KR100653107B1 - 불포화 지방산 또는 이를 함유하는 지질의 제조방법 - Google Patents

불포화 지방산 또는 이를 함유하는 지질의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 배지중의 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온이, 각각 5 내지 60mM, 5 내지 60mM, 2 내지 50mM, 0.5 내지 9mM, 0.5 내지 12mM의 범위에 있는 미생물 배양용 배지를 사용하여 배양시에 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물의 균학상의 형태를 제어하는 방법, 포스페이트 이온이 5 내지 60mM, 칼륨 이온이 5 내지 60mM, 나트륨 이온이 2 내지 50mM, 마그네슘 이온이 0.5 내지 9mM 및 칼슘 이온이 0.5 내지 12mM의 범위로 존재하는 배지중에서 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양함을 특징으로 하여 불포화 지방산 또는 이를 함유하는 지질을 제조하는 방법, 및 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온이, 각각 5 내지 60mM, 5 내지 60mM, 2 내지 50mM, 0.5 내지 9mM, 0.5 내지 12mM의 범위에 있음을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지에 관한 것이다.
사상균, 모르티에렐라 알피나, 모르티에렐라 엑시구아, 모르티에렐라 엘롱가타, 모트티에렐라 하이그로필라, 미생물 배양용 배지, 불포화 지방산, 지질, 아라키돈산, 감마-리놀렌산, 디호모-감마-리놀렌산, 미드산, 에시코사펜타엔산

Description

불포화 지방산 또는 이를 함유하는 지질의 제조방법{A process for producing unsaturated fatty acids or a lipid containing the same}
본 발명은 신규한 미생물 배양용 배지, 및 당해 배지중에서 불포화 지방산 생산능을 갖는 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양하여 수득되는 불포화 지방산 함유 유지의 제조방법에 관한 것이다.
아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 에이코사펜타엔산 및 미드산 등의 불포화 지방산은 강력하면서도 다채로운 생리활성을 갖는 프로스타글란딘, 트롬복산, 프로스타사이클린 및 류코트리엔 등의 전구 물질이라고 불리며, 최근에 주목되고 있다. 예를 들면, 아라키돈산은 특히 유아의 발육에 필요한 성분으로서, DHA(도코사헥사엔산)과 함께 급속히 연구가 진행되고 있으며, Lanting 등은 생후 3주간 이상 모유로 자란 유아와 유아용 분유로 자란 유아를 9세까지 추적조사하여, 행동면 등에 기초하여 뇌신경의 작은 장해의 발생율을 검토한 결과, 유아용 분유로 자란 아이의 뇌장해 발생율은 모유로 자란 아이의 2배라고 보고하였다[LANCET, vol. 344, 1319-1322(1994)].
이 충격적인 결과는 모유에는 존재하지만 유아용 분유에는 거의 존재하지 않는 DHA 및 아라키돈산 등의 불포화 지방산이 뇌의 발달에 관계하기 때문이라고 추측된다. 이밖에도, 불포화 지방산이 신생아의 뇌 및 망막의 발달에 관계할 것이라는 결과가 연이어 보고되어, 미숙아 및 신생아 영양의 영역에서 뜨거운 화제로서 주목되고 있다.
이들 불포화 지방산은 동물계에 널리 분포하며, 예를 들면, 아라키돈산은 동물의 부신선이나 간장에서 추출한 지질로부터 분리된다. 그러나 불포화 지방산의 함량이 적어서 대량 공급방법으로서는 불충분하기 때문에, 여러 미생물을 배양하여 불포화 지방산을 수득하는 방법이 고안되어 왔다. 그 중에서도 모르티에렐라 속에 속하는 미생물은 아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 에이코사펜타엔산 및 미드산 등의 불포화 지방산을 생산하는 미생물로서 알려져 있고 이 미생물을 사용한 발효법에 의해 당해 지방산을 제조하는 방법이 개발되어 있다[일본 공개특허공보 제(소)63-44891호, 제(소)63-12290호, 제(소)63-14696호, 제(소)63-14697호].
또한, 모르티에렐라 속 미생물에 변이 처리를 실시하여 수득되는, △12 불포화 활성이 저하 또는 결실되어 있는 변이주를 사용하여 미드산을 제조하는 방법도 공지되어 있다[일본 공개특허공보 제(평)5-91888호]. 또한, 모르티에렐라 속 미생물에 변이 처리를 실시하여 수득되는, △5 불포화 활성이 저하 또는 결실되어 있는 변이주를 사용하여 디호모-γ-리놀렌산을 대량으로 제조하는 방법도 공지되어 있다[일본 공개특허공보 제(평)5-91887호].
그러나, 모르티에렐라 속과 같은 사상균을 이용하여 액체 배지에서 발효 생산을 수행하는 경우, 때때로 균체 증식에 의한 배양액의 점도 증가와 그에 따르는 산소 공급 부족이 일어난다. 이의 대책으로서 개발된 용존 산소 농도 제어법[일본 공개특허공보 제(평)6-153970호]은 생산성 향상에 크게 공헌하고 있지만, 공업적 규모의 배양에서 경제적으로 뛰어난 높은 생산성을 실현함에 있어서 이것으로 충분하다고는 말할 수 없으며, 보다 염가의 배지나 미량 영양소의 탐색, 배양액의 유동성 개선을 위한 균 형태의 제어법 등의 폭넓은 배양 기술 개발이 불가결하다.
