CN101006181A - 含有任意含量的甘油二酯的微生物油脂的制造方法及该油脂 - Google Patents

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Abstract

本发明是甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂的制造方法，更加具体地说，该方法的特征在于，培养能够产生该油脂的微生物，根据需要提取该油脂。

Description

含有任意含量的甘油二酯的微生物油脂的制造方法及该油脂
技术领域
本发明涉及以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的甘油二酯油脂的制造方法。
本发明还涉及下述油脂的制造方法，即、通过分馏含有甘油三酯和甘油二酯的油脂，制造甘油三酯含量高且甘油二酯含量低的油脂、或甘油三酯含量低且甘油二酯含量高的油脂的方法。
本发明进一步涉及该油脂和配合该油脂形成的饮食物、治疗用营养食品、动物用饲料、宠物食品及医药品。
在本发明中，甘油三酯、甘油二酯是指从微生物中提取的甘油三酯、甘油二酯。
背景技术
这里所述的多不饱和脂肪酸是指碳原子数为18以上、且具有2个以上双键的脂肪酸。因为多不饱和脂肪酸具有各种独特的生理活性，所以在各种食品及动物饲料中添加使用以提高其功能，其主要为：亚油酸(LA)、α-亚麻酸(ALA)、γ-亚麻酸(GLA)、二均-γ-亚麻酸(DGLA)、Mead酸(MA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。应用时有时将其以游离脂肪酸型、磷脂质型使用，但主要作为甘油三酯型使用，其酰基残基中常含有作为组成成分的多不饱和脂肪酸。
生物合成人体的多不饱和脂肪酸时，有两个代表系列即ω3系列和ω6系列(ω表示从脂肪酸的甲基末端开始数到最初出现双键的碳原子的序号)。例如ω6系列，由亚油酸(18:2 ω6)经过重复脱饱和作用和延长碳链，转化为γ-亚麻酸(18:3ω6)、二均-γ-亚麻酸(20:3ω6)、花生四烯酸(20:4ω6)及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)。
对于ω3系列，由α-亚麻酸(18:3ω3)经过重复脱饱和作用和延长碳链，转化为二十碳五烯酸(20:5ω3)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5ω3)及4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22:6ω3)。作为ω3系列的多不饱和脂肪酸，已知二十碳五烯酸(以下称为“EPA”)、二十二碳六烯酸(以下称为“DHA”)特别具有对动脉硬化症、血栓症等成人病的预防效果、抗癌作用、增强学习能力的作用等诸多生理功能，在医药品、特定保健用食品方面的利用进行了各种尝试。但是，最近ω3系列以外的多不饱和脂肪酸(ω6系列及ω9系列)的生理功能也引起了人们的关注。
花生四烯酸占构成血液、肝脏等重要器官的脂肪酸的约10％(例如：人体血液的磷脂质中的脂肪酸组成比，花生四烯酸为11％，二十碳五烯酸为1％，二十二碳六烯酸为3％)，其作为细胞膜的主要构成成分参与调节膜流动性，在体内代谢中显示各种功能，另一方面，其作为前列腺素类化合物的直接前体发挥重要作用。特别是最近，作为婴幼儿营养及老人用营养辅助食品受到关注。通常情况下，摄取富含亚油酸的食品后可以转化为花生四烯酸，但成人病患者、亚健康人群、婴儿、老人的参与生物合成的酶的作用降低，花生四烯酸常常不足，所以作为油脂，期望直接摄取。
ω3系列的多不饱和脂肪酸EPA、DHA存在有鱼油这种丰富的供应源，而ω6系列的多不饱和脂肪酸γ-亚麻酸、二均-γ-亚麻酸、花生四烯酸及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)，几乎不能从以往的油脂供应源中得到，现在一般使用经过微生物发酵得到的以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂。例如，已报道了下述方法，即、培养各种能够产生以花生四烯酸为组成脂肪酸形成的油脂的微生物，得到以花生四烯酸为组成脂肪酸形成的油脂的方法。其中特别是通过使用被孢霉属(Mortierella)微生物，得到高含量花生四烯酸的油脂的方法(日本国特开昭63-44891、日本国特开昭63-12290)。这些油脂主要含有甘油三酯。
另一方面，甘油二酯也广泛存在于天然油脂中，因甘油二酯具有抑制血液中中性脂肪升高的作用而受到关注。近年来利用酶合成法能够工业性生产的甘油二酯作为抑制血液中中性脂肪升高的食品备受关注并已得到应用(科学和工业、74(1)33页(2000年))，并且在化妆品、医药品等领域得到应用。
铃木等(油科学第31卷第11号(1982)921页)将碳酸铵作为氮源培养Mortierella isabellina IFO7884，结果显示能够生产含有35％1，3甘油二酯的中性脂肪。
可是，并没有指出这些甘油二酯含有的脂肪酸组成。
此外，铃木等(油科学第37卷第11号(1988)1081页)将培养Mortierellaisabellina IFO8187得到的干燥菌体，使用极性溶剂乙醇进行提取，结果显示能够生产占中性脂肪的66.6％的甘油二酯。可是，并没有指出这些甘油二酯的脂肪酸组成。此外，使用该方法也会提取出大量极性脂质，为了提高中性脂质的纯度，必须进一步除去极性脂质。而且，通过研究提取条件，认为该油脂是浓缩甘油二酯后的油脂，而不是微生物生产的油脂。
