KR101439634B1 - 항균펩타이드 베타 디펜신 3 및 그 유사체의 재조합 단백질로의 대량 생산 방법 - Google Patents

항균펩타이드 베타 디펜신 3 및 그 유사체의 재조합 단백질로의 대량 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항균펩타이드 베타 디펜신 3 및 그 유사체의 재조합 단백질로의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 베타 디펜신 펩타이드 생산시 숙주를 보호하면서 동시에 대량 생산할 수 있는 방법 및 그에 관한 베타 디펜신 생산용 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법 및 배지 조성물을 이용하면, 종래에 숙주세포를 이용한 재조합 단백질 생산시 발생하는 숙주세포 사멸(killing-effect)로부터 숙주세포를 보호함으로써, 단백질 발현 증대를 획득할 수 있다.

Description

항균펩타이드 베타 디펜신 3 및 그 유사체의 재조합 단백질로의 대량 생산 방법 {Method for mass production of recombinant protein of antibacterial peptide beta-defensin 3 and homologs thereof}
본 발명은 항균펩타이드 베타 디펜신 3 및 그 유사체의 재조합 단백질로의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 베타 디펜신 펩타이드 생산시 숙주를 보호하면서 동시에 대량 생산할 수 있는 방법 및 그에 관한 베타 디펜신 생산용 배지 조성물에 관한 것이다.
인간 베타 디펜신 (beta-defensin) 펩타이드 (peptide)는 피부 및 다양한 신체 조직이 발현하는 천연의 항균 펩타이드 (anti-microbial peptide)로 생체 면역 체계에 가장 중요한 선천성 면역계(innate immune system)를 구성한다. 특히 베타 디펜신들은 다양한 상피세포(epithelial cells)에서 발현되며, 이러한 펩타이드들의 정상적 발현은 피부 및 상피세포에 정상적 미생물천이를 유지 및 조절하는 기능을 수행한다. 이러한 조절성 항균펩타이드들의 발현이 감소되면 비정상적인 미생물 천이가 유발되고, 이는 다양한 피부질환 및 접촉성 피부염의 고착화 혹은 만성화의 원인이 되기도 한다. 특히 인간 베타 디펜신-2와 -3의 감소가 아토피 피부염 환자의 병변 부위에서 아토피 피부염의 만성화의 중요한 원인이라고 보고되고 있다. 베타 디펜신은 수십 개의 아미노산으로 구성되는 단일의 폴리펩타이드로 6개의 시스테인 (cysteine) 잔기가 분포되어 3개의 이황화결합 (disulfide bond)에 의한 특이적인 구조를 가지고 있다. 이러한 베타 디펜신들은 수개의 중합체 (polymerization)를 이루어 미생물 세포막에 치명적인 구멍 (pore)을 형성하여 사멸작용을 나타낸다. 현재까지 다양한 분자생물학적 연구개발에 의해 수개의 인간 베타 디펜신들이 보고되었으며, 그 중 베타 디펜신-1, -2, 그리고 -3이 피부 세포에 중요하다고 알려져 있다. 본 발명자들은 인간 베타 디펜신의 항균활성에 필수적인 3개의 시스테인 간 구조를 동일하게 갖고 있으며 지금까지 보고되지 않은 새로운 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 존재를 인간 피부세포로부터 확인하고, 이 유전자를 클로닝한 후, 특징화하였으며, 재조합 단백질로 발현하여 항균활성을 확인하고 이러한 신규 펩타이드가 향후 아토피 피부염을 비롯한 다양한 피부 개선용 화장품, 의약외품 및 의약소재로 사용할 수 있음을 특허 등록하였다 (특허문헌 1).
그러나 재조합단백질로 인간 베타 디펜신을 생산하는 경우 발현 숙주에 대한 killing effect 때문에 높은 효율의 재조합단백질 생산이 어려워 상용화에 걸림돌이 되었다.
특허문헌 1: 대한민국 등록특허 10-0991293
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위하여, 배양 후 IPTG 발현 시 높은 농도의 유 및 무기염류를 혼합 첨가하여 발현 수율을 높이는 방법과 높은 rpm의 shaking 혹은 aeration을 통해 발현 수율을 높이는 방법들을 개발하였으며, 이러한 방법들을 활용하여 그렇지 않은 경우보다 최대 5배 이상의 숙주 보호와 발현 증대를 획득하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 베타 디펜신 단백질의 대량 생산방법 및 베타 디펜신 단백질 생산용 배지 조성물을 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 형질전환 미생물을 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서,
MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 MgCl2 및 CaCl2는 배양 배지 100중량부에 대하여 각각 0.1 ~ 5중량부 및 0.1 ~ 5중량부를 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 더 추가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질은 베타 디펜신 3 및 그 유사체이다.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 IPTG(Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 형질전환 미생물을 세포 사멸로부터 보호 하는방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 더 추가할 수 있다.