이러한 기술개발 방책으로서, 미량 영양소로서 염류의 첨가가 불포화 지방산생산성 또는 균 형태에 미치는 영향이 검토되고 있으며, 그 중에서도 칼륨, 나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트 등의 각 이온에 대해서는, 첨가 효과에 대해서 여러 보고가 이루어져 있다[국제출원 제WO96/21037호, 일본 공개특허공보 제(평)8-214893호, Appl. Microbiol. Biotechnol., vol.39, p.450 (1993), Biotechnology Lett., vol.12, no.6, p.455 (1990), 유카가쿠(油化學), vol.37, no.3, p.241 (1989), 유카가쿠, vol.42, no.11, p.893 (1993)]. 그러나, 한편에서 이들 주된 이온을 모두 영양보급이라는 개념을 상회하는 0.5mM 이상의 농도로 첨가하여, 보다 적극적인 불포화 지방산의 생산성 향상 효과를 검토하고, 또한 첨가 이온 밸런스가 미치는 균 형태 또는 지질 조성에 대한 영향까지도 검토한 보고는 이루어져 있지 않으며, 이온 첨가법의 최적화가 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은 모르티에렐라 속에 속하는 미생물의 발효법에 의한 불포화 지방산 함유 유지의 제조방법으로서, 배지에 염류를 첨가함으로써, 불포화 지방산의 생산성, 구체적으로는 균의 증식, 불포화 지방산의 축적 및 총지질의 축적 모두를 향상시켜 경제적이면서도 안정적으로 불포화 지방산 함유 유지를 제공하고자 하는 것이다. 또한, 본 발명은 예를 들면, 불포화 지방산이 높은 수율로 수득되는 등의 이점을 가지며, 또한 염가의 미생물 배양용 배지를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명자들은 위에서 언급한 과제를 해결하기 위해서 배지에 대한 염류 첨가 효과에 관해서, 불포화 지방산 수율 뿐만 아니라, 균 형태 및 지질 조성 변화에 관해서 종합적으로 검토한 결과, 칼륨, 나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트의 모든 이온을 소정 농도로 또한 균형 있게 첨가하는 것이 매우 효과적임을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온이, 각각 5 내지 60mM, 5 내지 60mM, 2 내지 50mM, 0.5 내지 9mM 및 0.5 내지 12mM의 범위에 있음을 특징으로 하는 미생물 배양용 배지 및 당해 배지중에서 사상균, 특히 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양하여, 생산성이 향상된 불포화 지방산 또는 이를 포함하는 지질을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 불포화 지방산이란 탄소수가 16개 이상이고 또한 이중결합이 1개 이상인 지방산을 말하며, 또한 이 중에서 탄소수가 18개 이상이고 또한 이중결합이 2개 이상인 지방산을 일반적으로 고급 불포화 지방산이라고 하며, 예로서 γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 미드산, 6,9-옥타데카디엔산 및 8,11-에이코사디엔산 등이 있다.
발명의 실시를 위한 형태
본 발명의 미생물 배양용 배지는 배지중의 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온이, 각각 5 내지 60mM, 5 내지 60mM, 2 내지 50mM, 0.5 내지 9mM 및 0.5 내지 12mM의 범위이고, 바람직하게는 각각 10 내지 45mM, 10 내지 45mM, 5 내지 40mM, 1 내지 6mM 및 1 내지 9mM의 범위이며, 미생물(예: 사상균)을 배양하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 배지를 사용함으로써, 불포화 지방산 생산능을 갖는 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물의 경우에 이의 배양물로부터 불포화 지방산을 높은 수율로 수득할 수 있게 된다. 또 본 발명의 배지는 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온 이외의 성분(예: 탄소원, 질소원 또는 미량 영양원 등)을, 사용하는 미생물에 따라서 적절히 배합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 불포화 지방산 함유 유지를 제조하는데 사용하는 미생물은, 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물이라면 모두 사용할 수 있다. 이러한 미생물로서는, 예를 들면 문헌[MYC0TAX0N, Vol. XLIV, No.2, pp. 257-265(1992)]에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있고, 구체적으로는 모르티에렐라 아속(subgenus Mortierella)(예: 모르티에렐라·엘롱가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라·엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모르티에렐라·하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70 및 CBS754.68 등)에 속하는 미생물이나, 마이크로뮤코아속(subgenus Micromucor)(예; 모르티에렐라·이자벨리나(Mortierella isabelina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모르티에렐라·나나(Mortierella nana) IFO8190, 모르티에렐라·라마니아나(Mortierella ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모르티에렐라·비나세아(Mortierella vinacea) CBS236.82 등)에 속하는 미생물을 들 수 있다.
이들 균주는 모두, 오오사까시의 재단법인 효소 연구소(IFO), 미국 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, ATCC) 및 네덜란드 센트랄뷰로 포르 쉬멀컬쳐스(Centraalbureau voor Schimmelcultures, CBS)로부터 어떠한 제한도 없이 입수할 수 있다. 또한, 본 발명자들이 토양으로부터 분리한 균주 모르티에렐라·엘롱가타 SAM0219(미공연균기 제8703호)(미공연조기 제1239호)를 사용할 수 있다. 이들 타입 컬쳐에 속하는 균주 또는 자연계에서 분리한 균주는 그대로 사용할 수 있지만, 1회 이상 증식 또는 단리시켜 수득되는, 원래의 균주와는 성질이 다른 자연변이주를 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명에 사용되는 미생물은, 모르티에렐라 속에 속하는 미생물(야생주)의 변이주 또는 재조합주, 즉 동일한 기질을 이용하여 배양하였을 경우, 원래의 야생주가 생산되는 양과 비교하여, 유지중의 특정 및/또는 모든 지방산 함량이 많아지도록, 또는 총유지량이 많아지도록, 또는 이들 둘다를 의도하여 설계된 것이 포함된다. 예를 들면, 특정한 불포화 지방산 함량이 많아지도록 설계된 변이주로서, △12 불포화화 활성이 결실된 모르티에렐라·알피나 SAM1861(미공연조기 제3590호, FERM제BP-3590호)나, △5 불포화화 활성이 결실된 모르티에렐라·알피나 SAM1860(미공연조기 제3589호, FERM 제BP-3589호)을 들 수 있다.
