KR20170141240A - 성장 및 단백질 생성의 탈결합 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 생물공학 분야, 특히 단백질 발현 분야에 있다. 본 발명은 일반적으로 생성 과정에서 세균 숙주 세포의 관심 단백질의 발현 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 생성 과정 동안 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질을 발현시킴으로써 관심 단백질을 발현하는 상기 세균 숙주 세포의 능력을 개선시킴에 관한 것이다. 상기 생성 과정 동안 상기 관심 단백질의 제조에서 상기 세균 숙주 세포의 성장의 탈결합은 (i) 대사 부담, (ii) 산소 요구, (iii) 대사열 발생을 감소시키고, (iv) 이종 단백질 발현에 의해 야기된 스트레스 반응을 피하며, 이에 의해 상기 관심 단백질을 생성하는 숙주 세포의 능력을 증가시킨다. 본 발명은 또한 단백질 발현을 위한 숙주 세포의 용도, 세포 배양 기술, 및 보다 구체적으로 관심 단백질을 생성시키기 위해 숙주 세포를 배양함에 관한 것이다.

Description

성장 및 단백질 생성의 탈결합
본 발명은 재조합 생물공학 분야, 특히 단백질 발현 분야에 있다. 본 발명은 일반적으로 생성 과정에서 세균 숙주 세포의 관심 단백질의 발현 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 생성 과정 동안 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질을 발현시킴으로써 관심 단백질을 발현하는 상기 세균 숙주 세포의 능력을 개선시킴에 관한 것이다. 상기 생성 과정 동안 상기 관심 단백질의 제조에서 상기 세균 숙주 세포의 성장의 탈결합은 (i) 대사 부담, (ii) 산소 요구, (iii) 대사열 발생을 감소시키고, (iv) 이종 단백질 발현에 의해 야기된 스트레스 반응을 피하며, 이에 의해 상기 관심 단백질을 생성하는 숙주 세포의 능력을 증가시킨다. 본 발명은 또한 단백질 발현을 위한 숙주 세포의 용도, 세포 배양 기술, 및 또한 관심 단백질을 생성시키기 위해 숙주 세포를 배양함에 관한 것이다.
관심 단백질(POI)의 성공적인 생성은 다수의 원핵생물 숙주에 의해 수행되었다. 가장 두드러진 예로는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)과 같은 세균이 있다. 일부 단백질의 수율은 높은 비율로 쉽게 성취되는 반면, 다수의 다른 단백질들은 단지 비교적 낮은 수준으로 생성된다.
대단히 많은 수의 생물학적 약제들(예를 들어 항체 또는 그의 기능성 단편)이 최근 10년간 생성되었으며, 점점 더 많은 수가 인간에서의 사용에 대한 승인에 근접하고 있지만 이들의 효율적인 생성은 여전히 도전적인 임무이다. 치료학적으로 활성인 용량은 종종 투여당 밀리그램(㎎) 정도이다. 따라서, 상당량의 단백질이 활성 성분으로서 필요하며, 이는 효율적이고 비용-효과적인 생성을 가치 있게 만든다.
세균 세포 발현 시스템은 이러한 유형의 분자의 생성을 위해 오랫동안 있어 왔으며 상기 생성의 주요 도구 중 하나이다. 공정 최적화의 핵심적인 목적은 최저의 가능한 비용으로 필요한 품질을 갖는 생성물을 고수율로 성취하는 것이며, 이는 종종 특수한 발현 구조물 또는 시스템의 성질에 의해 결정된다. 예를 들어, 높은 수준의 재조합 단백질 발현은 숙주 세포의 대사 능력을 압도할 수 있으며, 이는 결과적으로 플라스미드 손실, 감소된 산소 전달, 독성 부산물의 생성, 봉입체의 형성, 및/또는 종종 효율적인 단백질 생성을 해치는 스트레스 반응의 촉발을 도출한다. 또한, 때때로 관심 단백질을 암호화하는 mRNA의 고발현이 상기 단백질을 반드시 다량으로 유도하는 것은 아님이 공지되어 있다. 상이한 접근법들이 상기 문제를 다루기 위해 과학자들에 의해 수행되어 왔다.
예를 들어, 재조합 단백질의 발현을, 상기 관심 단백질을 암호화하는 유전자 투여량을 최적화하거나, 적합한 프로모터를 사용하거나, 또는 사용된 숙주 세포에 따라 상기 관심 단백질을 암호화하는 유전자의 코돈 사용을 최적화함으로써 더욱 증가시킬 수 있다. 다수의 다른 매개변수들, 예를 들어 발현 벡터 디자인, 배지 조성, 성장 온도, 샤프롱 동시-발현, mRNA 안정성, 번역 개시 및 후성적 과정이 숙주 세포에서의 재조합 단백질의 발현 수준에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
그러나, 숙주 세포에서 높은 수준의 단백질 수율은 폴딩, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 세포내 수송, 또는 세포로부터의 방출과 같은 하나 이상의 상이한 단계에서 제한될 수 있다. 관련된 기전들 중 다수는 여전히 완전히 이해되고 있지는 않으며, 숙주 유기체의 전체 게놈의 DNA 서열을 입수할 수 있는 경우에조차 최신의 현행 지식을 바탕으로 예측될 수 없다.
숙주 세포에서 단백질 생성에 관한 또 다른 문제는 상기 숙주 세포에 대한 상기와 같은 단백질의 잠재적인 독성이다. 상응하게, 소위 정지(Q)-세포의 개념이 전개되었다(WO 2007/071959). Q-세포에서 정상적인 세포 기전은 중단될 수 있으며 이는 독성 단백질의 생성을 허용한다. Q-세포를 차단시키기 위해서는 인돌을 가해야 한다. 그러나, 일부 용도의 경우, 인돌이 바람직하지 않을 수도 있다. 단지 숙주 세포의 생성 기구를 관심 단백질의 생성을 향해 이동시키는 또 다른 개념은 이. 콜라이에서의 단일 단백질 생성(SSP) 시스템이다. ACA 뉴클레오티드 서열에서 RNA를 절단하는 소위 mRNA 인터페라제(interferase)가 발현되는 반면, 관심 단백질을 암호화하는 mRNA는 ACA 염기 트리플렛이 없다(Suzuki et al. (2007), Nature Protocols 2(7), 1802.1810). 숙주 세포의 대사 능력을 성장보다는 재조합 단백질의 생성을 향하게 하는 추가적인 옵션은, 세포주기 정지를 일으키고 따라서 대사 흐름을 생성물 형성을 향하도록 하기 위해서 RNA 간섭을 이용하는 것이다(Ghosh et al. (2012), Microbial Cell Factories 11:93).
숙주 세포에 잠재적으로 독성인 단백질을 또한 포함하여, 적당량의 단백질 생성에 관한 종래 기술의 다양한 문제들의 경우, 과거 수년을 통해 이루어졌던 많은 장점들에도 불구하고, 잠재적으로 독성인 단백질을 포함한 상당량의 재조합 단백질을 생성하는 숙주 세포의 능력을 개선시키는 추가/대안의 방법을 확인하고 개발할 필요성이 여전히 존재한다. 상응하게, 본 발명에 근원하는 기술적 문제는 상기 요구에 부합하는 것이다.
본 발명은 상기 기술적 문제에 대한 해법으로서 간단하고 효율적이며 산업적인 방법에 사용하기에 적합한, 숙주 세포에서 재조합 단백질의 수율을 증가시키는 신규의 수단 및 방법을 제공한다. 이러한 수단 및 방법은 본 명세서에 기재되며, 실시예에 예시되고, 청구범위에 반영된다.
특히, 본 발명자들은 관심 단백질의 생성으로부터 숙주 세포의 성장을 탈결합(uncouple)하는 신규의 분자 기전을 밝혀내었다. 숙주 세포의 증식 및 이종 단백질의 동시 발현에 의해 야기되는 상기 세포의 이중 부담은 관심 단백질의 수율을 감소시킨다. 실제로, 관심 단백질의 생성 중 숙주 세포의 증식은 상기 숙주 세포에게 과도한 부담을 부과하여 세포 자원의 분배에 갈등을 발생시킨다. 이에 의해 독성 부산물의 생성, 감소된 산소 전달 및 스트레스 반응의 유도와 같은 다수의 불필요한 부작용이 발생하며, 결국 전사 및 번역을 구속하는 세포 대사의 재배향 및 잠재적으로는 세포사가 발생한다. 세포 합성 능력이 이종 단백질 발현의 토대인 경우, 숙주 세포의 능력을 고려해야 한다. 이종 단백질 발현의 불필요한 부작용을 감소시키거나 없애기 위해서, 본 발명자들은 상기 숙주 세포의 증식으로부터 관심 단백질의 생성을 탈결합하고, 이에 의해 숙주 세포에 대한 상기 부담을 상당히 감소시키고 관심 단백질의 수율을 증가시키는 발현 시스템을 개발하였다.
보다 특히, 본 발명자들은 유도성 프로모터의 조절하에서 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질을 포함하는 숙주 세포를 설계함으로써 상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질을 사용한다. 이는 필요한 자원이 존재하는 한 관심 단백질을 생성하는 상기 숙주 세포의 능력을 유지시키면서, 생성 과정 동안 목적하는 세포 밀도에 도달하면 상기 숙주 세포의 증식이 임의로 중지되게 한다. 따라서, 산소 소비, 영양분 요구 및 대사열 발생을 감소시키고, 스트레스 반응을 회피하고, 따라서 상기 관심 단백질의 생성에 충분한 자원을 입수할 수 있다. 이종 단백질 발현의 추가적인 문제는 봉입체 중 상기 관심 단백질의 통합이며, 이는 용해도를 감소시키고 이에 의해 수율이 감소한다. 상기 효과는 버넷(Vernet) 등(2010, Protein Expression and Purification, Vol. 77, Issue 1: 104-111)에 의해 입증된 바와 같은 세포 증식 및 유도 온도의 감소에 의해서 및 따라서 본 발명의 성장 탈결합된 생성 시스템에 의해서 회피될 수 있다.
세포 성장을 억제하는 파지 단백질은 본 발명자들에 의한 숙주 세포의 성장 및 상기 숙주 세포의 관심 단백질 생성의 탈결합에 유용한 것으로 밝혀졌다. 실제로, 상기 파지 단백질은 이상적으로는 상기 숙주 세포를 정지시키는 반면, 상기 파지 단백질에 민감하지 않은 발현 시스템은 이상적으로는 상기 정지된 숙주 세포의 단백질 생성 기구를 충분히 활용할 수 있다. 예를 들어, 박테리오파지 T7은 그의 단백질 gp0.7 및 Gp2를 사용하여 감염후 이. 콜라이 RNA 폴리머라제를 차단시킨다. 감염 직후 T7 프로모터의 조절하에서 바이러스 유전자에 매우 특이적인 T7 RNA 폴리머라제와 같은 박테리오파지 T7의 초기 바이러스 부류 I 유전자가 세균 프로모터의 조절하에서 발현된다. 상기 부류 I 유전자 중에는 Gp0.7이 있으며, 상기는 특히 이. 콜라이 RNA 폴리머라제를 인산화하여 초기 유전자의 전사 종결 및 숙주로부터 바이러스 RNA 폴리머라제로의 전환을 생성시킨다. 후속적으로, 상기 바이러스 유전자 Gp2가 발현되며, 상기 숙주 RNA 폴리머라제의 베타 서브유닛에 결합하여 상기를 추가로 억제한다. Gp0.7 및/또는 Gp2는 함께 이. 콜라이 RNA 폴리머라제를 억제하고 이에 의해 세포 증식을 억제하여, 바이러스용 세균 단백질 합성 기구를 인수한다. Gp2에 의한 이. 콜라이 RNA 폴리머라제의 억제가 스튜디에르와 모팻(Studier and Moffat, 1986, J. Mol. Biol., 189, 113-130)에 의해 입증되었지만, 이들은 세포 증식에 대한 영향은 개시하지 못했다.
여전히, Gp0.7 및 Gp2와 별개로, 추가의 상기와 같은 파지 단백질들을 입수할 수 있으며 이들은 본 발명자들에 의해, 상기와 같은 파지 단백질에 민감하지 않은 발현 시스템을 사용함으로써 관심 단백질을 생성하는 능력으로부터 숙주 세포의 성장을 탈결합하기 위해 파지 단백질을 사용하는 개념을 입증하는데 사용되었다. 추가의 상기와 같은 파지 단백질은 예를 들어 Nun, Gp6, Gp8 또는 A*, 바실러스 파지 SPO1 GP40 GPO1 GP40, 스타필로코커스 파지 G1 GP67, 써무스 써모필루스 파지 P23-45 GP39, 엔테로박테리아 파지 PhiEco32 GP79, 잔토모나스 오리자에 박테리오파지 Xp10 P7 단백질, 엔테로박테리아 파지 T4 Alc 단백질, 엔테로박테리아 파지 T4Asia 또는 바실러스 서브틸리스 ykzG 단백질이며, 이들은 당해 분야에 공지되어 있고 본 명세서에 또한 기재된다.
본 발명자들은, (i) 유도성 프로모터의 조절하에서 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질, (ii) 상기 세균 숙주 세포 중에 존재하지 않는 이종 RNA 폴리머라제 및 (iii) 상기 이종 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 조절하에서 관심 단백질을 포함하는 세균 숙주 세포를 생성시키고, 이에 의해 세포 증식을 억제하고 상기 숙주 세포 능력을 관심 단백질의 생성에 집중시킴을 촉진함으로써 관심 단백질의 생성에 상기 작용 원리를 채택하였다.
