산 생산성은 장기 보존일 때도 만족스럽게 재현되었다. 그러나, 비교예 1의 방법에 의해 제조되고 보존된 종균의 경우에는, 아라키돈산 생산성이 장기 보존되는 동안 떨어진 경향이 있었다.
결과
종균 준비 방법 포자 현탁액 저온 보존 (실시예 1의 방법) 포자 현탁액의 사면에 의한 보존(비교예 1의 방법)
종균 보존 방법 포자 현탁액의 저온 보존 크자펙 아가 배지 사면 고체-배양된 균사의 냉장보관
보존일수 아라키돈산 수율 1일 3.7g/ℓ 1일 3.6g/ℓ
보존일수 아라키돈산 수율 4년 4.0g/ℓ 4년 2.5g/ℓ
보존일수 아라키돈산 수율 8년 3.9g/ℓ 8년 2.2g/ℓ
실시예 4. 포자-형성 배지 pH의 효과
M. 알피나 1S-4를 아라키돈산-생산 균주로 이용하였다. 표 5에서 보여진 조성물을 갖는 서로 다른 pH의 두개의 크자펙 아가 배지를 테스트 튜브에 준비하였다. pH 조정하지 않은 크자펙 배지의 pH는 8.5로 측정되었다.
조정된 pH(6.0) pH 조정하지 않음(*2)
질산 나트륨(NaNO3) 2g/ℓ 2g/ℓ
제2인산칼륨(K2HPO4) 1g/ℓ 1g/ℓ
황산 마그네슘 칠수화물 (MgSO4·7H2O) 0.5g/ℓ 0.5g/ℓ
염화 칼륨(KCl) 0.5g/ℓ 0.5g/ℓ
황산 제1철 칠수화물 (FeSO4·7H2O) 0.01g/ℓ 0.01g/ℓ
수크로오스 30g/ℓ 30g/ℓ
아가 분말 13g/ℓ 13g/ℓ
HCl 용액 첨가(*1) 첨가하지 않음
*1: pH 6.0으로 조정하기 위해 첨가됨
*2: pH 8.5로 측정됨.
각 균사의 한 루프를 서로 다른 pH의 두개의 아가 배지로 옮기고, 고정상 배양을 7일 동안, 25℃에서 수행하였고, 균사 성장을 확인한 후에 테스트 튜브는 10일 동안 냉장고(4℃)에서 저장하였다.
멸균수를 각 테스트 튜브에 첨가하고, 그 혼합물은 포자 현탁액 준비를 위해 교반하였다. 포자 현탁액은 적절히 희석시키고, 감자 덱스트로즈 아가 배지 플레이트에 도말하여, 콜로니 계수법을 이용하여 포자 현탁액에서 포자를 계수하였으며, 1×106 포자/㎖의 결과를 pH 6.0의 아가 배지에서 획득하였고, 5×104 포자/㎖의 결과를 pH 조정하지 않은 배지(측정된 pH: 8.5)에서 획득하였다. 이들 양 방법에 의해 준비된 포자 현탁액은 실시예 3의 방법으로 배양하기 위해 사용하였고, 아라키돈산 수율을 비교하였다.
그 결과, 3.5g/ℓ의 아라키돈산 수율이 pH 6.0으로 조정된 배지에서 생산된 포자 현탁액으로부터 수득하였고, 2.9g/ℓ의 아라키돈산 수율은 pH를 조정하지 않은 배지로부터 수득하였다(측정된 pH: 8.5).
실시예 5. 저온 보존 시스템
-20℃ 냉동고 (5-1), -80℃ 냉동고 (5-2) 및 액체 질소 (대략 -196℃) (5-3)에서 저장된 1.2㎖ 부피의 냉동 유리병에서 보존된 포자 현탁액으로 실시예 1을 반복하였다. 이들 세가지 조건하에서 30일 동안 저장한 후, 배양은 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 양 포자 생존 비율 및 아라키돈산 생산성은 -80℃ 극초저온 냉동기에서 저장된 경우가 가장 뛰어났다.
