ES2342305T3 - Metodo de produccion de acidos grasos poliinsaturados usando una nueva tecnica de conservacion de celulas. - Google Patents
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Abstract
Un método para la conservación de un microorganismo capaz de producción microbiana de un ácido graso poliinsaturado o un compuesto que comprende un ácido graso poliinsaturado como un ácido graso constituyente, método que comprende: (a)formar esporas de dicho microorganismo, con crecimiento hifal, en un medio formador de esporas a pH 4-7 que contiene una fuente de nutrientes que comprende una sal inorgánica y un sacárido; (b)suspender las esporas obtenidas en (a) en agua esterilizada, o agua esterilizada que contiene un tensioactivo y/o una sal inorgánica, para preparar una suspensión de esporas, y añadir un crioprotector al 5-15% para preparar una suspensión de esporas que se crioconserva; y (c)conservar la suspensión de esporas que se crioconserva obtenida en (b) a entre -100ºC y -20ºC.
Description
Método de producción de ácidos grasos
poliinsaturados usando una nueva técnica de conservación de
células.
La presente invención se refiere a métodos para
la conservación de microorganismos que producen ácidos grasos
poliinsaturados o compuestos que los comprenden como ácidos grasos
constituyentes. La correspondiente biomasa microbiana es útil para
la producción de aceites crudos y/o fosfolípidos crudos obtenidos
mediante extracción de la biomasa, y grasas y aceites refinados y/o
fosfolípidos refinados obtenidos mediante refinado de los aceites
crudos y/o fosfolípidos crudos, así como alimentos y bebidas,
suplementos nutricionales terapéuticos, piensos para animales y
productos farmacéuticos que incorporan la biomasa y grasas o aceites
(aceites crudos y/o aceites refinados) y/o fosfolípidos
(fosfolípidos crudos y/o fosfolípidos refinados).
\vskip1.000000\baselineskip
La biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados
(abreviados posteriormente en la presente memoria como "PUFA")
en seres humanos se presenta para dos series representativas, las
series \omega3 y \omega6 (donde \omega representa el número
del átomo de carbono que tiene el primer doble enlace, contando
desde el extremo del grupo metilo del ácido graso), y, en el caso
de los ácidos grasos \omega6, por ejemplo, el ácido linoleico
(18:2 \omega6) se convierte en ácido
\gamma-linolénico (18:3 \omega6), ácido
dihomo-\gamma-linolénico (20:3
\omega6), ácido araquidónico (20:4 \omega6) y ácido
4,7,10,13,16-docosapentaenoico (22:5 \omega6),
mediante desaturación y elongación repetidas de la cadena
carbonada.
De forma similar, en el caso de los ácidos
grasos \omega3, el ácido \alpha-linolénico (18:3
\omega3) se convierte en ácido eicosapentaenoico (20:5
\omega3), ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico
(22:5 \omega3) y ácido
4,7,10,13,16,19-docosapentaenoico (22:6 \omega3),
mediante desaturación y alargamiento repetidos de la cadena
carbonada. Los PUFA \omega3 ácido eicosapentaenoico
(posteriormente en la presente memoria, "EPA") y ácido
docosapentaenoico (posteriormente en la presente memoria,
"DHA") en particular son conocidos por tener numerosas
funciones fisiológicas, incluyendo efectos profilácticos contra
enfermedades del adulto tales como aterosclerosis y trombosis o
efectos anticancerosos, así como efectos de refuerzo del
aprendizaje, y se han hecho diversos intentos de utilizarlos en
productos farmacéuticos y alimentos sanitarios específicos. Sin
embargo, las funciones fisiológicas de PUFA distintos de los tipos
\omega3 (tales como \omega6 y \omega9) recientemente han sido
objeto de atención.
El ácido araquidónico constituye aproximadamente
10% de los componentes de ácido graso de órganos vitales tales como
la sangre y el hígado (por ejemplo, la relación de composiciones de
los fosfolípidos en la sangre humana es 11% de ácido araquidónico,
1% de ácido eicosapentaenoico, 3% de ácido docosapentaenoico), y,
como un componente estructural principal de las membranas
celulares, contribuye a modular la fluidez de la membrana y realiza
diversas funciones metabólicas en el cuerpo, mientras que también
representa un papel importante como un precursor directo de
prostaglandinas. Recientemente, se han apreciado los papeles del
ácido araquidónico como un nutriente para niños lactantes y como un
ácido graso constituyente de cannabinoides endógenos que exhiben
efectos neurérgicos (2-araquidonoilmonoglicerol y
anandamida). Normalmente, la ingestión de alimentos ricos en ácido
linoleico conduce a su conversión en ácido araquidónico, pero,
puesto que las funciones de las enzimas implicadas en su
biosíntesis se reducen en pacientes con enfermedades del adulto o
afecciones preliminares así como en niños y ancianos, tales
individuos tienden a ser deficientes en ácido araquidónico; por lo
tanto, es deseable proporcionar medios para su ingestión directa en
forma de un ácido graso constituyente de grasas o aceites
(triglicéridos).
Aunque los aceites de pescado son fuentes
abundantes de PUFA \omega3 tales como EPA y DHA, PUFA \omega6
tales como ácido \gamma-linolénico, ácido
dihomo-\gamma-linolénico, ácido
araquidónico y ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico
(22:5 \omega6) virtualmente no pueden obtenerse a partir de
fuentes tradicionales de grasa o aceite y, por lo tanto, las grasas
y los aceites que comprenden PUFA como ácidos grasos (posteriormente
en la presente memoria denominados "grasas y aceites que
contienen PUFA") constituyentes obtenidos mediante fermentación
de microorganismos son los más usados en la actualidad. Por
ejemplo, se han propuesto métodos para obtener grasas y aceites que
comprenden ácido araquidónico como un ácido graso constituyente
(posteriormente en la presente memoria denominados "grasas y
aceites que contienen ácido araquidónico") mediante el cultivo de
diversos microorganismos capaces de producir grasas y aceites que
contienen ácido araquidónico.
Se sabe que las grasas y los aceites que tienen
una alta proporción de ácido araquidónico que constituye la porción
de ácido graso (posteriormente en la presente memoria denominados
"grasas y aceites ricos en ácido araquidónico") pueden
obtenerse al usar microorganismos pertenecientes al género
Mortierella (Publicación de Patente Japonesa No Examinada
SHO Nº 63-44891, Publicación de Patente Japonesa No
Examinada SHO Nº 63-12290). En los últimos años,
uno de los usos esenciales del ácido araquidónico es en el campo de
la nutrición de niños lactantes, por ejemplo, y específicamente, se
ha introducido el uso de grasas y aceites que contienen ácido
araquidónico obtenidos mediante fermentación en leche modificada.
También se han demostrado nuevos efectos de grasas y aceites que
contienen ácido araquidónico (Publicación de Patente Japonesa No
Examinada Nº 2003-48831: Composition with
prophylactic or ameliorative effect on symptoms and conditions
associated with brain function impairment), y se espera que estos
tengan gran demanda en el futuro.
Las grasas y los aceites obtenidos mediante el
cultivo de microorganismos de Mortierella consisten
principalmente en triglicéridos (aproximadamente 70% o más) y
fosfolípidos. Las grasas y los aceites comestibles están en forma
de triglicéridos y, para el propósito del uso descrito
anteriormente, las grasas y los aceites originales producidos por
las células (grasas y aceites obtenidos mediante extracción de las
células, conocidos como "aceites crudos") se extraen de la
biomasa celular producida mediante el cultivo de los
microorganismos, y a continuación los aceites crudos se someten a
pasos de refinado de grasas/aceites comestibles (desgomado,
desoxidación, desodorización, decoloración) para obtener grasas y
aceites refinados menos los fosfolípidos.