또한, 비용 효율이 뛰어난 기질을 높은 효율성으로 사용하고, 대응하는 야생주와 동량의 불포화 지방산을 생산하도록 설계된 미생물도 포함된다.
상기 모르티에렐라 속에 속하는 미생물은, 배지중의 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온의 농도를 소정의 범위로 제조하는 것 이외에는, 통상적인 방법에 따라 배양할 수 있다. 예를 들면, 상기 균주의 포자, 균사 또는 미리 배양하여 수득된 전기 배양액을, 액체 배지 또는 고체 배지에 접종하여 배양한다. 탄소원으로서는 글루코스, 프럭토스, 크실로스, 사카로스, 말토스, 가용성 전분, 당밀, 글리세롤, 만니톨, 시트르산, 옥수수 전분 등의 일반적으로 사용되고 있는 것을 모두 사용할 수 있지만, 글루코스, 말토스, 프럭토스, 옥수수 전분, 글리세롤 및 시트르산이 특히 바람직하다.
질소원으로서는 유기 질소원(예: 펩톤, 효모 추출물, 맥아 추출물, 고기 추출물, 카자미노산, 옥수수 침지액 및 요소 등), 무기 질소원(예: 질산암모늄 및 황산암모늄) 등을 사용할 수 있지만, 특히 대두로부터 수득되는 질소원을 단독으로 또는 복수로 사용하거나, 또는 상기 질소원과 배합하여 사용함으로써, 보다 바람직한 염류 첨가의 상승 효과가 수득된다. 대두로부터 수득되는 질소원은, 수분을 제외한 성분당 질소함량이 2% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 이상이다.
또한, 대두로부터 수득되는 질소원으로서는, 탈지 대두 또는 여기에 열처리; 산처리; 알칼리처리; 효소처리; 화학개질; 또는 당해 처리를 포함하는 화학적 및/또는 물리적 처리에 의한 변성 및/또는 재생; 물 및/또는 유기 용매를 사용한 일부성분의 제거; 여과 및/또는 원심분리에 의한 일부 성분의 제거; 동결; 분쇄; 건조; 및/또는 체에 의한 분리 등의 가공을 실시한 것, 또는 미탈지 대두에 동일한 가공을 실시한 것을 단독으로 또는 복수로 배합하여 사용할 수 있으며, 일반적인 것으로서는 대두, 탈지, 후레이크, 식용 대두 단백, 비지, 두유 및 콩가루 등을 들 수 있지만, 특히, 탈지에 열변성을 실시한 것, 보다 바람직하게는 탈지를 약 70 내지 90℃에서 열처리하고 또한 에탄올 가용성분을 제거한 것이 바람직하다.
이밖에 필요에 따라서, 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온 이외에, 철, 구리, 아연, 망간, 니켈, 코발트 등의 금속 이온이나 비타민 등을 미량 영양원으로서 사용할 수 있다. 불포화 지방산의 수율을 증가시키기 위해서, 불포화 지방산의 전구체로서, 예를 들면, 헥사데칸 또는 옥타데칸과 같은 탄화수소; 올레산 또는 리놀레산과 같은 지방산 또는 이의 염, 또는 지방산 에스테르, 예를 들면 에틸에스테르, 글리세롤 지방산 에스테르, 솔비탄 지방산 에스테르; 또는 올리브유, 대두유, 유채유, 면실유 또는 코코넛유와 같은 유지류를 단독으로 또는 배합하여 사용할 수 있다. 기질의 첨가량은 배지에 대하여 0.001 내지 10%이며, 0.5 내지 10%가 바람직하다. 또한, 이들 기질을 유일한 탄소원으로서 사용하여 배양할 수도 있다.
본 발명에 있어서 배지중의 포스페이트 이온은 5 내지 60mM, 칼륨 이온은 5 내지 60mM, 나트륨 이온은 2 내지 50mM, 마그네슘 이온은 0.5 내지 9mM, 칼슘 이온은 0.5 내지 12mM의 범위로 하고, 배지중의 포스페이트 이온은 10 내지 45mM이 바람직하며, 칼륨 이온은 10 내지 45mM, 나트륨 이온은 5 내지 40mM, 마그네슘 이온은 1 내지 6mM, 칼슘 이온은 1 내지 9mM의 범위로 한다.
이들 이온은, 포스페이트 이온의 경우에 예를 들어, 인산일수소이칼륨, 인산이수소일칼륨, 인산일수소이나트륨 및/또는 인산이수소일나트륨 등의 염류, 또한 칼륨 이온의 경우에, 예를 들어, 인산일수소이칼륨, 인산이수소일칼륨 및/또는 염화칼륨 등의 염류, 나트륨 이온의 경우에, 예를 들어, 인산일수소이나트륨, 인산이수소일나트륨, 염화나트륨 및/또는 황산나트륨 등의 염류, 마그네슘 이온의 경우에 예를 들어, 염화마그네슘 및/또는 황산 마그네슘 등의 염류, 칼슘 이온의 경우에, 예를 들어, 염화칼슘 및/또는 탄산칼슘 등의 염류를 배지에 첨가함으로써 제조할 수 있지만, 여기에 한정되는 것이 아니라 균의 생육을 억제하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
또한, 이들 염류는 수화물 또는 무수물의 어떠한 것이라도 좋다. 또한 상기 염류는 본 발명의 이온 농도의 범위내가 되도록 적절히 배합하여 사용한다. 예를 들면, 인산이수소일칼륨(KH2P04), 무수 황산나트륨(Na2S04), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H20) 및 염화칼슘 2수화물(CaCl2·2H20)의 4종류를 배합하여 소정량을 첨가함으로써, 본 발명의 이온을 소정 농도로 제조할 수 있다.