清水等(Biotechnology in Agriculture and Forestry vol.33 MedicalAromatic Plants VIII 360页)指出，高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4突变株生产含有20％甘油二酯的油脂，其中生产的花生四烯酸含量为19.4％。
另一方面，甘油二酯也广泛存在于天然油脂中，已在化妆品、医药品等领域得到应用，而近年来又发现了大量且高纯度制造的方法，其营养学方面的研究也在推进，其结果也作为抑制血液中中性脂肪升高的食品而被利用(科学与工业、74(1)33页(2000年))。
此外，使用酶等工业制造甘油二酯的方法如下所示。
例如，在日本国特开平1-71495号公报中，使用固定化脂肪酶，利用脂肪酸的低级醇酯和甘油制造甘油二酯，制造甘油二酯为80.1％的油脂。此外，在日本国特开昭62-25987号公报中，使用碱性脂肪酶在实际无水状态下，利用脂肪酸、低级醇和甘油制造60～70％的甘油二酯。
但是，这些甘油二酯是使用酶制造的，仍没有发现含有多不饱和脂肪酸的甘油二酯的制造方法。
即对于含有花生四烯酸等多不饱和脂肪酸、且含有高浓度甘油二酯的油脂未见报道，更没有进行工业制造，而且对其组合物全然不知。不用说酶、化学修饰，就是如何从微生物等天然界中获取也根本不知道，更不可能进行实施。
虽然已经公开了甘油三酯含量高且含有花生四烯酸的微生物油脂的制造方法及其油脂，但还没有公开甘油三酯含量高且甘油二酯含量低的微生物油脂的制造方法。
甘油二酯具有抑制血液中中性脂肪升高的作用等，近年来受到关注。但是，从氧化稳定性方面来看，优选甘油一酯少的油脂，即、与高度精制的甘油二酯相比，优选与甘油三酯同时存在。
铃木等(油科学第37卷第11号(1988)1081页)指出，能够生产占中性脂肪66.6％的甘油二酯，但其为利用极性溶剂乙醇从干燥菌体中提取的甘油二酯，该方法也会大量提取出极性脂质，为了提高中性脂质的纯度，必须进一步除去极性脂质。并且通过进一步研究提取条件，认为该油脂是浓缩甘油二酯后的油脂，而不是微生物生产的油脂。
日本国特开平1-71495和日本国特开昭62-25987中使用酶进行工业制造，但还没有发现含有多不饱和脂肪酸的甘油二酯的制造方法。
Shimada等(LIPIDvol.31.no.12(2003))使用酶，使含有花生四烯酸的甘油三酯和乙醇发生酯交换反应，反应过程中生成约25％的副产物甘油二酯，也生成同等程度的副产物甘油一酯。
即对于含有花生四烯酸等多不饱和脂肪酸、且含有高浓度甘油二酯的油脂未见报道，更没有进行工业制造，而且对其组合物全然不知。不用说酶、化学修饰，就是如何从微生物等天然界中获取也根本不知道，更不可能进行实施。
虽然已经公开了甘油三酯含量高且含有花生四烯酸的微生物油脂的制造方法及其油脂，但还没有公开甘油三酯含量高且甘油二酯含量低的微生物油脂的制造方法。
虽然已经报到了含有甘油二酯的微生物油脂，但是，由于甘油二酯的浓度低，这些制造法不适合生产的经济性。因此，把能够生产含有中性脂质中的甘油二酯为21％以上的油脂的微生物的开发作为课题。
专利文献1：日本国特开昭63-44891号公报
专利文献2：日本国特开昭63-12290号公报
专利文献3：日本国特开平1-71495号公报
专利文献4：日本国特开昭62-25987号公报
非专利文献1：科学与工业、74(1)33页(2000年)(日语原名：科学と工業)
非专利文献2：油科学第31卷第11号(1982)921页)(日语原名：油科学第31卷第11号)
非专利文献3：油科学第37卷第11号(1988)1081页)(日语原名：油科学第37卷第11号)
非专利文献4：Biotechnology in Agriculture and Forestry Vo 1.33Medical Aromatic Plants VIII p.360
非专利文献5：LIPID Vol.31，No.12，2003
发明内容
本发明者把得到能够生产含有中性脂质中的甘油二酯为21％以上的油脂的微生物作为目标，得到大量高山被孢霉(Mortierella alpina)的突变株，从其中选择生产甘油二酯浓度高的油脂的突变株。其结果，令人吃惊的是，通过使葡萄糖浓度、培养时间最优化，得到含有下述油脂的微生物的制造方法，所述油脂为：甘油二酯相对于中性脂质为30％以上、甘油三酯相对于中性脂质为50％以下的以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂。
将该微生物菌体内的油脂用适当溶剂进行提取，然后使用分馏等公知技术进行分离，能够得到与菌体内油脂相比，甘油二酯含量更高、甘油三酯含量低的油脂。利用该方法分离的另一种油脂，能够得到甘油三酯含量高、甘油二酯为低浓度的油脂。
因此，本发明提供甘油二酯为高含量形成的油脂的制造方法，以及配合该油脂形成的饮食物、治疗用营养食品和医药品。
本发明提供：甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂的制造方法，其特征在于，培养能够产生该油脂的微生物，根据需要提取该油脂。
在上述方法中，优选甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为30重量％以上，更优选甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为40重量％以上，如甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为50重量％以上。
在上述方法中，优选上述微生物是被孢霉属(Mortierella)微生物，更优选为被孢霉属(Mortierella)属被孢霉(Mortierella)亚属微生物，例如高山被孢霉(Mortierella alpina)种微生物。上述微生物优选为能够产生含有多不饱和脂肪酸的油脂的微生物突变株。