본 발명은 또한, MgCl2 및 CaCl2를 포함하는 재조합 단백질 생산용 배양 배지 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 MgCl2 및 CaCl2는 배양 배지 100중량부에 대하여 각각 0.1 ~ 5중량부 및 0.1 ~ 5중량부인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에있어서, 상기 배지에 KCl을 추가할 수 있으며, 배지 100중량부에 대하여 0.1~5중량부로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질 생산용 배양 배지는 트립톤, NaCl, 및 효모 추출물을 포함하는 배지인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배지는 LB 배지 또는 2x YTA 배지일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, MgCl2 및 CaCl2를 포함하는 재조합 단백질 생산시 형질전환 미생물을 세포 사멸로부터 보호하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 MgCl2 및 CaCl2는 조성물 100중량부에 대하여 각각 0.1 ~ 5중량부 및 0.1 ~ 5중량부인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 추가적으로 더 포함할 수 있으며, 비율은 조성물 100중량부에 대하여 0.1~5 중량부이다.
본 발명에 있어서, 상기 각각의 염들을 바람직하게는 동일한 비율로 포함하는 것도 좋다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 KCl, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양시, 배양물을 400~500rpm으로 회전하면서 진탕 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양물에 외부 공기를 제공하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 배지 조성물을 이용하면, 종래에 숙주세포를 이용한 재조합 단백질 생산시 발생하는 숙주세포 사멸(killing-effect)로부터 숙주세포를 보호함으로써, 단백질 발현 증대를 획득할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 베타 디펜신 3H(homolog) 유사체 발현시 숙주 균체량에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 2는 1mM IPTG 5시간 유도된 베타 디펜신 3H의 숙주 단백질 내 발현 비율을 확인한 결과이다.
도 3은 다양한 염처리를 통한 베타 디펜신 3H 발현으로부터 숙주세포의 세포 사멸 보호효과를 확인한 그래프이다.
도 4는 다양한 염처리가 베타 디펜신 3H 발현 비율에 영향을 미치는지 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 다양한 rpm 조건을 가지는 진탕 배양 및 외부 공기 주입에 따른 숙주 세포 사멸 보호효과를 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 베타 디펜신 3 유사체 클로닝시의 발현 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
본 발명은, 일 관점에서, 형질전환 미생물을 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 방법에 있어서, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 배지에 KCl을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 다른 관점에서, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 형질전환 미생물을 세포 사멸로부터 보호 하는방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 배양 배지에 KCl을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서의 형질전환 미생물을 이용한 재조합 단백질 생산방법은, 일반적으로 본 기술분야에 알려져 있는 것과 같이, 숙주세포를 이용하여 재조합 단백질을 대량 생산할 시에, 목적하는 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 유전자가 포함된 재조합 벡터를 숙주세포 (예컨대, 대장균 등)에 형질전환 시킨 후, 이러한 형질전환된 미생물을 배양 배지에 배양하여 목적 단백질을 수득하는 방식을 의미한다.
특히, 대장균의 경우, 대장균의 빠른 증식, 높은 발현 수율의 장점으로 인해 우수한 재조합 단백질 발현시스템으로 이용되고 있다. 그러나, 이러한 목적 단백질이 항균 펩타이드인 경우에, 축적된 단백질 산물이 생산 숙주세포에도 독성을 보일 가능성이 높고, 발현 산물의 독성을 피하기 위해 생산 숙주는 수용액(soluble) 상 단백질을 생산하는 대신 변성된 봉입체 (inclusion body) 단백질로 생산할 가능성이 높다. 또한, 발현 산물의 독성을 피하기 위해서는 생산 숙주는 증대된 단백질 가수분해 활성으로 목적 단백질을 분해할 가능성이 높다는 한계점이 존재한다.
이러한 한계점을 극복하기 위해 기존에는 대장균에서 잘 발생되지 않는 코돈을 대장균에서 흔히 발생되는 코돈으로 대체하거나, 수용액상 발현을 증대시킬 수 있는 다른 단백질과 융합 단백질(fusion protein) 형태로 생산하거나, 혹은 목적 단백질을 여러개 연결적으로 반복시켜(tendem repeat) 발현 정도를 증가시키는 방법들도 이용되어 왔다.
