KR101169630B1 - 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루코오스보다 저렴하고, 배지의 침투압 상승에는 기여하지 않고, 또한 모르티에렐라속 미생물이 자화할 수 있는 당화 전분을 배지 탄소원으로서 사용하여 모르티에렐라 (Mortierella) 속에 속하는 미생물을 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 종래보다 저렴한 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법을 제공한다.
고도 불포화 지방산, 모르티에렐라, 당화 전분

Description

고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING HIGHLY UNSATURATED FATTY ACID-CONTAINING LIPID}
본 발명은 고도 불포화 지방산 생산능을 갖는 모르티에렐라 (Mortierella) 속에 속하는 미생물 (이하, 모르티에렐라속 미생물이라고 한다.) 을, 당화 전분을 배지 탄소원으로서 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 있어서, 불포화 지방산이란 탄소 사슬에 이중결합이 1 개 이상 있는 지방산을 말하고, 또한 이 중에서 탄소수가 18 이상이고 또한 이중결합이 2 개 이상인 지방산을 일반적으로「고도 불포화 지방산」이라고 한다. 고도 불포화 지방산으로서는 예를 들어, γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 미드산, 6,9-옥타데카디엔산, 8,11-에이코사디엔산 등을 들 수 있다. 모르티에렐라속 미생물에 의해 만들어지는 고도 불포화 지방산은 그 대부분이 트리글리세리드의 구성 지방산으로서 생성되고, 그 이외에 디글리세리드, 모노글리세리드, 유리 지방산, 인지질 등의 여러가지 지질을 구성하는 지방산으로서도 생성된다. 본 명세서에 있어서의 고도 불포화 지방산 함유 지질이란 이들 여러가지 고도 불포화 지방산 함유 지질의 혼합물이고, 아라키돈산 생성량이란 이들 여러가지 지질의 구성 지방산으로서 존재하는 아라키돈산의 양을 유리 지방산량으로 환산한 값이다. 또한, 전분을 아밀라아제 등의 당화 효소로 처리하여 얻어지는 올리고글루코오스 및 글루코오스의 혼합물을「당화 전분」이라 하고, 당화 전분을 조제하기 위해 사용하는 아밀라아제 등의 당질 분해 효소를「당화 효소」,전분을 해당 효소로 처리하는 것을「당화 처리」 라고 한다. 당화 처리에 의한 전분의 분해도를「당화도」라고 하고, 당화도는 당화 전분의 환원 당/전체 당(%) 으로 표시되고, 예를 들어, 환원 당/전체 당이 50% 인 것은 당화 전분 중의α-글루칸의 평균 사슬 길이가 2 인 것을 나타내고 있다.
아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산은 특히 유아의 발육에 필요한 성분으로서, DHA (도코사헥사엔산) 와 함께 영양학적 견지에서 주목받고 있다. Lanting 등은 생후 3 주 이상 모유로 키운 유아와 육아용 분유로 키운 유아를 9 세까지 추적조사하여, 행동면 등으로부터 뇌신경의 작은 장애의 발생률을 검토한 결과, 육아용 분유로 자란 아이의 뇌장애 발생률은 모유로 자란 아이의 2 배라고 보고하였다 (LANCET, vol.344, 1319-1322 (1994)). 이 결과는 모유에는 존재하지만 육아용 분유에는 거의 존재하지 않는 DHA 나 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산이 유아의 뇌의 발달에 관여한다는 것을 의미한다. 그 밖에도, 고도 불포화 지방산이 신생아의 뇌 및 망막의 발달에 관여하고 있다는 결과가 잇달아 보고되고 있어 (Carlson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 90 : 1073-1077 (1993)), 미숙아 및 신생아에 있어서의 영양학적 관점에서 이들 고도 불포화 지방산의 중요성이 주목되고 있 다.
고도 불포화 지방산은 동물계에 널리 분포하고 있어, 예를 들어 아라키돈산은 동물의 부신선이나 간장에서 추출된 지질로부터 분리되고 있다. 그러나, 이들 동물 장기 중의 고도 불포화 지방산의 함량은 적기 때문에, 동물 장기로부터의 고도 불포화 지방산의 추출ㆍ분리가 고도 불포화 지방산을 대량 공급하기에 충분한 방법이라고 할 수는 없었다. 이 때문에, 여러 가지의 미생물을 배양하여 고도 불포화 지방산을 얻는 방법이 개발되어 왔다. 그 중에서도 모르티에렐라속 미생물은 아라키돈산, 디호모-γ-리놀렌산, 에이코사펜타엔산 등의 고도 불포화 지방산 함유 지질을 생산하는 미생물로서 알려져 있고, 이 미생물을 사용한 발효법에 의한 고도 불포화 지방산 함유 지질을 제조하는 방법이 개발되어 있다 (일본 공개특허공보 소63-44891, 일본 공개특허공보 소63-12290, 일본 공개특허공보 소63-14696, 일본 공개특허공보 소63-14697). 또한, 모르티에렐라속 미생물의 Δ12 불포화화 효소 활성이 저하 또는 결실되어 있는 변이주를 사용하여 미드산을 제조하는 방법도 알려져 있다 (일본 공개특허공보 평5-91888). 또한, 모르티에렐라속 미생물에 변이처리를 실시하여 얻어지는, Δ5 불포화화 효소 활성이 저하 또는 결실되어 있는 변이주를 사용하여, 디호모-γ-리놀렌산을 제조하는 방법도 알려져 있다 (일본 공개특허공보 평5-91887).