본 발명에서는 이러한 염류를 첨가함으로써, 불포화 지방산 수율이 대폭 증대한다. 또한, 액체배양에 있어서의 균 형태에 대한 영향은, 염류 이외의 배지 성분 및 사용하는 균주의 영향이 있기 때문에 일률적으로는 규정할 수 없지만, 예를 들어 포스페이트 첨가량 증가에 따라 펄프 형태의 균의 비율이 증가하고, 나트륨, 칼슘, 또는 마그네슘 첨가량 증가에 따라 펠릿 형태의 균의 비율이 증가한다. 펄프형에서의 증식은, 배양액의 점도를 상승시키고, 유동성 및 용존 산소 농도 저하의 원인이 되어 수율 저하를 야기한다.
한편, 펠릿형에서의 증식은 점도 상승이 일어나기 어렵고 유동성은 높지만, 펠릿 벽이 산소 이동의 속도를 제한하여 수율 저하를 야기한다. 그러나, 당해 이온을 소정 농도로 또한 균형있게 첨가함으로써 과도한 펄프화 및 과도한 펠릿화가 억제되고, 펄프와 펠릿의 혼합 상태가 유지되는 것으로 발견되었다. 이러한 기술에 의해서 균 형태의 제어가 용이하게 되어, 매우 높은 수율을 얻을 수 있게 된다.
상기한 바와 같이 수득된 불포화 지방산 함유 지질은, 이의 대부분이 트리글리세리드이지만, 배지에 첨가되는 포스페이트의 양이 증가함에 따라서 지질의 비율이 증가한다. 그러나, 포스페이트 이외에, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온을 모두 균형있게 첨가함으로써, 균체 지질중 트리글리세리드의 비율을 90% 이상으로 유지할 수 있음을 발견하였다. 목적 지질이 트리글리세리드인 경우, 첨가 염류를 본 발명 범위에서 균형을 맞춤으로써 높은 회수율을 유지할 수 있다.
상기의 탄소원, 질소원 및 또다른 배지 성분은 배양 개시전의 배지 및/또는 배양중의 배양액에 첨가할 수 있다. 이들 배지 성분은 한번에 첨가할 수도 있고, 또는 연속적으로, 혹은 여러번 나누어 경시적으로 첨가할 수도 있다. 이들 배지 성분은 각각 단독으로 또는 미리 혼합하여 멸균 및 첨가할 수 있으며, 이의 멸균방법 또는 첨가 순서는 특별히 제한되지 않는다. 탄소원 및 질소원은 각각 멸균하는 것이 바람직하고, 염류는 대수증식 종료까지 첨가하며, 대수증식 중기 이전에 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온, 마그네슘 이온 및 칼슘 이온 농도에 영향을 주지 않는 다른 배지 성분은 균의 생육을 저해하지 않는 농도라면 특히 제한하지 않는다.
실용상, 일반적으로 탄소원의 총 첨가량은 0.1 내지 40중량%이고, 1 내지 25중량%가 바람직하며, 질소원의 총첨가량은 0.01 내지 10중량%이고, 0.1 내지 10중량%의 농도로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 초기의 탄소원 첨가량은 1 내지 5중량%, 초기의 질소원 첨가량을 0.1 내지 6중량%이며, 배양 도중에 탄소원 및 질소원을, 보다 바람직하게는 탄소원만을 첨가하여 배양한다. 배양 온도는 5 내지 40℃이고, 바람직하게는 20 내지 30℃로 하며, 또한 20 내지 30℃에서 균체를 증식시킨 후 5 내지 20℃에서 배양을 계속하여 불포화 지방산을 생산할 수도 있다.
배지의 pH는 4 내지 10, 바람직하게는 5 내지 8로서 통기 교반 배양, 진동 배양 또는 정치 배양을 실시한다. 배양은 통상 2 내지 20일간 수행한다. 이와 같이 배양하여, 균체내에 불포화 지방산을 함유하는 지질이 생성되고 축적된다. 불포화 지방산의 제조에 있어서는, 액체 배지에 의한 통기 교반 배양이 바람직하다.
목적 지질은, 배양에 의해서 지질을 제조하는 도중의 배양액 또는 이의 멸균한 배양액 또는 배양 종료후의 배양액 또는 이의 멸균한 배양액, 또는 각각으로부터 집균한 배양 균체 또는 이의 건조물로부터, 통상적인 방법에 따라서 수득될 수 있다. 배양 균체로부터, 예를 들면 다음 방법을 사용하여 목적하는 지질을 채취한다.
배양 종료후에 배양액으로부터 원심분리 및/또는 여과 등의 상용의 고액 분리 수단에 의해 배양 균체를 수득한다. 배양 균체는 바람직하게는 세척, 분쇄 및 건조한다. 건조는 동결건조 및 풍건 등에 의해서 수행할 수 있다. 건조 균체는 질소 기류하에서 유기 용매에 의해서 추출처리하는 것이 바람직하다. 유기 용매로서는 에테르, 헥산, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 디클로로메탄 및 석유 에테르 등을 사용할 수 있고, 또한 메탄올과 석유 에테르의 교대추출 또는 클로로포름-메탄올-물의 단층 시스템의 용매를 사용한 추출에 의해서도 양호한 결과를 수득할 수 있으며, 바람직하게는 헥산을 사용하여 추출한다.