조건 5-1 -20℃ 저장 5-2 -80℃ 저장 5-3 액체 질소 저장
해동 후 포자의 수 2×102 포자/㎖ 9×103 포자/㎖ 1×102 포자/㎖
아라키돈산 수율 9.1g/ℓ 13.0g/ℓ 8.7g/ℓ
실시예 6. 대규모 탱크 배양에 의해 냉동 균주의 배양 재현성의 확인
M. 알피나 1S-4를 이용한 실시예 1의 방법에 의해 제조된 종균을 이용하여 배양을 수행하였다.
0.1vol%의 보존된 균을 1.0% 효모 추출액 및 2.0% 글루코오스를 함유한 pH 6.3의 배지로 옮긴 후에, 100 rpm 상호 교반, 28℃ 온도(제1단계)의 조건하에서 종균배양을 개시하였고, 이는 3일 동안 지속하였다. 그 다음, 1.0% 효모 추출액, 2% 글루코오스 및 0.1% 대두 오일을 함유한 pH 6.3의 배지 30ℓ를 50ℓ부피의 발효조에 준비시키고, 종균 배양액(제1단계)을 옮긴 후, 종균 배양(제2단계)을 200rpm 교반, 28℃ 온도, 150kPa 내부 압력 및 12.5ℓ/min 공기 흐름의 조건하에서 개시하고, 이는 2일 동안 지속하였다.
그 후 4500ℓ의 배지(배지 A: 336kg 대두 분말, 16.8kg KH2PO4, 2.8 kg MgCl2·6H2O, 2.8 kg CaCl2·2H2O, 5.6 kg 대두 오일)를 pH 4.5로 조정하고 121℃ 에서 2분동안 멸균하였다. 분리된 배지로서, 배지(배지 B: 112kg 수화된 글루코오스) 1000ℓ를 40초 동안 140℃에서 멸균하고, 이를 미리 준비한 배지 A에 첨가함으로써 배지 C를 준비하였다. 배지 C를 pH 6.3으로 조정한 후에, 28ℓ부피의 종균 배양액(제2단계)을 초기 배양액과 혼합되어 총 5600ℓ(10 ㎘ 부피 배양 탱크)로 옮겼다. 종균 배양액(제2단계)을 주배양 배지로 옮기기 위해, 증기를 멸균을 위하여 종균 배양 탱크 및 주배양 탱크로 연결된 튜브를 통해 통과시켰고(121-126℃에서 30분 이상), 그때 무균 공기를 60℃ 이하의 튜브 표면 온도로 냉각시키기 위해 튜브를 통해 도입하였다. 냉각한 후, 종균 배양액(제2단계)은 주배양 탱크로 규정된 부피로 이동시켰다. 종균 배양의 주배양으로의 이동이 완수될 때, 26℃, 49 Nm3/hr의 공기 흐름양, 및 200kPa 내부 압력에서 배양을 개시하였다. 배지는 주배양의 306시간 동안, 하기 표에서 보여지는 계획에 따라 배양되는 동안 피딩되었다. 배양이 완료될 때, 배양액의 부피는 배지 피딩에 의한 증가 및 증발에 의한 손실의 결과로서 7750ℓ였다. 배양을 완료했을 때, 배양액 당 아라키돈산의 수율은 18.2 g/L.였다.
주배양 시간 피딩 배지
19시간 후 280kg 수화된 글루코오스/460ℓ
43시간 후 280kg 수화된 글루코오스/450ℓ
67시간 후 252kg 수화된 글루코오스/390ℓ
91시간 후 252kg 수화된 글루코오스/410ℓ
120시간 후 224kg 수화된 글루코오스/370ℓ
140시간 후 168kg 수화된 글루코오스/280ℓ
163시간 후 168kg 수화된 글루코오스/270ℓ
배양 완료 후에, 멸균은 120℃에서 20분 동안 수행하였고, 수분이 있는 세포 매스는 지속적인 탈수기로 회수되고, 진동하는 유동층 건조기로 1wt%의 수분 함량이 되도록 건조하였고, 건조된 세포는 공기 컨베이어에 의해 팩킹위치로 운송되었다. 수득된 건조 세포 매스는 질소 가스와 함께 약 1 m3 부피의 알루미늄 포켓 용기로 포장되었고, 그 백의 입구는 10℃ 이하의 저온 저장고에서 저장되기 전에 열처리에 의해 봉합되었다.
용기를 제거한 후, 건조된 세포 매스는 헥산 추출을 수행하였고, 헥산 용액은 고체 부분을 제거하기 위해 여과되었고, 그 후 감압하에서 헥산을 제거하고 지방산 성분으로서 아라키돈산을 함유하는 크루드 오일을 수득하기 위하여 가열되었다. 동일한 배양이 세번 반복되었다. 배양의 완료된 때 아라키돈산의 수율은 표 7에서 요약하였다. 보존된 균의 재현성은 만족스러웠으며, 아라키돈산 생산성이 더욱 안정한 것임을 확인하였다.