Puesto que las grasas y los aceites que
contienen PUFA obtenidos mediante el cultivo de microorganismos de
Mortierella se acumulan en las hifas, el cultivo debe
llevarse a cabo hasta una concentración superior para incrementar
el rendimiento de las grasas y los aceites que contienen PUFA por
cultivo, para una economía incrementada de la producción de
grasas/aceites. El rendimiento de grasas y aceites que contienen
PUFA por cultivo es el producto de la concentración de células y el
contenido de grasas/aceites que contienen PUFA por célula, y por lo
tanto es necesario incrementar tanto la concentración de células
como el contenido de grasas/aceites que contienen PUFA por célula.
La concentración de células puede incrementarse al elevar la
concentración de la fuente de nitrógeno del medio, que normalmente
se convierte en componentes celulares.
El contenido de grasas/aceites que contienen
PUFA por célula sólo puede incrementarse al controlar
satisfactoriamente la morfología celular y al llevar a cabo el
cultivo con un suministro de oxígeno adecuado. Métodos presentados
para controlar la morfología celular incluyen la optimización de la
composición del medio salino (Nueva Publicación Doméstica Japonesa
Nº 98/029558), mientras que métodos para suministrar oxígeno
incluyen métodos de cultivo presurizados y métodos de cultivo
aeróbicos enriquecidos en oxígeno (Publicación de Patente Japonesa
No Examinada HEI Nº 06-153970). Sin embargo, puesto
que estos métodos se ven afectados por ligeras diferencias en las
condiciones de cultivo, no es fácil asegurar la reproducibilidad
del cultivo y, como resultado, no ha sido posible alcanzar una
capacidad de producción estable.
Documento de patente 1: Publicación de Patente
Japonesa No Examinada SHO Nº 63-44891.
Documento de patente 2: Publicación de Patente
Japonesa No Examinada SHO Nº 63-12290.
Documento de patente 3: Publicación de Patente
Japonesa No Examinada Nº 2003-48831.
Documento de patente 4: Nueva Publicación
Doméstica Japonesa Nº 98/029558.
Documento de patente 5: Publicación de Patente
Japonesa No Examinada HEI Nº 06-153970.
Así, para asegurar la producción estable de
grasas y aceites que contienen PUFA mediante microorganismos, es
muy deseable desarrollar un método para asegurar la reproducibilidad
del cultivo.
Los presentes inventores efectuaron una
investigación diligente sobre las condiciones de la etapa de cultivo
inicial que afectan a la fase de crecimiento de células cultivadas
durante la producción de grasas y aceites (triglicéridos) que
contienen PUFA y/o fosfolípidos que contienen PUFA mediante el
cultivo de microorganismos, y, como resultado, descubrieron que al
mejorar las condiciones de trasplante para las hifas o esporas
procedentes de pasos previos, es posible incrementar la
reproducibilidad del cultivo y alcanzar una producción estable de
grasas y aceites (triglicéridos) que contienen PUFA y/o fosfolípidos
que contienen PUFA.
Así, un aspecto en la presente memoria es
proporcionar un método para la producción de grasas y aceites
(triglicéridos) que contienen PUFA y/o fosfolípidos que contienen
PUFA y/o células que contienen PUFA que se basa en la
reproducibilidad mejorada del cultivo y la producción estable de
grasas y aceites (triglicéridos) que contienen PUFA y/o fosfolípidos
que contienen PUFA, caracterizándose el método por mejorar las
condiciones de trasplante para hifas o esporas procedentes de pasos
previos.
Específicamente, la presente invención
proporciona un método para la conservación de microorganismos
capaces de producción microbiana de ácidos grasos poliinsaturados o
compuestos que comprenden ácidos grasos poliinsaturados como ácidos
grasos constituyentes, método que comprende:
- (a)
- formar esporas de dicho microorganismo, con crecimiento hifal, en un medio formador de esporas a pH 4-7 que contiene una fuente de nutrientes que comprende sales inorgánicas y sacáridos;
- (b)
- suspender las esporas obtenidas en (a) anteriormente en agua esterilizada, o agua esterilizada que contiene un tensioactivo y/o sales inorgánicas, para preparar una suspensión de esporas, y añadir un crioprotector al 5-15% para preparar una suspensión de esporas que se crioconserva; y
- (c)
- conservar la suspensión de esporas que se crioconserva obtenida en (b) por encima de entre -100ºC y -20ºC.
En este método, las sales inorgánicas son
preferiblemente una o más sales inorgánicas seleccionadas del grupo
que consiste en nitrato sódico, hidrogenofosfato dipotásico, sulfato
magnésico, cloruro potásico y sulfato de hierro (I), y el medio
formador de esporas es preferiblemente un medio de agar de Czapek o
un medio de agar de Czapek-Dox ajustado hasta un pH
de 4-7.
Preferiblemente, el crioprotector usado para
este método es glicerina.
Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados o
compuestos que comprenden ácidos grasos poliinsaturados como ácidos
grasos constituyentes incluyen triglicéridos que comprenden ácidos
grasos poliinsaturados como ácidos grasos constituyentes y
fosfolípidos que comprenden ácidos grasos poliinsaturados como
ácidos grasos constituyentes, donde los ácidos grasos
poliinsaturados son preferiblemente ácidos grasos insaturados
\omega6, ácidos grasos poliinsaturados \omega3 o ácidos grasos
poliinsaturados \omega9, o sus combinaciones.
Los ácidos grasos insaturados \omega6
mencionados anteriormente son preferiblemente ácido
9,12-octadecadienoico (ácido linoleico)
18:2\omega6, ácido 6,9,12-octadecatrienoico (ácido
\gamma-linolénico) 18:3\omega6, ácido
8,11,14-eicosatrienoico
(dihomo-\gamma-linolénico)
20:3\omega6, ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico
(ácido araquidónico) 20:4\omega6, ácido
7,10,13,16-docosatetraenoico 22:9\omega6 o ácido
4,7,10,13,16- docosapentaenoico 22:5\omega6.
Los ácidos grasos insaturados \omega3
mencionados anteriormente son preferiblemente ácido
9,12,15-octadecatrienoico (ácido
\alpha-linolénico) 18:3\omega3, ácido
6,9,12,15-octadecatetraenoico (ácido estearidónico)
18:4\omega3, ácido 11,14,17-eicosatrienoico
(ácido dihomo-\alpha-linolénico)
20:3\omega3, ácido 8,11,14,17-eicosatetraenoico
20:9\omega3, ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico
20:5\omega3, ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico
22:5\omega3 o ácido
4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico 22:6\omega3.
Los ácidos grasos insaturados \omega9
mencionados anteriormente son preferiblemente ácido
6,9-octadecadienoico 18:2\omega9, ácido
8,11-eicosadienoico 20:2\omega9 o ácido
5,8,11-eicosatrienoico (ácido de Mead)
20:3\omega9.
El microorganismo usado para el método descrito
anteriormente es preferiblemente uno perteneciente al género
Mortierella, tal como Mortierella alpina.
La presente invención también proporciona un
método para la producción de ácidos grasos poliinsaturados o
compuestos que comprenden ácidos grasos poliinsaturados como ácidos
grasos constituyentes, caracterizado por conservar inicialmente
microorganismos mediante el método descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Más específicamente, uno de los rasgos del
cambio dependiente del tiempo de hongos filamentosos
Mortierella en cultivo líquido es un incremento en la masa
celular mediante proliferación celular (etapa de crecimiento
celular). La acumulación intracelular de grasas y aceites que
contienen PUFA se incrementa después de que el incremento en la
masa celular haya cesado esencialmente (etapa de acumulación de
grasas/aceites), dando como resultado finalmente una acumulación
intracelular abundante de grasas y aceites que contienen PUFA. Los
presentes inventores ya han presentado el cultivo con una fase de
crecimiento celular de aproximadamente dos días seguida por seis
días de la etapa de acumulación de grasa/aceite (J. Biosci. Bioeng.,
87:489-494 (1999)).
