CN102106233B

CN102106233B - 一种外生菌根菌菌种保藏方法

Info

Publication number: CN102106233B
Application number: CN 200910247487
Authority: CN
Inventors: 付绍春; 谭琦; 杨慧; 尚晓冬
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2029-12-29
Also published as: CN102106233A

Abstract

本发明涉及一种菌根食用菌菌种的保藏方法，其特征为：所述的菌根食用菌菌种的保藏方法包括如下步骤：a、将菌根菌的孢子或子实体组织放入琼脂培养基中培养菌丝体；b、将琼脂菌丝体接入液体培养基中培养；c、将上述培养的菌丝体经匀质器匀质并再次接入液体培养基中培养，直到符合要求为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃管中或连同培养容器一起密封保藏。本发明的方法经多种菌根食用菌菌种的保藏实验表明，是一种操作简单有效，效率高的方法，很适宜于在大量外生菌根菌菌种的保藏中推广应用，具有显著的经济效益。

Description

一种外生菌根菌菌种保藏方法

技术领域：

本发明涉及真菌的技术领域，具体地说是一种保藏用于生产菌根食用菌子实体为目的的菌种的方法。

背景技术：

目前菌根菌的大多数可食用子实体都是著名的食用菌，其价格极其昂贵。如松口蘑(Tricholoma matsutake)、黑孢块菌(Tubermelanosporum Vitt.)、意大利白块菌(Tuber magnatum)、松乳菇(Lactarius deliciosus)、红汁乳菇(L.hatsudake)、美味牛肝菌(Boletus edulis)、橙盖鹅膏菌(Amatanita caesarea)、中华块菌(Tuber sinense K.Tao et Liu)、印度块菌(Tuber indicum Cooke etMassee)、鸡油菌(Cantharellus cibarius Fr.)、干巴菌(Thelephoraganbajun Zang)、紫红拟锁瑚菌(Clavulinopsis miyabeana(Ito.)Ito.)、褐环乳牛肝菌(Suillus luteus(L.：Fr.)Gray)、厚环乳牛肝菌(Suillus greviller(KL.)sing.)、变绿红菇(Russulavirescens(schaeff.)Fr.)、橙盖鹅膏(Amanita caesarea(Scop：Fr.)Pers.ex schw.)、玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji (kawam.)Hongo)、烟色离褶伞(Lyophyllum fumosum(Pers.：Fr.)Orton)等，还有灰花纹鹅膏(Amanita fuliginea Hongo)、亚稀褶黑菇(Russula subnigricans Hongo)等极具经济价值的毒菌。

但是对其菌种的保藏一直是一个难题，但是因其独具的特性，在现有的技术条件下，不能象广泛栽培的腐生食用菌(如香菇、木耳等)那样进行保藏，液氮超低温保藏法是目前微生物菌种普遍采用的有效的保藏方法，(大型真菌菌种保藏技术规程，2004)，法国、日本、美国的ATCC等菌物保藏中心都试验过用液氮超低温保藏法保藏外生菌根菌，但至今没有获得成功的突破，众多试验表明仅有少数几个菌种的个别菌株能存活下来，如双色蜡蘑S238N菌株(CORBERY Y.and LE TACON F.，Storage of ectomycorrhizal fungiby freezing.Annales des Sciences Forestières，54，211-217，1997)，鸡油菌的SNGT2-A(ATCC 74488)菌株(Danell E.，Flygh G.，Cryopreservation of the ectomycorrhizal mushroom Cantharellus cibarius.Mycol.Res.106(11)：1340-1342，2002).中国菌物保藏中心食用菌分中心经过多年的实践经验也表明，在目前的保藏方法中，用液氮超低温保藏法保藏的外生菌根菌种98％以上都死亡，采取斜面低温传代法保藏菌种也良莠不齐，菌种严重退化，且经多年转管，有些已面貌全非。目前国外大多采用25℃移接繁殖保藏的方法保存外生菌根菌(如松茸、美味牛肝菌等)，部分采取斜面低温传代法保藏菌种，一般2-3个月就需要转管一次，这不仅费时费力，而且菌种退化严重，容易造成菌种性状丢失，甚至在保藏或转管过程中污染而造成损失。中国专利CN1321172C公开了一种食用菌液体菌种的保存方法。将腐生食用菌液体菌种先经过快速冷冻降温到-40℃～-20℃后，再在-40℃～-20℃温度下进行保藏，经冷冻保存7个月后的液体菌种经解冻活化，接种于固体培养基后75％以上能正常萌发，但没有做过菌根食用菌菌种保藏的实验。中国专利CN92108733.0公开了一种食用菌液体菌种的储存方法，液体菌种储存于一种密闭容器的内腔中，储存温度为1℃～25℃，储存时间最长可以达到90天。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种菌根食用菌菌种的保藏方法，它可填补现有外生菌根菌菌种保藏技术的空白。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种外生菌根菌菌种的保藏方法，其特征在于：所述的菌根菌菌种的保藏方法包括如下步骤：a、将菌根菌的孢子或子实体组织放入经改良的琼脂培养基中培养菌丝体；b、将琼脂培养基中培养的菌丝体接入液体培养基中培养；c、将上述培养的菌丝体经匀质器匀质并再次接入液体培养基中培养，直到菌丝体的菌丝球直径达到0.2-1.5cm为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃管中密封保藏，保藏温度1-25℃、湿度55～75％。