본 발명자들은, 특히, 베타 디펜신 3 유사체 생산시에 발현 숙주에 대한 높은 세포사멸효과(killing effect) 때문에 재조합 단백질 생산이 어려웠던 점을, 특정 염의 처리와 특정 rpm에서의 진탕 배양 및 외부 공기 주입을 통해 해소하고자 했다.
구체적으로, 목적 단백질 생산시에는, 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 포함된 벡터로 형질전환된 형질전환 미생물을 전배양한다. 이때 전배양 조건은, 하기 실시예에 나타난 것으로 제한되지는 않으나, 예컨대 항생제 함유된 LB 배지에서 하룻밤 정도 배양할 수 있다.
상기 LB 배지 이외에도 2x YTA 배지를 사용할 수 있다.
이렇게 전배양한 후에, 동일한 조성의 배지에서 진탕 배양 후에, 목적 단백질의 생산 수율을 높이기 위해, IPTG를 첨가할 수 있다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이, IPTG를 첨가하는 경우 목적 단백질의 발현 수율은 증가되지만, 형질전환된 미생물의 균체량이 상당히 감소하게 된다. IPTG 처리는 0.5~2mM을 처리하고, 처리후 3~8 시간을 배양함으로써 induction하여 발현을 유도하는 것이 목적 단백질 생산 수율 극대화를 위해 적절할 것이다.
이러한 숙주세포의 세포 사멸 효과를 막기 위해서, 본 발명에서는, KCl, MgCl2, 및 CaCl2를 추가적으로 처리하였다. 이러한 염들의 처리는, IPTG를 배양 배지에 처리 전, 또는, IPTG와 동시에 배양배지에 처리, 또는 IPTG를 배양배지에 처리한 후에 처리할 수 있다.
다만 IPTG와 염의 처리 간격이 10분내 인 것이 바람직하며, 처리 후에는 5시간 정도 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는, 상기 방법에서 IPTG와 염 처리 후에 진탕 배양을 3 시간 내지 8시간동안 수행함으로써 숙주세포 사멸로부터의 보호와 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있다.
또한, 본 발명에서는, 상기 방법에서 외부에 공기를 주입함으로써 숙주세포 사멸로부터의 보호와 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있다. 구체적인 조건은, 이에 제한되는 것은 아니나, 에어스톤 및 제균용 필터를 포함한 기포 발생기를 이용해 분당 5~10L의 공기를 목적 단백질을 유도하는 5시간 동안 공급한다.
본 발명에 있어서, 숙주세포로 이용될 수 있는 미생물로는 대장균일 수 있따.
본 발명에 있어서, 상기 KCl, MgCl2 및 CaCl2는 배양 배지 100중량부에 대하여 각각 0.1 내지 5중량부를 첨가할 수 있다.
상기 세가지 염이 동일한 비율로 포함될 수도 있다.
이러한 비율은 단지 바람직한 범위일 뿐이며, 상기 범위 이상에서도 동등 또는 그 이상의 단백질 생산 효과를 낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질은 베타 디펜신 (beta-defensin) 또는 그 유사체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베타 디펜신은 본 출원시 이전에 기술분야에 널리 알려져 있는 물질로, 본 발명의 명세서 배경기술에도 설명된 바 있으며, 특히, 본 발명에서는 베타 디펜신 -1, 베타 디펜신-2, 베타디펜신-3, 베타디펜신-4, 또는 그 유사체(homolog)일 수 있다. 여기서, 유사체란, 인간 베타 디펜신 -1, 2, 3, 4와 동일한 항균활성 구조(세개의 시스테인간 결합구조)를 갖고 높은 서열 상동성(10, 15, 20, 50 내지, 60 내지, 62, 70 내지, 80 내지 ~99.9%)을 보이는 유사체를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 베타디펜신 - 3 의 유사체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 IPTG(Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 형질전환 미생물을 배양할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, MgCl2 및 CaCl2를 포함하는 재조합 단백질 생산용 배양 배지 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 추가적으로 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 KCl, MgCl2 및 CaCl2는 배양 배지 100중량부에 대하여 각각 0.1~5중량부, 0.1~5중량부 및 0.1~5중량부인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 생산용 배양 배지 조성물이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 단백질 생산용 배양 배지는 트립톤, NaCl, 및 효모 추출물을 포함하는 배지인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다른 관점에서, MgCl2 및 CaCl2를 포함하는 재조합 단백질 생산시 형질전환 미생물을 세포 사멸로부터 보호하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 배지에 KCl을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 KCl, MgCl2 및 CaCl2는 조성물 100중량부에 대하여 각각 0.1~5중량부이다.