배양이 완료된 때 아라키돈산 수율의 요약
배양
1 18.2g/ℓ
2 (1년 후) 17.8g/ℓ
3 (5년 후) 17.9g/ℓ
실시예 7. 냉동된 디호모 -γ-리놀렌산-생산 균주의 배양 재현성 확인
몰티에렐라 알피나 SAM1860을 디호모-γ-리놀렌산-생산 균주로 이용하였다. 고정상 배양을 테스트 튜브로 제공된 크자펙 아가 배지(pH 6.0으로 조정되고 멸균됨)에서 사면으로 25℃에서 12일 동안 수행하였고, 균사 성장을 확인한 후에, 테스트 튜브는 20일 동안 냉장고(4℃)에서 저장되었다.
멸균수를 테스트 튜브에 첨가하고 그 혼합물은 포자 현탁액을 준비하기 위해 교반하였다. 포자 현탁액은 적절히 희석하고 감자 덱스트로스 아가 배지 플레이트로 도말하여, 콜로니 계수법을 이용하여 포자 현탕액에서 포자를 계수하였으며, 5×106 포자/㎖ 가 나왔다. 그 후, 포자 현탁액은 멸균수로 100배 희석하였다. 그 희석된 포자 현탁액, 글라이세린 및 멸균수를 다음 비율로 혼합하였다: 희석된 포자 현탁액:글라이세린:멸균수=1:1:8(부피비). 1㎖의 혼합물을 멸균된 1.2㎖ 부피의 냉동 유리병에 넣고, -80℃의 극초저온 냉동고에서 한 달 동안 저온 보관하였다.
비교예로서, 동일한 방법으로 제조된 포자 현탁액을 냉장고(5℃)에서 한달 동안 보관하였다. 한달 동안 보관한 두개의 보존된 균주는 실시예 3과 동일한 방법으로 배양하였다. 그 결과, DGLA 수율은 하기 표 8에서 보는 바와 같으며, 저온 보존 방법의 효율성을 보여주고 있다.
결과
종균 준비 방법 포자 현탁액의 저온보존 포자 현탁액의 냉장 보존
DGLA 수율 3.1g/ℓ 2.7g/ℓ
실시예 8. 다른 냉동된 아라키돈산 -생산 균주들의 배양 재현성 확인
몰티에렐라 엘롱가타 IF08570 및 몰티에렐라 알피나 CBS754.68을 아라키돈산-생산 균주로 사용하였다.
고정상 배양은 테스트 튜브에서 제공된, 크자펙 아가 배지(pH 6.0을 조정되고 살균됨)에서 사면으로 25℃에서 10일 동안 수행되었고, 균사 성장 확인 후에, 테스트 튜브는 20일 동안 냉장고(4℃)에서 보관하였다. 멸균수를 테스트 튜브에 첨가하고, 그 혼합물은 포자현탁액을 준비하기 위하여 교반하였다. 포자 현탁액은 멸균수로 10배 희석되었다. 희석된 포자 현탁액, 글라이세린 및 멸균수는 다음 비율로 혼합되었다: 희석된 포자 현탁액: 글라이세린: 멸균수=1:1.5:7.5 (부피비). 그 혼합물 1㎖를 멸균된 1.2㎖의 냉동 유리병에 담고, -80℃의 극초저온 냉동고에서 한 달 동안 저온 보존하였다.
비교예로서, 상기와 동일한 방법에 의해 제조된 포자 현탁액을 냉장고(5℃)에서 한 달 동안 저장하였다.
한 달 동안 저장된 각각의 네 개의 보존된 균주(두 개의 다른 균주 × 두 개의 다른 보존 방법)를 1% 효모 추출액 및 2% 글루코스를 함유한 pH 6.3의 배지로 옮기고, 100rpm 상호 교반, 28℃ 온도의 조건하에서 3일 동안 종균 배양을 하였다. 그 후 25ℓ의 배지(500g 글루코오스, 775g 탈지 대두 분말, 50g KH2PO4, 7.5 g/L MgCl2·6H2O, 7.5 g/L CaCl2·2H2O, 25 g 대두 오일, pH 6.0)를 50ℓ부피의 발효조에 준비하였고, 종균 배양액을 옮기고 주배양은 200 rpm 교반, 28℃ 온도, 150kPa 내부 압력의 조건 하에서 개시하였다. 그 배양은 186 시간 동안 지속되었고, 약 1.2%의 글루코오스 농도를 유지하기 위하여 50% 글루코스 용액을 대략 매 24시간 마다 첨가하였다.
그 결과로서, 하기 표9의 아라키돈산 수율을 획득하였으며, 이는 보존 방법의 효율성을 보여주고 있다.