추출물로부터 감압하에서 유기 용제를 증류 제거하여, 고농도의 불포화 지방산 함유 지질을 수득할 수 있다. 또한, 상기 방법 대신에 습균체를 사용하여 추출할 수 있다. 이 경우에는 메탄올 또는 에탄올 등의 물-혼화성 용매, 또는 이들과 물 및/또는 다른 용매로 이루어지는 물-혼화성 혼합 용매를 사용한다. 그 밖의 순서는 위에서 언급한 바와 같다. 배양물로부터 채취한 불포화 지방산 함유 지질로부터 불포화 지방산 함유 트리글리세리드를 분리 및 정제하기 위해서는, 통상적인 방법에 의해, 용매 추출, 탈용매 후에 탈산성화, 탈색, 탈취, 탈고무 처리 또는 냉각분리 등에 의해 수행할 수 있게 된다.
다음에, 실시예에 따라 본 발명을 구체적으로 설명한다.
실시예 1.
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina) CBS754.68을 사용한다. 글루코스 2%, 대두유 0.1% 및 표 1의 조성의 질소원 및 염류성분을 함유하는 4종류의 배지 5L를 10L들이 배양조에서 제조하고, 초기 pH를 6.0으로 조절한다. 전기 배양액 50mL를 접종하고, 온도 28℃, 통기량 1.0vvm 및 교반 속도 300rpm으로 8일간 통기 교반 배양을 한다. 글루코스 농도를 유동 첨가법에 의해서 4일째까지는 1 내지 2%로, 그 이후는 0.5 내지 1%로 유지한다.
배양의 결과, 5종류의 이온 모두를 효모 추출물 배지에 첨가하면 아라키돈산 생성량이 1.35배로 증가하고, 대두 단백에 첨가하면 1.68배로 증대하여 염류 첨가의 유효성이 확인된다. 인산수소칼륨만 첨가한 경우에는, 아라키돈산 생성량 증가는 확인되지 않는다.
아라키돈산 생성량 이외에, 수득된 균체로부터 헥산으로 지질을 추출한 후, 분리조건(헥산:디에틸에테르:포름산=42:28:0.3)하에 TLC 방법으로 지질 조성마다 분획하고, 각 조성 함량을 TLC/FID 분석기(상품명:이아트로스캔 제조원:야트론사)로 정량한다.
이의 결과, 인산수소칼륨만의 첨가에 의해서, 헥산으로 추출한 균체 지질중의 인지질의 비율이 증가하는 한편, 인산수소칼륨을 포함하는 4종류의 염류를 모두 첨가함으로써, 염류를 첨가하지 않은 경우와 동등한 지질 조성이 수득됨을 알 수 있고, 목적 생산물이 트리글리세리드인 경우는, 전체 이온을 균형 있게 첨가함으로써 트리글리세리드 함량이 높은 지질이 수득됨을 확인한다.
배지 효모 추출물 1% 대두 단백 1.5% 효모 추출물 1% KH2PO4 0.3% (22mM) MgCl2·6H2O 0.05% (2.5mM) Na2SO4 0.1% (7.0mM) CaCl2·2H2O 0.05% (3.4mM) 대두단백 1.5% KH2PO4 0.3% (22mM) MgCl2·6H2O 0.05% (2.5mM) Na2SO4 0.1% (7.0mM) CaCl2·2H2O 0.05% (3.4mM) 대두단백 1.5% KH2PO4 0.3% (22mM)
아라키돈산 생성량 2.28g/L 1.93g/L 3.07g/L 3.24g/L 2.00g/L
총지방산 생성량 6.57g/L 5.74g/L 8.82g/L 8.95g/L 5.83g/L
건조균체 농도 17.3g/L 15.7g/L 19.3g/L 22.0g/L 16.0g/L
트리글리 세리드 함량 97.2% 97.4% 97.0% 96.0% 88.3%
인지질 함량 1.2% 1.2% 1.4% 1.2% 9.5%
효모 추출물: TASTONE154AG 제조원: 유니버설후즈사 대두단백: 에스산 미트 특등 제조원: 아지노모토사
실시예 2.
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina) CBS754.68을 사용한다. 글루코스 2%, 콩가루 1.5%, 대두유 0.1% 및 표 2의 조성의 염류 성분을 함유하는 4종류의 배지 25L를 50L들이 배양조에서 제조하고, 초기 pH를 6.2로 조절한다. 전기 배양액 50mL를 접종하고, 온도 28℃, 통기량 1.0vvm, 교반 속도 300rpm 및 탱크 내압 200kPa의 조건으로 8일간 통기 교반 배양을 수행한다. 글루코스 농도를 유동 첨가법에 의해서 4일째까지는 1 내지 2%로, 그 이후는 0.5 내지 1%로 유지한다.
배양의 결과, 염류 첨가에 의해서 아라키돈산 생성량이 증대되고, 염류 첨가의 유효성에 의해 효과적인 농도 범위가 확인된다.