모르티에렐라속 미생물이 전분 자화능을 갖는 것은 이미 알려져 있으나, 그 자화능은 글루코오스 자화능에는 못미치기 때문에 글루코오스가 배지 탄소원으로서 널리 사용되어 왔다 (Shinmen 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 31 : 11-16 (1989), Aki 등, JAOCS 78 : 599-604 (2001)). 모르티에렐라속 미생물의 전분 자화능에 착안한 결과, 분비되고 있는 전분 분해 효소가 단리 정제되고, 이러한 전분 분해 효소가 α-글루코시다아제인 것이 보고되어 있다 (타나카 등, 농예 화학회 요지집 1999 년 3월). 그러나, α-글루코시다아제는 α-글루칸의 비환원 말단에서 글루코오스 단위를 잘라나가는 분해양식을 갖는 엑소형 아밀라아제로, 전분으로 대표되는 고분자량 α-글루칸을 분해하는 활성이 낮고, 수개의 글루코오스로 이루어지는 올리고글루코오스를 분해하는 활성이 높다. 이것이 모르티에렐라속 미생물의 전분 자화능이 글루코오스 자화능에 비해 떨어지는 원인의 하나인 것으로 생각된다. 한편, 글루코오스를 탄소원으로서 사용하는 경우, 배지 중의 고농도 글루코오스에 의한 침투압의 상승이, 모르티에렐라속 미생물의 균체 증식 및 고도 불포화 지방산 함유 지질의 생산성에 악영향을 야기하기 때문에, 저농도 글루코오스로 배양하여, 자화된 글루코오스를 보충하기 위해 배양 중에 글루코오스를 순차적으로 첨가하는 방법 (유가 배양법)이 널리 사용되고 있다 (Shinmen 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 31 : 11-16 (1989)). 또한, 고농도의 글루코오스에 내성을 갖는 모르티에렐라속 미생물을 사용하여 고도 불포화 지방산 함유 지질을 생산하는 시도 (국제공개번호: WO98/39468) 도 행하여지고 있다.
배지 탄소원은 배지의 원재료비의 대부분을 차지하고 있고, 이것을 글루코오스보다 저렴한 원료로 변경할 수 있다면, 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 경비의 삭감이 도모된다. 글루코오스의 원료인 전분을 배지 탄소원으로서 사용하면, 원재료비 삭감이 도모되지만, 모르티에렐라속 미생물이 생산하는 α-글루코시 다아제는 상기와 같이 전분을 분해하는 활성이 낮고, 따라서 전분을 충분히 자화할 수 없다. 또한, 글루코오스를 고농도로 함유하는 배지는 침투압이 높아져, 모르티에렐라속 미생물의 증식 지연, 고도 불포화 지방산 함유 지질의 생산성 저하 및 균 형태의 변화 등의 원인이 되기 때문에, 배양 중에 순차적으로 글루코오스를 첨가하지 않고 배양 개시시부터 글루코오스를 고농도로 함유시키는 회분 배양법으로, 저렴하게 고도 불포화 지방산 함유 지질을 제조하기는 어렵다. 이 문제를 해결하는 수단으로서, 배양 중에 순차적으로 글루코오스를 첨가하는 유가 배양법이 사용되지만, 유가 배양법은 글루코오스를 순차적으로 첨가하기 위한 추가 장치를 필요로 할 뿐만 아니라, 배양 공정에서의 작업 횟수나 작업 시간을 증가시키기 때문에, 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 비용을 증가시킨다. 또한, 글루코오스는 전분을 여러 가지의 아밀라아제로 효소분해하여 제조되지만, 효소처리 후에 글루코오스를 단리ㆍ정제할 필요가 있어, 효소처리 및 단리ㆍ정제의 비용이 글루코오스를 전분보다 고가의 것으로 하고 있다.
전분 또는 가용성 전분을 배지 탄소원으로서 이용한 고도 불포화 지방산 함유 지질의 생산에 관해 보고되어 있지만 (Shinmen 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 31 : 11-16 (1989), Aki 등, JAOCS 78 : 599-604 (2001)), 고도 불포화 지방산 함유 지질의 생산량은 배지 중의 당질당 동량의 글루코오스를 탄소원으로 한 경우에 비해 낮고, 이것은 전분 또는 가용성 전분이 완전히 자화되어 있지 않기 때문이다.
발명의 개시
본 발명은 글루코오스보다 저렴하고, 배지의 침투압 상승에는 기여하지 않고, 또한 모르티에렐라속 미생물이 자화할 수 있는 배지 탄소원을 사용한 종래보다 저렴한 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법을 제공한다.
모르티에렐라속 미생물이 생산하는 α-글루코시다아제는 상기와 같이 전분을 분해하는 활성이 낮다. 전분을 배지 탄소원으로서 사용하기 위해서는 모르티에렐라속 미생물이 생산하는 α-글루코시다아제가 분해되기 쉬운 당화 전분으로까지 전분을 분해할 필요가 있었다. 그러나, 전분을 글루코오스로까지 완전히 분해하면 단당의 증가에 의한 침투압의 상승을 야기하여 상기한 바와 같은 고도 불포화 지방산 함유 지질의 생산에 여러가지 악영향을 미친다. 그래서, 전분을 당화 처리하는 당질 분해 효소 및 해당 효소에 의한 당화 처리의 조건을 선택함으로써, 당화 전분 중의 올리고글루코오스의 평균 사슬 길이를, 모르티에렐라속 미생물이 생산하는 α-글루코시다아제가 분해되기 쉬운 적절한 길이로 제어하는 것을 본 발명자들은 착상하였다. 그리고, 본 발명자들은 전분을 각종 당질 분해 효소에 의해 여러가지 조건으로 당화 처리하여 얻어진 당화 전분을 배지 탄소원으로서, 모르티에렐라속 미생물을 배양하여 얻어진 균체로부터 추출한 고도 불포화 지방산 함유 지질의 생산성을, 배지 탄소원으로서 동량의 전분 또는 글루코오스를 사용하여 회분 배양한 경우, 및 배지 탄소원으로서 동량의 글루코오스를 첨가하여 유하 배양한 경우의 그 생산성과 비교하였다. 그 결과, 당화 전분을 탄소원으로 한 배양에서는 전분 또는 글루코오스를 배지 탄소원으로 한 회분 배양보다 높은 생산성을 나타내고, 글루코오스를 배지 탄소원으로서 유하 배양한 경우와 동등한 생산성을 나타내는 것을 알아내고, 거듭 검토하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 즉,
(1) 모르티에렐라 (Mortierella) 속에 속하는 미생물을, 당화 전분을 함유하는 배지를 사용하여 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법,
(2) 당화 전분이, 전분 또는 가용성 전분을 당화 효소로 처리하여 얻어지는 당화 전분인 상기 (1) 에 기재된 제조 방법,
(3) 모르티에렐라 (Mortierella) 속에 속하는 미생물을, (a) 전분 또는 가용성 전분 및 (b) 당화 효소를 함유하는 배지를 사용하여 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법,
(4) 전분 또는 가용성 전분을 함유하는 배지를 사용하여 모르티에렐라 (Mortierella) 속 미생물과 당화 효소 생산능을 갖는 미생물을 혼합 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법,