También se presentó que la morfología celular se
determina esencialmente durante la fase de crecimiento celular,
sugiriendo la extrema importancia de fijar y manejar las condiciones
de cultivo iniciales. Sin embargo, aun cuando perezca ser
importarse fijar y manejar las condiciones de cultivo iniciales, no
pueden encontrarse informes publicados con respecto a la fijación
de las condiciones de cultivo iniciales, y particularmente las
condiciones de trasplante para hifas y esporas. Centrándose en este
aspecto, los presentes inventores efectuaron una investigación
diligente que condujo al descubrimiento de que el método de
trasplante tiene un efecto fundamental sobre los resultados del
cultivo y que mejorar el método de trasplante contribuye
significativamente a mejorar la productividad de grasas y aceites
que contienen PUFA.
Para obtener compuestos que comprenden ácidos
grasos poliinsaturados como ácidos grasos (grasas y aceites que
contienen PUFA y/o fosfolípidos que contienen PUFA) constituyentes
mediante cultivo líquido de microorganismos, una pequeña cantidad
de células de la cepa conservada se siembra en primer lugar en la
solución de cultivo y se deja proliferar (primera etapa de cultivo
seminal). A continuación, el aumento a escala se efectúa mediante
la transferencia sucesiva a medios de gran volumen, y el cultivo
principal es la etapa final de cultivo en la que la masa microbiana
se recupera para obtener grasas y aceites que contienen PUFA. El
cultivo seminal es el cultivo en cada etapa durante el aumento a
escala mediante subcultivo sucesivo.
Métodos conocidos para conservar células
incluyen métodos en los que células cultivadas sobre medio de agar
en superficie inclinada se conservan en un refrigerador a 5ºC o un
congelador a -20ºC, métodos en los que una suspensión de esporas
fúngicas filamentosas se conserva en un refrigerador a 5ºC, métodos
en los que se añade un crioprotector y las células se conservan en
un congelador de nitrógeno líquido o a una temperatura ultrabaja de
entre -150ºC y -196ºC creada con nitrógeno líquido, métodos en los
que las células se cultivan en suelo y se secan, y métodos en los
que las células se secan por congelación y se refrigeran ("Hakko
Kogaku no Kiso [Fundamentals of Fermentation Engineering]"
(1988), traducido por Ishizaki, F., Center for Academic
Publications, Japón).
Además, "Maintaining cultures for
Biotechnology and Industry (1996)", editado por J.C.
Hunter-Cevera & A. Belt, Academic Press,
compara la conservación a -20ºC sobre una superficie inclinada, la
conservación con nitrógeno líquido y la conservación con secado por
congelación y resume los efectos sobre los grados de supervivencia
y el mantenimiento de la productividad. De acuerdo con este informe,
los métodos de conservación en superficie inclinada a -20ºC
proporcionan los grados de supervivencia y el mantenimiento de la
productividad más satisfactorios
(p. 25).
(p. 25).
Para hongos filamentosos, el informe muestra que
es difícil mantener establemente las células en un estado puro
vivo, y que, aunque no existe un método que pueda aplicarse
ampliamente a todos los hongos filamentosos, la conservación en
nitrógeno líquido puede considerarse ideal. (ibid, p. 105).
También se da una lista de ejemplos que usan diversos
crioprotectores, y todas las técnicas de la especialidad anterior
son combinaciones de conservación con nitrógeno líquido o secado
por congelación (ibid, p. 118, Tabla 4). Puesto que el punto
de ebullición del nitrógeno líquido a 1 presión atmosférica es
-195,8ºC, la temperatura en el tubo de almacenamiento de nitrógeno
líquido se mantiene a aproximadamente -196ºC.
Para hongos filamentosos del género
Mortierella, el método de conservación y el método de
transferencia al cultivo seminal usado es la conservación con
refrigeración en superficie inclinada sobre medio de agar de
Czapek, en un artículo de los presentes inventores (J. Am. Oil Chem.
Soc., 75:1501-1505 (1998)). En un artículo de Park
et al. (Biotechnol. Bioprocess Eng.,
6:161-166 (2001)), el método empleado implica la
preparación de una suspensión de esporas a 10^{3} esporas/ml
mediante superficie inclinada de medio de agar y su transferencia
al medio.
A la luz de la gran importancia de fijar y
manejas las condiciones para el cultivo inicial, los presentes
inventores también se fijaron en e investigaron diligentemente la
importancia de la conservación de células que probablemente afecta
al cultivo inicial. Como resultado, se descubrió que un método de
adición de un crioprotector y conservación de la mezcla a entre
-100ºC y -20ºC es eficaz como un nuevo método, distinto de la
conservación en superficie inclinada, la conservación con nitrógeno
líquido y el secado por congelación que se han presentado en la
bibliografía anterior, mientras que también se descubrió un método
para preparar excelentes suspensiones de esporas.
Es un aspecto de la presente memoria
proporcionar un método para la producción de grasas y aceites
(triglicéridos) que contienen PUFA y/o fosfolípidos que contienen
PUFA y/o células que contienen PUFA, por el que grasas y aceites
(triglicéridos) que contienen PUFA y/o fosfolípidos que contienen
PUFA se producen de un modo estable con reproducibilidad de cultivo
mejorada, caracterizándose el método por transferir y cultivar
células conservadas mediante los nuevos método de preparación de
células conservadas y método de conservación.
La presente divulgación proporciona la
producción de compuestos que comprenden ácidos grasos
poliinsaturados como ácidos grasos (grasas y aceites
(triglicéridos) y/o fosfolípidos) constituyentes y métodos para la
producción de células microbianas que producen los compuestos
(grasas y aceites (triglicéridos) y/o fosfolípidos), mediante la
transferencia y el cultivo de células conservadas mediante los
nuevos método de preparación de células conservadas y método de
conservación.
Así, es esencial el cultivo de un microorganismo
capaz de producir compuestos que comprenden ácidos grasos
poliinsaturados como ácidos grasos (grasas/aceites (triglicéridos)
y/o fosfolípidos) constituyentes. El microorganismo mencionado en
la presente memoria es preferiblemente un microorganismo que produce
al menos un tipo de ácido graso poliinsaturado de entre ácidos
grasos poliinsaturados \omega6 que tienen un número de carbonos de
18 o más y tres o más dobles enlaces, ácidos grasos poliinsaturados
\omega9 que tienen un número de carbonos de 18 o más y dos o más
dobles enlaces y ácidos grasos poliinsaturados \omega3 que tienen
un número de carbonos de 18 o más y tres o más dobles enlaces, como
el ácido graso constituyente principal de los triglicéridos y/o
fosfolípidos.
Como ácidos grasos poliinsaturados \omega6 que
tienen un número de carbonos de 18 o más y tres o más dobles
enlaces pueden mencionarse ácido \gamma-linolénico
(ácido 6,9,12- octadecatrienoico), ácido
dihomo-\gamma-linolénico (ácido
8,11,14-eicosatrienoico), ácido araquidónico (ácido
5,8,11,14-eicosatetraenoico), ácido
7,10,13,16-docosatetraenoico (22:9 \omega6) y
DPA\omega6 (ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico).
Como ácidos grasos poliinsaturados \omega9 que tienen un número
de carbonos de 18 o más y dos o más dobles enlaces pueden
mencionarse ácido 6,9-octadecadienoico, ácido
8,11-eicosadienoico y ácido de Mead (ácido
5,8,11-eicosatrienoico). Como ácidos grasos
poliinsaturados \omega3 que tienen un número de carbonos de 18 o
más y tres o más dobles enlaces pueden mencionarse ácido
\alpha-linolénico (ácido
9,12,15-octadecatrienoico), ácido
6,9,12,15-octadecatetraenoico (18:9\omega3),
ácido 8,11,14,17-eicosatetraenoico (20:4\omega3),
EPA (ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico),
DPA\omega3 (ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico)
y DHA (ácido 4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico).
Puede usarse cualquier microorganismo que pueda
producir un compuesto que comprende un ácido graso poliinsaturado
como un ácido graso (grasa/aceite (triglicérido) y/o fosfolípido)
constituyente. Como ejemplos de microorganismos capaces de producir
aceites y grasas (triglicéridos) que contienen ácido araquidónico
como un ácido graso constituyente pueden mencionarse hongos
pertenecientes a los géneros Mortierella, Conidiobolus,
Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium,
Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium y
Saprolegnia.