본 발명자들은 전형적으로 아라비노스 유도성 프로모터의 조절하에서 박테리오파지 T7 단백질 Gp2를 포함하는 NEB10-베타 이. 콜라이 숙주 세포를 사용하였다. Gp2 발현의 유도시 강한 용량 의존적인 성장 억제가 관찰되었다. 후속으로, 본 발명자들은 T7 프로모터 조절하의 GFP 유전자의 게놈 통합된 사본 및 아라비노스 유도성 프로모터 조절하에 Gp2 유전자를 암호화하는 발현 벡터를 포함하는 이. 콜라이 균주 HMS174(DE3) TN7::<T7GFP>를 사용하였다. 본 발명자들은 GFP의 발현이, 단독으로 GFP만을 발현하는 숙주 세포에 비해 Gp2의 동반 발현시 증가됨을 보일 수 있었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 "하나의" 및 "상기"는 문맥상 달리 명백히 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함함에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "하나의 발현 카세트"에 대한 언급은 본 명세서에 개시된 발현 카세트들 중 하나 이상을 포함하며 "상기 방법"에 대한 언급은, 변형되거나 본 명세서에 기재된 방법들에 대체될 수 있는 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지된 등가의 단계들 및 방법들에 대한 언급을 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 공보 및 특허는 내용 전체가 참고로 인용된다. 상기 참고로 인용된 자료가 반박되거나 본 명세서와 일치하지 않는 경우, 본 명세서가 임의의 상기와 같은 자료를 대체할 것이다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소들에 선행하는 "적어도"란 용어는 상기 일련의 모든 요소를 언급하는 것으로 이해해야 한다. 당해 분야의 숙련가들은 통상 이하의 실험을 사용하여 본 명세서에 기재된 발명의 특정한 실시태양들에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기와 같은 등가물들을 본 발명에 포함하고자 한다.
본 명세서 및 하기의 청구범위 전체를 통해, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다"란 단어 및 "포함하는" 및 "포함하여"와 같은 어미변화들은 서술된 완전체 또는 단계, 또는 완전체들 또는 단계들의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 완전체 또는 단계 또는 완전체들 또는 단계들의 그룹의 제외는 아님을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에 사용시 "포함하는"이란 용어는 "함유하는"이란 용어로 대체되거나 또는 때때로 본 명세서에 사용시 "갖는"이란 용어로 대체될 수 있다.
본 명세서에 사용시 "로 이루어지는"은 청구항 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 제외한다. 본 명세서에 사용시 "로 본질적으로 이루어지는"은 청구항의 기본 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 제외하지 않는다. 본 명세서에서 각각의 경우에 "포함하는", "로 필수적으로 이루어지는" 및 "로 이루어지는"이란 용어들 중 어느 하나를 다른 2개의 용어 중 어느 하나로 대체할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "약" 또는 "대략적으로"란 용어는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 및 보다 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 상기는 또한 구체적인 숫자를 포함한다, 예를 들어 약 20은 20을 포함한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학기술 용어들은 당해 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 의미들을 가질 것이다. 더욱이, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 발명의 방법 및 기법을 일반적으로는 당해 분야에 주지된 통상적인 방법에 따라 수행한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화의 기법들과 관련하여 사용되는 명명법들은 당해 분야에 주지되고 통상적으로 사용되는 것들이다.
본 발명의 방법 및 기법을 달리 나타내지 않는 한 일반적으로 당해 분야에 주지된 통상적인 방법에 따라, 본 명세서 전체를 통해 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌들에 기재된 바와 같이 수행한다. 예를 들어 하기의 참고문헌들을 참조하시오: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, J, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I 1976 CRC Press; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II 1976 CRC Press. 본 명세서에 기재된 분자 및 세포 생물학, 단백질 생화학, 효소학 및 의학 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이들의 실험 과정 및 기법은 당해 분야에 주지되고 통상적으로 사용되는 것들이다.
다수의 문서들이 본 명세서의 본문 전체를 통해 인용된다. 본 명세서에 인용된 문서들(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조사의 명세서, 설명서 등을 포함하여)(상기 또는 하기의)은 각각 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 본 명세서에서 본 발명이 선행 발명에 의해 상기와 같은 명세를 선행할 자격이 주어지지 않음을 인정하는 것으로서 해석되어야 하는 것은 없다.
본 발명은 일반적으로 생성 과정에서 숙주 세포로부터 관심 단백질의 발현 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 생성 과정 동안 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질을 발현시킴으로써 관심 단백질을 발현하는 상기 세균 숙주 세포의 능력을 개선시킴에 관한 것이다. 상기 생성 과정 동안 상기 관심 단백질의 제조에서 상기 세균 숙주 세포의 성장의 탈결합은 (i) 대사 부담, (ii) 산소 요구, (iii) 대사열 발생을 감소시키고, (iv) 이종 단백질 발현에 의해 야기된 스트레스 반응을 피하며, 이에 의해 상기 관심 단백질을 생성하는 숙주 세포의 능력을 증가시킨다. 본 발명은 또한 단백질 발현을 위한 숙주 세포의 용도, 세포 배양 기술, 및 또한 관심 단백질을 생성하기 위해 숙주 세포를 배양함에 관한 것이다.
상응하게, 본 발명의 목적은
(i) 유도성 프로모터의 조절하에서 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
(ii) 상기 세균 숙주 세포에 이종인 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
(iii) 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 조절하에서 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는
세균 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 핵산이 도입된, 즉 유전자-조작된 임의의 원핵생물 세포를 지칭한다. 원핵생물 숙주 세포의 바람직한 예는 이. 콜라이이다. 그러나, 또한 슈도모나스 종, 살모넬라 종, 바실러스 종, 락토바실러스 종, 코리네박테리움 종, 미크로박테리움 종 또는 액티노마이세테스 종이 고려된다. 상기와 같은 용어가 특정한 피실험 세포뿐만 아니라 상기와 같은 세포의 자손을 지칭하고자 함은 물론이다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 다음 세대에서 몇몇 변형이 발생할 수도 있기 때문에, 상기와 같은 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지는 않으나, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "숙주 세포"란 용어의 범위내에 여전히 포함될 수 있다. 재조합 숙주 세포는 바람직하게는 배양물 중에서 성장된 단리된 세포일 수 있다.
바람직한 실시태양 또는 본 발명에서 상기 세균 숙주 세포는 이. 콜라이이다.
숙련가는 본 발명의 세균 숙주 세포를 생성시키기 위해 당해 분야에 공지된 유전공학 기법을 알고 있다. 예를 들어, 무작위화되거나 표적화된, 세균 게놈내로 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 통합시키기 위한 세균 숙주 세포의 유전 공학에 이용가능한 다양한 키트를 입수할 수 있다. 예를 들어 하기의 문헌들을 참조하시오: Zhang et al. (1998), Nature Genetics 20, 123-128 또는 Sharan et al. (2009), Nature Protocols 4(2), 206-223. 숙련가는 또한 세균 숙주 세포의 형질전환 기법뿐만 아니라 플라스미드, 코스미드, bac미드 등과 같은 염색체외 요소의 생성에 사용될 수 있는 임의의 다른 클로닝 기법을 알고 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 숙주 세포의 "성장"이란 용어는 세포분열로 인한 세포수의 증가를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 프로모터 서열은 바람직하게는 발현 카세트의 암호화 서열의 시작 가까이에 삽입되어 그의 발현을 조절하는 비-암호화 발현 조절 서열이다. 가장 간단하지만 기본적으로 정확한 방식으로 삽입되는 경우 이는 상기 프로모터와, 주어진 암호화 서열이 전사되고 결국 유전자에 의해 암호화된 실제 단백질로 번역될 수 있는지의 여부를 결정하는 전사 인자라 칭하는 다양한 분화 단백질과의 상호작용이다. 당해 분야의 숙련가는 임의의 적합한 프로모터가 숙주 세포에서의 재조합 발현에 사용될 수 있음을 알 것이다. 상기 프로모터 자체는 상류 활성화 서열, 인헨서 서열 또는 이들의 조합이 선행될 수 있다. 이들 서열은 세포에서 강한 전사 활성을 나타내고 세포외 또는 세포내 단백질을 암호화하는 유전자로부터 유래되는 임의의 DNA 서열인 것으로서 당해 분야에 공지되어 있다. 또한 당해 분야의 숙련가는 종결 및 폴리아데닐화 서열이 적합하게는 상기 프로모터와 동일한 공급원으로부터 유래할 수 있음을 알 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "유도성 프로모터"란 용어는 내인성 또는 외인성 자극의 존재 또는 부재에 반응하여 작동적으로 연결된 유전자 또는 기능성 RNA의 발현을 조절하는 프로모터를 지칭한다. 상기와 같은 자극은 비제한적으로 화학적 화합물 또는 환경 신호일 수 있다.
"작동적으로 연결된" 발현 조절 서열은 상기 발현 조절 서열이 발현 카세트와 연속적인 결합뿐만 아니라 상기 발현 카세트의 발현 조절과 트랜스로 또는 떨어져서 작용하는 발현 조절 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 분자"란 용어는 대개는 하나의 데옥시리보스 또는 리보스로부터 또 다른 것에 연결되는 중합체성 형태의 뉴클레오티드(즉 폴리뉴클레오티드)를 지칭한다. "뉴클레오티드 서열"이란 용어는 바람직하게는 DNA 또는 RNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 RNA(리보뉴클레오티드 함유), cDNA, 게놈 DNA 및 합성 형태의 센스 및 안티센스 가닥 모두 및 이들의 혼합된 중합체를 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가들에 의해 쉽게 이해되는 바와 같이, 상기는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형되거나 또는 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 표지물, 메틸화, 천연 뉴클레오티드 중 하나 이상의 유사체에 의한 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 하전되지 않은 결합(예를 들어 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등), 하전된 결합(예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 부분(예를 들어 폴리펩티드), 삽입제(예를 들어 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이터, 알킬화제, 및 변형된 결합(예를 들어 알파 아노머성 핵산 등)을 포함한다. 또한 수소 결합 및 다른 화학적 상호작용을 통해 지정된 서열에 결합하는 능력에 있어서 폴리뉴클레오티드를 모방하는 합성 분자가 포함된다. 상기와 같은 분자들은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 펩티드 결합이 상기 분자의 주쇄 중 포스페이트 결합을 대체하는 것들을 포함한다.
이에 관하여, 발현산물인 핵산은 바람직하게는 RNA인 반면, 세포내에 도입되는 핵산은 바람직하게는 DNA, 예를 들어 게놈 DNA 또는 cDNA이다.
상기 핵산은 임의의 위상적인 입체구조로 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산은 단일가닥, 이중가닥, 삼중가닥, 사중가닥, 부분 이중가닥, 분지된, 헤어핀, 환상 또는 패들락 입체구조로 존재할 수 있다.
"폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산들의 중합체를 포함하는 분자를 지칭한다. 상기 용어는 본 명세서에서 상기 분자의 특정한 길이를 언급함을 의미하는 것이 아니며, 따라서 본 명세서에서 "단백질"이란 용어와 호환 가능하게 사용된다. 본 명세서에서 사용시, "폴리펩티드" 또는 "단백질"이란 용어는 또한, 발현 카세트 또는 벡터에 의해 발현되거나 또는 본 발명의 숙주 세포로부터 단리될 수 있는 "관심 폴리펩티드" 또는 "관심 단백질"을 포함한다. 관심 단백질은 또한 숙주 세포에 잠재적으로 유해하거나 또는 심지어 독성일 수도 있는 단백질을 포함한다.
관심 단백질의 예는 효소, 보다 바람직하게는 녹말분해 효소, 지방분해 효소, 단백질분해 효소, 세포분해 효소, 옥시도리덕타제 또는 식물 세포-벽 분해 효소; 및 가장 바람직하게는 아미노펩티다제, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카보하이드라제, 카복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 큐티나제, 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제, 데옥시리보뉴클레아제, 에스테라제, 갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, 할로페록시다제, 헤미셀룰라제, 인베르타제, 이소머라제, 락카제, 리가제, 리파제, 라이아제, 만노시다제, 옥시다제, 펙티나제, 페록시다제, 피타제, 페놀옥시다제, 폴리페놀옥시다제, 프로테아제, 리보뉴클레아제, 트랜스퍼라제, 트랜스글루타미나제, 및 자일라나제로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 활성을 갖는 효소이다. 더욱 또한, 관심 단백질은 또한 성장인자, 사이토킨, 수용체, 수용체 리간드, 치료 단백질, 예를 들어 인터페론, BMP, GDF 단백질, 섬유아세포 성장인자, 펩티드, 예를 들어 단백질 억제제, 막 단백질, 막-결합된 단백질, 펩티드/단백질 호르몬, 펩티드 독소, 펩티드 항독소, 항체 또는 그의 기능성 단편, 예를 들어 Fab 또는 F(ab)2 또는 항체의 유도체, 예를 들어 이중특이성 항체(예를 들어 scFv), 키메릭 항체, 인간화된 항체, 단일 도메인 항체, 예를 들어 나노바디 또는 도메인 항체(dAb) 또는 안티칼린 등일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "폴리펩티드"는 천연 및 비천연 단백질 모두, 및 그의 단편, 돌연변이체, 유도체 및 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 숙주 세포에 동종(고유)이거나 또는 이종인 폴리펩티드일 수 있다. 관심 폴리펩티드는 또한 숙주 세포에 고유한 폴리펩티드를 포함하며, 이는 핵산 서열에 의해 암호화되고, 그의 발현은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 외래인 하나 이상의 조절 서열에 의해 조절된다. 폴리펩티드는 임의의 길이를 가질 수 있다. 폴리펩티드는 임의의 활성 또는 생물활성을 갖는 단백질 및/또는 펩티드를 포함한다. "펩티드"는 유사체, 및 구조 및 따라서 생물학적 기능을 모방하는 유사물질을 포함한다.
폴리펩티드는 이량체, 삼량체 및 보다 고차의 올리고머, 즉 하나 초과의 폴리펩티드 분자로 이루어지는 올리고머를 추가로 형성할 수 있다. 상기와 같은 이량체, 삼량체 등을 형성하는 폴리펩티드 분자는 동일하거나 동일하지 않을 수도 있다. 상응하는 보다 고차의 구조는 결과적으로 동종- 또는 이종이량체, 동종- 또는 이종삼량체 등으로 지칭된다.