(5) 당화 효소 생산능을 갖는 미생물이 아스페르길루스 (Aspergillus) 속에 속하는 미생물인 상기 (4) 기재의 제조 방법,
(6) 아스페르길루스 (Aspergillus) 속에 속하는 미생물이, 아스페르길루스 오리재 (Aspergillus oryzae) 또는 아스페르길루스 카와치 (Aspergillus kawachii) 인 상기 (5) 기재의 제조 방법,
(7) 모르티에렐라 (Mortierella) 속에 속하는 미생물이, 모르티에렐라속 모르티에렐라아속 (subgenus Mortierella) 에 속하는 미생물인 상기 (1)～(6) 에 기재된 제조 방법,
(8) 모르티에렐라아속 (Subgenus Mortierella) 에 속하는 미생물이, 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 알리아세아 (Mortierella alliacea) 인 상기 (7) 기재의 제조 방법,
(9) 고도 불포화 지방산이 γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 미드산, 6,9-옥타데카디엔산 및 8,11-에이코사디엔산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 지방산인 상기 (1)～(8) 에 기재된 제조 방법에 관한 것이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에서 사용하는 미생물은 고도 불포화 지방산 함유 지질을 생성할 수 있는 모르티에렐라 (Mortierella) 속에 속하는 미생물이면 어떠한 미생물이라도 좋다. 이러한 미생물로서는 예를 들어 MYCOTAXON, Vol. XLIV, No.2, pp. 257-265 (1992) 에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있고, 구체적으로는 모르티에렐라 엘론가타 (Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라 엑시구아 (Mortierella exigua) IF08571, 모르티에렐라 히그로필라 (Mortierella hygrophila) IF05941, 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS 219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모르티에렐라아속 (Subgenus Mortierella) 에 속하는 미생물이나, 모르티에렐라 이자벨리나 (Mortierella isabellina) CBS194.28, IF06336, IF07824, IFO7873, IF07874, IF08286, IF08308, IFO7884, 모르티에렐라 나나 (Mortierella nana) IFO8190, 모르티에렐라 라마니아나 (Mortierella ramanniana) IFO5426, IF08186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모르티에렐라 비나세아 (Mortierella vinacea) CBS236.82 등의 마이크로무코르아속 (subgenus Micromucor) 에 속하는 미생물을 들 수 있다.
이들 균주는 모두, 오오사카시의 재단법인 발효 연구소 (IFO), 및 미국 American Type Culture Collection (ATCC), 및 네덜란드 Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) 로부터 아무런 제한없이 입수할 수 있다. 또한, 본 발명자들이 토양에서 분리한 균주 모르티에렐라 엘론가타 SAM0219 (미공연균기 제 8703 호) (미공연조기 제 1239 호) 를 사용할 수도 있다. 이들 타입 컬처에 속하는 균주, 또는 자연계에서 분리한 균주를 그대로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용하는 상기 미생물로서는 모르티에렐라속 미생물 (야생주) 의 변이주 또는 유전자 재조합주이어도 된다. 그 중에서도, 야생주와 동일한 배양조건으로 배양하였을 때에, 원래의 야생주가 생성하는 고도 불포화 지방산지질의 양과 비교하여, 지질 중의 특정한 또는 전부의 고도 불포화 지방산 함량이 많아지거나, 또는 총 지질량이 많아지거나, 또는 그 양방을 달성할 수 있는 변이주 내지 유전자 재조합주가 바람직하다. 지질 중의 특정한 고도 불포화 지방산 함량이 많아지 는 변이주로서, 예를 들어, Δ12 불포화화 효소 활성이 결실된 모르티에렐라 알피나 SAM1861 (미공연조기 제 3590 호, FERM BP-3590) 이나, Δ5 불포화화 효소 활성이 결실된 모르티에렐라 알피나 SAM1860 (미공연조기 제 3589 호, FERM BP-3589) 를 들 수 있다. 또한, 고농도의 글루코오스에 내성을 갖는 모르티에렐라 SAM2197 (FERM BP-6261) 을 사용할 수도 있다.
본 발명에 관한 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법으로서는 (i) 상기 기술한 모르티에렐라속 미생물을, 당화 전분을 함유하는 배지를 사용하여 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하거나, (ii) 상기 기술한 모르티에렐라속 미생물을, (a) 전분 또는 가용성 전분 및 (b) 당화 효소를 함유하는 배지를 사용하여 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하거나, 또는 (iii) 전분 또는 가용성 전분을 함유하는 배지를 사용하여 상기 기술한 모르티에렐라속 미생물과 당화 효소 생산능을 갖는 미생물 (이하, 당화 효소 생산 미생물이라고 한다.) 을 혼합 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 3 개의 태양을 들 수 있다. 하기에 각각의 태양에 관해서 나누어 설명한다.
본 발명의 제 1 태양으로서, 상기 기술한 모르티에렐라속 미생물을, 당화 전분을 함유하는 배지를 사용하여 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법에 관해서 설명한다. 이와 같이, 전분을 미리 당화 처리하여 얻어진 당화 전분을 배지 탄소원으로서 사용함으로써, 모르티에렐라속 미생물에 자화되기 쉽고, 또한 배지의 침투압 상승을 억제하여 대 탄소원당 고도 불포화 지방산 함유 지질의 수율을 증가시킬 수 있다는 이점이 있다.
본 태양에 있어서의 모르티에렐라속 미생물의 단일 배양은 배지 탄소원으로서 당화 전분을 사용하는 것 이외에는 통상적인 방법에 따라서 실시하면 된다. 예를 들어, 상기 모르티에렐라속 미생물의 포자, 균사 또는 미리 배양하여 얻어진 배양액을, 액체 배지 또는 고체 배지에 접종하여 배양하는 방법을 들 수 있다.