Como ejemplos de hongos pertenecientes al género
Mortierella, subgénero Mortierella, pueden mencionarse
Mortierella elongata, Mortierella
exigua, Mortierella hygrophila y Mortierella
alpina. Más específicamente, pueden mencionarse las cepas
Mortierella elongata IFO8570, Mortierella
exigua IFO8571, Mortierella hygrophila
IFO5941
y Mortierella alpina IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53,
CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68, etc.
y Mortierella alpina IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53,
CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68, etc.
Como ejemplos de microorganismos capaces de
producir DHA pueden mencionarse microorganismos pertenecientes a
los géneros Crypthecodinium, Thraustochytrium, Schizochytrium,
Ulkenia, Japonochytrium y Haliphthoros.
Todas estas cepas pueden adquirirse sin
restricciones especiales del Institute for Fermentation, Osaka
(IFO), American Type Culture Collection (ATCC) o Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS). También pueden usarse las cepas
Mortierella alpina 1S-9 y
Mortierella elongata SAM0219 (FERM-P
8703) (FERM-BP 1239), aisladas de suelo por el
grupo de investigación para la presente invención.
Para el cultivo de una cepa que va a usarse, es
necesario preparar en primer lugar células conservadas de la cepa
obtenida. El método para preparar las células conservadas implica
preparar en primer lugar un medio formador de esporas. El medio
formador de esporas se produce al preparar un medio que comprende
algunos o la totalidad de los siguientes componentes: nitrato
sódico, hidrogenofosfato dipotásico, sulfato magnésico, cloruro
potásico y sulfato de hierro (I), con sacáridos, y ajustar el pH
hasta el intervalo de 4-7, y preferiblemente
5-6,5. Después de añadir agar al medio preparado y
efectuar la esterilización térmica, el sólido enfriado se usa como
el medio formador de esporas. El medio formador de esporas no está
particularmente restringido con tal de que permita el crecimiento
hifal y la formación de esporas, pero generalmente se caracteriza
por tener un intervalo de pH de 4-7 que es adecuado
para la formación de esporas.
Como un ejemplo específico, puede mencionarse un
medio obtenido al añadir ácido clorhídrico o ácido sulfúrico a agar
de Czapek (2 g/l de nitrato sódico, 1 g/l de hidrogenofosfato
dipotásico, 0,5 g/l de heptahidrato de sulfato magnésico, 0,5 g/l
de cloruro potásico, 0,01 g/l de heptahidrato de sulfato de hierro
(I), 30 g/l de sacarosa, 13 g/l de agar), para ajustar el pH hasta
6,0. Como otro ejemplo puede mencionarse un medio obtenido al
añadir ácido clorhídrico o ácido sulfúrico a medio de agar de
Czapek-Dox (2 g/l de nitrato sódico, 1 g/l de
hidrogenofosfato dipotásico, 0,5 g/l de heptahidrato de sulfato
magnésico, 0,5 g/l de cloruro potásico, 0,01 g/l de heptahidrato de
sulfato de hierro (I), 30 g/l de glucosa, 13 g/l de agar), para
ajustar el pH hasta 6,0.
Este método se usa para preparar un medio
inclinado o un medio de placa, y las hifas o esporas se inoculan en
el medio para cultivo sólido bajo condiciones aeróbicas. La
temperatura de cultivo se mantiene a 0-90ºC,
preferiblemente 10-35ºC y más preferiblemente
15-30ºC, para el crecimiento celular y la formación
de esporas. La temperatura de cultivo puede cambiarse durante el
transcurso del cultivo y, por ejemplo, el crecimiento a 25ºC puede
estar seguido por cultivo a 5ºC.
Después de confirmar la formación de esporas, se
añade agua esterilizada a las hifas cultivadas en sólido y la
mezcla se agita mediante un método ordinario para obtener una
suspensión de esporas. No hay restricciones particulares sobre los
aditivos en el agua esterilizada añadida, y en lugar de agua
purificada puede usarse agua que contiene tensioactivos, sales
inorgánicas o similares añadidos, o puede usarse solución salina
preparada. El método de agitación puede implicar la simple
aplicación de fuerza externa al recipiente de cultivo sólido, o la
fuerza puede aplicare directamente a las hifas con un cepillo
esterilizado o similar.
La suspensión de esporas o la suspensión de
esporas e hifas que se obtiene de este modo se usa como la solución
de reserva de conservación. La solución de reserva de conservación
también puede diluirse con agua esterilizada o con una solución que
contiene tensioactivos o sales inorgánicas para la preparación de la
solución de reserva de conservación final. A continuación, se añade
un crioprotector a la solución de reserva de conservación. El
crioprotector no está particularmente restringido con tal de que sea
uno usado comúnmente, y pueden añadirse uno o más seleccionados de
entre polvo de agar, suero bovino fetal, DMSO, glicerina, inositol,
poli(alcohol vinílico), leche desnatada y similares. Como un
ejemplo específico, puede añadirse glicerina al crioprotector hasta
una concentración de glicerina de 10% en la solución de
conservación.
Después de añadir el crioprotector, la solución
de conservación se aporta a un recipiente de conservación.
Adecuadamente, el recipiente es un tubo de plástico esterilizado o
similar. Como un ejemplo específico, la solución de conservación se
aporta a un vial criogénico de 1,2 ml de volumen mediante un
procedimiento estéril. A continuación, la solución de conservación
se almacena en un congelador de temperatura ultrabaja. La
temperatura dentro del congelador de temperatura ultrabaja se
controla hasta un intervalo de entre -100ºC y -20ºC, preferiblemente
entre -90ºC y -30ºC y más preferiblemente entre -85ºC y
-50ºC.
Las células almacenadas en el congelador de
temperatura ultrabaja de este modo pueden conservarse establemente
durante períodos prolongados.
Cuando las células conservadas han de usarse
para cultivo, la solución de conservación se descongela en primer
lugar. La descongelación debe llevarse a cabo tan rápidamente como
sea posible, preferiblemente en menos de 30 minutos a una
temperatura de no más de 40ºC, más preferiblemente en menos de 30
minutos a una temperatura de no más de 30ºC y aún más
preferiblemente en menos de 10 minutos a una temperatura de no más
de 30ºC.
\newpage
La solución de conservación descongelada de este
modo se transfiere a un medio líquido para el cultivo. La fuente de
carbono usada puede ser una común tal como glucosa, fructosa,
xilosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melaza, glicerol,
manitol o almidón sacarificado, aunque no existe limitación a
estas.
Como fuentes de nitrógeno pueden usarse fuentes
de nitrógeno naturales tales como peptona, extracto de levadura,
extracto de malta, extracto de carne, un casaminoácido, licor de
maceración de maíz, proteína de soja, soja desengrasada y harina de
semillas de algodón, así como fuentes de nitrógeno orgánicas
incluyendo urea o fuentes de nitrógeno inorgánicas tales como
nitrato sódico, nitrato amónico y sulfato amónico, entre las que
pueden mencionarse particularmente fuentes de nitrógeno obtenidas
de soja, y específicamente soja, soja desengrasada, escamas de
soja, proteína de soja comestible, okara, leche de soja, harina de
soja y similares. Especialmente preferida para el uso es la soja
desengrasada desnaturalizada térmicamente, y más preferiblemente uno
o más tipos diferentes de soja desengrasada tratada térmicamente a
aproximadamente 70-90ºC y agotada de los componentes
solubles en etanol, opcionalmente en combinación con cualquiera de
las fuentes de nitrógeno mencionadas anterior-
mente.
mente.
Si es necesario, también pueden añadirse
nutrientes traza incluyendo ion fosfato, ion potasio, ion sodio,
ion magnesio o ion calcio, iones metálicos tales como hierro, cobre,
zinc, manganeso, níquel o cobalto, o vitaminas. Tales componentes
del medio no están particularmente restringidos con tal de que estén
en concentraciones que no interfieran con el crecimiento del
microorganismo. Para aplicaciones prácticas, la fuente de carbono
se añade generalmente en una concentración total de
0,1-40% en peso y preferiblemente
1-25% en peso y la fuente de nitrógeno en una
concentración total de 2-15% en peso y
preferiblemente 2-10% en peso, y especialmente una
adición de fuente de carbono inicial de 1-5% en peso
y una adición de fuente de nitrógeno inicial de 3-8%
en peso, con alimentación adicional de las fuentes de carbono y
nitrógeno (más preferiblemente solo la fuente de carbono) durante
el
cultivo.
cultivo.