결과
종균 배양 방법 포자 현탁액의 저온 보존 포자 현탁액의 냉장 보존
아라키돈산 수율
M. 엘론가타 IFO8570 3.4g/ℓ 2.0g/ℓ
M. 알피나 CBS754.68 7.2g/ℓ 5.1g/ℓ
실시예 9. 9년 동안 저장된 샘플의 L-건조방법 및 저온 보존 방법의 비교
포자 현탁액을 준비하고, 건조된 포자 앰플을 만들어 L-건보방법("Maintaining cultures for Biotechnology and Industry (1996)", edited by J.C. Hunter-Cevera & A. Belt, Academic Press, p.115)으로 알려진 일반적인 방법으로 보존하였다. 생산 후 9년 동안 저장한 후에, 6개의 L-건조된 앰플을 개봉하고 그 성분들을 소생시켜 아가 배지 위에 도말하고, 생존 포자의 수를 계산하였다. 마찬가지로, 실시예 1의 방법에 의해 준비된(그리고 9년동안 저온 보존된) 6개의 1.2㎖ 부피의 냉동 유리병을 개봉하고, 생존 포자의 수를 계산하였다.
그 결과는 하기 표에서 보는 바와 같으며, 실시예 1에 따른 보존 방법이 선행 기술인 L-건조 방법과 비교하여 현저하게 뛰어난 생존율을 보임을 확인할 수 있었다. 이로써 본 발명의 방법이 미생물 균주의 장기 보존을 위한 가장 효율적인 방법임을 알 수 있다.
조건 L-건조 방법 저온 보존
생존 앰플의 수 3개의 앰플은 생존 3개의 앰플은 사멸 6개의 튜브 모두 생존
생존 포자의 수 생존 앰플에서 2 사멸 앰플에서 0 튜브에 200

Claims (12)

  1. 폴리불포화 지방산 또는 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물의 미생물 생산이 가능한 미생물의 보존 방법으로서,
    (a) 무기염 및 당류를 포함하는 영양원을 함유하는 pH 4-7의 포자-형성 배지에서 포자를 형성하고;
    (b) 포자 현탁액을 제조하기 위하여 상기 (a)에서 수득한 포자를 멸균수 또는 계면활성제 및/또는 무기염을 함유하는 멸균수로 현탁시키고, 저온 보존되는 포자 현탁액을 제조하기 위하여 5-15%의 항냉동제를 첨가하고; 및
    (c) 상기 (b)에서 수득한 저온 보존되는 포자 현탁액을 -100℃와 -20℃사이에서 보존하는 것을 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 무기염은 질산 나트륨, 제이인산칼륨, 황산마그네슘, 염화칼륨 및 황산제일철로 구성된 군에서 선택된 무기염의 적어도 하나인 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포자-형성 배지는 pH 4-7로 조정된 크자펙 아가 배지(Czapek agar medium) 또는 크자펙-독스 아가 배지(Czapek-Dox agar medium)인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항냉동제는 글라이세린인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리불포화 지방산 또는 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물은 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 포함하는 트리글라이세라이드 또는 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 포함하는 인지질인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리불포화 지방산은 ω6 불포화 지방산, ω3 폴리불포화 지방산 또는 ω9 폴리불포화 지방산 또는 그들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ω6 폴리불포화 지방산은 9,12-옥타데카디에노산(리놀렌산) 18:2ω6, 6,9,12-옥타데카트리에노산 (γ-리놀렌산) 18:3ω6, 8,11,14-에이코사트리에노산 (디호모-γ-리놀렌산) 20:3ω6, 5, 8, 11, 14-에이코사테트라에노산 (아라키돈산) 20:4ω6, 7, 10, 13, 16-도코사테트라에노산 22:4ω6 또는 4, 7, 10, 13, lβ-도코사펜타에노산 22:5ω6인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ω3 불포화 지방산은 9,12,15-옥타데카트리에노산 (α-리놀렌산) 18:3ω3, 6, 9, 12, 15-옥타데카테트라에노산 (스테아리돈산) 18:4ω3, 11, 14, 17-에이코사트리에노산 (디호모-α-리놀렌산) 20:3ω3, 8, 11, 14, 17-에이코사테트라에노산 20:4ω3, 5,8,11,14,17-에이코사펜타에노산 20:5ω3, 7,10,13,16,19-도코사펜타에노산 22:5ω3 또는 4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노산 22:6ω3인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ω9 불포화 지방산은 6,9-옥타데카디에노산 18:2ω9, 8, 11-에이코사디에노산 20:2ω9 또는 5, 8, 11-에이코사트리에노산 (미드 산, Mead acid) 20:3ω9인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 몰티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 몰티에렐라 속에 속하는 미생물은 몰티에렐라 알피나(Mortierella alpina)것임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 보존된 미생물을 이용하는 것을 특징으로 하는, 폴리불포화 지방산 또는 지방산 성분으로서 폴리불포화 지방산을 함유하는 화합물의 생산방법.
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