본 발명에 있어서, KCl, MgCl2 및 CaCl2를 재조합 단백질 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환 미생물을 배양시, 배양물을 400~500rpm으로 회전하면서 진탕 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양물에 외부 공기를 제공하여 배양하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
인간 베타 디펜신 3 유사체 생산에 따른 숙주세포 Kiinge effect 확인
(1) 6His-tag를 갖는 발현 벡터 클로닝
클로닝된 새로운 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)를 재조합 단백질로 발현하기 위한 발현벡터로의 클로닝은, 대한민국 등록특허 10-0991293호의 등록공보에 기재된 제조과정을 기반으로 하여, 다음과 같이 수행하였다. 우선 유전자 서열(서열번호 2로 확인된 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)의 cDNA 서열을 바탕으로 sense와 antisense의 각각 말단에 BamH I과 Nde I 제한효소 인식서열을 함유하는 프라이머를 디자인하고, 상기의 정제된 TA cloning 플라스미드를 주형으로하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 산물을 agarose gel에서 정제한 후, BamHI과 NdeI 제한효소들로 동시 절단하였다. 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)를 pET-41b(+) 단백질 발현용 벡터로 클로닝하기 위하여 pET-41b(+) 벡타를 역시 BamHI과 NdeI 제한효소들로 동시 절단하였다. 이 제한효소 처리 산물을 agarose gel 전기영동 후 제한효소 절단이 확인된 벡터들만을 gel extraction으로 분리 정제하였다. 상기에서 제한 효소 동시 처리 후 준비된 인간 베타 디펜신 3 유사체(beta-defensin 3H)와 pET-41b(+) 단백질 발현용 벡터를 1:1 몰비로 ligation하여 BL21에 형질전환 하였다. 형질전환 시킨 후 kanamycin이 100 ug/ml 농도로 첨가된 LB agar plate에 도말하한 다음 37에서 배양하였다. 잘 자란 콜로니들을 골라 동일 농도의 kanamycin이 함유한 LB배지 10 ml에 접종한 후 37에서 하룻밤 배양하였다. 배양액에서 플라스미드를 정제하고, 정제된 플라스미드를 주형으로 하여 다시 sense primer와 anti-sense primer(서열번호 3 및 서열번호 4)
sense primer: 5'-AGTTATTTGAGGAATTCCAC (서열번호 3),
antisense primer: 5'-TTATTTCTTTCTTCGGCAGCA (서열번호 4)
를 사용한 PCR에서 정확한 PCR product를 보이는 콜로니를 선별하였다. 이 콜로니를 적절히 길러 glycerol을 첨가하여 발현 균주 stock을 만들고, 본 항균 단백질을 생산하는 종균으로 사용하였다. 단백질 발현용 pET-41b(+) 벡터로의 클로닝을 위한 발현벡터의 개열지도는 도 6과 같다.
(2) 단백질 고효율 생산을 위한 염 처리
상기 (1)에서 얻어진 6X histidine tag를 갖는 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)를 함유하는 발현벡터를 갖는 BL21(DE3)를 100 ug/ml 농도의 kanamycin을 함유하는 2X LB 액체 배지 10ml에 접종한 후 30에서 하룻밤 배양하였다(전배양 하였다). 다음날 아침 동일한 농도의 kanamycin을 함유하는 2x LB배지 (조성 tryptone 20 g/liter, NaCl 20 g/liter, yeast extract 10 g/liter) 1L에 배양된 배양액 10 ml을 접종하여 (1/100 접종), 30에서 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 660 nm에서 흡광도가 0.8에 도달하였을 때 최종 농도 1 mM에 해당하는 IPTG (Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 30도에서 5시간 추가로 배양하였다.
(3) 인간 베타 디펜신 3 유사체의 발현시 숙주 killing 효과 확인
(2)에서 설명된 바와 같이, 2X LBK 배지에서 1mM IPTG로 30도 5시간 발현 유도하는 조건을 바탕으로 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H) 발현 유도가 숙주 E. coli의 생존에 미치는 독성의 정도를 확인하였다.