더욱이, 폴리펩티드는 다수의 상이한 도메인을 포함할 수 있으며, 이들은 각각 하나 이상의 독특한 활성을 갖는다.
본 발명의 단백질 또는 관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 임의의 원핵생물, 진핵생물 또는 다른 공급원으로부터 획득할 수 있다.
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 단백질 또는 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 프로모터에 의해 조절된다. 상기 프로모터는 바람직하게는 상기 숙주 세포에 대해 이종이고 발현이 유도성일 수 있는 RNA 폴리머라제에 의해 특이적으로 전사된다. 그러나, 상기 RNA 폴리머라제는 또한 구성적으로 (constitutively) 발현될 수도 있다.
본 명세서에 사용시, "세균 숙주 세포의 성장"이란 용어는 숙주 세포가, 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질을 발현하지 않고 상기 세균 숙주 세포에 대해 이종인 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 조절하에서 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포에 비해 그의 성장이 적어도 손상됨을 의미한다. 현저하게, 상기는 그럼에도불구하고 상기 파지 단백질을 발현하지 않는 상기와 같은 숙주 세포가 유도성 프로모터의 조절하에서 상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함함은 제외하지 않는다. 실제로, 상기와 같은 숙주 세포는 예를 들어 이전에 기재한 바와 같이 성장의 장애를 측정하기에 바람직한 참조 세포이다. 달리 말하면, 성장의 장애를 측정해야 하는 경우, 숙련가는 상기 파지 단백질의 발현이 유도될 때의 본 발명의 숙주 세포를 상기 파지 단백질의 발현이 유도되지 않는 때의 상기와 같은 숙주와 쉽게 비교할 수 있다.
"세균 숙주 세포의 성장"이 본 명세서에 기재된 바와 같이 억제되는 경우, 성장은 바람직하게는 전사, DNA-복제 및/또는 세포 분열을 포함한다. 상응하게, 파지 단백질, 특히 본 명세서에 기재된 파지 단백질 중 하나 이상은 전사, DNA-복제 및/또는 세포 분열을 억제하는 것이 바람직하다.
"파지 단백질"은 본 명세서에서 언급될 때 (박테리오)파지로부터의 단백질이다. 파지는 세균을 감염시키며 상기 세균에서 복제가 가능하다. 세균을 감염시키고 상기 세균에서 복제되는 경우 파지는 상기 세균의 단백질 합성 기구를 충분히 활용하기 위해서, 예를 들어 전사, DNA-복제 및/또는 세포 분열을 억제함으로써 상기 세균의 성장을 억제하는 하나 이상의 단백질을 가질 수 있다.
상응하게, 본 발명은 예를 들어 숙주 전사의 차단을 일으킴으로써 상기 세균 숙주 세포의 성장 억제를 실행하는 임의의 파지 단백질로 수행될 수 있다. 이 경우에 상기 세균 숙주 세포는 유도성 프로모터의 조절하에서 상기 세균 숙주 세포의 전사적 차단을 일으키는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "숙주 전사 차단 (host transcription shut-off)"이란 용어는 상기 세균 숙주 세포의 전사의 억제에 관한 것이다. 숙주 전사의 차단을 일으키는데 사용될 수 있는 단백질, 예를 들어 Gp2, GP0.7, Nun, Gp6, Gp8, A*, YkzG 입실론-서브유닛은 본 명세서에 기재되어 있다. 그러나, 숙주 전사 차단을 실행하는 추가의 단백질을 또한 본 발명의 실행에 사용할 수 있다. 상기와 같은 단백질은 예를 들어 바실러스 파지 SPO1 GP40 SPO1 GP40, 스타필로코커스 파지 G1 GP67, 써무스 써모필루스 파지 P23-45 GP39, 엔테로박테리아 파지 PhiEco32 GP79, 잔토모나스 오리자에 박테리오파지 Xp10 P7 단백질, 엔테로박테리아 파지 T4 Alc 단백질, 엔테로박테리아 파지 T4 Asia 단백질이다.
예시적으로, 실시예 1은 도 1과 함께 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 파지 단백질 Gp2의 유도된 발현에 의한 상기 숙주 세포의 전사의 억제가 상기 숙주 세포의 성장을 유도 분자 아라비노스의 함수로서 억제함을 예시한다.
상응하게, 본 발명의 파지 단백질은 바람직하게는
(i) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 단백질,
여기에서 상기 단백질은
(a) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이고;
(ii) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 단백질,
여기에서 상기 단백질은
(a) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이고;
(iii) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 인산화하는 단백질,
여기에서 상기 단백질은
(a) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 인산화하는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 인산화하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이고;
(iv) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 단백질,
여기에서 상기 단백질은
(a) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이고;
(v) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 단백질,
여기에서 상기 단백질은
(a) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이고;
(vi) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 단백질,
여기에서 상기 단백질은
(a) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이고;
(vii) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 단백질,
여기에서 상기 단백질은
(a) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질이고;
(viii) 숙주 전사 차단을 일으키는 단백질,
여기에서 상기 단백질은
(a) 숙주 전사 차단을 일으키는 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
(b) 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 숙주 전사 차단을 일으키는 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시태양에서 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열, 상기 RNA 폴리머라제를 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열, 관심 단백질을 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열을 상기 숙주 세포의 게놈에 통합시키거나 또는 염색체외 벡터에 의해 포함시킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "벡터"란 용어는 본 발명의 유전자 또는 관심 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트가 삽입되거나 클로닝될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 더욱 또한, 상기 벡터는 숙주 세포의 선택을 부여하는 항생제 내성 유전자를 암호화할 수 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 발현 벡터이다.
상기 벡터는 숙주 세포에서 자율 복제가 가능할 수 있다(예를 들어 숙주 세포에서 기능하는 복제의 기원을 갖는 벡터). 상기 벡터는 선형, 환상 또는 초나선 형태를 가질 수 있으며 특정한 목적을 위해서 다른 벡터 또는 다른 물질과 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 유전자 또는 관심 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 발현하기 위해 본 발명에 사용되는 벡터는 대개 발현 카세트의 요소로서 전사 구동에 적합한 전사 조절 요소, 예를 들어 프로모터, 인헨서, 폴리아데닐화 신호, 전사 중지 또는 종결 신호를 함유한다. 상기 폴리펩티드의 적합한 발현을 위해서, 바람직하게는 적합한 번역 조절 요소, 예를 들어 리보솜 및 번역 과정을 종결시키기 위한 정지 코돈을 모집하기에 적합한 5' 캡 구조를 도출하는 5' 비번역 영역을 상기 벡터내에 포함시킨다. 특히, 상기 선택성 마커 유전자로서 제공되는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 적합한 프로모터 중에 존재하는 전사 요소의 조절하에서 전사시킬 수 있다. 상기 선택성 마커 유전자의 생성 전사물 및 상기 관심 단백질의 생성 전사물은 상당한 수준의 단백질 발현(즉 번역) 및 적합한 번역 종료를 촉진하는 기능성 번역 요소를 갖는다.
상기 벡터는 폴리링커(다중 클로닝 부위), 즉 분자 클로닝에 사용되는 다수의 플라스미드상의 표준 특징인 다수의 제한 부위를 함유하는 DNA의 짧은 분절을 포함할 수 있다. 다중 클로닝 부위는 전형적으로 5 초과, 10, 15, 20, 25, 또는 25 초과의 제한 부위를 함유한다. MCS내 제한 부위는 전형적으로 독특하다(즉 상기는 상기 특정한 플라스미드내에 단지 한 번 존재한다). MCS는 분자 클로닝 또는 서브클로닝을 수반하는 과정 동안 통상적으로 사용된다.
한 가지 유형의 벡터는 플라스미드이며, 이는 추가적인 DNA 분절이 결찰을 통해 또는 무-제한 클로닝에 의해 도입될 수 있는 환상 이중 가닥 DNA 고리를 지칭한다. 다른 벡터는 코스미드, 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC) 또는 미니-염색체를 포함한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기에서 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈내에 결찰시킬 수 있다.
본 발명은 또한 숙주 세포 게놈내에 통합될 수 있고 이에 의해 상기 숙주 세포 게놈과 함께 복제되는 벡터에 관한 것이다. 발현 벡터는 사전정의된 제한 부위(형질감염에 앞서 벡터 핵산의 선형화에 사용될 수 있다)를 포함할 수 있다. 숙련가는 게놈내로의 통합 방법을 알고 있다. 예를 들어, 상기 선형화 제한 부위를 어떻게 놓는가가 중요한데, 그 이유는 상기 제한 부위가, 상기 벡터가 개방/선형화되는 곳을 결정하고 따라서 상기 구조물이 숙주 세포의 게놈내에 통합될 때 발현 카세트의 순서/배열을 결정하기 때문이다.
항생제 내성 유전자는 본 발명에 따라, 상응하는 유전자 산물을 발현함으로써 선택 이점(예를 들어 항생제에 대한 내성)을 갖는 형질전환된 세포를 제공하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자 산물은, 상기 유전자 산물이 내성을 부여하는 항생제를 세포 배양 배지에 적용하는 경우 상기 항생제 내성 유전자를 발현하지 않는 세포와 구별될 수 있도록(즉 세포의 선택) 상기 항생제 내성 유전자를 발현하는 세포에 특성을 부여한다. 상기 세포에 대한 유전자 산물에 의한 내성은 상이한 분자 기전(예를 들어 약물의 불활성화, 증가된 유출)을 통해 부여될 수 있다.
본 발명의 유전자 또는 관심 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 DNA 구조물로서 상기 발현 벡터내에 삽입한다. 상기 DNA 구조물은 합성 DNA 분자, 게놈 DNA 분자, cDNA 분자 또는 이들의 조합으로부터 재조합적으로 제조될 수 있다. 상기 DNA 구조물은 바람직하게는 당해 분야에 공지된 표준 기법에 따라 상이한 단편들을 서로 결찰시킴으로써 제조된다.
본 발명의 유전자 또는 관심 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트는 상기 발현 벡터의 부분일 수 있다. 바람직하게, 상기 발현 벡터는 DNA 벡터이다. 상기 벡터는 편의상 상기 관심 단백질을 암호화하는 유전자 및 항생제 내성 유전자의 적합한 발현을 촉진하는 서열들을 포함한다. 이들 서열은 전형적으로는, 비제한적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 프로모터 서열, 전사 개시 부위, 전사 종결 부위, 및 폴리아데닐화 기능을 포함한다.
상기 발현 카세트는 인헨서 및/또는 인트론을 포함할 수 있다. 대개, 인트론은 개방 판독 프레임의 5' 단부에 놓인다. 상응하게, 인트론을, 발현율을 증가시키기 위해서 관심 폴리펩티드 발현을 위한 발현 카세트 중에 포함시킬 수 있다. 상기 인트론을 상기 프로모터 및 또는 프로모터/인헨서 요소 및 발현되는 폴리펩티드의 개방 판독 프레임의 5' 단부 사이에 배치할 수 있다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 다수의 적합한 인트론이 현재의 기술 수준으로 공지되어 있다.
숙주 중에 존재하는 본 발명에 따른 발현 카세트 또는 벡터를 상기 숙주의 게놈내에 통합시키거나 또는 일부 형태로 염색체 외에서 유지시킬 수 있다.
더욱 또한, 상기 발현 카세트는 적합한 전사 종결 부위를 포함할 수 있다. 이는, 제2 전사 유닛을 통해 상류 프로모터로부터 계속되는 전사로서, 하류 프로모터의 기능을 억제할 수 있다(프로모터 폐쇄 또는 전사 간섭으로서 공지된 현상). 상기 사건은 원핵생물 및 진핵생물 모두에서 기술되었다. 2개의 전사 단위 사이의 전사 종결신호의 적합한 배치는 프로모터 폐쇄를 방지할 수 있다. 전사 종결 부위는 충분히 특성화되어 있으며 발현 벡터 중의 그의 통합은 유전자 발현에 다수의 이로운 효과를 갖는 것으로 입증되었다.
본 명세서에 사용된 "5'" 및 "3'"이란 용어는 유전 요소의 위치 및/또는 사건의 방향(5'에서 3'), 예를 들어 5'에서 3' 방향으로 진행하는 RNA 폴리머라제에 의한 전사 또는 리보솜에 의한 번역과 관련된 뉴클레오티드 서열의 특징을 기술하는데 사용되는 규약을 지칭한다. 유의어는 상류(5') 및 하류(3')이다. 통상적으로, 뉴클레오티드 서열, 유전자 지도, 벡터 카드 및 RNA 서열은 좌측에서 우측으로 5'에서 3'으로 작성되거나 또는 5'에서 3' 방향을 화살표로 나타내며, 여기에서 화살표 머리는 3' 방향을 향한다. 상응하게, 상기 규약에 따라, 5'(상류)은 좌측을 향해 위치한 유전 요소를 가리키고, 3'(하류)은 우측을 향해 위치한 유전 요소를 가리킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "발현"이란 용어는 뉴클레오티드 서열의 전사를 의미한다. 상기 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 단백질을 암호화한다. 상응하게, 상기 용어는 또한 mRNA의 생성(뉴클레오티드 서열로부터 전사 산물로서) 및 상응하는 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질을 생성시키는 상기 mRNA의 번역을 포함한다.
상기 RNA 폴리머라제는 유리하게는 상기 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세균 숙주 세포에 이종이다. "이종"은 상기 RNA 폴리머라제가 상기 세균 숙주 세포 중에 자연적으로 존재하지 않음, 즉 상기 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 당해 분야에 공지된 수단 및 방법에 의해 본 발명의 교시에 따라 상기 세균 숙주 세포에 도입시키지 않는 한, 상기 세균 숙주 세포가 상기 RNA 폴리머라제를 자연적으로 포함하지 않음을 의미한다. 따라서 상기 RNA 폴리머라제는 이상적으로는 상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질에 민감하지 않다.