KH2PO4첨가량 0% 0.075(5.5mM) 0.3%(22mM) 1.2%(88mM)
MgCl2·6H2O 첨가량 0% 0.0125%(0.61mM) 0.05%(2.5mM) 0.2%(9.8mM)
Na2SO4 첨가량 0% 0.025%(1.8mM) 0.1%(7.0mM) 0.4%(28mM)
CaCl2·2H2O 첨가량 0% 0.0125(O.85mM) 0.05%(3.4mM) 0.2%(14mM)
아라키돈산 생성량 2.11g/L 2.61g/L 2.90g/L 1.95g/L
실시예 3.
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina) CBS754.68을 사용한다. 글루코스 2%, 탈지 대두 가루 1.5%, 대두유 0.1% 및 표 3의 조성의 염류 성분을 포함하는 4종류의 배지 25L를 50L들이 배양조에서 제조하고, 초기 pH를 6.0으로 조절한다. 전기 배양액 50mL를 접종하고, 온도 28℃, 통기량 1.0vvm, 교반 속도 300rpm 및 탱크 내압 200kPa의 조건에서 8일간 통기 교반 배양을 수행한다. 글루코스 농도를 유동 첨가법에 의해서 4일째까지는 1 내지 2%로 유지하고, 그 이후는 0.5 내지 1%로 유지한다.
염류 무첨가 배지에서 균 형태는 펠릿형과 펄프형의 혼합상태에서 증식하고, 펠릿형의 대부분은 미립형으로 약 0.5 내지 1.5mm 이다. 포스페이트만을 첨가한 배지에서는 매우 미세한 펄프형으로 증식하고, 배지 유동성이 크게 저하된다. 한편, 마그네슘, 칼슘 및 나트륨염을 첨가한 배지에서는 균의 대부분이 약 1 내지 2mm 직경의 구상 펠릿이 되고, 유동성은 높지만 균체당 지질 함량이 낮은 결과가 된다. 그러나, 4종류의 염 모두를 첨가한 배지에서는 미세한 구상 펠릿과 펄프의 혼합 배양이 되며, 유동성이 손상되지 않으며 지질 함량이 높은 균체가 수득되며, 그 결과, 아라키돈산 수율 향상이 달성된다.
KH2PO4첨가량 0% 0% 0.3%(22mM) 0.3%(22mM)
MgCl2·6H2O 첨가량 0% 0.025%(1.2mM) 0% 0.025%(1.2mM)
Na2SO4 첨가량 0% 0.05%(3.5mM) 0% 0.05%(3.5mM)
CaCl2·2H2O 첨가량 0% 0.025(1.7mM) 0% 0.025%(1.7mM)
아라키돈산 생성량 2.30g/L 2.20g/L 2.33g/L 3.10g/L

실시예 4.
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라·엘롱가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라·엑시구아(Mortiella exigua) IFO8571, 모르티에렐라·하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941을 사용한다. 글루코스 2%, 식용 대두 단백(상품명:에스산프로테인SS, 제조원: 아지노모토사) 1.5%, 유채유 0.1% 및 표 4의 조성 성분을 첨가한 6종류(2종류×3균주)의 배지 25L를 각각 50L들이 배양조에서 제조하고, 초기 pH를 5.8로 조절한다. 온도 24℃, 통기량 1.0vvm, 교반 속도 200rpm 및 탱크 내압 1.0kg/cm2G의 조건으로 통기 교반 배양을 개시하고, 7일간 배양한다. 글루코스 농도를 유동 첨가법에 의해 5일째까지는 1.5%로 유지하며, 그 후에는 글루코스를 유동 첨가하지 않는다. 배양 7일째의 종료시에는 글루코스가 고갈된다.
그 결과, 염류첨가에 의한 아라키돈산 수율 증대가 확인된다.
KH2PO4첨가량 0% 0.3%(22mM)
MgCl2·6H2O 첨가량 0% 0.05%(2.5mM)
Na2SO4 첨가량 0% 0.1%(7.0mM)
CaCl2·2H2O 첨가량 0% 0.05(3.4mM)
모르티에렐라·엘롱가타 IFO8570 아라키돈산 생성량 1.50g/L 2.20g/L
모르티에렐라·엑시구아 IFO8571 아라키돈산 생성량 1.20g/L 1.45g/L
모르티에렐라·하이그로필라 IFO5941 아라키돈산 생성량 1.25g/L 1.45g/L

실시예 5.
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라·알피나(Mortierella alpina) CBS754.68을 사용한다. 초기 글루코스 2%, 대두유 0.1% 및 배양 도중 유동 첨가에 의한 것도 포함하는 표 5의 조성의 질소원 및 염류 성분을 포함하는 6종류의 배지 25L를 50L들이 배양조에서 제조하고, 초기 pH를 6.0으로 조절한다. 전기 배양액 100mL를 접종하고, 온도 24℃, 통기량 1.0vvm, 교반 속도 200rpm 및 탱크 내압 200kPa로 8일간 통기 교반 배양한다.
글루코스 농도를 유동 첨가법에 의해서 4일째까지는 1 내지 2%로, 그 이후는 0.5 내지 1%로 유지한다. 질소원을 유동 첨가한 경우 용존 산소 농도를 유지하기 위해서, 표 5의 조건 3 및 4는 교반을 300rpm까지, 조건 5 및 6은 400rpm까지 상승시킨다.
배양의 결과, 염류 첨가에 의한 아라키돈산 생성량이 확인된다. 또한, 영양원을 다량 첨가하여 비교적 높은 농도로 배양하는 경우라도, 염류 첨가 효과가 확인된다.