발현 유도 직후 (0.1hrs)와 발현 유도 5시간 후 배양 배지의 optical density (at 600nm)를 비교한 결과, 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)를 유도하기 위해 IPTG를 첨가한 0.1시간 후는 첨가 직전 보다 2% 감소한 98%의 흡광도를 보였으며, 유도 5시간 후는 유도에 의해 발현된 beta-defensin 3H의 숙주 killing effect에 의해 유도 직전의 흡광도에서 14% 감소한 약 86%의 흡광도를 보였다. IPTG를 처리하지 않고 동일한 조건에서 5시간 추가 배양한 대조군에서는 흡광도가 318%로 3배 이상 증가함을 고려하면 beta-defensin 3H 발현에 의한 숙주 균체량 감소를 확인할 수 있었다 (도 1). 비록 재조합단백질 생산 수율을 감소시키는 목적단백질, 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 숙주 killing effect는 확인되었으나 생존한 숙주 균체량으로 부터 목적단백질 발현 비율을 확인한 결과 비교적 높은 양의 beta-defensin 3H가 발현되어 있음을 확인할 수 있었다 (도 2).
인간 베타 디펜신 3 유사체 고발현을 위한 염 처리
(1) 상기 실시예 1에서의 인간 베타 디펜신 3 유사체의 생산에 있어서, 최종 농도 1 mM에 해당하는 IPTG (Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 30도에서 5시간 추가로 배양하였다.
이때 다양한 염의 처리를 통해 목적 단백질인 beta-defensin 3H의 killing effect를 감소시키고 숙주 보호 효과를 유도하기 위하여 IPTG 처리와 함께 적게는 1 ~ 3% 농도 까지의 다양한 조합(표 1)의 염을 처리한다. 추가적으로 12시간 목적 단백질 생산을 유도하면서 1시간 단위로 600nm에서 흡광도를 측정하여 다양한 염의 처리가 발현 숙주의 생존에 미치는 영향을 분석하였다.
(2) 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 발현 비율에는 영향을 주지 않으며 숙주 killing effect가 감소되는 조건을 탐색하기 위해, 1%씩 각각의 염을 단일 혹은 혼합하는 방식으로 2X LB배지에 들어있지 않은 세 가지 상이한 염들을 조합하여 실험한 결과, 다양한 염의 혼합 처리가 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 숙주 사멸 효과를 크게 낮출 수 있음을 확인하였다 (표 1 및 도 3).
다양한 염 조합이 beta-defensin 3H의 발현숙주 생존에 미치는 영향
IPTG 처리군 (무염처리) 대비
상대 숙주 생육도 (흡광도) 비율 (%)
KCl 1% 134±5 %
CaCl2 1% 129±7 %
MgCl2 1% 128±5 %
KCl 2% 165±11 %
CaCl2 2% 160±7 %
MgCl2 2% 163±6 %
KCl 1% + CaCl2 1% 207±9 %
KCl 1% + MgCl2 1% 195±11 %
MgCl2 1% + CaCl2 1% 238±12 %
KCl 1% + MgCl2 1% + CaCl2 1% 245±15 %
구체적으로, 표 1에서 볼 수 있듯이 3종류의 염을 혼합하여 사용하는 경우가 단독으로 사용하는 경우보다 높은 숙주 보호 효과를 확인할 수 있었으며, CaCl2 1%와 MgCl2 1%를 혼합하는 경우와 세종류의 염 모두를 1%씩 혼합하는 경우에서 가장 높은 238±12 %와 245±15 %의 균체가 생존하여 가장 높은 숙주 보호 효과를 확인할 수 있었다 (도 3). 그리고 숙주 보호 효과로 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 숙주 killng effect를 감소시키는 염의 첨가가 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H) 발현 비율 자체에 미치는 영향을 조사하기 위하여 IPTG 발현 이후 동일한 균체량을 샘플로 하여 SDS-PAGE로 조사하였다. Induction 직전 숙주 단백질에서는 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)를 거의 찾아 볼 수 없지만 5시간 induction에서는 크게 증가함을 확인하였다. 다양한 염처리 방법에 따른 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 발현 비율의 차이는 확인되지 않았다 (도 4)
인간 베타 디펜신 3 유사체 고발현을 위한 다양한 rpm 조건 및 aeration 처리
실시예 1에서 제조된 6X histidine tag를 갖는 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)를 함유하는 발현벡터를 갖는 BL21(DE3)를 100 ug/ml 농도의 kanamycin을 함유하는 2X LB 액체 배지 10ml에 접종한 후 30에서 하룻밤 배양하였다(전배양 하였다). 다음날 아침 동일한 농도의 kanamycin을 함유하는 2x LB배지 (조성 tryptone 20 g/liter, NaCl 20 g/liter, yeast extract 10 g/liter) 1L에 배양된 배양액 10 ml을 접종하여 (1/100 접종), 30에서 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 다음날 아침 동일한 농도의 kanamycin을 함유하는 2x LB배지 1L에 배양된 배양액 10 ml을 접종하여 (1/100 접종), 30에서 200 rpm으로 흔들면서 배양하였다. 