이러한 태양에 있어서의 미생물 배양용 배지는 배지 탄소원으로서 당화 전분을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 그 중에서도, 배지 탄소원으로서 사용하는 당화 전분은 배양하는 모르티에렐라속 미생물이 생산하는 α-글루코시다아제가 가장 분해되기 쉬운 당화도, 즉 당화 전분 중의 올리고글루코오스의 평균 사슬 길이로 하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 침투압의 상승과 모르티에렐라속 미생물이 자화할 수 있는 당화 전분 중의 올리고글루코오스의 사슬 길이를 고려하여, 환원 당/전체 당의 비율, 요컨대 당화도가 약 20～90% 정도, 바람직하게는 약 30～90% 정도의 당화 전분을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 당화 전분은 전분 또는 가용성 전분을 당화 효소로 처리하여 얻을 수 있고, 또한 당화 효소의 선택 및 해당 효소에 의한 당화 처리의 조건을 설정함으로써, 상기 원하는 당화도의 당화 전분을 얻을 수 있다. 당화 효소로서는 전분 등을 분해할 수 있는 당질 분해 효소이면 특별히 한정되지 않지만, 랜덤한 분해 양식을 갖는 α-아밀라아제 등의 엔드형 아밀라아제, 또는 전분 분자의 말단에서 말토오스 단위로 잘라내는 β-아밀라아제 등의 엑소형 아밀라아제가 바람직하다. 또한, 다른 작용기전의 당화 효소를 조합하여 사용해도 된다. 당화 처리에 사용하는 당화 효소는 해당 당화 효소를 생산하는 미생물을 배양하고, 그 배양액으로부터 공지된 방법으로 그 효소를 얻을 수 있다. 또한, 시판되고 있는 당화 효소를 사용해도 된다. 시판의 당화 효소로서는 아밀라아제 AD「아마노」1 (아마노 엔자임 주식회사 제) 등의 α-아밀라아제, 또는 플루라나아제「아마노」3 (아마노 엔자임 주식회사 제) 등의 플루라나아제 등을 들 수 있다. 또한, 상기 당화 전분은 전분 또는 가용성 전분을 산으로 분해하는 등 다른 공지된 방법으로 얻을 수도 있다. 전분 또는 가용성 전분을 산으로 분해하여 당화 전분을 얻는 산분해법으로서는 옥살산을 사용하는 처리를 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 상기 당화 전분으로서는 시판되고 있는 당화 전분을 사용해도 된다. 시판의 당화 전분으로서는 후지 시럽 C-75S, 후지 시럽 C-75, HMTP-75 또는 A-75 (모두 카토 화학사 제) 등을 들 수 있다. 이들 시판의 당화 전분은 각각 당화도가 다르기 때문에, 본 발명에서 실시하기에 바람직한 당화 전분을 선택할 수 있다.
본 태양에서 사용하는 미생물 배양용 배지에는 당화 전분을 보충하는 부원료로서, 예를 들어 글루코오스, 프룩토오스, 자일로오스, 수크로오스, 말토오스, 당밀, 글리세롤, 만니톨 또는 시트르산 등의 일반적으로 사용되고 있는 배지 탄소원을 함유하고 있어도 된다. 또, 배지 질소원으로서, 예를 들어 대두 가루, 대두 플레이크, 탈지 대두 가루, 식용 대두 단백, 대두 펩티드, 볶은 콩가루, 펩톤, 효모 엑기스, 맥아 엑기스, 육(肉) 엑기스, 카자미노산, 콘스티플리커 또는 우레아 등 의 유기 질소원, 또는 질산암모늄 또는 황산암모늄 등의 무기 질소원이, 본 태 양에서 사용하는 미생물 배양용 배지에 함유되어 있어도 된다. 그 중에서도, 배지 질소원으로서는 탈지 대두에 열변성을 실시한 것이 바람직하고, 특히 탈지 대두를 약 70～90℃ 에서 열처리하고 나아가 에탄올 가용 성분을 제거한 것이 보다 바람직하다.
또한, 본 태양에서 사용하는 미생물 배양용 배지에는 인산, 칼륨, 나트륨, 마그네슘, 및/또는 칼슘으로 이루어지는 무기 염류나, 철, 구리, 아연, 망간, 니켈, 코발트 등의 금속 이온이나 비타민 등이, 미량 영양원으로서 함유되어 있어도 된다. 그 중에서도, 인산, 칼륨, 나트륨, 마그네슘 및 칼슘으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 이상의 무기 염류가 함유되어 있는 것이 바람직하다.
또한, 본 태양에서 사용하는 미생물 배양용 배지에는 고도 불포화 지방산의 수율을 증가시키기 위해, 고도 불포화 지방산의 전구체로서, 예를 들어, 헥사데칸 또는 옥타데칸같은 탄화수소; 올레산 또는 리놀레산같은 지방산 또는 그 염, 트리아실글리세롤, 또는 예를 들어 에틸에스테르, 글리세린지방산에스테르, 소르비탄지방산에스테르같은 지방산에스테르; 올리브유, 대두유, 유채유, 면실유 또는 야자유같은 유지류가 함유되어 있어도 된다. 상기 화합물은 1 종류만 단독으로 함유되어 있어도 되고, 2 종류 이상 조합되어 함유되어 있어도 된다.
상기 탄소원, 질소원, 그 밖의 배지 성분은 배양개시 전의 배지 및/또는 배양 중의 배지에 첨가할 수 있다. 이들 배지 성분은 한번에 첨가할 수도 있고, 또는 연속적으로, 또는 복수회로 나누어 경시적으로 첨가할 수도 있다. 이들 배지 성분은 각각 단독으로 또는 미리 혼합하여 살균한 후 첨가할 수 있고, 그 살 균방법, 첨가순서는 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 탄소원과 질소원은 따로따로 살균하는 것이 바람직하고, 염류는 대수 증식 종료까지, 보다 바람직하게는 대수 증식 중기보다 전에 첨가하는 것이 바람직하다. 인산이온, 칼륨이온, 나트륨이온, 마그네슘이온, 칼슘이온 농도에 영향을 주지 않은 다른 배지 성분에 관해서는 모르티에렐라속 미생물의 생육을 저해하지 않는 농도이면, 그 첨가시기는 특별히 제한되지 않는다.