本发明还提供：能够产生甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂的被孢霉属(Mortierella)微生物，优选能够产生甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为30重量％以上，以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂的被孢霉属(Mortierella)微生物。上述微生物优选为高山被孢霉(Mortierella alpina)、如突变株。
本发明还提供含有下述油脂的微生物菌体，所述油脂为：甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂。优选甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为30重量％以上，更优选甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为40重量％以上，例如甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为50重量％以上。上述微生物优选为被孢霉属(Mortierella)微生物的微生物菌体，例如高山被孢霉(Mortierella alpina)种微生物的微生物菌体。菌体可以是活菌也可以是死菌，或干燥菌体。
本发明进一步提供：甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂，其为从能够产生该油脂的微生物的培养菌体中提取的油脂。优选甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为30重量％以上，更优选甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为40重量％以上，例如甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为60重量％以上。上述提取，例如使用非极性溶剂或亲水性溶剂。
本发明进一步提供：培养能够产生以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂的微生物，从得到的含有甘油二酯和甘油三酯的菌体中提取油脂，通过蒸馏分离得到的中性脂质中甘油二酯为70％以上、甘油三酯为30％以下的油脂。
本发明还提供：培养能够产生以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂的微生物，从得到的含有甘油二酯和甘油三酯的菌体中提取油脂，通过蒸馏分离得到的中性脂质中甘油三酯为95％以上、甘油二酯为5％以下的油脂。
构成本发明的油脂的多不饱和脂肪酸为，如二均-γ-亚麻酸(20:3ω6)、花生四烯酸(20:4ω6)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22:4ω6)、4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5ω6)、6，9，12，15-十八碳四烯酸(18:4ω3)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20:4ω3)、二十碳五烯酸(20:5ω3)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5ω3)、4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22:6ω3)、6，9-十八碳二烯酸(18:2ω9)、8，11-二十碳二烯酸(20:2ω9)或5，8，11-二十碳三烯酸(Mead酸：20:3ω9)或这些物质的组合物。
本发明还提供：含有上述本发明的油脂或将该油脂作为原料使用、或进行化学修饰的食品组合物、动物用饲料组合物、宠物食品、化学产品原料、医药、化妆品组合物。
具体实施方式
突变株的获得
本发明涉及：培养油脂中具体为粗油中甘油二酯含量高、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸而形成的微生物，使其生产该油脂，对该油脂进行精制后配合该精制油脂形成的饮食物、治疗用营养食品以及医药品。
因此，在本发明中，只要能够产生以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂(甘油二酯)的微生物，均可使用。例如：作为具有生产组成脂肪酸为花生四烯酸的油脂(甘油三酯)能力的微生物，可以为属于被孢霉属(Mortierella)、耳霉属(Conidiobolus)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、青霉属(Penicillium)、枝孢属(Cladosporium)、毛霉属(Mucor)、镰孢霉属(Fusarium)、曲霉属(Aspergillus)、红酵母属(Rhodotorula)、虫霉属(Entomophthora)、Echinosporangium属、水霉属(Saprolegnia)的微生物。
属于被孢霉属(Mortierella)被孢霉(Mortierella)亚属的微生物，例如可以为长被孢霉(Mortierella elongata)、Mortierella exigua、Mortierella hygrophila、高山被孢霉(Mortierella alpina)等。