El rendimiento de la grasa o el aceite que
contiene PUFA puede incrementarse al usar un precursor de ácido
graso insaturado, por ejemplo, un hidrocarburo tal como hexadecano u
octadecano; un ácido graso tal como ácido oleico o ácido linoleico
o una de sus sales, un éster de ácido graso tal como un éster
etílico, un éster de ácido graso de glicerina o un éster de ácido
graso de sorbitán, o una grasa o aceite tal como aceite de oliva,
aceite de soja, aceite de colza, aceite de semillas de algodón o
aceite de coco, bien solos o bien en combinaciones. La adición del
sustrato puede ser a 0,001-10% y preferiblemente
0,05-10% con respecto al medio. Tales sustratos
también pueden usarse como la única fuente de carbono para el
cultivo.
La temperatura de cultivo para el microorganismo
que produce la grasa o el aceite que contiene PUFA difiere
dependiendo del microorganismo usado, y puede ser
5-40ºC y preferiblemente 20-30ºC, o
las células desarrolladas al cultivar a 20-30ºC
pueden cultivarse subsiguientemente a 5-20ºC para
producir grasas y aceites que contienen PUFA. Tal control de
temperatura también puede incrementar la proporción de PUFA de los
ácidos grasos constituyentes en las grasas y aceites que contienen
PUFA. El cultivo seminal puede llevarse a cabo mediante cultivo en
fermentador de botella, cultivo con remoción o cultivo líquido
estacionario, y se lleva a cabo cultivo en fermentador de botella
para el cultivo principal. El pH del medio al inicio del cultivo
principal (al transferir el cultivo seminal) se ajusta hasta
5-7, y preferiblemente 5,5-6,5. El
período de cultivo para cada etapa del cultivo seminal será
normalmente 1-10 días, preferiblemente
1-5 días y más preferiblemente 1-3
días. El período de cultivo para el cultivo principal será
normalmente 2-30 días, preferiblemente
5-20 días y más preferiblemente
5-15
días.
días.
Se sabe que los microorganismos pertenecientes
al género Mortierella subgénero Mortierella producen
compuestos que comprenden ácido araquidónico como el ácido graso
(grasas y aceites (triglicéridos que contienen ácido araquidónico)
y/o fosfolípidos que contienen ácido araquidónico) constituyente
principal, pero, a través de la mutagénesis de la cepa mencionada
anteriormente, los presentes inventores han tenido éxito en la
obtención de un microorganismo capaz de producir grasas y aceites
que comprende ácido
dihomo-\gamma-linolénico como el
ácido graso constituyente principal (Publicación de Patente Japonesa
No Examinada HEI Nº 5-91887), y microorganismos
capaces de producir grasas y aceites que comprenden ácidos grasos
poliinsaturados \omega9 como los ácidos grasos constituyentes
principales (Publicación de Patente Japonesa No Examinada HET Nº
591888).
Además, los presentes inventores han obtenido
microorganismos que tienen resistencia a fuentes de carbono de alta
concentración (Publicación de Patente Japonesa No Examinada HEI Nº
5-9188, Publicación de Patente Japonesa No
Examinada HEI Nº 10-57085, Publicación de Patente
Japonesa No Examinada HEI Nº 5-91886), que son
hongos pertenecientes al género Mortierella subgénero
Mortierella y capaces de producir grasas y aceites que
contienen PUFA y/o fosfolípidos que contienen PUFA mediante cultivo
usando cepas conservadas que se han almacenado mediante el método
de cultivo, y específicamente los nuevos método de preparación y
método de almacenamiento de células conservadas, de acuerdo con la
invención. Sin embargo, la presente invención no está limitada a
hongos pertenecientes al género Mortierella subgénero
Mortierella, y el método de cultivo de la invención puede
aplicarse a microorganismos capaces de producir compuestos que
comprenden ácidos grasos poliinsaturados como ácidos grasos (grasas
y aceites (triglicéridos) y/o fosfolípidos) constituyentes, para
obtener la biomasa microbiana pretendida, aceites crudos y/o
fosfolípidos crudos, y grasas y aceites refinados y/o fosfolípidos
refinados obtenidos mediante el refinado de los aceites crudos y/o
fosfolípidos crudos.
\newpage
El método para obtener el aceite crudo y/o
fosfolípido crudo a partir de microorganismos que tienen la grasa o
el aceite acumulados en las células puede implicar tratar toda la
solución cultivada directamente o después de la esterilización, la
concentración y la acidificación, y a continuación recuperar las
células cultivadas mediante medios de separación de
sólidos/líquidos normales tales como precipitación natural,
separación centrífuga y/o filtración. La separación de
sólidos/líquidos puede apoyarse mediante la adición de un agente de
agregación o un adyuvante de filtración. Ejemplos de agentes de
agregación incluyen cloruro de aluminio, cloruro cálcico, algina y
quitosano. La tierra diatomácea puede mencionarse con un adyuvante
de filtración. Preferiblemente, las células cultivadas se enjuagan,
se rompen y se secan. El secado puede llevarse a cabo mediante
secado por congelación, secado por soplado, secado en lecho
fluidizado o similares.
Los medios para recuperar el aceite crudo y/o
los fosfolípidos crudos de las células secadas pueden ser un método
de extracción con disolvente orgánico o un método de prensado, pero
se prefiere la extracción con un disolvente orgánico bajo una
corriente de nitrógeno. Como disolventes orgánicos pueden usarse
etanol, hexano, metanol, cloroformo, diclorometano, éter de
petróleo, acetona y similares, o puede emplearse la extracción
alternativa con metanol y éter de petróleo, o un sistema disolvente
de una sola capa de
cloroformo-metanol-agua. Sin
embargo, el método de extracción usado para obtener el aceite crudo
y/o el fosfolípido crudo no está limitado al método descrito
anteriormente y en su lugar puede ser cualquier método que consiga
una extracción eficaz de grasas y aceites (triglicéridos) y/o
fosfolípidos celulares. Por ejemplo, la extracción con un flujo de
CO_{2} supercrítico puede emplearse como un medio
eficaz.
eficaz.
Mediante la retirada a presión reducida del
disolvente orgánico o los componentes del flujo supercrítico del
extracto obtenido mediante extracción usando el disolvente orgánico
o el flujo supercrítico, es posible obtener los aceites crudos y/o
los fosfolípidos crudos buscados. Asimismo, en este caso, los
aceites crudos y/o fosfolípidos crudos pueden extraerse mediante el
mismo método que de células secadas, pero la eficacia de extracción
puede ser mayor al usar un disolvente compatible con agua tal como
metanol, etanol o acetona, o una mezcla compatible con agua que
comprende cualquiera de estos con agua y/u otro disolvente.
La biomasa microbiana que contiene ácidos grasos
poliinsaturados como ácidos grasos constituyentes obtenida usando
el presente procedimiento, o los aceites crudos y/o fosfolípidos
crudos, pueden usarse directamente mediante la incorporación a
piensos para animales. Sin embargo, para aplicaciones a alimentos,
se usa preferiblemente un procedimiento común de refinado de
grasas/aceites. El procedimiento de refinado de grasas/aceites usado
puede ser un procedimiento habitual tal como desgomado,
desoxidación, desodorización, decoloración, tratamiento en columna,
destilación molecular, extracción de estearina o similares.
Existe un número ilimitado de usos para la
biomasa microbiana, los aceites crudos, las grasas y los aceites
(triglicéridos) refinados, los fosfolípidos crudos y los
fosfolípidos refinados producidos en la presente memoria: por
ejemplo, pueden usarse como materiales de partida y aditivos para
alimentos, bebidas, cosméticos y productos farmacéuticos. Los
propósitos de uso y las cantidades de uso también son completamente
libres.