실용상, 일반적으로 탄소원의 총 첨가량은 약 O.1～4O 중량% 정도, 바람직하게는 약 1～25 중량% 정도, 질소원의 총 첨가량은 약 0.01～10 중량% 정도, 바람직하게는 약 0.1～10 중량% 정도의 농도로 하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 최초의 탄소원 첨가량을 약 1～12 중량% 정도, 최초의 질소원 첨가량을 약 0.1～8 중량% 정도로 하여 배양 도중에 탄소원 및 질소원을 첨가할 수도 있다. 또한, 상기 기술한 고도 불포화 지방산의 전구체의 첨가량은 배지에 대하여 약 0.001～10% 정도, 바람직하게는 약 0.5～10% 정도이다.
배양조건도 특별히 한정되지 않고, 통상적인 방법에 따르면 된다. 예를 들어, 배양온도는 약 5～40℃ 정도, 바람직하게는 약 20～30℃ 정도이다. 또한, 약 20～30℃ 정도에서 모르티에렐라속 미생물을 증식시킨 후, 약 5～20℃ 정도에서 배양을 계속하여 고도 불포화 지방산을 생산시킬 수도 있다. 또한, 배지 pH 는 약 4～10 정도, 바람직하게는 약 5～8 정도이다. 배양 방법으로서는 예를 들어 통기 교반 배양, 진탕 배양, 또는 정치 배양 등을 들 수 있다. 배양은 통상 약 2～20 일 정도 실시한다. 이와 같이 배양하여, 모르티에렐라속 미생물 내에 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질이 생성축적된다. 본 발명에 있어서는 액체 배지에 의한 통기 교반 배양이 바람직하다.
이어서, 이상과 같이 하여 얻어지는 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취한다. 상기「배양물」로서는 예를 들어, 배양에 의해 지질을 제조하는 도중의 배양액 또는 그 살균한 배양액, 또는 배양종료 후의 배양액 또는 그 살균한 배양액, 또는 각각에서 집균한 배양균체 또는 그 건조물 등을 들 수 있다. 이러한 배양물로부터, 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 방법으로서는 공지된 방법을 사용해도 된다. 예를 들어, 배양균체로부터 다음 방법에 의해 목적으로 하는 지질을 채취할 수 있다.
배양종료 후, 배양액으로부터 원심분리 및/또는 여과 등의 상용의 고액 분리 수단에 의해 배양균체를 얻는다. 배양균체는 바람직하게는 수세, 파쇄, 건조시킨다. 건조는 동결건조, 풍건 등에 의해 실시할 수 있다. 건조 균체는 바람직하게는 질소기류 하에서 유기 용매에 의해서 추출처리한다. 유기 용매로서는 예를 들어, 에테르, 헥산, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 석유에테르 등을 사용할 수 있다. 또한, 메탄올과 석유에테르의 교대 추출이나 클로로포름-메탄올-물의 1 층계의 용매를 사용한 추출에 의해서도 양호한 결과를 얻을 수 있다. 그 중에서도, 헥산을 사용하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출물로부터 감압 하에서 유기용제를 증류 제거함으로써, 고농도의 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 얻을 수 있다. 또한, 상기 방법 대신에 습균체를 사용하여 추출을 할 수도 있다. 이 경우에는 메탄올, 에탄올 등의 물에 대하여 상용 성인 용매, 또는 이들과 물 및/또는 다른 용매로 이루어지는 물에 대하여 상용성의 혼합용매를 사용한다. 그 밖의 수순은 상기와 동일하다.
다음에, 본 발명의 제 2 태양으로서, 상기 기술한 모르티에렐라속 미생물을, (a) 전분 또는 가용성 전분 및 (b) 당화 효소를 함유하는 배지를 사용하여 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법에 관해서 설명한다. 본 태양에 있어서는 배지에 함유되는 전분 또는 가용성 전분으로부터 당화 효소에 의해 생성되는 당화 전분을 배지 탄소원으로서 사용한다. 즉, 본 태양에 있어서는 전분의 당화 처리와 모르티에렐라속 미생물의 배양을 동시에 실시한다. 보다 구체적으로는 전분 또는 가용성 전분을 탄소원으로 하는 배지에 당화 효소를 첨가하여 전분 또는 가용성 전분을 모르티에렐라속 미생물이 생산하는 α-글루코시다아제가 분해되기 쉬운 당화 전분으로 변환하고, 그 당화 전분으로부터 상기 α-글루코시다아제에 의해 생성되는 글루코오스를 모르티에렐라속 미생물이 자화하여 고도 불포화 지방산 함유 지질을 제조하는 방법이다.
본 태양에서 사용하는 전분으로서는 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는 예를 들어, 쌀 전분, 고구마 전분, 감자 전분, 타피오카 전분, 소맥 전분 또는 콘스타치, 또는 이들의 화공 전분이나 α화 전분 등을 들 수 있다. 전분 중 열탕에 녹는 것을 가용성 전분이라고 한다.
본 태양에서 사용하는 당화 효소로서는 당화 처리에 사용하는 효소이면 어느 것이나 사용할 수 있고, 구체적으로는 상기 제 1 태양과 같이 당화 효소 생산 미생 물로부터 조제한 당화 효소 및 시판의 당화 효소를 사용할 수 있다. 본 태양에서 사용하는 당화 효소로서는 제 1 태양과 같이, 랜덤한 분해양식을 갖는 α-아밀라아제 등의 엔드형 아밀라아제, 및 전분 분자의 말단에서 말토오스 단위로 잘라내는 β-아밀라아제 등이 바람직하지만, 전분을 비환원 말단으로부터 순차적으로 분해하여 글루코오스를 생성하는 글루코아밀라아제 등의 엑소형 아밀라아제도 사용할 수 있다. 글루코아밀라아제에 의해 생성한 글루코오스는 즉시 모르티에렐라속 미생물에 의해 자화되기 때문에, 배지의 침투압 상승에 의한 악영향이 일어나지 않기 때문이다.