具体可以为，Mortierella elongate IFO8570、Mortierella exigua IFO8571、Mortierella hygrophila IFO5941、Mortierella alpine IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等菌株。
例如能够产生DHA的微生物，可以为属于Crypthecodenium属、Thrautochytrium属、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、Ulkenia属、Japonochytrium属或海壶菌属(Haliphthoros)的微生物等。
这些菌体均可从大阪市财团法人发酵研究所(IFO)、美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)以及Centrralbureau voorSchimmelcultures(CBS)中得到，不受任何限制。此外，也可使用本发明研究组从土壤中分离的菌株长被孢霉(Mortierella elongata)SAM0219(微工研菌寄第8703号)(微工研条寄第1239号)。
可以直接使用属于上述菌种保藏中心的菌株或从自然界中分离的菌株，也可以使用通过增殖及/或分离1次以上得到的与原来菌株性质不同的自然突变菌株。即、对这些脂质生产菌实施突变处理，通过选择能够选择出甘油二酯生成能力高的脂质生产菌。
突变处理，只要能够适用于上述脂质生产菌，没有特别限定，例如可以为下述一般的突变操作，即、进行放射线(X射线、γ-射线、中性粒子射线)照射、紫外线照射、高热处理等，或使微生物悬浮于适当的缓冲液中，加入诱变剂培养一定时间后，适当稀释接种于琼脂培养基上，得到突变株的菌落。诱变剂可以为：氮芥、甲基甲烷磺酸酯、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)等烷化剂，5-溴尿嘧啶等碱基类似物，丝裂霉素C等抗生素，6-巯基嘌呤等碱基合成抑制剂，硫酸原黄素等色素类，4-硝基喹啉N-氧化物等致癌剂，氯化锰、甲醛等化合物。此外，使用的微生物可以为生长发育菌体(菌丝)，也可以为孢子。
从进行突变处理的脂质生产菌中选择甘油二酯生成能力高的脂质生产菌的方法，没有特别限定，但突变处理过的脂质生产菌生成的脂质优选用高效液相色谱法等分析。
如实施例1所示，对实施诱变处理的约3000个菌株按照上述方法进行选择，结果得到3株产生甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂的突变株，这表明诱变处理过的约每1000株菌株中，能够得到平均1株目标突变株。因此，本发明得到突变株的频率，与一般通过诱变处理-选择的随机选择法相比非常高，与本发明中实际得到的3株突变株具有同等上述特性的突变株，通过反复本发明实施例1所述的方法，能够容易得到。
属于被孢霉属(Mortierella)属被孢霉(Mortierella)亚属的微生物，被认为是能够产生以花生四烯酸为主要组成脂肪酸形成的油脂(甘油三酯)的微生物，但本发明者通过对上述菌株实施诱变处理，获得了能够产生以二均-γ-亚麻酸为主要组成脂肪酸形成的油脂(甘油三酯)的微生物(日本国特开平5-91887)、能够产生以ω9系列多不饱和脂肪酸为主要组成脂肪酸形成的油脂(甘油三酯)的微生物(日本国特开平5-91888)。并且得到了具有高浓度碳源耐性的微生物(WO98/39468)，这些微生物是被孢霉属(Mortierella)被孢霉(Mortierella)亚属微生物，通过对这些菌株实施与本发明同样的诱变处理，能够得到蓄积以二均-γ-亚麻酸、ω9系列多不饱和脂肪酸为主要组成脂肪酸的甘油二酯含量高的油脂的微生物。
本发明的油脂，是培养能够产生以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂的微生物，从其培养物中得到的微生物油脂。通过在培养槽内培养微生物，使菌体中蓄积含有高浓度甘油二酯的油脂，进而从该油脂中提取得到。
具体来说，其为：甘油二酯相对于油脂的含量为21重量％以上、优选为35重量％以上，且多不饱和脂肪酸相对于甘油二酯的总脂肪酸的含量为2重量％以上、优选为9重量％以上的油脂。因此，必须培养能够产生以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂(甘油二酯)的微生物。这里所述的微生物，优选能够产生将下述多不饱和脂肪酸中的至少1种多不饱和脂肪酸作为甘油二酯的主要组成脂肪酸的微生物，所述多不饱和脂肪酸为：碳原子数为18以上且具有3个以上双键的ω6系列多不饱和脂肪酸、碳原子数为18以上且具有2个以上双键的ω9系列多不饱和脂肪酸、以及碳原子数为18以上且具有3个以上双键的ω3系列多不饱和脂肪酸。
作为碳原子数为18以上且具有3个以上双键的ω6系列多不饱和脂肪酸，可以为γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)、二均-γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22:4ω6)及DPAω6(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)；作为碳原子数为18以上且具有2个以上双键的ω9系列多不饱和脂肪酸，可以为6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸、及Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)；作为碳原子数为18以上且具有3个以上双键的ω3系列多不饱和脂肪酸，可以为α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)、6，9，12，15-十八碳四烯酸(18:4ω3)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20:4ω3)、EPA(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、DPAω3(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)、及DHA(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。