조건번호 1 2 3 4 5 6
초기대두단백량 1.5% 1.5% 1.5% 1.5% 1.5% 1.5%
배양 도중 대두 단백 유동첨가량 0.6% 0.6% 1.6% 1.6%
초기KH2PO4첨가량 0.3% (22mM) 0.3% (22mM) 0.3% (22mM)
초기MgCl2·6H2O 첨가량 0.05% (2.5mM) 0.05% (2.5mM) 0.05% (2.5mM)
초기Na2SO4 량 0.1% (7.0mM) 0.1% (7.0mM) 0.1% (7.0mM)
초기CaCl2·2H2O량 0.05% (3.4mM) 0.05% (3.4mM) 0.05% (3.4mM)
아라키돈산 생성량 3.60g/L 4.90g/L 5.00g/L 6.81g/L 7.32g/L 9.04g/L
대두 단백: 에스산미트 등 제조원: 아지노모토사
실시예 6.
미드산 생산균으로서 모르티에렐라·알피나 SAM1861(미공연조기 제3590호, FERM 제BP-3590호)을, 디호모-γ-리놀렌산 생산균으로서 모르티에렐라·알피나 SAM1860(미공연조기 제3589호, FERM 제BP-3589호)를 사용한다. 초기 글루코스 2%, 대두 단백(상품명:에스산미트 특등, 제조원:아지노모토사) 1.5%, 올리브유 0.1% 및 표 6의 조성의 염류 성분을 포함하는 4종류(2종류×2균주)의 배지 5L를 10L들이 배양조에서 제조하고, 초기 pH를 6.0으로 조절한다. 전기 배양액 100ml를 접종하고, 온도 28℃, 통기량 1.0vvm 및 교반 속도300rpm으로 8일간 통기 교반 배양한다. 배양온도는 2일째에 20℃로 감소시킨다. 또한, 글루코스 농도를 유동 첨가법에 의해서 1 내지 2%로 유지한다.
그 결과, 염류 첨가에 의한 미드산 및 디호모-γ-리놀렌산 수율 증대가 확인된다.
KH2PO4첨가량 0% 0.3%(22mM)
MgCl2·6H2O 첨가량 0% 0.05%(2.5mM)
Na2SO4 첨가량 0% 0.1%(7.0mM)
CaCl2·2H2O 첨가량 0% 0.05(3.4mM)
모르티에렐라·알피나 SAM1861 미드산 생성량 1.52g/L 1.92g/L
모르티에렐라·알피나 SAM1860 디호모-γ-리놀렌산 생성량 2.06g/L 2.31g/L
실시예 7.
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라·알피나(Morierella alpina) CBS754.68을 사용한다. 초기 글루코스 2%, 식용 대두 단백 4%, 대두유 0.1%, KH2P04 0.3%, Na2S04 0.1%, MgCl2·6H20 0.05% 및 CaCl2·2H20 0.05%의 배지 6000L를 10kL들이 배양조에서 제조하고, 초기 pH를 6.1로 조절한다. 전기 배양액 30L를 접종하고, 배양온도 26℃, 통기량 0.5vvm, 교반 속도 30rpm 및 탱크 내압 200kPa로 통기 교반 배양을 개시한다. 배양 1일째부터, 용존 산소 농도를 유지하도록 통기량 및 회전수를 조정하면서 배양을 계속한다. 또한, 18%의 글루코스를 배양 1일째부터 5일째에 걸쳐서 여러번 나누어 첨가한다.
10일간의 통기 교반 배양을 수행한 결과, 아라키돈산 생성량은 13g/L이다.
제13 규칙의 2에 규정하는 기탁된 미생물에 대한 언급
국제기탁기관
명칭:공업기술원 생명공학공업기술연구소
수신자: 이바라키켄 쓰쿠바시 도우 1초메 1반 3고
기탁일 및 기탁번호:
(1) 기탁 미생물의 명칭: 모르티에렐라·엘롱가타 SAM0219
기탁일: 1986년 3월19일
기탁번호: FERM 제BP-1239호
(2) 기탁 미생물의 명칭: 모르티에렐라·알피나 SAM1860
기탁일: 1991년 9월30일
기탁번호: FERM 제BP-3589호
(3) 기탁 미생물의 명칭: 모르티에렐라·알피나 SAM1861
기탁일: 1991년 9월30일
기탁번호: FERM 제BP-3590호

Claims (28)

  1. 각각 5 내지 60mM 범위의 포스페이트 이온, 5 내지 60mM 범위의 칼륨 이온, 2 내지 50mM 범위의 나트륨 이온, 0.5 내지 9mM 범위의 마그네슘 이온 및 0.5 내지 12mM 범위의 칼슘 이온을 포함하는 배양 배지 중에서,
    모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata), 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) 및 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양하여,
    아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 5,8,11-에이코사트리엔산 및 에이코사펜타엔산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화 지방산을 생산하도록 함을 포함하여, 아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 5,8,11-에이코사트리엔산 및 에이코사펜타엔산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화 지방산을 제조하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 불포화 지방산이 아라키돈산인 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 모르티에렐라 속에 속하는 미생물이 모르티에렐라 엑시구아 및 모르티에렐라 하이그로필라로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  6. 각각 10 내지 45mM 범위의 포스페이트 이온, 10 내지 45mM 범위의 칼륨 이온, 5 내지 40mM 범위의 나트륨 이온, 1 내지 6mM 범위의 마그네슘 이온 및 1 내지 9mM 범위의 칼슘 이온을 포함하는 배양 배지 중에서,
    모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata), 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) 및 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양하여,
    아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 5,8,11-에이코사트리엔산 및 에이코사펜타엔산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화 지방산을 생산하도록 함을 포함하여, 아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 5,8,11-에이코사트리엔산 및 에이코사펜타엔산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화 지방산을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 불포화 지방산이 아라키돈산인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 모르티에렐라 속에 속하는 미생물이 모르티에렐라 엑시구아 및 모르티에렐라 하이그로필라로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  9. 각각 5 내지 60mM 범위의 포스페이트 이온, 5 내지 60mM 범위의 칼륨 이온, 2 내지 50mM 범위의 나트륨 이온, 0.5 내지 9mM 범위의 마그네슘 이온 및 0.5 내지 12mM 범위의 칼슘 이온을 포함하는 배양 배지 중에서,
    모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata), 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) 및 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양하여,