본 태양은 당화 전분 대신에 (a) 전분 또는 가용성 전분 및 (b) 당화 효소를 미생물 배양 배지 성분으로서 사용하는 것 이외에는 상기 제 1 태양과 완전히 동일하다. 또, 본 태양에 있어서의 미생물 배양 배지 성분에는 상기 기술한 당화 전분이 함유되어 있어도 된다.
다음에, 본 발명의 제 3 태양으로서, 전분 또는 가용성 전분을 함유하는 배지를 사용하여 상기 기술한 모르티에렐라속 미생물과 당화 효소 생산 미생물을 혼합 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법에 관해서 말한다. 본 태양에 있어서는 배지에 함유되는 전분 또는 가용성 전분으로부터 당화 효소 생산 미생물이 생산하는 당화 효소에 의해 생성되는 당화 전분을 배지 탄소원으로서 사용한다. 즉, 본 태양은 전분 또는 가용성 전분을 배지 탄소원으로 한 배지에 있어서, 모르티에렐라속 미생물과 함께 상기 당화 처리에 사용하는 당화 효소 생산 미생물을 혼합 배양함으로써 당화 전분을 생성시키고, 그 당화 전분으로부터 모르티에렐라속 미생물이 고도 불포화 지방산 함유 지질을 제조하는 방법이다.
본 태양에 있어서는 모르티에렐라속 미생물을 주 미생물로서 배양하고, 당화 효소 생산 미생물을 부 미생물로서 배양한다. 상기 당화 효소 생산 미생물로서는 당화 효소를 분비하는 미생물이면 모두 사용할 수 있지만, 예를 들어 아스페르길루스 (Aspergillus) 속, 리조푸스 (Rhizopus) 속이나 트리코데르마 (Trichoderma) 속에 속하는 사상균, 바실루스 (Bacillus) 속, 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속이나 클레브시엘라 (Klebsiella) 속에 속하는 세균을 들 수 있다. 그 중에서도, 당화 효소 생산 미생물로서는 α-아밀라아제를 생산하는 아스페르길루스속에 속하는 미생물이 바람직하고, 특히 아스페르길루스ㆍ오리재 (Aspergillus oryzae) 또는 아스페르길루스 카와치 (Aspergillus kawachii) 가 보다 바람직하다. 또한, 상기 글루코아밀라아제를 분비하는 미생물도 부 미생물로서 바람직하게 사용할 수 있다. 글루코아밀라아제 분비 미생물로서는 아스페르길루스속 미생물 및 리조푸스속 미생물 등을 들 수 있다. 또, 당화 효소 생산능이 부여된 모르티에렐라속 미생물의 변이주 또는 유전자 재조합주를 단일 배양함으로써, 당화 효소 생산 미생물과의 혼합 배양과 동일한 효과를 얻을 수 있다.
본 태양은 당화 전분 대신에, 전분 또는 가용성 전분을 미생물 배양 배지 성분으로서 사용하고, 모르티에렐라속 미생물을 단일 배양하는 대신에, 모르티에렐라속 미생물과 당화 효소 생산 미생물을 혼합 배양하는 것 이외에는 상기 제 1 태양과 완전히 같다. 또, 본 태양에 있어서의 미생물 배양 배지 성분에는 상기 기 술한 당화 전분이 함유되어 있어도 된다. 이 경우, 당화 전분의 당화도, 즉 환원 당/전체 당의 비율은 약 0～80% 정도, 바람직하게는 약 0～70% 정도인 것이 바람직하다. 또한, 모르티에렐라속 미생물과 당화 효소 생산 미생물을 혼합 배양할 때에는 양 미생물을 동시에 배양하기 시작해도 되고, 미리 일방의 미생물을 어느 정도 배양한 후, 타방의 미생물을 첨가하여 혼합 배양해도 된다.
이상과 같은 방법에 의해 얻어지는 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질은 동물용 사료나 식품 등의 여러 가지의 용도에 사용할 수 있다. 여기서, 상기 지질에는 γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 미드산, 6,9-옥타데카디엔산 및 8,11-에이코사디엔산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 고도 불포화 지방산이 함유되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 고도 불포화 지방산의 분리정제는 통상적인 방법에 의해, 용매추출, 탈용매 후, 탈산, 탈색, 탈취, 탈검 처리, 또는 냉각분리 등에 의해 실시할 수 있다. 바람직하게는 국제공개번호: WO98/39468 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.
이하 실시예에 따라서 본 발명을 상세하게 설명하겠지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 또, 배지 중의 성분조성은 전부 중량% 로 나타낸다.
〔실시예 1〕
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라속 SAM2197 (FERM BP-6261) 을 사용하였다.
표 1 의 배지 1-A, 1-B, 1-C 각각 5L 를 10L 용량 배양조에 조제하고, 미리 플라스크 배양으로 조제한 전 배양액을 접종하여 배양하였다. 배지 1-A 의 아밀라아제 처리 전분은 전분에 α-아밀라아제 (와코쥰야쿠 주식회사 제 제품 코드 번호 011-16881) 를 첨가하여 37℃ 에서 30 분 인큐베이트한 것을 사용하였다. 환원 당은 소모기 넬슨 (Somogyi-Nelson) 법으로, 전체 당은 페놀황산 (Phenol-H2S04) 법으로 측정하였다. 측정 결과, 배지 1-A 의 아밀라아제 처리 전분의 환원 당/전체 당의 비율은 38%, 배지 1-B 의 가용성 전분의 환원 당/전체 당의 비율은 0% 이었다.