바람직하게, 상기 RNA 폴리머라제는 박테리오파지 T3 RNA 폴리머라제, T7 박테리오파지 RNA 폴리머라제, 조작된 직교 (orthogonal) T7 RNA 폴리머라제, 박테리오파지 SP6 RNA 폴리머라제 또는 박테리오파지 Xp10 RNA 폴리머라제이다. 추가의 RNA 폴리머라제, 예를 들어 조작된 직교 T7 폴리머라제가 문헌[Temme et al. (2012), Nucleic Acids Research 40(17), 8773-8781]에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서 상기 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 유도성 또는 구성적 프로모터의 조절하에 있다. 유도성 프로모터의 예는 본 명세서에, 상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 조절하는 유도성 프로모터와 관련하여 기재된다. 상기 유도성 프로모터는 또한 본 명세서에서 하기에 기재하는 바와 같이 RNA 폴리머라제를 조절하는 유도성 프로모터에 대해 바람직한 예이다.
바람직하게, 상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 조절하는 유도성 프로모터는 아라비노스, IPTG, 트립토판, 자일로스, 람노스, 포스페이트 또는 파지 람다 cl 단백질에 의해 조절된다.
상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 조절하거나 또는 상기 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 조절하는 유도성 프로모터에 관하여, 동일한 유도성 프로모터를 적용하는 것이 바람직하다. 바람직한 예들이 본 명세서에 기재되어 있다. 상기 바람직한 실시태양은 성장 및 단백질 생성을 탈결합하기 위해서 상기 파지 단백질 및 RNA 폴리머라제의 발현을 동시에 유도할 수 있게 한다. 그러나, 물론, 또한 상이한 유도성 프로모터들을 본 발명의 교시에 따라 사용할 수 있다.
상기 세균 숙주 세포의 바람직한 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 비-기능성 아라비노스 오페론을 갖는다.
본 발명은 또한
(i) 유도성 프로모터의 조절하에서 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
(ii) 상기 세균 숙주 세포에 이종인 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는
세균 숙주 세포 제제를 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "세균 숙주 세포 제제"는 유리하게는 완전한, 살아있는 세균 숙주 세포가 없지만 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 전사 및 번역하는 능력을 가지며, 이에 의해 상기 뉴클레오티드 서열이 프로모터의 조절하에서 상기 제제가 유래되는 상기 세균 숙주 세포에 대해 이종인 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 임의의 제제이다. 상기와 같은 제제를 예를 들어 세균 숙주 세포의 순한 용해에 의해 또는 상기와 같은 세균 숙주 세포에 프렌치 프레스를 가하는 것과 같은 기계적 힘에 의해 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 세균 숙주 세포를 본 명세서에 정의된 바와 같이 상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환시킴을 포함하는, 상기 숙주 세포의 생성 방법을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "형질전환"이란 용어는 뉴클레오티드 서열을 도입시킴에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변경을 의미한다. 상기 뉴클레오티드 서열은 반드시 상이한 공급원으로부터 기원할 필요는 없지만, 어느 시점에서 상기를 도입시켜야 하는 세포에 대해 외부에 있을 것이다.
추가의 태양에서 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 세균 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양하고 관심 단백질을 수득함을 포함하는, 상기 관심 단백질의 생성 방법을 포함한다.
본 발명의 숙주 세포에서 폴리펩티드를 생성시키는 다수의 적합한 방법들이 당해 분야에 존재한다. 편의상, 상기 생성된 단백질을 배양 배지, 배양된 숙주 세포의 용해물 또는 단리된(생물학적) 막으로부터 확립된 기법에 의해 수확한다. 예를 들어, 특히 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 PCR에 의해 합성하고 발현 벡터내에 삽입할 수 있다. 후속으로, 세포를 상기 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 그 후에, 상기 세포를 배양하여 목적하는 단백질(들)을 생성/발현시키고, 이를 단리 및 정제한다. 예를 들어, 상기 생성물을 비제한적으로 세포 용해, 숙주 세포 파괴, 원심분리, 여과, 한외여과, 추출, 증발, 분무 건조 또는 침전을 포함하는 통상적인 과정에 의해 상기 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수할 수 있다. 정제를 당해 분야에 공지된 다양한 과정들, 예를 들어 비제한적으로 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기영동 과정(예를 들어 예비 등전점 포커싱), 차동 용해도(예를 들어 암모늄 설페이트 침전) 또는 추출에 의해 수행할 수 있다.
"관심 단백질의 단리"는 도입된 벡터의 발현 도중 또는 상기 발현 후 생성된 관심 단백질의 분리를 지칭한다. 발현 산물로서 단백질 또는 펩티드의 경우에, 상기 단백질 또는 펩티드는 상기 단백질이 기능성이기 위해 필요하고 충분한 서열과 별개로, 추가적인 N- 또는 C-말단 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기와 같은 단백질을 융합 단백질이라 칭한다.
관심 폴리펩티드를 본 발명의 숙주 세포에서 발현시키는 경우, 상기 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도를 충족시키기 위해서 뉴클레오티드 서열의 코돈 사용을 적합화함으로써 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 변형시킬 필요가 있을 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "바람직한 코돈 사용의 빈도"는 주어진 아미노산을 명시하기 위한 뉴클레오티드 코돈의 사용에서 본 발명의 숙주 세포에 의해 나타난 선호를 지칭한다. 유전자 중 특정 코돈의 사용 빈도를 측정하기 위해서, 상기 유전자 중 상기 코돈의 존재수를 상기 유전자 중 동일한 아미노산을 명시하는 모든 코돈의 전체 존재수로 나눈다. 유사하게, 숙주 세포에 의해 나타난 바람직한 코돈 사용 빈도를, 상기 숙주 세포에 의해 발현되는 다수의 유전자 중의 바람직한 코돈 사용 빈도를 평균함으로써 산정할 수 있다. 상기 분석을 상기 숙주 세포에 의해 고도로 발현되는 유전자로 제한하는 것이 바람직할 수 있다. 숙주 세포에 의해 사용되는 코돈 사용 빈도로부터의 합성 유전자에 대해 바람직한 코돈 사용 빈도의 편차율은 먼저 상기 숙주 세포의 경우로부터의 단일 코돈의 사용 빈도의 편차율을 측정한 다음 모든 코돈에 대한 평균 편차를 획득함으로써 산정된다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 상기 산정은 특유의 코돈(즉 ATG 및 TGG)을 포함한다.
태그를 사용하여 관심 단백질의 정체 및/또는 정제를 허용할 수 있다. 상응하게, 관심 단백질은 태그를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서, 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 또한, 상기 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 유리하게 인프레임 유전자 융합되는 태그를 암호화한다. 상기 태그는 상기 관심 단백질의 C- 또는 N-말단에 있을 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 태그의 예는 비제한적으로 HAT, FLAG, c-myc, 헤마글루티닌 항원, His(예를 들어 6xHis) 태그, 플래그-태그, 스트렙-태그, 스트렙II-태그, TAP-태그, 키틴 결합 도메인(CBD), 말토스-결합 단백질, 면역글로불린 A(IgA), His-6-태그, 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 태그, 인테인 및 스트렙트아비딘 결합 단백질(SBP) 태그를 포함한다.
추가의 실시태양에서 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 세균 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양하고 관심 단백질을 수득함을 포함하는, 상기 관심 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "수율"이란 용어는 예를 들어 재조합 숙주 세포로부터 수확되는 관심 단백질의 양을 지칭하며, 증가된 수율은 상기 숙주 세포에 의한 상기 관심 단백질 또는 모델 단백질의 증가된 생성 또는 분비량에 기인할 수 있다. 수율을 숙주 세포의 단백질 ㎎/바이오매스 g(건조 세포 중량 또는 습윤 세포 중량으로서 측정됨)에 의해 나타낼 수 있다. "역가"란 용어는 본 명세서에 사용시, 유사하게 단백질 g/배양 브로쓰(세포 포함) L로서 나타내는, 생성된 관심 단백질 또는 모델 단백질의 양을 지칭한다. 수율의 증가를, 상기 수율이 재조합 숙주 세포로부터 획득된 경우, 생성 과정 동안 일시적으로 억제된 상기 세포의 증식을, 증식이 변형되지 않은 숙주 세포로부터 획득된 수율에 비교하여 측정할 수 있다.
예시적으로, 실시예 3은 도 3과 함께 파지 단백질 Gp2의 유도된 발현이 모델 단백질 GFP의 증가된 발현을 생성시킴을 예시한다.
바람직하게, 본 명세서에 기재된 방법은
(a) 세균 세포를 적어도 20 g/L 세포 건조 질량(CDM)의 밀도로 증식시키고;
(b) 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하고;
(c) 0.05 h-1의 초기 성장률을 허용하는 일정한 선형 급식율로 세균 세포를 급식시키고;
(d) 상기 세균 세포를 적어도 12시간 동안 추가로 배양하는
배양 단계를 포함한다.
추가의 바람직한 실시태양에서 본 발명은 세균 숙주 세포에 이종인 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(상기 뉴클레오티드 서열은 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 조절하에 있다)을 포함하는 세균 숙주를, 유도성 프로모터의 조절하에서 상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환시킴을 포함하는, 상기 관심 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 포함한다.
관심 단백질의 생성 방법은 적합한 조건하에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 제제를, 본 명세서에 정의된 바와 같은 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 조절하에서 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열과 접촉되게 함을 포함한다.
더욱 또한, 본 명세서에 기재된 방법은, 세포에 독성이고, 생존력, 세포 성장 및/또는 세포분열에 불리한 영향을 미치는 관심 단백질에 관한 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "독성"이란 용어는 관심 단백질 또는 그의유도체 또는 그의 전구체가 그의 발현시 숙주 세포에 불리한 영향을 미치거나 또는 상기 숙주 세포에 불리한 영향을 미치는 유도체로 대사됨을 의미한다. 불리한 영향의 예는 성장 억제이다. 상기 용어는 또한 상기 숙주 세포의 사망을 포함한다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 방법은 관심 단백질을 변형시키고/시키거나 상기 관심 단백질을 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함하는 조성물로 제형화함을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "관심 단백질을 변형시킴"이란 용어는 비제한적으로 또 다른 단백질과의 융합, 표지물의 부가, 관심 단백질의 절두, 번역후 변형, 예를 들어 아세틸화, 글루코실화, 비오틴화, 산화, 뉴클레오티드 부가, 아미드화, 아미노산 부가, 알킬화, 팔미토일화 등의 부가, 관심 단백질의 가교결합, 관심 단백질의 화학적 변형, 예를 들어 peg화, 아민의 설프히드릴로의 전환, 설프히드릴기의 차단 등일 수 있다. "표지물"은 형광 표지, 생물발광 표지물, 방사성 표지물, 효소 표지물 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 방법을 관심 단백질에의 화합물의 통합에 의한 상기 관심 단백질의 변형에 사용할 수 있음이 고려된다. 상기 화합물의 통합을 상기 관심 단백질의 표지화에 사용할 수 있다. 이는 특히 단백질 구조 분석에 유용할 수 있다. 상기 화합물에 대한 예는 C12, N15, D2O 또는 이들의 임의의 조합이다. 본 발명의 방법은 상기 화합물이, 관심 화합물의 생성에 독점적으로 사용될 것이나 세포 단백질의 생성에는 사용되지 않을 것이라는 이점을 제공한다. 따라서, 관심 단백질의 표지화에 보다 적은 표지화 화합물이 필요할 것이다.
더욱 또한, 본 발명의 방법을, 비-정규 아미노산의 관심 단백질에의 통합에 의한 상기 관심 단백질의 변형에 사용할 수 있다. 상기와 같은 비-정규 아미노산의 일례는 플루오로 아미노산(예를 들어 4-플루오로-L-쓰레오닌)이며, 이를 관심 단백질의 플루오르화에 사용할 수 있다. 비-정규 아미노산을, 하나 이상의 정규 아미노산의 그의 비-정규 유사체에 의한 잔기-특이적 치환 또는 관심 단백질의 암호화 서열에의 앰버 정지 코돈 인-프레임 삽입에 의한 부위-특이성에 의해 상기 단백질에 전체적으로 통합시킬 수 있다. 상기 앰버 정지 코돈은 직교 tRNA에 의해(예를 들어 오-아실화된 억제인자 tRNA에 의해) 인식되며, 여기에서 상기 직교 tRNA는 우세하게는 직교 tRNA 합성효소에 의해 비-정규 아미노산으로 충전된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "관심 단백질의 조성물로의 제형화"란 용어는 상기 관심 단백질을, 예를 들어 상기 관심 단백질을 분해, 변성, 가혹한 환경 또는 프로테아제에 의한 가수분해로부터 보호하거나 또는 상기 관심 단백질을 희석하거나, 또는 환자에게 약물로서 투여시 상기 관심 단백질의 약제 활성을 개선시키거나 또는 제조 공정에 이로운 하나 이상의 성분 등과 혼합함을 의미한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 관심 단백질을 표지물로 변형시킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "표지물"이란 용어는 비제한적으로 태그, 예를 들어 비오틴, 스트렙-태그 II, FLAG-태그, HA-태그, Myc-태그, 폴리(His)-태그, 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), 키틴 결합 단백질(CBP) 등, 또는 형광 탐침, 예를 들어 GFP, RFP, BFP, YFP, mCherry, FITC, TRITC, DyLight 플루오르, PE, 양자점, 알렉사 플루오르 등, 또는 효소, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 페록시다제, 글루코스 옥시다제, 베타-글락토시다제 등, 또는 활성 부위 탐침, 예를 들어 데스티오비오틴-FP 세린 하이드롤라제 탐침 등일 수 있다.