660 nm에서 흡광도가 0.8에 도달하였을 때 최종 농도 1 mM에 해당하는 IPTG를 첨가하여 30도에서 5시간 추가로 배양하였다. 이때 가장 우수한 숙주 보호 효과를 보이는 염 조합인 KCl 1% + CaCl2 1% + MgCl2 1%를 첨가하였다. 추가적으로 12시간 목적 단백질 생산을 유도하면서 flask shaking의 경우 100 rpm, 200 rpm, 300 rpm, 400 rpm, 그리고 500 rpm의 조건으로 aeration을 증가시켜 숙주 보호 효과를 비교하였다. 외부에서 강제 배기 형태의 aeration의 효과를 실험하기 위하여 미세한 기포의 생성을 위해 에어스톤 및 제균용 filter를 장착한 기포발생기를 설치하고 단백질을 발현하는 5시간 동안 분당 5L의 공기를 제공하여 그 효과를 비교하였다.
더욱 숙주 killing effect를 감소시켜 인간 베타 디펜신 3 유사체 (beta-defensin 3H)의 생산 수율을 증대시키기 위하여, 단백질 발현 및 배양 조건의 주요한 인자인 aeration이 미치는 영향을 다양한 rpm 조건에서 시험하였다. 과도한 aeration의 예로 공기발생기를 활용해 외부에서 직접 aeration을 하는 경우도 그 효과를 확인하였다 (도 5). 실험 결과, 본 배양 induction 과정에서 rpm을 높일 수 록 숙주에 대한 보호 효과가 있음을 확인하였으며, KCl 1% + CaCl2 1% + MgCl2 1%의 처리와 같이 적용할 경우 400rpm, 500rpm, 그리고 외부에서 과도한 양의 aeration을 가하는 조건들에서 대조군 대비 5배 이상의 숙주 보호효과를 유발할 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BIO FD&C <120> Method for mass production of recombinant protein of antibacterial peptide beta-defensin 3 and derivatives thereof <130> 2012-10 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> beta defensin 3 derivative <400> 1 Met Ser Tyr Leu Arg Asn Ser Thr Ser Leu Val Arg Val Pro Lys Ala 1 5 10 15 Phe Leu Lys Pro Phe Arg Val Cys Cys Phe Val Ile Ala Gly His Gly 20 25 30 Gly Ile Ile Asn Thr Leu Gln Lys Tyr Tyr Cys Arg Val Arg Gly Gly 35 40 45 Arg Cys Ala Val Leu Ser Cys Leu Pro Lys Glu Glu Gln Ile Gly Lys 50 55 60 Cys Ser Thr Arg Gly Arg Lys Cys Cys Arg Arg Lys Lys 65 70 75 <210> 2 <211> 231 <212> DNA <213> beta defensin 3 derivative <400> 2 agttatttga ggaattccac aagccttgta cgtgtaccaa aagccttcct aaaacctttc 60 cgtgtgtgct gttttgtcat tgcaggtcat ggaggaatca taaacacatt acagaaatat 120 tattgcagag tcagaggcgg ccggtgtgct gtgctcagct gccttccaaa ggaggaacag 180 atcggcaagt gctcgacgcg tggccgaaaa tgctgccgaa gaaagaaata a 231 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer <400> 3 agttatttga ggaattccac 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer <400> 4 ttatttcttt cttcggcagc a 21

Claims (14)

  1. 서열번호 2의 염기 서열로 표시되는 유전자로 형질전환된 대장균을 이용하여 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 인간 베타 디펜신 3 유사체를 생산하는 방법에 있어서,
    MgCl2 및 CaCl2를 상기 인간 베타 디펜신 3 유사체 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환된 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지에 KCl을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 배지에 IPTG(Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 형질전환된 대장균을 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, KCl, MgCl2 및 CaCl2를 상기 인간 베타 디펜신 3 유사체 생산용 배양 배지에 첨가하여 형질전환된 대장균을 배양시, 배양물을 400~500rpm으로 회전하면서 진탕 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배양물에 공기 공급(aeration)하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.

  8. 삭제
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