Como ejemplos de composiciones alimentarias
pueden mencionarse alimentos habituales, así como alimentos
funcionales, suplementos nutricionales, leche modificada para niños
prematuros, leche modificada para niños maduros, leche modificada
para niños lactantes, alimentos infantiles, alimentos maternos o
alimentos geriátricos. Como ejemplos de alimentos que contienen
grasas/aceites pueden mencionarse alimentos naturales que contienen
grasas/aceites, tales como carne, pescado y nueces, alimentos a los
que se añaden grasas/aceites durante la preparación, tales como
sopas, alimentos que emplean grasas/aceites como medio de
calentamiento, tales como rosquillas, alimentos grasos y aceitosos
tales como mantequilla, alimentos procesados a los que se añaden
grasas/aceites durante el procesamiento, tales como galletas, o
alimentos que se pulverizan o se revisten con grasas/aceites durante
el acabado, tales como bizcochos duros. Tales composiciones también
pueden añadirse a alimentos agrícolas, alimentos fermentados,
piensos para ganado, alimentos marinos y bebidas que no contienen
grasas o aceites. También pueden estar en forma de alimentos
funcionales o productos farmacéuticos, y por ejemplo, en formas
procesadas tales como nutrientes entéricos, polvos, gránulos,
pastillas para chupar, soluciones orales, suspensiones, emulsiones,
jarabes y
similares.
similares.
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La presente invención se explicará ahora con más
detalle mediante los siguientes ejemplos, sabiendo que la invención
no está limitada a ellos.
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Ejemplo
1
Se usó Mortierella alpina
1S-4 como una cepa productora de ácido araquidónico.
Se llevó a cabo un cultivo estacionario durante 7 días a 25ºC en
una superficie inclinada en medio de agar de Czapek (ajustado hasta
pH 6,0 y esterilizado) proporcionado en un tubo de ensayo, y,
después de confirmar el crecimiento hifal, el tubo de ensayo se
almacenó en un refrigerador (4ºC) durante 10 días.
Se añadió agua esterilizada al tubo de ensayo y
la mezcla se agitó bien para preparar una suspensión de esporas. La
suspensión de esporas se diluyó apropiadamente y se revistió sobre
una placa de medio de agar de dextrosa de patata, y se usó un
método de conteo de colonias para contar las esporas en la
suspensión de esporas, dando un resultado de 1 x 10^{6}
esporas/ml. A continuación, la suspensión de esporas se diluyó 100
veces con agua esterilizada. La suspensión de esporas diluida,
glicerina y agua se mezclaron en la siguiente proporción:
suspensión de esporas diluida:glicerina:agua = 1:1:8 (en volumen)
(el agua y la glicerina se premezclaron y se esterilizaron). Una
porción de 1 ml de la mezcla se puso en un vial criogénico
esterilizado de 1,2 ml de volumen y se crioconservó en un
congelador de temperatura ultrabaja a -80ºC.
Para el uso de la M. alpina en cultivo
líquido, la cepa crioconservada se descongeló rápidamente en una
incubadora a 25ºC y se transfirió al cultivo líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Comparativo
1
Se usó Mortierella alpina
1S-4 como una cepa productora de ácido araquidónico.
Se llevó a cabo un cultivo estacionario durante 7 días a 25ºC en
una superficie inclinada en medio de agar de Czapek (ajustado hasta
pH 6,0 y esterilizado) proporcionado en un tubo de ensayo, y,
después de confirmar el crecimiento hifal, el tubo de ensayo se
almacenó en un refrigerador.
Para el uso de la M. alpina
1S-4 en un cultivo líquido, se añadió agua
esterilizada al tubo de ensayo y la mezcla se agitó bien para
preparar una suspensión de esporas. La suspensión de esporas se
transfirió a un medio líquido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El cultivo se llevó a cabo a partir de una cepa
de semillas preparada mediante el método del Ejemplo 1 y el Ejemplo
Comparativo 1 usando M. alpina 1S-4.
Después de transferir 0,1% en volumen de la cepa
de semillas conservada al medio a pH 6,3 que contiene 1,0% de
extracto de levadura y 2,0% de glucosa, el cultivo seminal se inició
bajo condiciones de remoción recíproca a 100 rpm, 28ºC de
temperatura, y el cultivo se continuó durante 3 días.
A continuación se prepararon 25 l de medio a pH
6,3 que contenía 5,0% de polvo de soja desengrasado, 0,3% de
KH_{2}PO_{4}, 0,1% de Na_{2}SO_{4}, 0,05% de
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0,05% de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O,
1,8% de glucosa y 0,1% de aceite de soja en un fermentador de
botella de 50 l de volumen, y a continuación 100 ml de la solución
de cultivo seminal se transfirieron y el cultivo se inicio bajo
condiciones de 92 rpm de agitación, 26ºC de temperatura, 200 kPa de
presión interna y 12,5 l/min de flujo de aire. Durante el cultivo,
se añadió glucosa a la concentración mostrada en la Tabla 1, y el
cultivo se continuó durante 10 días.
El cultivo se llevó a cabo varias veces mediante
el mismo método, en días diferentes después de iniciar la
conservación de la cepa de semillas. Los rendimientos de ácido
araquidónico obtenidos el 10º día de cultivo para cada cultivo se
muestran en la Tabla 2.
En el caso de la cepa de semillas preparada y
conservada mediante el método del Ejemplo 1, la reproducibilidad
del rendimiento de ácido araquidónico era satisfactoria para cada
cultivo. Sin embargo, resultaba una escasa reproducibilidad para
cada cultivo cuando se usaba la cepa de semillas preparada y
conservada mediante el método del Ejemplo Comparativo 1.
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Ejemplo
3
El cultivo se llevó a cabo a partir de una cepa
de semillas preparada mediante el método del Ejemplo 1 y el Ejemplo
Comparativo 1 usando M. alpina 1S-4.
Después de transferir 0,1% en volumen de la cepa
de semillas conservada al medio a pH 6,3 que contiene 1,0% de
extracto de levadura y 2,0% de glucosa, el cultivo seminal se inició
bajo condiciones de 100 rpm de remoción recíproca, 28ºC de
temperatura, y el cultivo se continuó durante 3 días.
A continuación, se prepararon 25 l de medio a pH
6,3 que contiene 1,0% de extracto de levadura, 1,8% de glucosa y
0,1% de aceite de soja en un fermentador de botella de 50 l, y a
continuación 100 ml de la solución de cultivo seminal se
transfirieron y el cultivo se inició bajo condiciones de 200 rpm de
agitación, 28ºC de temperatura, 150 kPa de presión interna y 25
l/min de flujo de aire. Durante el cultivo, se añadió glucosa a la
concentración mostrada en la Tabla 3, y el cultivo se continuó
durante 7 días.
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El cultivo se llevó a cabo varias veces mediante
el mismo método, en días diferentes después de iniciar la
conservación de la cepa de semillas. Los rendimientos de ácido
araquidónico obtenidos el 7º día de cultivo para cada cultivo se
muestran en la Tabla 4.
En el caso de la cepa se semillas preparada y
conservada mediante el método del Ejemplo 1, la productividad de
ácido araquidónico se reproducía satisfactoriamente incluso con
conservación prolongada. Sin embargo, en el caso de la cepa de
semillas preparada y conservada mediante el método del Ejemplo
Comparativo 1, la productividad de ácido araquidónico tendía a caer
durante la conservación prolongada.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
4
Se usó M. alpina 1S-4
como una cepa productora de ácido araquidónico. Dos medios de agar
de Czapek diferentes con diferente pH, que tienen las composiciones
mostradas en la Tabla 5, se prepararon en tubos de ensayo. Se midió
que el pH del medio de Czapek sin ajuste del pH era 8,5.