관심 화합물의 생성 방법은 세균 숙주 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같이 배양하고 상기 관심 단백질의 생성을 위해 상기 세균 숙주 세포에 의해 전환되고/되거나 사용되는 화합물을 부가함을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "관심 화합물"이란 용어는 비제한적으로 플라스틱용, 예를 들어 비사이클로[3.2.0]-헵트-2-엔-6-온에서 락톤, 알콜로의 전환, 예를 들어 프로키랄 카보닐 화합물에서 키랄로의 전환, 페룰산에서 코니페릴 알데히드에서 코니페릴 알콜로의 전환, 또는 유제놀에서 페룰산에서 코니페릴 알콜에서 바닐린으로의 전환을 위한 전구체 또는 구성블록 분자일 수 있다.
본 발명은 또한 관심 단백질의 생성을 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 숙주 세포 또는 제제의 용도에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서 본 발명은 관심 단백질의 수율을 증가시키기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 숙주 세포 또는 제제의 용도에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서 본 발명은 숙주 세포에서 관심 단백질의 수율을 증가시키기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 파지 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 파지 단백질의 용도로, 여기에서 관심 단백질은 T7 프로모터의 조절하에 있으며 숙주 세포는 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
도 1: Gp2의 유도된 발현은 이. 콜라이 균주 NEB10-베타의 숙주 세포 성장을 용량-의존적인 방식으로 억제한다.
Gp2 암호화 서열을 아라비노스-유도성 프로모터의 조절하에서 저-사본 f-플라스미드 pKLJ12(Jones and Keasling(1998), Biotechnol Bioengineer 59: 659-665)에 클로닝하였다. 상기 플라스미드 pKLJ12+Gp2를 araD139 돌연변이를 포함하는 이. 콜라이 균주 NEB10-베타에서 형질전환시켰다. 결과적으로, NEB10-베타는 유도인자 아라비노스를 대사할 수 없다. 상이한 농도의 아라비노스의 부가 및 이에 의한 Gp2의 발현은 증식의 억제를 용량-의존적인 방식으로 일으킨다.
도 2: 아라비노스의 부가는 숙주 세포 성장에 영향을 미치지 않는다.
숙주 세포 성장에 대한 화합물 아라비노스의 어떠한 영향도 배제하기 위해서, Gp2 발현 카세트의 리보솜 결합 부위가 없는 플라스미드 pKLJ12+Gp2의 유도체를 사용하였다. 결과적으로, Gp2의 발현은 유도될 수 없으며 따라서 아라비노스의 존재 또는 부재하에서의 증식의 차이는 관찰되지 않았다.
도 3: Gp2의 유도된 발현은 모델 단백질 GFP의 발현 수준을 증가시킨다.
T7 프로모터 조절하에 GFP 암호화 서열 및 IPTG-유도성 프로모터 조절하에 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 이. 콜라이 균주 HMS174(DE3) TN7::<T7GFP>를 아라비노스-유도성 프로모터의 조절하에서 Gp2 암호화 서열을 갖는 플라스미드 pKLJ12+Gp2로 형질전환시켰다. 3개의 연속적인 실험은 T7 RNA 폴리머라제 및 Gp2를 발현하는, IPTG 및 아라비노스로 유도된 숙주 세포가 GFP를, IPTG만으로 유도된, 따라서 T7 RNA 폴리머라제를 발현하지만 Gp2는 발현하지 않는 숙주 세포에 비해 더 높은 정도로 발현함을 보였다.
도 4: 벡터 부재하에 pKLJ12+Gp2 삽입물로부터 Gp2의 발현은 GFP 발현을 증가시킨다.
T7 프로모터 조절하에 GFP 암호화 서열 및 IPTG-유도성 프로모터 조절하에 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 이. 콜라이 균주 HMS174(DE3) TN7::<T7GFP>를 Gp2 발현 카세트를 포함하는 pKLJ12+Gp2의 삽입물로 형질전환시켰다. 3개의 경우 중 2개에서, 상기 Gp2 발현 카세트의 형질전환은 IPTG 유도 후 3시간째에 증가된 GFP 발현을 생성시켰다.
도 5: 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 예시적인, 그럼에도 불구하고 바람직한(파지) 단백질의 아미노산 서열들.
도 6: Gp2 발현이 없는 참조 발효 공정.
참조 발효 공정에서 Gp2는 발현되지 않으며 따라서 예상된 바와 같이 모델 단백질 GFP의 생성 동안 세포가 계속 성장한다. 결과적으로, 재조합 단백질 부재하에서 총 CDM(세포 건조 질량) 및 CDM은 전체 발효 공정 동안 증가한다. GFP의 유도된 발현은 전체 발효 공정 동안 특이적인 용해성 GFP 및 전체 용해성 GFP 모두의 일정한 증가를 생성시킨다.
도 7: 성장 및 단백질 생성이 Gp2 발현에 의해 탈결합된 예시적인 발효 공정.
예시적인 발효 공정에서 Gp2 발현은 세포의 성장 정지를 일으킨다. 결과적으로, 재조합 단백질 부재하의 CDM은 11시간 시점에서 Gp2 발현의 유도시 일정하게 남아있는 반면 총 CDM은 재조합 GFP의 생성으로 인해 보통으로 증가한다. 특이적인 용해성 GFP 및 전체 용해성 GFP는 모두 상기 세포의 성장 정지에도 불구하고 상기 발효 공정 과정 동안 증가한다.
도 8: Gp2의 발현은 상등액 중 GFP의 발현 수준 및 GFP 대 용해성 숙주 세포 단백질(HCP)의 비를 증가시킨다.
쿠마씨 염색된 SDS PAGE 젤은 표준 시스템(게놈 통합된 유도성 Gp2 단백질이 없는 이. 콜라이 BL21(DE3))에 비해 게놈 통합된 유도성 Gp2 단백질을 갖는 성장 탈결합된 시스템(이. 콜라이 BL21(DE3))을 사용한 상등액(S) 중의 용해성 GFP의 증가를 나타낸다. 더욱 또한, 상기 상등액 중 GFP 대 HCP(라이소자임 제외)의 상대적인 양은 표준 시스템에 비해 성장 탈결합된 시스템을 사용한 경우 상당히 더 높다. 추가로, GFP의 용해도는 표준 시스템에 비해 성장 탈결합된 시스템의 사용에 의해 개선된다.
도 9: 참조 공정도. 0.1 mM IPTG에 의한 유도.
도 10: 유가 배양의 공정도 및 아라비노스 및 IPTG에 의한 유도 전략.
도 11: BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제) 및 BL21(DE3)pET30(HIV1-프로테아제)의 진탕 플라스크 배양의 SDS page 분석.
참조 균주 및 모델 균주 배양의 유도된 및 유도되지 않은 샘플의 비교. HIV1-프로테아제 밴드는 11 kDa에 위치한다.
도 12: 균주 BL21(DE3)::TN7(GP2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제) 및 BL21(DE3)pET30(HIV1-프로테아제)의 성장 및 생성물 형성 동역학.
(A) 참조 발효 공정: μ = 0.10 h-1의 지수 공급율로 공급 21시간째에 20 μmol IPTG/g CDM에 의한 유도; (B) 모델 발효 공정: 공급 11시간째에 0.1M 아라비노스 + 20 μmol IPTG/g에 의한 유도, 이때 지수 공급(μ = 0.20 h-1)을 선형 공급으로 전환하였다.
도 13: BL21(DE3)pET30(HIV1-프로테아제)에 의한 참조 공정 발효의 SDS page 분석.
도 14: SDS PAGE 분석: BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제)의 배양.
도 15: BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제)[모델 공정, 녹색] 및 BL21(DE3)pET30(HIV1-프로테아제)[참조 공정, 적색]에 의한 HIV1-프로테아제 생성 수율의 비교.
(A,C,E) 생성된 전체, 용해성 및 불용성 HIV1-프로테아제의 비교; (B,D) 총 CDM 및 순 CDM의 비교; (F) 상기 두 시스템 모두에 의해 생성된 전체 HIV1-프로테아제.
도 16: HCD 생물반응기 유가 배양에서 성장 탈결합된 단백질 발현에 대해 확립된 공급 프로파일.
배양 전체를 통한 성장 곡선 및 성장 속도의 이론적인 경향, 일정한 글루코스 수율 계수에 근거한 계산.
도 17: BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)의 HCD 배양의 SDS page 분석.
공급 15시간째에 0.1M 아라비노스 및 20 μmol IPTG/g CDM에 의한 유도, 이때 지수 공급(μ = 0.17 h-1)을 선형 공급으로 전환하였다. GFP 밴드는 27 kDa에 위치한다.
도 18: 균주 BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30a(GFPmut3.1)의 HCD 배양의 성장 및 생성물 형성 동역학.
공급 15시간째에 0.1M 아라비노스 + 20 μmol IPTG/g에 의한 유도, 이때 지수 공급(μ = 0.20 h-1)을 선형 공급으로 전환하였다.
도 19: 성장 탈결합된 시스템의 HCD 배양 동안 시간당(A) 및 전체(B) O2 소비 및 CO2 형성.
공급 15시간째에 0.1M 아라비노스 + 20 μmol IPTG/g CDM에 의한 유도, 이때 지수 공급율 μ = 0.17 h-1; 공급 배지에 (NH4)2SO4를 보충하였다.
도 20: BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)의 HCD 및 비-HCD 배양간의 GFPmut3.1 생성 수율의 비교.
(A,C,E) 생성된 전체, 용해성 및 불용성 GFPmut3.1의 비교; (B,D) 총 CDM 및 순 CDM의 비교; (F) 생성된 총 GFPmut3.1.
실시예
하기의 실시예는 본 발명을 예시하지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 숙주 세포 RNA 폴리머라제의 억제는 숙주 세포의 성장을 억제한다.
숙주 세포의 증식에 대한 숙주 세포 RNA 폴리머라제의 억제 효과를 평가하기 위해서 아라비노스-유도성 프로모터의 조절하에서 Gp3 암호화 서열을 저-사본 f-플라스미드 pKLJ12(Jones and Keasling (1998) Biotechnol Bioeng Vol. 59, Issue 6: 659-665)(상기 숙주 세포에 대해 단지 작은 부담만을 구성하며 안정하게 유지된다) 중에 클로닝하였다. 상기 단백질 Gp2는 상기 효소의 베타-서브유닛에 결합함으로써 상기 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 것으로 공지되어 있다. 상기 플라스미드 pKLJ12+Gp2를 araD139 돌연변이를 포함하는 이. 콜라이 균주 NEB10-베타에 형질전환시켰다. 결과적으로, NEB10-베타는 상기 유도인자 아라비노스를 대사할 수 없다. 0시간 시점에서 다수의 배양물을 접종하고 Gp2 발현을 1.5%, 0.1% 또는 0.001% 아라비노스의 부가에 의해 2시간 후에 유도하였다. 상기 세균의 증식을, OD600 ㎚ 값을 측정함으로써 측정하였다. 상이한 농도의 아라비노스의 부가 및 이에 의한 Gp2의 발현은 아라비노스가 생략된 세균 배양물에 비해 용량-의존적인 방식으로 증식의 억제를 일으켰다(도 1). 숙주 세포 성장에 대한 화합물 아라비노스의 어떠한 영향도 배제하기 위해서, 상기 Gp2 발현 카세트의 리보솜 결합 부위가 없는 플라스미드 pKLJ12+Gp2의 유도체를 사용하였다. 결과적으로, Gp2의 발현은 유도될 수 없으며 따라서 아라비노스의 존재 또는 부재하에서의 증식의 차이는 관찰되지 않았다(도 2).
실시예 2: 숙주 세포 게놈 중 Gp2 암호화 발현 카세트의 통합.
숙주 세포 집단에서 Gp2 단백질의 안정한 발현을 부여하기 위해서, 상기 Gp2 암호화 발현 카세트를 TN7 유전자좌에서 동종 재조합을 통해 NEB10-베타의 게놈에 통합시켰다. 상기 삽입된 서열은 아라비노스 프로모터, 조절제, 종결제, 및 암피실린 내성 유전자의 조절하에서 Gp2 유전자를 포함하였다. 이를 위해서, 50 bp 오버행을 PCR을 통해 상기 삽입 요소에 가하였다. 선형 PCR 산물을 pSIM 헬퍼 플라스미드(숙주 세포 게놈 중에 상기 PCR 산물의 통합을 매개하는 단백질의 열 충격 유도된 발현을 부여한다)로 NEB 10-베타 숙주 세포내로 동시에 형질전환시켰다. 성공적인 통합 후에 상기 pSIM 플라스미드를 상기 숙주 세포로부터 회수할 수 있다(Sharan et al., 2009, Nat Protoc. 4(2):206-23).
실시예 3: 이. 콜라이에서 Gp2의 유도된 발현은 모델 단백질 GFP의 발현을 증가시킨다.
T7 프로모터 조절하에 GFP 암호화 서열 및 IPTG-유도성 프로모터 조절하에 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 이. 콜라이 균주 HMS174(DE3) TN7::<T7GFP>를 아라비노스-유도성 프로모터의 조절하에서 Gp2 암호화 서열을 갖는 플라스미드 pKLJ12+Gp2로 형질전환시켰다. 상기 배양물 접종 약 2시간 후에 IPTG를 가하여 T7 RNA 폴리머라제 및 이에 의해 GFP의 발현을 유도하였다. Gp2를 발현시키기 위해서 접종 약 3시간 후에 아라비노스를 가하였다. 3개의 연속적인 실험은 T7 RNA 폴리머라제 및 Gp2를 발현하는, IPTG 및 아라비노스로 유도된 숙주 세포가 GFP를, IPTG만으로 유도된, 따라서 T7 RNA 폴리머라제를 발현하지만 Gp2는 발현하지 않는 숙주 세포에 비해 더 높은 정도로 발현함을 보였다. 아라비노스의 존재 또는 부재하에서 IPTG가 없는 2개의 샘플에서 GFP가 상기 프로모터의 누출로 인해 약간 발현되었다(도 3).
실시예 4: 벡터 부재하에 pKLJ12+Gp2 삽입물로부터 Gp2의 발현은 GFP 발현을 증가시킨다.