使用时，本发明的方法经多种菌根食用菌菌种的保藏实验表明，是一种操作简单有效，效率高的方法，很适宜于在大量外生菌根菌菌种的保藏中推广应用，具有显著的经济效益。

附图说明：

图1为两种菌种保藏方法对比效果图

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

本发明一种外生菌根菌菌种的保藏方法，其特征在于：所述的外生菌根菌菌种的保藏方法包括如下步骤：a、将菌根菌的孢子或子实体组织放入改良的琼脂培养基中培养菌丝体；其中经改良的琼脂培养基的组成如下：Cacl₂，0.03～0.07g；Nacl，0.018～0.03g；KH₂Po₄，0.4～0.65g；MgSo₄·7H₂O，0.13～0.2g；维生素B₁，80～200μg；Fecl₃·6H₂O，0.012～0.036g；(NH₄)₂HPo₄，0.23～0.27g；葡萄糖，10～30g；大麦芽汁250～450mL；琼脂条，15～20g；补蒸馏水至1000mL，pH值5.1～5.8；b、将菌丝体接入液体培养基中培养；其中液体培养基的组成如下：Cacl₂，0.03～0.07g；Nacl，0.018～0.03g；KH₂Po₄，0.4～0.65g；MgSo₄·7H₂O，0.13～0.2g；维生素B₁，80～200μg；Fecl₃·6H₂O，0.012～0.036g；(NH₄)₂HPo₄，0.23～0.27g；葡萄糖，10～30g；大麦芽汁250～450mL；补蒸馏水至1000mL，pH值5.1～5.8；c、将上述培养的菌丝体经匀质器匀质并再次接入液体培养基中培养，直到菌丝体的菌丝球直径达到0.2-1.5cm为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃管中或连同培养容器一起密封保藏。a步骤中，将菌根菌的孢子或子实体组织放在琼脂培养基上，放入培养室中培养，培养室的温度为15-25℃，菌丝的生长速度为25-45天，直到菌丝体长满培养基表50-80％，b步骤中，将菌丝体接入液体培养基中，并放在往返式摇床上培养，培养条件为20-28℃、湿度55～75％、120-180转/分钟，培养7-21天。c步骤中，将菌丝体匀质并接入与b步骤中相同的液体培养基中并放置于震荡培养箱内培养，培养条件为为温度15-28℃、湿度55～75％，转速120-180转/分钟，培养7-21天，直到菌丝球直径达到0.2-1.5cm左右为止。d步骤中，将培养好的菌丝球放入螺口玻璃管中，将菌丝球与终培养液一同放入螺口玻璃管中保藏，保藏温度1-25℃、湿度55-75％。

本发明者在试验过程中发现，我们根据这一发现发明设计了这样一种菌根食用菌菌种的保藏方法。

实施例1

松口蘑菌种的保藏方法

具体操作步骤如下：a、先将新鲜松口蘑的子实体组织放入改良的琼脂培养基中培养菌丝体，直到菌丝体的菌丝体长满培养基表50％，经改良的琼脂培养基的组成如下：Cacl₂，0.05g；Nacl，0.02g；KH₂Po₄，0.5g；MgSo₄·7H₂O，0.18g；维生素B₁，200μg；Fecl₃·6H₂O，0.02g；(NH₄)₂HPo₄，0.25g；葡萄糖，20g；大麦芽汁350mL；琼脂条，20g；补蒸馏水至1000mL，pH5.5；培养室的温度为25℃，正负2℃，菌丝的生长速度为培养30天；b、将琼脂菌丝体接入液体培养基中培养，液体培养基的组成如下，Cacl₂，0.05g；Nacl，0.02g；KH₂Po₄，0.5g；MgSo₄·7H₂O，0.18g；维生素B₁，200μg；Fecl₃·6H₂O，0.02g；(NH₄)₂HPo₄，0.25g；葡萄糖，20g；大麦芽汁350mL；补蒸馏水至1000mL，pH5.5；并放在往返式摇床上培养，培养条件为23℃、湿度65％，转速150转/分钟，培养14天；c、将菌丝体匀质并接入与b步骤中相同的液体培养基中并放置于震荡培养箱内培养，培养条件为温度24℃、湿度65％，转速160转/分钟，培养11天，直到菌丝球直径达到0.8cm左右为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃管中或连同培养容器一起密封保藏，保藏温度10℃、湿度55％。以综合PDA斜面培养保藏法做对照。按着以上方法保藏菌种14个月，分别转接于综合PDA培养基上，用此法保藏的菌种经转接活化后仅用3天菌种即萌发，菌丝生长旺盛，菌落形态草帽状，30天菌落直径达3cm(接入时菌球直径0.3cm)；而对照法保藏的菌种需5天才萌发，菌丝生长一般，菌落形态不完整，30天菌落直径达1.8cm(接入时菌块直径0.8cm)；见图1左边为本专利申请的保藏方法，右边为常规方法。