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Una presilla de cada una de las hifas se
transfirió a dos medios de agar de diferente pH y se llevó a cabo
cultivo estacionario a 25ºC durante 7 días, y, después de confirmar
el crecimiento hifal, los tubos de ensayo se almacenaron en un
refrigerador (4ºC) durante 10 días.
Se añadió agua esterilizada a cada uno de los
tubos de ensayo y la mezcla se agitó bien para preparar una
suspensión de esporas. La suspensión de esporas se diluyó
apropiadamente y se revistió sobre una placa de medio de agar de
dextrosa de patata, y se usó un método de conteo de colonias para
contar las esporas en la suspensión de esporas, dando un resultado
de 1 x 10^{6} esporas/ml obtenido en el medio de agar a pH 6,0, y
5 x 10^{4} esporas/ml obtenido en el medio sin ajuste del pH (pH
medido: 8,5).
Suspensiones de esporas preparadas mediante
ambos métodos se usaron para el cultivo mediante el método del
Ejemplo 3, y se compararon los rendimientos de ácido araquidónico.
Como resultado, se obtuvo un rendimiento de ácido araquidónico de
3,5 g/l a partir de la suspensión de esporas producida en el medio
ajustado hasta pH 6,0, y se obtuvo un rendimiento de ácido
araquidónico de 2,9 g/l a partir del medio sin ajuste del pH (pH
medido:
8,5).
8,5).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se repitió el Ejemplo 1 pero con la suspensión
de esporas conservada preparada en un vial criogénico de 1,2 ml de
volumen almacenado en un congelador a -20ºC para la condición
(5-1), en un congelador de temperatura ultrabaja a
-80ºC para la condición (5-2) y en nitrógeno líquido
(aproximadamente -196ºC) para la condición (5-3).
Después de 30 días de almacenamiento bajo estas tres condiciones, se
llevo a cabo un cultivo del mismo modo que en el Ejemplo 2. Como
resultado, tanto el grado de supervivencia de esporas como la
productividad de ácido araquidónico eran superiores bajo la
condición de almacenamiento en un congelador de temperatura
ultrabaja a
-80ºC.
-80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
El cultivo se llevó a cabo a partir de una cepa
de semillas preparada mediante el método del Ejemplo 1 usando M.
alpina 1S-4.
Después de transferir 0,1% en volumen de la cepa
conservada al medio a pH 6,3 que contiene 1,0% de extracto de
levadura y 2,0% de glucosa, se inició el cultivo seminal bajo
condiciones de 100 rpm de remoción recíproca, 28ºC de temperatura
(1ª etapa), y el cultivo se continuó durante 3 días.
A continuación, se prepararon 30 l de medio a pH
6,3 que contiene 1% de extracto de levadura, 2% de glucosa y 0,1%
de aceite de soja en un fermentador de botella de 50 l de volumen, y
a continuación la solución de cultivo seminal (1ª etapa) se
transfirió y el cultivo seminal (2ª etapa) se inició bajo
condiciones de 200 rpm de agitación, 28ºC de temperatura, 150 kPa
de presión interna y 12,5 l/min de flujo de aire, durante 2 días de
cultivo.
A continuación, 4500 l de medio (Medio A: 336 kg
de polvo de soja, 16,8 kg de KH_{2}PO_{4}, 2,8 kg de
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, 2,8 kg de CaCl_{2}\cdot2H_{2}O,
5,6 kg de aceite de soja) se ajustaron hasta un pH de 4,5 y se
esterilizaron bajo condiciones de 121ºC, 20 minutos. Como un medio
separado, se preparó Medio C al esterilizar 1000 l de medio (Medio
B: 112 kg de glucosa hidratada) a 140ºC durante 40 segundos y
añadirlo al Medio A previo. Después de ajustar el Medio C hasta pH
6,3, se transfirió un volumen de 28 l del cultivo seminal (2ª
etapa), para un total combinado de 5600 l de solución de cultivo
inicial (depósito de cultivo de 10 kl de volumen).
Para la transferencia de la solución de cultivo
seminal (2ª etapa) al medio de cultivo principal, se hizo pasar
vapor a través del tubo que conecta el depósito de cultivo seminal y
el depósito de cultivo principal para la esterilización (\geq30
min a 121-126ºC), y a continuación se introdujo aire
estéril a través del tubo para enfriamiento hasta una temperatura
de la superficie del tubo de menos de 60ºC. Después del
enfriamiento, el cultivo seminal (2ª etapa) se dejó pasar y se
transportó en un volumen prescrito al depósito de cultivo
principal. Cuando se completaba la transferencia del cultivo seminal
al medio de cultivo principal, el cultivo se iniciaba a una
temperatura de 26ºC, una cantidad del flujo de aire de 49 Nm^{3}/h
y una presión interna de 200 kPa. El medio se alimentó durante el
cultivo de acuerdo con el esquema mostrado en la siguiente tabla,
durante 306 horas de cultivo principal. Cuando el cultivo era
completo, el volumen de cultivo era 7750 l como resultado del
incremento por la alimentación del medio y la pérdida por
evaporación. El rendimiento de ácido araquidónico por cultivo a la
terminación del cultivo era
18,2 g/l.
18,2 g/l.
Después de la terminación del cultivo, se llevó
a cabo esterilización bajo condiciones de 12ºC, 20 minutos, y a
continuación la masa húmeda de células se recuperó con un
deshidratador continuo y se secó hasta un contenido de humedad de
1% en peso con un secador de lecho fluidizado oscilatorio, y las
células secadas se transportaron hasta un lugar de envasado usando
un transportador de aire. La masa seca de células obtenida se envasó
en una bolsa receptora de aluminio de aproximadamente 1 m^{3} de
volumen junto con nitrógeno gaseoso, y la abertura de la bolsa se
selló térmicamente antes del almacenamiento en una cámara de
almacenamiento fría a menos de 10ºC.
Después de la retirada de la bolsa receptora, la
masa seca de células se sometió a extracción con hexano y la
solución de hexano se filtró para retirar la porción sólida, después
de lo cual se calentó bajo presión reducida para retirar el hexano
y obtener un aceite crudo que comprende ácido araquidónico como un
ácido graso constituyente.
El mismo cultivo se repitió tres veces. Los
resultados para los rendimientos de ácido araquidónico se resumen
en la Tabla 7. La reproducibilidad de la cepa conservada era
satisfactoria, confirmando así que se había alcanzado una
productividad de ácido araquidónico más estable.
Ejemplo
7
Se usó Mortierella alpina SAM1860
como una cepa productora de ácido
dihomo-\gamma-linolénico. Se
llevó a cabo cultivo estacionario durante 12 días a 25ºC en una
superficie inclinada en medio de agar de Czapek (ajustado hasta pH
6,0 y esterilizado) proporcionado en un tubo de ensayo, y, después
de confirmar el crecimiento hifal, el tubo de ensayo se almacenó en
un refrigerador (4ºC) durante 20 días.
Se añadió agua esterilizada al tubo de ensayo y
la mezcla se agitó bien para preparar una suspensión de esporas. La
suspensión de esporas se diluyó apropiadamente y se revistió sobre
una placa de medio de agar de dextrosa de patata, y se usó un
método de conteo de colonias para contar las esporas en la
suspensión de esporas, dando un resultado de 5 x 10^{6}
esporas/ml.
A continuación, la suspensión de esporas se
diluyó 100 veces con agua esterilizada. La suspensión de esporas
diluida, glicerina y agua esterilizada se mezclaron en la siguiente
proporción: suspensión de esporas diluida:glicerina:agua
esterilizada = 1:1:8 (en volumen). Una porción de 1 ml de la mezcla
se puso en un vial criogénico esterilizado de 1,2 ml de volumen y
se crioconservó durante un mes en un congelador de temperatura
ultrabaja a -80ºC.
Como un ejemplo comparativo, una suspensión de
esporas preparada mediante el mismo método se almacenó durante un
mes en un refrigerador (5ºC).
Las dos cepas conservadas almacenadas durante un
mes se usaron para el cultivo mediante el mismo método que en el
Ejemplo 3. Como resultado, los rendimientos de DGLA eran como se
muestran en la Tabla 8, indicando la eficacia de la
crioconservación.