T7 프로모터 조절하에 GFP 암호화 서열 및 IPTG-유도성 프로모터 조절하에 T7 RNA 폴리머라제를 포함하는 이. 콜라이 균주 HMS174(DE3) TN7::<T7GFP>를 Gp2 발현 카세트를 포함하는 pKLJ12+Gp2의 삽입물로 형질전환시켰다. 3개의 경우 중 2개에서, 상기 Gp2 발현 카세트의 형질전환은 IPTG 유도 후 3시간째에 증가된 GFP 발현을 생성시켰다(도 4).
실시예 5: 모델 단백질 GFP의 수율에 대한 Gp2 발현의 효과를 평가하는 예시적인 발효 공정의 설명.
배양 방식 및 공정 분석
세포를 표준 조절 유닛이 장착된 12 L(순 부피 8 L, 배치 부피 4 L) 컴퓨터-조절된 생물반응기(MBR; 스위스 베치콘 소재)에서 증식시킨다. pH를 25% 암모니아 용액(ACROS 오가닉스)의 부가에 의해 7.0±0.05의 설정값에서 유지시키고, 온도는 37 ℃±0.5 ℃로 설정한다. 산소 제한을 피하기 위해서, 용존 산소 수준을 교반기 속도 및 공기 공급량 조절에 의해 30% 포화 이상에서 안정화시킨다. 형광 측정을 산업 환경에서 온라인 측정용으로 특수 설계된 다중-파장 분광형광계, 바이오뷰(BioView)(등록상표)(델타 라이트 앤드 옵틱스(DELTA Light & Optics), 덴마크 링비 소재)를 사용하여 수행한다. 0.5 ㎖/l 배지 농도의 소포 현탁액(PBG2000)의 부가에 의해 발포를 억제한다. 접종을 위해서, 심부 동결된(-80 ℃) 실행 세포 뱅크 바이알을 해동시키고 1 ㎖(광학 밀도 OD600 = 1)을 상기 생물반응기에 무균적으로 옮긴다. 배양시 공급을 시작하고, 4 L 배치 배지에서 22.5 g의 세균 건조 물질로 증식시키고, 정지 단계로 들어간다. 상기 공급 단계의 시작과 함께 배양 온도를 30 ℃로 감소시킨다. 상기 공급 배지는 추가의 363 g의 세균 건조 물질을 제공하기에 충분한 성분을 제공하였다(4 배가).
참조 공정(도 6)에서 (표준) 발현 시스템 이. 콜라이 BL21(DE3)pET30a GFPmut3.1을 사용하였다. 상기 공급 단계에서 성장 속도를 0.1 h-1로 설정하였으며 재조합 유전자 발현의 3 배가를 지난 공급물 개시 유도를, 상기 생물반응기에 직접 단일 펄스에 의해 그램 CDM당 20 μmol IPTG로 수행하였다.
게놈 통합된 유도성 Gp2 단백질을 함유하는 상기 (표준) 발현 시스템 이. 콜라이 BL21(DE3)pET30a GFPmut3.1(도 7)에서, 상기 공급 단계에서 성장 속도를 3 배가를 위해 지수 기질 공급을 통해 0.2 h-1로 설정하였다. 그 후에 세포 건조 물질 그램당 20 μmol IPTG 및 10 mmol 아라비노스에 의한 유도를 수행하고 배지 공급을 0.05 h-1의 초기 성장 속도로 추가로 16시간 동안 선형 공급으로 전환시킨다. 상기 기질 공급을 기질 탱크 중의 중량 손실의 중복된 피드백 조절과 함께, 지수 성장 연산, x=x0.eμt에 따라 펌프 속도를 증가시킴으로써 조절한다.
배지 조성
본 연구에 사용된 최소 배지는 리터당 3 g KH2PO4 및 6 g K2HPO4*3H2O를 함유한다. 이들 농도는 필요한 완충제 용량을 제공하며 또한 P 및 K 공급원으로서 작용한다. 다른 성분을 생성되는 세균 건조 물질 그램과 관련하여 부가한다: 나트륨 시트레이트(삼나트륨 염 *2H2O; ACROS 오가닉스) 0.25 g, MgSO4*7H2O 0.10 g, CaCl2*2H2O 0.02　g, 미량 원소 용액 50 ㎕ 및 글루코스*H2O 3 g. 상기 집단의 초기 성장을 가속화하기 위해서, 복합체 성분 효모 추출물 0.15 g을 상기 최소 배지에 가하여 배치 배지를 수득한다. 상기 공급 단계를 위해서 8 L의 최소 배지를 상기 공급 단계에서 생성되는 생물학적 건조 물질의 양 363 g에 따라 제조하며, 이때 P-염을 다시 리터당 부가한다. 미량 원소 용액: 5 N HCl(g/L) 중에서 제조된다: FeSO4*7H2O 40.0, MnSO4*H2O 10.0, AlCl3*6H2O 10.0, CoCl2 (Fluka) 4.0, ZnSO4*7H2O 2.0, Na2MoO2*2H2O 2.0, CuCl2*2H2O 1.0, H3BO3 0.50.
오프라인 분석
광학 밀도(OD)를 600 ㎚에서 측정한다. 세균 건조 물질을 10 ㎖의 세포 현탁액의 원심분리, 증류수에의 재-현탁에 이은 원심분리, 및 사전-칭량된 비커로의 전달을 위한 재-현탁에 이어서, 105 ℃에서 24시간 동안 건조시키고 재칭량함으로써 측정한다. 상기 세균 성장의 진행을 세포 건조 물질의 총량(총 CDM)을 계산함으로써 측정한다.
재조합 단백질 GFP의 함량을 ELISA 및 SDS-PAGE 젤상에서 밴드의 농도측정 정량분석을 사용하는 전기영동 단백질 정량분석에 의해 측정한다. 용해성 재조합 생성물을 GFP-ELISA를 통해 정량분석하는 반면, 봉입체 중 재조합 생성물은 SDS-PAGE 젤 전기영동으로 측정한다.
추가로, 상등액 및 봉입체를 SDS-PAGE 젤 전기영동을 사용하여 분석하였다. 쿠마씨 염색된 SDS PAGE 젤은 표준 시스템에 비해 성장 탈결합된 시스템을 사용하는 경우 상등액 중의 용해성 GFP의 증가를 나타낸다. 더욱 또한, 상기 상등액 중의 HCP에 대한 GFP의 상대적인 양은 표준 시스템에 비해 성장 탈결합된 시스템을 사용하는 경우 상당히 더 높다. 추가로, GFP의 용해도를, 성장 탈결합되지 않은 표준 시스템(BL21(DE3)pET30a GFPmut3.1)에 비해 성장 탈결합된 시스템을 사용함으로써 개선시킨다(도 8).
실시예 6: 성장 탈결합된 시스템을 사용하는 HIV-1 프로테아제의 생성.
개발된 성장 탈결합된 공정의 응용성을 입증하기 위해서, 또 다른 재조합 단백질이 필요하였다. 상기 목적을 위해서 HIV-1 프로테아제를, 상기는 이. 콜라이에 대단히 독성이어서 생성시키기 어렵기 때문에(Korant and Rizzo, (1991), Biomed Biochim Acta 50: 643-6), 상기 성장 탈결합된 시스템 및 모델 공정의 확인을 위한 제2 모델 단백질로서 선택하였다. 이. 콜라이에서 1형 인간 면역결핍 바이러스로부터의 상기 아스파틱 프로테아제의 과발현은 대개, 가능하게는 그의 단백질 분해 활성과 관련된, 생성되는 세포에 대한 독성 효과에 의해 수반된다(Fernandez et al., (2007), Biotechnol Lett 29: 1381-6). 결과적으로, 상기 단백질은 일반적으로 미생물 시스템에서는 발현시키기 어렵다. 레트로바이러스 단백질은 폴리단백질 전구체로서 합성되며 특이적인 프로테아제에 의해 처리된다(Volonte et al., (2011), Microb Cell Fact 10: 53). 이들 전구체는 Gag 및 Gag-Pol 폴리펩티드이며, 이들은 HIV-1 프로테아제에 의해 성숙한 단백질들로 단백질분해에 의해 처리된다(Kohl et al., (1988), Proc Natl Acad Sci U S A 85: 4686-90).
HIV-1 프로테아제는 HI-바이러스에 의해 암호화되며 이에 의해 상기 바이러스의 성숙화에 중요한 역할을 한다. 상기는 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 가능한 치료의 개발에 매력적인 표적이다. 세균 배양 시스템에서 다량의 HIV-1 프로테아제를 발현할 수 있는 시스템의 유효성이, 다량의 상기 단백질 획득의 최종적인 목표이다(Volonte et al., (2011), Microb Cell Fact 10: 53).
참조 발효 공정:
상기 배양의 배치 단계를 37 ℃의 온도에서 수행하며 1 ㎖의 실행 세포 뱅크(WCB)를 접종하였다. 실험에 따라, 2개의 상이한 모델 단백질을 함유하는 하기의 균주들을 상기 공정 설계에 사용하였다:
·BL21(DE3)pET30(GFPmut3.1)
·BL21(DE3)pET30(HIV1-프로테아제)
상기 배치 단계를 11시간 내지 13시간(용존 산소 중의 피크에 의해 표시됨) 후에 완료하였으며 상기 공급 단계를 그 후 바로 시작하였다. 지수 공급 단계에서 상기 발현된 재조합 단백질의 봉입체 형성을 감소시킬 뿐만 아니라 보다 양호한 O2-용해도를 성취하기 위해서 온도를 30 ℃로 감소시켰다. 상기 유가 공정의 성장률(μ)을 4 세대 동안 지수적인 기질 공급에 의해 0.10 h-1에서 일정하게 유지시켰다. 상기 세포 건조 물질(CDM)이 4 L 배치 부피 중 22.5 g CDM으로 상기 배치 단계의 끝에 도달한 후에 공급을 개시시켰다.
IPTG(20 μmol/g CDM)의 단일 펄스에 의한 유도가 상기 공급-단계의 세 번째 세대(공급 개시 후 21시간째) 후에 발생하였다. 상기 샘플링 과정을 1 세대 동안 지속하였다. 상기 참조 공정 설계에 대한 개요를 도 9에 나타낸다.
발효 공정/성장 탈결합된 생성 시스템:
상기 배양의 배치 단계를 37 ℃의 일정한 온도에서 수행하였으며 1 ㎖의 WCB를 접종하였다. 하기의 시스템을 상기 공정 설계로 배양하였다:
·BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)
·BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제)
상기 배치 단계를 11시간 내지 13시간 후에 완료하였으며 상기 공급 단계를 그 후 바로 시작하였다. 지수 공급 단계에서 상기 발현된 재조합 단백질의 보다 양호한 용해도를 성취하고 보다 양호한 산소 전달속도(OTR)를 성취하기 위해서 온도를 30 ℃로 감소시켰다. 상기 성장률을 μ = 0.20 h-1에서 일정하게 유지시켰다. 상기 재조합 단백질 생성을 세 번째 세대 후에(공급 개시 후 21시간째에) 단일 펄스의 0.1 M 아라비노스(Gp2) 및 20 μmol IPTG/g CDM(관심 유전자 - GOI)로 유도하였다. 네 번째 세대 샘플링이 발생하는 동안, μ = 0.050 h-1의 초기 성장률로 출발하여 상기 실험 과정 동안 μ = 0.025 h-1로 감소하는 선형 공급 프로파일을 적용하였다. 상기 샘플링 과정을 1 세대 동안 지속하였다. 상기 참조 공정 설계에 대한 개요를 도 10에 나타낸다.
에스케리키아 콜라이에서 HIV-1 프로테아제 생성:
플랫폼 공정의 광범위한 응용성을 입증하기 위해서, 또 다른 재조합 단백질들에 의한 실험이 필요하다. 상기 목적을 위해서, 이. 콜라이에서 생성되기 어려운 단백질인 HIV-1 프로테아제를 벤치마킹 실험을 위해 선택하였다.
참조 균주 BL21(DE3)pET30a(HIV1-프로테아제) 및 모델 균주 BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제)의 생물반응기 배양을 수행하기 전에, 표준 진탕 플라스크 배양을, 상기 재조합 단백질이 생성되는지를 확인하기 위해서 수행하였다. HIV1-프로테아제 밴드는 리소자임 밴드 아래 11 kDa에 위치한다. HIV1-프로테아제의 정량분석에 하기의 선형 방정식을 사용하였다:
y = 0.0007x R2 = 0.9708
도 11에 따라, 상기 두 균주 모두 불용성 형태로 HIV1-프로테아제를 생성시킬 수 있었다. 성장 탈결합된 시스템의 생성은 69 ㎍/㎖의 농도를 제공한 반면, 상기 참조 시스템은 단지 5 ㎍/㎖의 불용성 HIV1-프로테아제를 생성시켰다. 결과적으로 BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제)가 상기 참조 균주보다 13배 더 HIV1-프로테아제를 생성시킬 수 있었다.
상기 두 균주 모두 상기 모델 단백질을 생성시킬 수 있었으며, 상기 두 시스템 모두의 실험 규모 배양을 수행하였다. BL21(DE3)pET30a(HIV1-프로테아제)를 참조 시스템으로서 사용하였으며 발효 공정을 상기 설명에 따라 수행하였다. 나란히, 상기 성장 탈결합된 시스템에 의한 신규 플랫폼 공정을 도 10에 기재된 바와 같이 BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제)로 수행하였다. 상기 지수 공급 단계 동안 μ = 0.20 h-1의 성장률을 적용하였다.