为了培养本发明使用的菌株，将其菌株的孢子、菌丝、或预先培养得到的菌种培养液、或通过菌种培养回收的菌体接种到液体培养基中进行增菌培养。为液体培养基时，碳源一般使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、糖化淀粉等，但并不限于这些物质，可使用任何碳源。氮源可以使用蛋白胨、酵母浸膏、麦芽浸膏、肉浸膏、酪蛋白水解物、玉米浸渍液、大豆蛋白、脱脂大豆、棉籽饼等天然氮源，尿素等有机氮源，以及硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵等无机氮源。
从大豆中得到的氮源，具体可以为大豆、脱脂大豆、大豆薄片、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆乳、熟黄豆粉等。特别优选单独或多数使用对脱脂大豆实施热变性后的脱脂大豆，更优选单独或多数使用将脱脂大豆在约70～90℃进行热处理后进一步除去乙醇可溶性成分的脱脂大豆，或与上述氮源组合使用。此外，可选择性地将磷酸离子、钾离子、钠离子、镁离子、钙离子以及铁、铜、锌、锰、镍、钴等金属离子、维生素等作为微量营养源使用。
这些培养基成分，只要其浓度不阻碍微生物的生长发育，没有特别限定。实际上，一般情况下碳源的总添加量为0.1～40重量％，优选为1～25重量％。氮源的总添加量为1～15重量％，优选为2～10重量％。更优选初始碳源添加量为1～5重量％，初始氮源添加量为3～8重量％，培养过程中流加碳源和氮源，更优选仅流加碳源培养。
为了增加多不饱和脂肪酸的收率，作为多不饱和脂肪酸的前体，可以单独或组合使用下述物质：如十六烷、十八烷等烃；油酸、亚油酸等脂肪酸或其盐；或脂肪酸酯，如乙酯、甘油脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯；或橄榄油、大豆油、菜籽油、棉籽油、椰子油等油脂类。基质的添加量相对于培养基为0.001～10％，优选为0.5～10％。此外，也可将这些基质作为唯一碳源进行培养。
产生多不饱和脂肪酸的微生物的培养温度根据使用的微生物而确定，可以为5～40℃，优选为20～30℃，并且也可以在20～30℃培养使菌体增殖，然后在5～20℃继续培养使其生产多不饱和脂肪酸。根据这样的温度管理，也能够提高生成脂肪酸中的多不饱和脂肪酸的比例。菌种培养采用通气搅拌培养、振荡培养、固体培养或静置液体培养，增菌培养采用通气搅拌培养。培养时间通常为2～30日，优选5～20日，更优选5～15日。
例如，将甘油二酯酸生产菌KY-1株加入装有4000L酵母浸膏2％、葡萄糖6％、pH为6.0的培养基的10kL通气搅拌培养槽内，在温度28℃、通气量1VVM、槽内压1.0kg/cm2的条件下，通气搅拌培养7日。培养结束并灭菌后，用连续式脱水机回收湿菌体，用干燥机干燥至水分含量为5wt％，能够得到干燥菌体。
本发明的油脂是，培养能够产生以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂(甘油二酯)的微生物，从培养物中得到的微生物油脂。其最大特点是通过用培养槽培养，可使菌体中含有的油脂中的甘油二酯含量增加，所以培养基、培养条件、油脂的提取精制方法并不限于这些。
回收菌体提取油脂
从菌体内蓄积有甘油二酯含量高且以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂的微生物中取得油脂的方法，培养结束后，直接将培养液，或对培养液实施灭菌、浓缩、酸化等处理后，通过自然沉降、离心分离及/或过滤等常用的固液分离手段，得到培养菌体。为了有助于固液分离，可以加入凝集剂、助滤剂。凝集剂可以使用如氯化铵、氯化钙、藻朊酸、壳聚糖等。助滤剂例如可以使用硅藻土。优选对培养菌体进行水洗、破碎、干燥。
干燥可以通过冷冻干燥、风干、流动床干燥等进行。从干燥菌体中得到粗油的手段，可以使用有机溶剂提取法、压榨法，优选在氮气流下用有机溶剂提取。有机溶剂可以使用乙醇、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚、丙酮等，也可以使用甲醇和石油醚交替提取、氯仿-甲醇-水的三相系溶剂。
这些溶剂中，如果使用己烷等疏水性溶剂进行提取，不会提取出磷脂质等极性脂质，而能够高纯度提取甘油二酯、甘油三酯等中性脂质。得到的提取油脂，不需要在除去磷脂质等脱胶工序、除去游离脂肪酸等脱酸工序等精制工序中付出大量工作就能够得到精制油脂。
如果使用乙醇等亲水性溶剂，虽然可提取出磷脂质等极性脂质，但更能选择性地提取甘油二酯，能够提取出菌体内存在的中性脂肪中的甘油二酯浓度以上的高浓度的甘油二酯油脂。例如使用乙醇作溶剂，能够得到中性脂质中含有甘油二酯70％以上、甘油三酯30％以下的油脂。
该乙醇提取残渣再用己烷提取，能够提高菌体内存在的中性脂质中的甘油三酯浓度。即、能够得到中性脂质中含有甘油二酯10％以下、甘油三酯80％以上的油脂。
获得粗油使用的提取法并不限于上述方法，所有有效提取菌体内油脂的方法均可使用，例如也能够将超临界提取法等作为有效手段使用。