实施例2美味牛肝菌菌种的保藏

具体操作步骤如下：a、先将美味牛肝菌的孢子或子实体组织放入改良的琼脂培养基中培养菌丝体，直到菌丝体的菌丝体长满培养基表75％，经改良的琼脂培养基的组成如下：Cacl₂，0.06g；Nacl，0.03g；KH₂Po₄，0.6g；MgSo₄·7H₂O，0.2g；维生素B₁，150μg；Fecl₃·6H₂O，0.02g；(NH₄)₂HPo₄，0.25g；葡萄糖，30g；大麦芽汁400mL；琼脂条，18g；补蒸馏水至1000mL，pH5.6；培养室的温度为22℃，菌丝的生长速度35天；b、将琼脂菌丝体接入液体培养基中培养，液体培养基的组成如下：Cacl₂，0.06g；Nacl，0.03g；KH₂Po₄，0.6g；MgSo₄·7H₂O，0.2g；维生素B₁，150μg；Fecl₃·6H₂O，0.02g；(NH₄)₂HPo₄，0.25g；葡萄糖，30g；大麦芽汁400mL；补蒸馏水至1000mL，pH5.6；并放在往返式摇床上培养，培养条件为25℃、湿度65％、150转/分钟，培养12天；c、将菌丝体匀质并接入与b步骤中相同的液体培养基中并放置于震荡培养箱内培养，培养条件为为温度25℃、湿度65％，转速150转/分钟，培养10天，直到菌丝球直径达到1.0cm左右为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃管中或连同培养容器一起密封保藏，将培养好的菌丝球放入螺口玻璃管中，将菌丝球与终培养液一同放入螺口玻璃管中保藏，保藏温度12℃、湿度55％。以综合PDA斜面培养保藏法做对照。

按着以上方法保藏菌种14个月，分别转接于综合PDA培养基上，用此法保藏的菌种经转接活化后仅用3天菌种即萌发，菌丝生长旺盛；而对照法保藏的菌种需5-7天才萌发，菌丝生长一般，菌落形态不完整，本保藏菌种的方法明显优于现有技术的菌种保藏的方法。

Claims

1.一种菌根食用菌菌种的保藏方法，其特征在于：所述的菌根食用菌菌种的保藏方法包括如下步骤：a、将菌根菌的孢子或子实体组织放入改良的琼脂培养基中培养菌丝体；其中经改良的琼脂培养基的组成如下：Cacl₂，0.03～0.07g；Nacl，0.018～0.03g；KH₂Po₄，0.4～0.65g；MgSo₄·7H₂O，0.13～0.2g；维生素B₁，80～200μg；Fecl₃·6H₂O，0.012～0.036g；(NH₄)₂HPo₄，0.23～0.27g；葡萄糖，10～30g；大麦芽汁250～450mL；琼脂条，15～20g；补蒸馏水至1000mL，pH值5.1～5.8；b、将菌丝体接入液体培养基中培养；其中液体培养基的组成如下：Cacl₂，0.03～0.07g；Nacl，0.018～0.03g；KH₂Po₄，0.4～0.65g；MgSo₄·7H₂O，0.13～0.2g；维生素B₁，80～200μg；Fecl₃·6H₂O，0.012～0.036g；(NH₄)₂HPo₄，0.23～0.27g；葡萄糖，10～30g；大麦芽汁250～450mL；补蒸馏水至1000mL，pH值5.1～5.8；c、将上述培养的菌丝体经匀质器匀质并再次接入液体培养基中培养，直到菌丝体的菌丝球直径达到0.2-1.5cm为止；d、将以上培养好的菌丝球转入螺口小玻璃管中或连同培养容器一起密封保藏；a步骤中，所述培养菌丝体是放入培养室中培养，培养室的温度为15-25℃，菌丝的生长时间为25-45天，直到菌丝体长满培养基表50-80％，b步骤中，所述培养是放在往返式摇床上培养，培养条件为20-28℃、湿度55～75％、120-180转/分钟，培养7-21天；c步骤中，所述液体基是与b步骤中相同的液体培养基，并放置于震荡培养箱内培养，培养条件为温度15-28℃、湿度55～75％，转速120-180转/分钟，培养7-21天，直到菌丝球直径达到0.2-1.5cm为止；d步骤中，将菌丝球与终培养液一同放入螺口小玻璃管中保藏，保藏温度1-25℃、湿度55-75％。