도 12의 그래프 A에 나타낸 바와 같이, 상기 표준 공정에 대한 HIV-1 프로테아제의 최대 비 농도는 상기 단백질의 용해성 발현 없이 11.8 ㎎/g CDM이었다. 상기 획득된 부피 수율은 0.3 g/L로 또한 매우 낮다. 상기 결과는 HIV-1 프로테아제가 낮은 수율 및 발현이 어려운 단백질 그룹에 속한다는 진술을 입증한다(Volonte et al., (2011), Microb Cell Fact 10: 53; Worsdorfer et al., (2011), Science 331: 589-92). 그래프 B는 상기 모델 공정에서, CDM의 성장이 유도 후 정지되었고 순 CDM의 감소는 없었음을 보인다. 상기 공정의 끝에서 상기 성장 탈결합된 시스템은 총 233.5 g CDM을 생성시켰다. 331.92 g CDM을 생성시킨 상기 참조 공정에 비해, 상기 모델 공정은 30% 적은 CDM을 생성시켰다. 상기 단백질 생성의 유도 후에, 상기 모델 공정은 또한 상기 참조 시스템에 비해 155.2 g 적은 염기를 소비하였다. 도 13은 상기 참조 공정의 SDS page 분석을 나타낸다. 상기 참조 공정 발효의 정량분석에 하기의 선형 방정식을 사용하였다:
y = 0.0006x R2 = 0.9981
도 13에 따라, 상기 참조 시스템은 오직 불용성 형태(IB)로 HIV1-프로테아제를 생성시킬 수 있었다. 상기 단백질 발현 단계의 시작에서, BL21(DE3)pET30(HIV1-프로테아제)는 ㎖당 2 ㎍의 불용성 HIV1-프로테아제를 생성시켰다. 네 번째 세대의 끝에서 상기 참조 공정은 ㎖당 19 ㎍의 불용성 HIV1-프로테아제를 제공하였다.
도 14는 상기 성장 탈결합된 공정 발효의 SDS page 분석을 나타낸다. HIV1-프로테아제의 정량분석에 하기의 선형 방정식을 사용하였다:
y = 0.0009x R2 = 0.9611
도 14에 따라, 상기 성장 탈결합된 시스템은 용해성(S) 및 불용성 형태(IB)로 HIV1-프로테아제를 생성시킬 수 있었다. 상기 단백질 생성 단계의 시작에서, BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제)는 79%의 용해성 및 21%의 불용성 HIV1-프로테아제를 발현하였다. 용해성 단백질의 비는 연장된 공정 지속기간에 따라 감소하였다. 네 번째 세대의 끝에서(공급 출발 후 27시간째), 12%가 용해성으로서 발현되고 88%가 불용성 HIV1-프로테아제로서 발현되었다.
이들 실험의 결과에 대한 요약을 도 15에 나타낸다. 그래프 A에 나타낸 바와 같이, 상기 성장 탈결합된 시스템은 47 ㎎/g CDM의 농도로 HIV1-프로테아제를 생성시킬 수 있었던 반면, 상기 참조 공정은 12 ㎎/g CDM의 총 HIV1-프로테아제 농도를 생성시켰다. 따라서, BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-프로테아제)는 BL21(DE3)pET30a(HIV1-프로테아제)에 비해 그램 CDM당 거의 4배 더 많은 HIV1-프로테아제를 생성시켰다. 그래프 C에 따라, 상기 모델 공정은 상기 공정의 끝에서 9 ㎎/g 용해성 HIV1-프로테아제 농도를 제공한 반면, 상기 참조 균주는 용해성 형태의 HIV1-프로테아제를 생성시킬 수 없었다. 그래프 F에 나타낸 바와 같이, 상기 모델 공정은 11 g HIV1-프로테아제의 총 질량을 생성시킨 반면, 상기 참조 공정은 단지 총 4 g의 결과에 도달하였을 뿐이다. 결론적으로 상기 모델 공정은 상기 참조 공정에 비해 약 3배 더 많은 HIV1-프로테아제를 생성시켰다. 도 15의 그래프 D는 생성된 재조합 생성물(X-P) 없이 계산된 순 CDM(g)을 나타낸다. X-P는 전체 CDM 생성에 비해 일정하게 남아있었다(그래프 B). 상기 성장 탈결합된 시스템의 유도 후에 26 g의 CDM이 상기 공정의 끝까지 형성된 반면, 상기 참조 시스템은 상기 생성 단계 동안 122 g CDM을 생성시켰다. 요약하면, 상기 성장 탈결합된 시스템은 상기 참조 시스템에 비해 약 30% 더 적은 CDM과 함께 282% 더 많은 HIV1-프로테아제를 생성시켰다.
실시예 7: 성장 탈결합된 시스템을 사용하는 고-세포-밀도 배양( HCDC ).
비-HCD 생물반응기 배양으로부터의 결과는 상기 성장 탈결합된 발현 시스템이, μ = 0.2 h-1의 성장 속도가 산소 제한의 위험 없이 유지되기 어렵기 때문에 HCD 배양에 중요한 유도 전 가변 성장 속도를 허용해야 함을 암시하였다. 너무 높은 성장 속도는 특히 지수 공급 단계 동안 부분최적 조건을 생성시킬 것이다. 상기 HCD 공정은 유도 시점에서 60 g/L의 CDM 농도에 도달하도록 설계되었다. 상기 수행된 HCDC는 단지 비-HCDC에 비해 반-HCDC에서 필적할만한 특정량의 단백질 및 보다 높은 생산성에 도달하는 상기 성장 탈결합된 시스템의 능력만을 나타내어야 하기 때문에, GFPmut3.1을 유일한 모델 단백질로서 사용하였다. 상기 HCD 발효 설계를 도 16에 나타낸다. 상기 배치를 37 ℃의 온도에서 수행하고 16시간 후에 완료하였다. 지수 공급 단계(μ = 0.17 h-1)는 상기 배치 단계 완료 후 바로 시작되었으며, 약 2 세대 동안 지속되었다. 상기 공급 배지에 또한 암모늄 설페이트를 보충하여 비-질소-제한 조건을 보장하였다. 그 후에 1차 선형 공급 프로파일을 적용하여 1 세대 동안 지속하였다. 상기 공급 단계 출발 후 15시간째에 상기 단백질 생성을 0.1 M 아라비노스 + 20 μmol IPTG/g CDM으로 유도하였다. 상기 생성 단계 동안 2차 선형 공급 프로파일을 적용하였으며, 이를 처음에 μ = 0.050 h-1로 출발하여 상기 공정의 끝에서 0.020 h-1의 μ로 감소된 계산된 성장률로 약 1 세대 동안 지속하였다. 상기 단백질 발현 단계를 33시간 동안 지속하였다. 상기 생성되는 낮은 성장 속도의 목적은 POI를 발현하는데 필요한 만큼만 충분한 글루코스를 공급하는 것이었다.
도 17은 성장 탈결합된 시스템의 HCD 배양의 SDS page 분석을 나타낸다. 33시간의 단백질 생성 후에 BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)은 63% 용해성 및 37% 불용성 GFP를 생성시킬 수 있었으며, 이는 상기 성장 탈결합된 시스템 공정의 비-HCD 배양에 비해 개선이며 HCDC로의 규모 상승이 상기 발현된 단백질의 용해도에 그다지 영향을 미치지 못함을 나타낸다.
도 18은 성장 탈결합된 시스템의 HCDC의 결과를 나타낸다. BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)은 g CDM당 268.4 ㎎ 용해성 및 157.6 ㎎ 불용성 GFP를 생성시킬 수 있었다. 상기 생성 단계 동안 총 279.5 g 량의 GFP가 생성되었으며 그 중 176.1 g이 불용성 형태로 생성되었다. 상기 공정은 30 g/L GFP의 농도(이는 상기 성장 탈결합된 시스템의 비-HCDC에 비해 300%의 증가이다)를 제공하였다. 단백질 발현의 유도 후에 순 CDM이 중단되었으며 다소 일정하게 남아있었고, 이는 상기 성장 탈결합된 시스템의 비-HCDC로부터의 결과와 일치한다.
상기 HCD 모델 발효 공정의 단백질 생성 동안 총 O2 소비 및 총 CO2 형성의 분석은 상기 성장 탈결합된 시스템이 상기 성장 탈결합된 시스템의 비-HCDC에 필적할만큼 높은 양의 총 CO2를 형성함을 보였다. 도 19의 그래프 A에 나타난 바와 같이, 단백질 생성의 유도 후에 BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)의 O2 소비 및 CO2 형성은 일정하게 남았으며, 이는 상기 HCD 공정이 여전히 대사 활성임을 나타낸다.
도 20은 상기 성장 탈결합된 시스템의 HCD 및 비-HCD 배양간의 결과에 대한 요약을 나타낸다. 그래프 A는 BL21(DE3)::TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)의 비-HCDC가 g CDM당 480.18 ㎎ GFP(이는 모든 수행된 배양 중 가장 높은 비 농도이다)를 생성시킬 수 있었음을 나타낸다. 상기 HCD 공정은 g CDM당 426 ㎎ GFP에 필적하는 높은 비 농도에 도달하였다. 더욱 또한, 상기 HCDC 공정은 용해성 형태로 7% 더 많은 특이적인 GFP를 생성시킬 수 있었다. 그래프 D에 나타난 바와 같이, 상기 두 배양 동안 순 CDM의 성장이 단백질 발현의 유도 후에 정지하고 감소하였다. 상기 유도시에, HCDC 공정은 57 g/L의 CDM 농도에 도달하였으며 비-HCDC 공정(유도시에 22 g/L에 도달하였다)에 비해 216% 더 많은 총 CDM을 생성시켰다(그래프 B). 상기 성장 탈결합된 시스템의 HCDC는 총 280 g 량의 GFP를 생성시켰으며, 이는 상기 시스템의 비-HCDC에 비해 243%의 증가이다(그래프 F). 그래프 B에 나타낸 총 생성된 CDM 및 도 F에 나타낸 생성된 순 CDM을 고려하여, 상기 HCDC는 비-HCDC에 비해 300% 더 많은 순 CDM과 함께 243% 더 많은 GFP를 생성시켰다. 그래프 D는 생성된 재조합 단백질(X-P) 없이 계산된 순 CDM(g)을 나타낸다. 순 CDM의 감소는 상기 두 시스템 모두의 유도 후에 거의 독점적으로 재조합 GFPmut3.1만이 생성됨을 입증하였다.