在减压等条件下，从用有机溶剂、超临界流体提取的提取物中除去有机溶剂、超临界流体成分，能够得到目标粗油。此外，能够使用湿菌体代替上述方法进行提取。此时使用甲醇、乙醇、丙酮等水溶性溶剂，或这些溶剂和水及/或其他溶剂组成的水溶性混合溶剂，其他操作与上述相同。
本发明得到的使甘油二酯含量增加的以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的粗油，能够配合在动物饲料中直接使用。但是，考虑到在食品中应用的情况，优选供以一般油脂精制工序使用。油脂精制工序能够使用脱胶、脱酸、脱臭、脱色、柱处理、分子蒸馏、脱蜡等通常方法的工序。
在适当条件下使用分子蒸馏，在蒸馏出的油脂成分中，能够得到目前还没有的高纯度的含有甘油二酯的精制油脂。用己烷提取的甘油三酯浓度高的油脂，进一步通过分子蒸馏将甘油二酯作为蒸馏液除去的油脂，能够得到甘油三酯为90％以上的高含量、甘油二酯为5％以下的非常低含量的油脂。
高浓度的含有甘油二酯的油脂，通过使用各种提取精制方法，结合目标用途，能够同时得到甘油二酯、甘油三酯为任意纯度的油脂。
油脂的用途
有关本发明的油脂(甘油二酯和甘油三酯)的用途具有无限可能性，能够作为食品、饮料、动物饲料、宠物食品、化妆品、医药品的原料及添加剂使用。特别是，在利用甘油二酯的亲水性比甘油三酯大的食品中的应用在扩大。
例如，作为食品组合物，可以为一般食品、功能性食品、营养补助食品、早产儿用配方乳、新生儿用配方乳、婴儿用配方乳、婴儿用食品、孕产妇食品或老人用食品等。作为含有油脂的食品例，可以为肉、鱼、或果仁等本来含有油脂的天然食品、汤类等制作时加入油脂的食品、炸面圈等将油脂作为热媒体的食品、黄油等油脂食品、曲奇等加工时加入油脂的加工食品、或韧性饼干等加工完成时喷上油脂或涂抹油脂的食品等。并且也可以添加到不含油脂的农产食品、发酵食品、畜产食品、水产食品或饮料中。并且可以为功能性食品、医药品的形态，也可以为如经肠营养剂、粉末、颗粒、含片、内服液、悬浮液、乳浊液、糖浆剂等加工形态。
实施例
以下，根据实施例对本发明进一步具体说明。但本发明并不限于实施例。
实施例1突变株的制备
将高山被孢霉(M.alpina)1S-4接种到含有300ml Czapeck琼脂培养基(0.2％NaNO3、0.1％K2HPO4、0.05％MgSO4·7H2O、0.05％KCl、0.001％FeSO4·7H2O、3％蔗糖、2％琼脂、pH 6.0)的大型斜面瓶中，28℃培养2周时间形成孢子。培养后在大型斜面瓶中滴加2滴Tween 80，加入50ml灭菌水后充分振荡，用4层纱布过滤滤液。重复2次该操作，取滤液8,000×g离心10分钟。
使上述得到的孢子悬浮于TM缓冲液(Tris-maleate buffer)(50mM Tris、50mM maleate、pH 7.5)中，使其为1×106孢子/ml。然后使用NTG进行诱变处理。
将NTG处理过的孢子悬浮液进行多阶段稀释，涂布在GY琼脂培养基(1％葡萄糖、0.5％酵母浸膏、0.005％Triton X-100、1.5％琼脂、pH6.0)上。28℃培养，将出现的菌落随机接种在新平板上挑选，28℃形成0.5～1cm的菌落后，12℃培养2日。
将上述平板上挑选的突变株在含有4ml GY液体培养基(葡萄糖2％、酵母浸膏1％、pH6.0)的试管(12.3×200mm)中振荡培养7日。得到的菌体的脂质按照Bligh-Dyer法提取。取约1g菌体加入乳钵中，加入2ml的1％KCl水溶液充分研磨后，移到螺口试管内。向其中加入4ml溶剂A(CHCl3/MeOH、2/1、v/v)，旋转搅拌使2相充分混合，然后离心数分钟，分离取出下层CHCl3层。将这样分离取出的CHCl3层用离心蒸发器浓缩干燥固化，加入约500μl溶剂A，-20℃保存。
TLC分析时，使用涂有硅胶的薄板(Art5721、200×200×0.25mm、Merck)，因为主要分析甘油三酯(TG)、甘油二酯(DG)、甘油一酯(MG)、及游离脂肪酸(FFA)，所以使用己烷/乙醚/乙酸(70∶30∶1、v/v)作展开溶剂。展开后喷以磷钼酸乙醇溶液5％(w/v)，120℃加热，检测各脂质的样点，查找其形态与亲株不同的样点。
结果，在使用TLC的第一次筛选中，确认有甘油三酯(TG)的样点比其他脂质成分的样点薄的菌株，或甘油二酯(DG)、游离脂肪酸(FFA)的样点浓的菌株，该菌株经过使用蒸发光散射分析系统的HPLC分析，结果证明与亲株标准(1S-4)相比较，甘油二酯和甾醇的含有率略高。
对约3000个菌落进行分析，结果得到甘油二酯占总脂质的比率高的3株突变株(#1株、#2株、#3株)。这些株的甘油二酯的含有率为31％、28％、22％。
表1
    甘油二酯     甘油三酯   甘油一酯   其他
#1     31％     65％     N.D.   5％
#2     28％     68％     N.D.   4％
#3     22％     73％     N.D.   5％
N.D.未检测出
实施例2实施例1得到的突变株与亲株的比较
将甘油二酯比率高的3株突变株(#1株、#2株、#3株)中甘油二酯含量最高的#1株(KY-1株)接种于酵母浸膏为1％、葡萄糖为0、2、3、4、6％的培养基上，反复振荡300rpm，温度28℃的条件下开始培养，培养7日。
培养结束时每单位湿菌体的甘油三酯、甘油二酯、甾醇的含量用实施例1的方法分析，其结果如表2所示，没有检测出甘油一酯。葡萄糖为2％时培养，菌体中的甘油二酯变为最大15.36mg/g，此时甘油二酯在中性脂质中所占的比率也变为最大34.5％。
表2
  葡萄糖浓度(％)     湿菌体量(mg/ml培养液)   甘油三酯(mg/g湿菌体) 甾醇(mg/g湿菌体)   1.2甘油二酯(mg/g湿菌体)
    0     1.1     1.09     2.65     0