    아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 5,8,11-에이코사트리엔산 및 에이코사펜타엔산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화 지방산 또는 상기 불포화 지방산을 함유하는 지질을 생산하도록 함을 포함하여, 아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 5,8,11-에이코사트리엔산 및 에이코사펜타엔산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화 지방산 또는 상기 불포화 지방산을 함유하는 지질을 제조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 모르티에렐라 속에 속하는 미생물이 모르티에렐라 엑시구아 및 모르티에렐라 하이그로필라로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  11. 각각 5 내지 60mM 범위의 포스페이트 이온, 5 내지 60mM 범위의 칼륨 이온, 2 내지 50mM 범위의 나트륨 이온, 0.5 내지 9mM 범위의 마그네슘 이온 및 0.5 내지 12mM 범위의 칼슘 이온을 포함하는 배양 배지 중에서,
    모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata), 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) 및 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양하여,
    아라키돈산 또는 아라키돈산을 함유하는 지질을 생산하도록 함을 포함하여, 아라키돈산 또는 아라키돈산을 함유하는 지질을 제조하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 모르티에렐라 속에 속하는 미생물이 모르티에렐라 엑시구아 및 모르티에렐라 하이그로필라로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  13. 각각 10 내지 45mM 범위의 포스페이트 이온, 10 내지 45mM 범위의 칼륨 이온, 5 내지 40mM 범위의 나트륨 이온, 1 내지 6mM 범위의 마그네슘 이온 및 1 내지 9mM 범위의 칼슘 이온을 포함하는 배양 배지 중에서,
    모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata), 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) 및 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양하여,
    아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 5,8,11-에이코사트리엔산 및 에이코사펜타엔산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화 지방산 또는 상기 불포화 지방산을 함유하는 지질을 생산하도록 함을 포함하여, 아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 5,8,11-에이코사트리엔산 및 에이코사펜타엔산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 불포화 지방산 또는 상기 불포화 지방산을 함유하는 지질을 제조하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 모르티에렐라 속에 속하는 미생물이 모르티에렐라 엑시구아 및 모르티에렐라 하이그로필라로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  15. 각각 10 내지 45mM 범위의 포스페이트 이온, 10 내지 45mM 범위의 칼륨 이온, 5 내지 40mM 범위의 나트륨 이온, 1 내지 6mM 범위의 마그네슘 이온 및 1 내지 9mM 범위의 칼슘 이온을 포함하는 배양 배지 중에서,
    모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata), 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) 및 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 모르티에렐라(Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양하여,
    아라키돈산 또는 아라키돈산을 함유하는 지질을 생산하도록 함을 포함하여, 아라키돈산 또는 아라키돈산을 함유하는 지질을 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 모르티에렐라 속에 속하는 미생물이 모르티에렐라 엑시구아 및 모르티에렐라 하이그로필라로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  17. 제1항, 제6항, 제9항, 제11항, 제13항 및 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 포스페이트 이온이 인산일수소이칼륨, 인산이수소일칼륨, 인산일수소이나트륨 및 인산이수소일나트륨으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 염류에 의해서 공급되고; 칼륨 이온이 인산일수소이칼륨, 인산이수소일칼륨 및 염화칼륨으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 염류에 의해서 공급되며; 나트륨 이온이 인산일수소이나트륨, 인산이수소일나트륨, 염화나트륨 및 황산나트륨으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 1개 이상의 염류에 의해서 공급되고; 마그네슘 이온이 염화마그네슘 및/또는 황산마그네슘에 의해서 공급되며; 칼슘 이온이 염화칼슘 및/또는 탄산칼슘에 의해서 공급되는 방법.
  18. 제1항, 제6항, 제9항, 제11항, 제13항 및 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 이온이 인산이수소일칼륨(KH2P04), 무수 황산나트륨(Na2S04), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H20) 및 염화칼슘 2수화물(CaCl2·2H20)의 배합에 의해서 공급되는 방법.
  19. 제1항, 제6항, 제9항, 제11항, 제13항 및 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 배양 배지에 대두로부터 수득되는 질소원을 추가로 첨가하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 대두로부터 수득되는 질소원의 질소 함량이 수분을 제외한 총 성분당 2중량% 이상인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 대두로부터 수득되는 질소원이 탈지 대두, 미탈지 대두 및 이들의 가공된 생성물로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 질소원인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 탈지 대두 또는 미탈지 대두에 실시되는 가공이, 열 처리; 산 처리; 알칼리 처리; 효소 처리; 화학적 개질; 또는 상기 처리를 포함하는 화학적 및/또는 물리적 처리에 의한 변성 및/또는 재생; 물 및/또는 유기 용매를 사용한 일부 성분의 제거; 여과 및/또는 원심분리에 의한 일부 성분의 제거; 동결; 분쇄; 건조; 및/또는 체에 의한 분리인 방법.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 제19항에 있어서, 대두로부터 수득되는 질소원이 적어도 열처리를 실시한 탈지 대두인 방법.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제19항에 있어서, 배양 배지에 효모 추출물을 추가로 첨가하는 방법.
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