7 일간의 통기 교반 배양의 결과, 배지 1-A 에서는 4.2g/L, 배지 1-B 에서는 1.2g/L, 배지 1-C 에서는 4.3g/L의 아라키돈산 생성량이 각각의 배지에서 얻어졌다. 또, 아라키돈산 생성량은 다음과 같이 하여 산출하였다. 즉, 배양액을 여과지로 여과하여 균체 케이크를 회수하고, 균체를 105℃ 에서 건조시킨 후, 칭량하였다. 건조 후의 칭량치를 여과에 이용한 배양액량으로 나누어 건조 균체 농도를 구하였다. 건조 균체편 약 20 mg 을 나사구 시험관에 칭량하고, 이것에 염산메탄올 2mL 및 디클로로메탄 1mL 을 첨가하여 50℃ 에서 3 시간 반응시켰다. 반응 후, 헥산을 첨가하여 지방산메틸에스테르를 추출하고, 회수한 헥산층을 감압농축하였다. 얻어진 지방산메틸에스테르를 소정량의 아세토니트릴에 용해하여 가스크로마토그래피로 분획하고, 피크 면적으로부터 각 지방산메틸에스테르를 정량하였다. 정량 결과를 균체편 정밀 칭량치로 나누어, 건조 균체당 각 지방산 함량을 구하였다. 얻어진 각 지방산 함량에 건조 균체 농도를 곱하여 각 지방산 생성량을 구하였다.
배지 No. 1-A 1-B 1-C
아밀라아제 처리 전분
가용성 전분
글루코오스
대두 가루
대두유
소포제		 12%
0%
0%
3%
0.2%
0.1%		 0%
12%
0%
3%
0.2%
0.1%		 0%
0%
12%
3%
0.2%
0.1%
아라키돈산 생성량 4.2g/L 1.2g/L 4.3g/L

상기 표를 통해 알 수 있는 바와 같이, 가용성 전분을 사용한 배지에서는 아라키돈산 생성량이 낮았지만, 전분을 아밀라아제로 처리한 당화 전분을 사용함으로써, 글루코오스 배지와 동등한, 높은 아라키돈산 생성량이 얻어졌다.
〔실시예 2〕
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라속 SAM2197 (FERM BP-6261) 을 사용하였다. 가용성 전분 24%, 효모 엑기스 1.5% 의 배지 50mL 를 500mL 플라스크에 조제하였다. 배지 5OmL 에 모르티에렐라속 SAM2197 의 포자를 1 ×1O5 개 접종하고, 아스페르길루스 오리재 (Aspergillus oryzae) 의 포자 현탁액을 다양한 양 접종하여, 160rpm, 28℃ 에서 7 일간 배양하였다. 또한, 비교를 위해 글루코오스 12%, 효모 엑기스 1.5% 의 배지를 상기와 동일하게 조제하여 모르티에렐라속 SAM2197 (FERM BP-6261) 을 접종하여 배양하였다. 배양 5 일째에 글루코오스 12% 를 첨가하여 160rpm, 28℃ 에서 7 일간 배양하였다. 배양의 결과, 표 2 에 나타내는 바와 같이, 아스페르길루스 오리재의 포자 현탁액 접종량이 0.lmL 일 때 에 아라키돈산 생성량이 0.56g/L 로 최대가 되고, 이는 모르티에렐라의 단일 배양으로 가용성 전분을 사용한 경우 (0.3g/L) 의 2 배 가까운 값이 되고, 또한 단일 배양으로 글루코오스를 탄소원으로서 사용한 경우와 동등한 생성량이었다. 아스페르길루스의 포자접종량이 1mL 가 되면 아라키돈산 생성량은 저하되었지만, 이는 아스페르길루스의 증식의 영향에 의해, 모르티에렐라의 증식이 억제되는 경우가 있을 수 있음이 시사된 것으로, 모르티에렐라속 미생물과 당화 효소 생산 미생물의 혼합 배양시에는 전자를 주 미생물로서 배양하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.
탄소원 아스페르길루스 포자
현탁액 접종량		 아라키돈산 생성량
가용성 전분 0mL 0.30g/L
가용성 전분 0.01mL 0.50g/L
가용성 전분 0.1mL 0.56g/L
가용성 전분 1mL 0.16g/L
글루코오스 0mL 0.58g/L

〔실시예 3〕
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) CBS754.68 을 사용하였다. 표 3 에 나타내는 여러 가지의 당을 4.5%, 효모 엑기스를 1% 함유하는 배지 50mL 를 500mL 용량 플라스크에 조제하고, 1 ×103 개의 포자를 접종하여 배양하였다. 28℃, 100rpm 에서 5 일간 배양하였다. 당화 전분 (2), (7) 및 (8) 의 당화 처리 방법으로서는 전분에 α-아밀라아제 및 플루라나아제를 첨가하여 37℃ 에서 30 분간 인큐베이트한 것을 사용하였다. 또, α-아밀라아제로서 아밀라아제 AD「아마노」1 (아마노 엔자임 주식회사 제) 을, 또한 플루라나아제로서 플루라나아제「아마노」3 (아마노 엔자임 주식회사 제) 을 사용하였다.
배양 결과, 표 3 에 나타내는 바와 같은 아라키돈산 생성량이 얻어져, 상기 기술한 바와 같은 당화도의 바람직한 범위가 존재하는 것이 나타났다.
탄소원 환원 당/전체 당의 비율 아라키돈산 생성량
글루코오스 100% 0.65g/L
가용성 전분 (1) 0% 0.11g/L
당화 전분 (2) 18% 0.43g/L
당화 전분 (3) 27% 0.58g/L
당화 전분 (4) 33% 0.61g/L
당화 전분 (5) 50% 0.61g/L
당화 전분 (6) 55% 0.69g/L
당화 전분 (7) 80% 0.69g/L
당화 전분 (8) 92% 0.65g/L

탄소원의 상세
(1) 마츠타니 화학 제, 스타빌로즈 K
(2) 전분을 α-아밀라아제 및 플루라나아제로 당화 처리한 것
(3) 카토 화학 제, 후지 시럽 C-75S
(4) 카토 화학 제, 후지 시럽 C-75
(5) 카토 화학 제, HMTP-75 (M-70)
(6) 카토 화학 제, A-75
(7) 전분을 α-아밀라아제 및 플루라나아제로 당화 처리한 것
(8) 전분을 α-아밀라아제 및 플루라나아제로 당화 처리한 것
〔실시예 4〕
아라키돈산 생산균으로서 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) CBS754.68 을 사용하였다. 효모 엑기스 및 글루코오스를 영양원으로 하는 배지에서 종배양을 실시하고, 50L 용량 배양조에 조제한 본 배양의 배지에 접종하였다. 본 배양의 배지 조성은 표 4 에 나타내는 4-A, 4-B, 4-C 의 3 가지 당 조성으로 실시하고, 당 이외의 공통의 배지 조성은 대두 가루 4%, 대두유 0.1%, KH2PO4 0.3%, Na2SO4 0.1%, CaCl2ㆍ2H2O 0.05%, MgCl2ㆍ6H2O 0.05% 로 배양하였다. 또, 사용한 당화 전분의 환원 당/전체 당의 비율은 30% 이었다.