    2     7.7     11.79     17.35     15.36
    3     11.8     11.33     0.54     5.41
    4     12.6     8.21     0.39     2.14
    6     13.8     11.67     0.15     1.15
作为比较例，与实施例同样的方法培养1S-4株，进行分析。结果如表3所示。
表3
葡萄糖浓度(％)   湿菌体量(mg/ml培养液)   甘油三酯(mg/g湿菌体)  甾醇(mg/g湿菌体)     1.2甘油二酯(mg/g湿菌体)
    0     2.9     2.16     0     0
    2     12.2     18.83     0.60     0.59
    3     13.5     16.23     1.59     0
    4     14.3     8.17     1.25     0
    6     13.9     28.33     0.18     0
实施例3
将甘油二酯酸生产菌KY-1株接种到加入4ml GY培养基(酵母浸膏1％、葡萄糖2％、pH6.0)的100ml三角烧瓶内，振荡300rpm，在温度28℃的条件下开始培养，培养4、6、8日。
培养结束后菌体，测定其干燥后的菌体重量。对于上述得到的菌体，用Bligh-Dyer法提取脂质后，使用液相色谱法的蒸发光散射检测器对各脂质成分进行定量。
结果如表4所示，没有检测出甘油一酯。培养日数到第8日时，每单位菌体的总中性脂质量变为最大16mg/g。培养第4、6、8日的甘油二酯在全部中性脂质中所占的比率分别达到13％、31.5％、18.1％。
表4
培养日数                    脂质量mg/菌体g
计 甘油三酯 甘油二酯 游离脂肪酸     甘油二酯的比率(％)
  4日6日8日   1.513.016.0     8.65.99.5     1.54.12.9     1.43.03.6     13.031.518.1
分析培养第4日、6日、8日的甘油三酯、甘油二酯、游离脂肪酸中含有的组成脂肪酸，结果如表5所示。甘油二酯中含有的花生四烯酸为8.1～13.8％。
表5
脂肪酸名 惯用名                 4日                6日               8日
  甘油三酯中的组成脂肪酸％   甘油二酯中的组成脂肪酸％   游离脂肪酸中的组成脂肪酸％   甘油三酯中的组成脂肪酸％   甘油二酯中的组成脂肪酸％   游离脂肪酸中的组成脂肪酸％   甘油三酯中的组成脂肪酸％   甘油二酯中的组成脂肪酸％   游离脂肪酸中的组成脂肪酸％
C14；0C15；0C16；0C17；0C17；1C18；0C18；1C18；2C18；3C20；0C20；1C20：3C20：4C22；0C24；0 肉豆蔻酸棕榈酸硬脂酸油酸亚油酸γ-亚麻酸花生酸二均-γ-亚麻酸花生四烯酸山嵛酸behenicacid     2.511.616.610.711.75.724.83.73.50.70.52.05.10.10.8     1.17.910.07.513.44.33325.95.70.00.32.18.10.00.3     4.211.414.919.3727.518.24.03.10.70.60.84.6122.2     2.18.122.88.37.64.224.44.94.00.50.52.48.50.412     1.16.615.04.27.62.528.011.85.70.30.52313.80.00.6     1.46.015.53.75.92.129.412.13.70.50.42.412.61.232     1.67.322.18.17.310.62334.53.20.50.52.36.70.41.5     1.06.115.94.37.92.430.011.35.70.20.62.211.90.00.5     1.25.518.04.86.33.028.411.63.70.80.42.16.62.452
作为比较例1，将1S-4株用与实施例同样的方法进行培养、分析。结果如表6所示。培养第6日甘油二酯蓄积量变为最大2.4mg/g菌体，此时甘油二酯在中性脂质中所占的比率减少为5.8％。
表6
  培养日数               脂质量mg/菌体g
  计     甘油三酯     甘油二酯 游离脂肪酸   甘油二酯的比率(％)
  4日6日8日   70.941.117.1     64.934.814.7     2.42.41.0     3.63.91.4     3.45.85.6
实施例4用50L培养发酵罐制造
将甘油二酯酸生产菌KY-1株接种到装有30L含有酵母浸膏为2％及葡萄糖为2％的培养基(pH6.0)的50L通气搅拌培养槽内，在温度28℃、通气量1VVM、搅拌200RPM的条件下通气搅拌培养7日。培养2日、3日、4日时添加葡萄糖，使葡萄糖浓度增加2％。培养结束后在98℃灭菌20分钟，然后过滤回收湿菌体，用干燥机干燥至水分含量为5wt％，得到干燥菌体630g。从该菌体中用己烷提取油脂，得到43g油脂。
该油脂的中性脂质中含有的甘油二酯为36％，甘油二酯中含有的花生四烯酸为全部脂肪酸的15.2％。

Claims (28)

1.一种油脂的制造方法，其为甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂的制造方法，其特征在于，培养能够产生该油脂的微生物，根据需要提取该油脂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为30重量％以上。