Ejemplo
8
Se usaron Mortierella elongata
IFO8570 y Mortierella alpina CBS754.68 como cepas
productoras de ácido araquidónico.
Se llevó a cabo cultivo estacionario durante 10
días a 25ºC en una superficie inclinada en medio de agar de Czapek
(ajustado hasta pH 6,0 y esterilizado) proporcionado en un tuvo de
ensayo, y, después de confirmar el crecimiento hifal, el tubo de
ensayo se almacenó en un refrigerador (4ºC) durante 20 días.
Se añadió agua esterilizada al tubo de ensayo y
la mezcla se agitó bien para preparar una suspensión de esporas. La
suspensión de esporas se diluyó 10 veces con agua esterilizada. La
suspensión de esporas diluida, glicerina y agua esterilizada se
mezclaron en la siguiente proporción: suspensión de esporas
diluida:glicerina:agua esterilizada = 1:1,5:7,5 (en volumen). Una
porción de 1 ml de la mezcla se puso en un vial criogénico
esterilizado de 1,2 ml de volumen y se crioconservó durante un mes
en un congelador de temperatura ultrabaja a -80ºC.
Como un ejemplo comparativo, una suspensión de
esporas preparada mediante el mismo método se almacenó durante un
mes en un refrigerador (5ºC).
Cada una de las cuatro cepas conservadas
almacenadas durante un mes (dos cepas diferentes x dos métodos de
conservación diferentes) se transfirió a un medio a pH 6,3 que
contiene 1% de extracto de levadura y 2% de glucosa, y se usó
durante 3 días de cultivo seminal bajo condiciones de 100 rpm de
remoción recíproca, 28ºC de temperatura.
A continuación, 25 l de medio (500 g de glucosa,
775 g de polvo de soja desengrasado, 50 g de KH_{2}PO_{4}, 7,5
g/l de MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, 7,5 g/l de
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 25 g de aceite de soja, pH 6,0) se
preparó en un fermentador de botella de 50 l de volumen, y a
continuación la solución de cultivo seminal se transfirió y el
cultivo principal se inició bajo condiciones de 200 rpm de
agitación, 28ºC de temperatura y 150 kPa de presión interna. El
cultivo se continuó durante 186 horas, mientras se añadía una
solución de glucosa al 50% aproximadamente cada 24 horas para una
concentración de glucosa de aproximadamente 1,2%. Como resultado,
se obtuvieron los rendimientos de ácido araquidónico mostrados en la
Tabla 9, indicando la eficacia del método de crioconservación.
Ejemplo
9
Se preparó una suspensión de esporas, y ampollas
de esporas secas se crearon y se conservaron mediante el método de
secado desde la fase líquida conocido convencionalmente
("Maintaining cultures for Biotechnology and Industry (1996)",
editado por J.C. Hunter-Cevera & A. Belt,
Academic Press, p.115). Después de la creación y el almacenamiento
durante 9 años, las seis ampollas secadas desde la fase líquida se
abrieron y sus contenidos se restauraron y se revistieron sobre
medio de agar, y se contó el número de esporas supervivientes.
Asimismo, los seis viales criogénicos de 1,2 ml de volumen
preparados mediante el método del Ejemplo 1 (y crioconservados
durante 9 años) se abrieron y se contó el número de esporas
supervivientes.
Los resultados mostrados en la tabla posterior
confirmaban que el método de conservación de acuerdo con el Ejemplo
1 daba como resultado un grado de supervivencia notablemente
superior en comparación con el método de secado desde la fase
líquida de la técnica anterior. Se concluía que el método de la
invención es un método muy eficaz para la conservación prolongada
de cepas microbianas.
Claims (13)
1. Un método para la conservación de un
microorganismo capaz de producción microbiana de un ácido graso
poliinsaturado o un compuesto que comprende un ácido graso
poliinsaturado como un ácido graso constituyente, método que
comprende:
- (a)
- formar esporas de dicho microorganismo, con crecimiento hifal, en un medio formador de esporas a pH 4-7 que contiene una fuente de nutrientes que comprende una sal inorgánica y un sacárido;
- (b)
- suspender las esporas obtenidas en (a) en agua esterilizada, o agua esterilizada que contiene un tensioactivo y/o una sal inorgánica, para preparar una suspensión de esporas, y añadir un crioprotector al 5-15% para preparar una suspensión de esporas que se crioconserva; y
- (c)
- conservar la suspensión de esporas que se crioconserva obtenida en (b) a entre -100ºC y -20ºC.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha sal inorgánica es al menos un tipo de sal
inorgánica seleccionado del grupo que consiste en nitrato sódico,
hidrogenofosfato dipotásico, sulfato magnésico, cloruro potásico y
sulfato de hierro (I).
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
ó 2, caracterizado porque dicho medio formador de esporas es
un medio de agar de Czapek o un medio de agar de
Czapek-Dox ajustado hasta un pH de
4-7.
4. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho
crioprotector es glicerina.
5. Un método para la conservación de un
microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4, caracterizado porque dicho ácido graso poliinsaturado
o compuesto que comprende un ácido graso poliinsaturado como un
ácido graso constituyente es un triglicérido que comprende un ácido
graso poliinsaturado como un ácido graso constituyente o un
fosfolípido que comprende un ácido graso poliinsaturado como un
ácido graso constituyente.
6. Un método para la conservación de un
microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, caracterizado porque dicho ácido graso poliinsaturado
es un ácido graso insaturado \omega6, un ácido graso
poliinsaturado \omega3 o un ácido graso poliinsaturado \omega9,
o una de sus combinaciones.
7. Un método para la conservación de un
microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, caracterizado porque dicho ácido graso insaturado
\omega6 es ácido 9,12-octadecadienoico (ácido
linoleico) 18:2\omega6, ácido
6,9,12-octadecatrienoico (ácido
\gamma-linolénico) 18:3\omega6, ácido
8,11,14-eicosatrienoico (ácido
dihomo-\gamma-linolénico)
20:3\omega6, ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico
(ácido araquidónico) 20:4\omega6, ácido
7,10,13,16-docosatetraenoico 22:9\omega6 o ácido
4,7,10,13,16-docosapentaenoico 22:5\omega6.
8. Un método para la conservación de un
microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, caracterizado porque dicho ácido graso insaturado
\omega3 es ácido 9,12,15-octadecatrienoico (ácido
\alpha-linolénico) 18:3\omega3, ácido
6,9,12,15-octadecatetraenoico (ácido estearidónico)
18:4\omega3, ácido 11,14,17-eicosatrienoico
(ácido dihomo-\alpha-linolénico)
20:3\omega3, ácido 8,11,14,17-eicosatetraenoico
20:4\omega3, ácido 5,8,11,14,17-eicosapentaenoico
20:5\omega3, ácido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico
22:5\omega3 o ácido
4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico 22:6\omega3.
9. Un método para la conservación de un
microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, caracterizado porque dicho ácido graso insaturado
\omega9 es ácido 6,9-octadecadienoico
18:2\omega9, ácido 8,11-eicosadienoico
20:2\omega9 o ácido 5,8,11-eicosatrienoico (ácido
de Mead) 20:3\omega9.
10. Un método para la conservación de un
microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 9, caracterizado porque dicho microorganismo es uno
perteneciente al género Mortierella.
11. Un método para la conservación de un
microorganismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 10, caracterizado porque dicho microorganismo
perteneciente al género Mortierella es Mortierella
alpina.
12. Un método para la producción de un ácido
graso poliinsaturado o un compuesto que comprende un ácido graso
poliinsaturado como un ácido graso constituyente, que comprende
conservar un microorganismo mediante un método de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para dar esporas
crioconservadas, y obtener un ácido graso poliinsaturado o un
compuesto que comprende un ácido graso poliinsaturado como un ácido
graso constituyente a partir de un microorganismo cultivado a
partir de las esporas crioconservadas.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
12, que comprende descongelar las esporas crioconservadas durante
30 minutos o menos a una temperatura no superior a 40ºC.
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