10 일간 배양한 결과, 배지 4-A 에서는 13.5g/L, 4-B 에서는 7g/L, 4-C 에서는 13.3g/L 의 아라키돈산 생성량이 각각 얻어졌다. 이 결과로부터, 당화 전분을 사용함으로써, 고농도 글루코오스에 의한 증식 저해의 회피와, 유가 회수 저감에 의한 배양 비용의 저감이 가능하게 된다.
배지 No. 4-A 4-B 4-C
탄소원 글루코오스 글루코오스 당화 전분
최초 당 농도 1.8% 6% 6%
유가 당 농도
1 일째 유가
2 일째 유가
3 일째 유가
4 일째 유가
5 일째 유가
4.1%
4.1%
3.6%
2.7%
1.7%
0%
6%
6%
0%
0%
0%
6%
6%
0%
0%
전체 탄소원 18% 18% 18%
아라키돈산 생성량 13.5g/L 7.0g/L 13.3g/L

〔실시예 5〕
미드산 생산균으로서 모르티에렐라 알피나 SAM1861 (미공연조기 제 3590 호, FERM BP-3590) 을, 디호모-γ-리놀렌산 생산균으로서 모르티에렐라 알피나 SAM1860 (미공연조기 제 3589 호, FERM BP-3589) 을 사용하였다. 표 5 에 나타내는 3 종류의 배지 50mL 를 500mL 용량 플라스크에 조제하여, 1 ×103 개의 포자를 접종하여 배양을 개시하였다. 24℃, 100rpm 의 조건으로 7 일간 배양을 실시하였다.
배지 No. 5-A 5-B 5-C
당화 전분 (*)
가용성 전분
글루코오스
대두 가루
KH2PO4
소포제		 5%
0%
0%
1.5%
0.2%
0.1%		 0%
5%
0%
1.5%
0.2%
0.1%		 0%
0%
5%
1.5%
0.2%
0.1%
균주: SAM1861
미드산 생성량
0.44g/L
0.12g/L
0.45g/L
균주: SAM1860
디호모-γ-리놀렌산 생성량
0.55g/L
0.20g/L
0.60g/L
(*) 환원 당/전체 당의 비율 ＝ 35% 의 당화 전분을 사용하였다.
가용성 전분을 사용한 배양에서는 미드산 생산, 디호모-γ-리놀렌산 생산 모두 낮은 생산량이었지만, 당화 전분을 사용함으로써 글루코오스 배지와 동등한 높은 생성량이 얻어졌다.
본 발명에 있어서, 모르티에렐라속 미생물을 배양할 때에, 배지 탄소원으로서 종래 사용되었는 글루코오스보다 저렴한 전분 등을 사용하기 때문에, 배지의 원재료비를 삭감할 수 있고, 나아가서는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 경비의 삭감을 도모할 수 있다. 또한, 배지 탄소원으로서 당화 전분을 사용함으로 써, 배지의 침투압 상승을 억제하여 대 탄소원당 고도 불포화 지방산 함유 지질의 수율을 증가시킬 수 있다. 이와 같이 침투압의 상승을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명에서는 배지 탄소원으로서 글루코오스를 사용하는 경우와는 달리, 반드시 유가 배양법을 실시할 필요는 없어지고, 배양 공정에서의 설비, 작업 횟수나 작업 시간을 생략할 수 있고, 나아가서는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 비용을 삭감할 수 있다.

Claims (9)

  1. 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 알리아세아 (Mortierella alliacea) 를, 전분 또는 가용성 전분으로부터 α-아밀라아제, β-아밀라아제 및 플루라나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 당화 효소에 의해 생성되는 환원당/전체 당비 (%) 가 33 ~ 90 % 인 당화 전분을 함유하는 배지를 사용하여 배양하고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 알리아세아 (Mortierella alliacea) 를, (a) 전분 또는 가용성 전분 및 (b) α-아밀라아제, β-아밀라아제 및 플루라나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 당화 효소를 함유하는 배지를 사용하여 배양하고, 그 배지에 함유되는 전분 또는 가용성 전분으로부터 α-아밀라아제, β-아밀라아제 및 플루라나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 당화 효소에 의해 생성되는 환원당/전체 당비 (%) 가 33 ~ 90 % 인 당화 전분을 배지 탄소원으로서 사용하여, 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 알리아세아 (Mortierella alliacea) 에 의해 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 생성시키고, 배양물로부터 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법.
  4. 전분 또는 가용성 전분을 함유하는 배지를 사용하여 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 알리아세아 (Mortierella alliacea) 를 주 미생물로, 아스페르길루스 (Aspergillus) 속 미생물을 부 미생물로 혼합 배양하고, 상기 아스페르길루스 (Aspergillus) 속 미생물에 의해 전분 또는 가용성 전분으로부터 생성된 환원당/전체 당비 (%) 가 33 ~ 90 % 인 당화 전분을 함유하는 배양액으로부터 상기 모르티에렐라 알피나 (Mortierella alpina) 또는 모르티에렐라 알리아세아 (Mortierella alliacea) 에 의해 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 제조하고, 상기 고도 불포화 지방산을 함유하는 지질을 채취하는 것을 특징으로 하는 고도 불포화 지방산 함유 지질의 제조 방법.
  5. 삭제
  6. 제 4 항에 있어서, 아스페르길루스 (Aspergillus) 속에 속하는 미생물이, 아스페르길루스 오리재 (Aspergillus oryzae) 또는 아스페르길루스 카와치 (Aspergillus kawachii) 인 제조 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1 항, 제 3 항, 제 4 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 고도 불포화 지방산이 γ-리놀렌산, 디호모-γ-리놀렌산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 미드산, 6,9-옥타데카디엔산 및 8,11-에이코사디엔산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 지방산인 제조 방법.
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