3.如权利要求1所述的方法，其中，甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为40重量％以上。
4.如权利要求1所述的方法，其中，甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为50重量％以上。
5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述微生物是被孢霉属微生物。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述微生物是被孢霉属的被孢霉亚属微生物。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述微生物是高山被孢霉种微生物。
8.如权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，所述微生物是能够产生含有多不饱和脂肪酸的油脂的微生物的突变株。
9.一种被孢霉属微生物，其能够产生甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂。
10.一种被孢霉属微生物，其能够产生甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为30重量％以上、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂。
11.如权利要求9或10所述的微生物，其为高山被孢霉。
12.如权利要求9～11中任一项所述的微生物，其为突变株。
13.一种微生物菌体，其含有甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂。
14.如权利要求13所述的微生物菌体，其中，甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为30重量％以上。
15.如权利要求13所述的微生物菌体，其中，甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为40重量％以上。
16.如权利要求13所述的微生物菌体，其中，甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于50重量％以上。
17.如权利要求13～16中任一项所述的微生物菌体，其中，所述微生物是被孢霉属微生物。
18.如权利要求17所述的微生物菌体，其中，所述微生物是高山被孢霉种微生物。
19.一种油脂，其为甘油二酯相对于全部中性脂质的比率大于20重量％、以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸的含有甘油二酯的油脂，其特征在于，其为从能够生产该油脂的微生物的培养菌体中提取的油脂。
20.如权利要求19所述的油脂，其中，甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为30重量％以上。
21.如权利要求19所述的油脂，其中，甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为40重量％以上。
22.如权利要求19所述的油脂，其中，甘油二酯相对于全部中性脂质的比率为60重量％以上。
23.如权利要求19～22中任一项所述的油脂，其使用非极性溶剂提取。
24.如权利要求19～22中任一项所述的油脂，其使用亲水性溶剂提取。
25.一种油脂，其为培养能够产生以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂的微生物，从得到的含有甘油二酯和甘油三酯的菌体中提取油脂，通过蒸馏分离得到的中性脂质中甘油二酯为70％以上、甘油三酯为30％以下的油脂。
26.一种油脂，其为培养能够产生以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂的微生物，从得到的含有甘油二酯和甘油三酯的菌体中提取油脂，通过蒸馏分离得到的中性脂质中甘油三酯为95％以上、甘油二酯为5％以下的油脂。
27.如权利要求19～26所述的油脂中的以多不饱和脂肪酸为组成脂肪酸形成的油脂，其特征在于，组成油脂的多不饱和脂肪酸是：二均-γ-亚麻酸(20:3ω6)、花生四烯酸(20:4 ω6)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22:4 ω6)、4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22:5 ω6)、6，9，12，15-十八碳四烯酸(18:4 ω3)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20:4 ω3)、二十碳五烯酸(20:5 ω3)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22:5 ω3)、4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22:6 ω3)、6，9-十八碳二烯酸(18:2 ω9)、8，11-二十碳二烯酸(20:2 ω9)或5，8，11-二十碳三烯酸(Mead酸：20:3 ω9)或这些物质的组合物。
28.一种食品组合物、动物用饲料组合物、宠物食品、化学产品原料、医药、化妆品组合物，其中含有权利要求19～27中任一项所述的油脂、或将该油脂作为原料使用、或对该油脂进行化学修饰。
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