상기 비-HCD와 HCD 공정간의 총 생성된 GFP 및 생성된 순 CDM의 비교는 상기 성장 탈결합된 시스템이 심지어 규모-상승된 HCD 공정에서조차 상기 생성된 GFP와 순 CDM간에 선형 관계를 보임을 나타낸다. 상기는 또한 상기 성장 탈결합된 시스템의 HCD 배양이 훨씬 더 많은 CDM 농도와 함께 추가의 HCDC 발효에 대한 높은 가능성을 가짐을 밝힌다. 유도에 앞서 100 g/L 이하의 CDM 농도를 갖는 배양은 막대한 양의 GFP를 제공할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> ENGENES BIOTECH GMBH <120> Uncoupling growth and protein production <130> IPA171107-DE <150> LU 92705 <151> 2015-04-30 <150> EP 15190078.4 <151> 2015-10-16 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 64 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Gp2 phage protein <400> 1 Met Ser Asn Val Asn Thr Gly Ser Leu Ser Val Asp Asn Lys Lys Phe 1 5 10 15 Trp Ala Thr Val Glu Ser Ser Glu His Ser Phe Glu Val Pro Ile Tyr 20 25 30 Ala Glu Thr Leu Asp Glu Ala Leu Glu Leu Ala Glu Trp Gln Tyr Val 35 40 45 Pro Ala Gly Phe Glu Val Thr Arg Val Arg Pro Cys Val Ala Pro Lys 50 55 60 <210> 2 <211> 110 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Nun phage protein <400> 2 Met Val Lys Lys Thr Ile Tyr Val Asn Pro Asp Ser Gly Gln Asn Arg 1 5 10 15 Lys Val Ser Asp Arg Gly Leu Thr Ser Arg Asp Arg Arg Arg Ile Ala 20 25 30 Arg Trp Glu Lys Arg Ile Ala Tyr Ala Leu Lys Asn Gly Val Thr Pro 35 40 45 Gly Phe Asn Ala Ile Asp Asp Gly Pro Glu Tyr Lys Ile Asn Glu Asp 50 55 60 Pro Met Asp Lys Val Asp Lys Ala 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Asp 355 360 365 Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val 370 375 380 Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe 385 390 395 400 Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe 405 410 415 Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe 420 425 430 Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys 435 440 445 Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly 450 455 460 Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys 465 470 475 480 Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro 485 490 495 Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu 500 505 510 Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr 515 520 525 Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln 530 535 540 His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn 545 550 555 560 Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala 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Lys Pro Ile Tyr Glu Leu His 20 25 30 Arg Gly Glu Lys Ser Lys Thr Tyr Tyr Val Thr His Ile Ala Thr Gly 35 40 45 Lys Thr Pro Ala Cys Ala Gly Leu Leu Arg Asp Ala Ile Met Lys Ala 50 55 60 Cys Met Leu Glu Gly Leu Leu 65 70 <210> 6 <211> 341 <212> PRT <213> artificial <220> <223> A* phage protein <400> 6 Met Lys Ser Arg Arg Gly Phe Ala Ile Gln Arg Leu Met Asn Ala Met 1 5 10 15 Arg Gln Ala His Ala Asp Gly Trp Phe Ile Val Phe Asp Thr Leu Thr 20 25 30 Leu Ala Asp Asp Arg Leu Glu Ala Phe Tyr Asp Asn Pro Asn Ala Leu 35 40 45 Arg Asp Tyr Phe Arg Asp Ile Gly Arg Met Val Leu Ala Ala Glu Gly 50 55 60 Arg Lys Ala Asn Asp Ser His Ala Asp Cys Tyr Gln Tyr Phe Cys Val 65 70 75 80 Pro Glu Tyr Gly Thr Ala Asn Gly Arg Leu His Phe His Ala Val His 85 90 95 Phe Met Arg Thr Leu Pro Thr Gly Ser Val Asp Pro Asn Phe Gly Arg 100 105 110 Arg Val Arg Asn Arg Arg Gln Leu Asn Ser Leu Gln Asn Thr Trp Pro 115 120 125 Tyr Gly Tyr Ser Met Pro Ile Ala Val Arg Tyr Thr Gln Asp Ala Phe 130 135 140 Ser Arg Ser Gly Trp Leu Trp Pro 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Gly Leu Val Leu 115 120 125 Tyr Asn Glu Glu Lys Gly Glu Gln Arg Ser Ala Val Tyr Ser Glu Ile 130 135 140 Gly Pro Tyr His Val Leu Val Pro Arg Asp Thr Asp Thr His Thr Pro 145 150 155 160 Thr Arg Glu Glu Leu Ala Ala Val Ile Met Asn Lys Ala Phe Thr Arg 165 170 175 Thr Glu Thr Gln Asp Ser Gln Glu Asp Thr Gly Thr His Lys Gly Leu 180 185 190 Gly Leu Thr Gly Thr Asp Leu Tyr His Ser Leu Arg Asp Leu Asp Ala 195 200 205 Lys Val Gln Ser Gly Tyr Tyr Thr Ala Thr Glu Asn Glu Glu Asp Val 210 215 220 Lys Ser Glu Ile Glu Ala Thr Lys Lys His Met Lys Ala Val Lys Glu 225 230 235 240 Ser Gly Lys Thr Val Asn Asp Tyr Arg Lys Glu Glu Asn Thr Lys Arg 245 250 255 Cys Lys Leu Lys Ala Leu Thr Asn Lys Phe Asn Arg Leu Phe Leu Lys 260 265 270 Ser Val Ile Asp Thr Asp Ser Leu Gln Val Gly Lys Ala Tyr Leu Ile 275 280 285 Gly Gly Arg Asp Met Lys Asn Val His Gly Leu Tyr Thr Gly Thr Thr 290 295 300 Phe Asp Gln Gln His Ala Asn Phe Leu Ile Val Glu Thr Asp Arg Met 305 310 315 320 His Arg Thr Leu Thr Val Ser Ala Glu Gln Leu Phe Ala Glu Glu Arg 325 330 335 His Ile Val Asp Ile Glu Lys Arg Val Glu Gln Thr Glu Asp 340 345 350 <210> 9 <211> 202 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Staphylococcus phage G1 GP67 <400> 9 Met Thr Asn Ser Lys Lys Lys Gly Asp Thr Phe Glu Arg Lys Ile Ala 1 5 10 15 Lys Glu Leu Thr Ala Trp Trp Gly Tyr Gln Phe Asn Arg Ser Pro Gln 20 25 30 Ser Gly Gly Ala Ser Trp Gly Lys Asp Asn Asn Ala Val Gly Asp Ile 35 40 45 Val Val Pro Gln Glu Ala Asn Phe Pro Leu Val Val Glu Cys Lys His 50 55 60 Arg Glu Glu Trp Thr Ile Asp Asn Val Leu Leu Asn Asn Arg Glu Pro 65 70 75 80 His Thr Trp Trp Glu Gln Val Ile Asn Asp Ser Ser Lys Val Asn Lys 85 90 95 Thr Pro Cys Leu Ile Phe Thr Arg Asn Arg Ala Gln Ser Tyr Val Ala 100 105 110 Leu Pro Tyr Asp Glu Lys Val Tyr Glu Asp Leu Arg Asn Asn Glu Tyr 115 120 125 Pro Val Met Arg Thr Asp Phe Ile Ile Asp Asn Ile Arg Lys Asp Lys 130 135 140 Phe Phe Tyr Asp Val Leu Ile Thr Thr Met Asn Gly Leu Thr Ser Phe 145 150 155 160 Thr Pro Ser Tyr Ile Ile Ser Cys Tyr Asp Lys Lys Asp Ile Lys Pro 165 170 175 Tyr Lys Lys Val Glu Ser Asn Leu Ser Glu Val Ser Lys His Glu Asp 180 185 190 Glu Leu Ile Asn Asp Leu Leu Ser Asp Ile 195 200 <210> 10 <211> 141 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Thermus thermophilus phage P23-45 GP39 <400> 10 Met Val Glu Gly Phe Val Glu Pro Tyr Ile Arg Leu Phe Glu Ala Ile 1 5 10 15 Pro Asp Ala Glu Thr Glu Leu Ala Thr Phe Tyr Asp Ala Asp Leu Asp 20 25 30 Thr Leu Pro Pro Arg Met Phe Leu Pro Ser Gly Asp Leu Tyr Thr Pro 35 40 45 Pro Gly Pro Val Arg Leu Glu Glu Ile Lys Arg Lys Arg Arg Val Arg 50 55 60 Leu Val Lys Val Ser Ile Tyr Arg Phe Glu His Val Gly Leu Gly Leu 65 70 75 80 Ala Ala Arg Pro Tyr Ala Tyr Ala Tyr Ala Trp Gln Gly Asp Asn Gly 85 90 95 Ile Leu His Leu Tyr His Ala Pro Val Val Leu Glu Asp Val Pro Glu 100 105 110 Val Leu Glu Leu Asp Glu Val Thr Tyr Asn Glu Ser Tyr Val Arg Leu 115 120 125 Met Arg Ala Met Gly His Val Asp Ala Phe Ile Asp Leu 130 135 140 <210> 11 <211> 82 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Enterobacteria phage PhiEco32 GP79 <400> 11 Met Asp Met Phe Ser Leu Glu Asp Leu Val Gln Asn Gly Met Met Glu 1 5 10 15 Gln Lys Glu Pro Leu Ile Val Gly Ser Arg Lys Glu Leu Arg Lys Leu 20 25 30 Cys Glu Glu Trp Gly Ile Thr Asn Gln Arg Met Ile Gly Asn Gln Phe 35 40 45 Ser Ala Ile Val Thr Phe Leu Lys Arg Gly Asp Lys Tyr Ser Met Glu 50 55 60 Cys Val Glu Arg Ile Ile Thr Glu Ala Gln Gln Asp Lys Gly Val Thr 65 70 75 80 Tyr Leu <210> 12 <211> 73 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Xanthomonas oryzae bacteriophage Xp10 P7 <400> 12 Met Asn Glu Phe Thr Gln Ile Ser Gly Tyr Val Asn Ala Phe Gly Ser 1 5 10 15 Gln Arg Gly Ser Val Leu Thr Val Lys Val Glu Asn Asp Glu Gly Trp 20 25 30 Thr Leu Val Glu Glu Asp Phe Asp Arg Ala Asp Tyr Gly Ser Asp Pro 35 40 45 Glu Phe Val Ala Glu Val Ser Ser Tyr Leu Lys Arg Asn Gly Gly Ile 50 55 60 Lys Asp Leu Thr Lys Val Leu Thr Arg 65 70 <210> 13 <211> 167 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Enterobacteria phage T4 Alc <400> 13 Met Asp Leu Gln Leu Ile Thr Thr Glu Met Val Val Glu Ala Tyr Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Asp Gly Ile Ser Val Phe Lys Gly Asn Arg Arg Val Gly 20 25 30 Tyr Ile Thr Gly Leu Lys Lys Asp Leu Ala Lys Gln Val Lys Arg Lys 35 40 45 Thr Thr Ile Lys Glu Tyr Arg Asn Arg Arg Leu Glu Gln Ala Arg Asp 50 55 60 Met Leu Pro Asp Ala Val Glu Glu Met Lys Val Phe Leu Glu Asn Gln 65 70 75 80 Leu Ala Lys Tyr Asp Cys Glu Val Phe Ile Asn Gln Thr Gln Pro Asn 85 90 95 Val His Ile Asn Ser Cys Lys Cys Tyr Ile Ile Val Asn Pro Leu Thr 100 105 110 Gly Lys His Arg Leu Gly Ile Ser Asn Pro Asn Arg Ser Ala Ser Asp 115 120 125 Met Ala Glu Asp Val Glu Ala Cys Phe Lys Ile Ser Lys Ser Pro Ala 130 135 140 Glu His His Ile Leu Ile Asn Gly Leu Ser Gln Asp Asp Ile Val Glu 145 150 155 160 Val Ile Lys Thr Leu Cys Met 165 <210> 14 <211> 90 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Enterobacteria phage T4 Asia <400> 14 Met Asn Lys Asn Ile Asp Thr Val Arg Glu Ile Ile Thr Val Ala Ser 1 5 10 15 Ile Leu Ile Lys Phe Ser Arg Glu Asp Ile Val Glu Asn Arg Ala Asn 20 25 30 Phe Ile Ala Phe Leu Asn Glu Ile Gly Val Thr His Glu Gly Arg Lys 35 40 45 Leu Asn Gln Asn Ser Phe Arg Lys Ile Val Ser Glu Leu Thr Gln Glu 50 55 60 Asp Lys Lys Thr Leu Ile Asp Glu Phe Asn Glu Gly Phe Glu Gly Val 65 70 75 80 Tyr Arg Tyr Leu Glu Met Tyr Thr Asn Lys 85 90

Claims (24)

  1. (i) 유도성 프로모터의 조절하에 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    (ii) 상기 세균 숙주 세포에 이종인 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    (iii) 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 조절하에 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는,
    세균 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    성장이 전사, DNA-복제 및/또는 세포분열의 억제에 의해 억제되는, 세균 숙주 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 파지 단백질이
    (i) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 단백질로서,
    여기에서 상기 단백질은
    (a) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
    (b) 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (ii) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 단백질로서,
    여기에서 상기 단백질은
    (a) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
    (b) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (iii) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 인산화하는 단백질로서,
    여기에서 상기 단백질은
    (a) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 인산화하는 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
    (b) 서열번호 3에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 인산화하는 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (iv) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 단백질로서,
    여기에서 상기 단백질은
    (a) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
    (b) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (v) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 단백질로서,
    여기에서 상기 단백질은
    (a) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
    (b) 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (vi) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 단백질로서,
    여기에서 상기 단백질은
    (a) 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
    (b) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 DNA 복제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (vii) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 단백질로서,
    여기에서 상기 단백질은
    (a) 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
    (b) 서열번호 7에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 세균 숙주 세포 RNA 폴리머라제를 억제하는 아미노산 서열을 갖는 단백질;
    (viii) 숙주 전사 차단을 일으키는 단백질로서,
    여기에서 상기 단백질은
    (a) 숙주 전사 차단을 일으키는 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14에 나타낸 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 단백질; 또는
    (b) 서열번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14에 나타낸 아미노산 서열에 40% 이상, 예를 들어 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 동일성을 갖고 숙주 전사 차단을 일으키는 아미노산 서열을 갖는 단백질인. 세균 숙주 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 상기 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 상기 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 또는 염색체외 벡터에 의해 포함되는, 세균 숙주 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 유도성 또는 구성적 프로모터의 조절하에 있는, 세균 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 RNA 폴리머라제가 박테리오파지 T3 RNA 폴리머라제, T7 박테리오파지 RNA 폴리머라제, 조작된 직교 T7 RNA 폴리머라제, 박테리오파지 SP6 RNA 폴리머라제 또는 박테리오파지 Xp10 RNA 폴리머라제인, 세균 숙주 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유도성 프로모터가 아라비노스, IPTG, 트립토판, 자일로스, 람노스, 포스페이트 또는 파지 람다 cl 단백질에 의해 조절되는, 세균 숙주 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    비-기능성 아라비노스 오페론을 갖는, 세균 숙주 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    이. 콜라이(E. coli)인, 세균 숙주 세포.
  10. (i) 유도성 프로모터의 조절하에 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 제3항에 정의된 바와 같은 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    (ii) 상기 세균 숙주 세포에 이종인 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는,
    세균 숙주 세포 제제.
  11. 세균 숙주 세포를, 제3항에 정의된 바와 같은 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환시킴을 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 숙주 세포의 생성 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 세균 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양하고 관심 단백질을 수득함을 포함하는, 관심 단백질의 생성 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 세균 숙주 세포를 적합한 조건하에서 배양하고 관심 단백질을 수득함을 포함하는, 관심 단백질의 수율을 증가시키는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    배양 단계가
    (a) 세균 세포를 적어도 20 g/L 세포 건조 질량(CDM)의 밀도로 증식시키고;
    (b) 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하고;
    (c) 0.05 h-1의 초기 성장률을 허용하는 일정한 선형 공급율로 세균 세포를 공급시키고;
    (d) 상기 세균 세포를 적어도 12시간 동안 추가로 배양함
    을 포함하는, 방법.
  15. 관심 단백질의 수율을 증가시키는 방법으로서, 세균 숙주 세포에 이종인 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상기 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 조절하에 있는 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세균 숙주를, 유도성 프로모터의 조절하에 상기 세균 숙주 세포의 성장을 억제하는 파지로부터의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환시킴을 포함하는, 방법.
  16. 관심 단백질의 생성 방법으로서, 적합한 조건하에서 제10항의 제제를, 제10항에 정의된 바와 같은 RNA 폴리머라제에 의해 인식되는 프로모터의 조절하에 관심 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열과 접촉되게 함을 포함하는, 방법.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    관심 단백질이 세포에 독성이고, 생존력, 세포 성장 및/또는 세포분열에 불리한 영향을 미치는, 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    관심 단백질을 변형시키고/시키거나 관심 단백질을 적어도 하나의 추가적인 성분을 포함하는 조성물로 제형화함을 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    관심 단백질을 표지물로 변형시키는, 방법.
  20. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 세균 숙주 세포를 배양하고 관심 화합물의 생성을 위해 상기 세균 숙주 세포에 의해 전환되고/되거나 사용되는 화합물을 부가함을 포함하는, 관심 단백질의 생성 방법.
  21. 관심 단백질의 생성을 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 제10항의 제제의 용도.
  22. 관심 단백질의 수율을 증가시키기 위한 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 제10항의 제제의 용도.
  23. 숙주 세포에서 관심 단백질의 수율을 증가시키기 위한 제3항에 정의된 바와 같은 파지 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 용도.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 관심 단백질이 T7 프로모터의 조절하에 있고 상기 숙주 세포가 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 용도.

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