CN107849573A - 生长和蛋白质生产的解偶联 - Google Patents

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Abstract

本发明属于重组生物技术领域，特别属于蛋白质表达领域。本发明一般涉及在生产过程中提高细菌宿主细胞的目的蛋白质的表达水平的方法。本发明特别涉及通过在生产过程中表达抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质来提高细菌宿主细胞表达目的蛋白质的能力。在生产过程中使制造目的蛋白质的细菌宿主细胞的生长解偶联减少(i)代谢负担，(ii)氧需求，(iii)代谢热发展，和(iv)避免由异源蛋白质表达引起的应激反应，由此提高宿主细胞产生目的蛋白质的能力。本发明还涉及宿主细胞在蛋白质表达、细胞培养技术中的用途，更具体地涉及培养宿主细胞以产生目的蛋白质。

Description

生长和蛋白质生产的解偶联
技术领域
本发明属于重组生物技术领域，特别属于蛋白质表达领域。本发明一般涉及在生产过程中提高细菌宿主细胞的目的蛋白质的表达水平的方法。本发明特别涉及通过在生产过程中表达抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质来提高细菌宿主细胞表达目的蛋白质的能力。在生产过程中使制造目的蛋白质的细菌宿主细胞的生长解偶联减少(i)代谢负担，(ii)氧需求，(iii)代谢热发展，和(iv)避免由异源蛋白质表达引起的应激反应，由此提高宿主细胞产生目的蛋白质的能力。本发明还涉及宿主细胞用于蛋白质表达、细胞培养技术的用途，更具体地涉及培养宿主细胞以生产目的蛋白质。
背景技术
用许多原核宿主已经成功生产出目的蛋白质(POI)。最突出的例子是细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。虽然一些蛋白质的生产已容易地实现高收率，但其它许多蛋白质的生产水平仍相对很低。
在过去十年中已经生产了大量生物药物(例如抗体或其功能性片段)，而且越来越多接近被批准用于人体，但是生物药物的高效生产依然是一项具有挑战性的任务。每次给药的治疗活性剂量通常为毫克(mg)级。因此，作为活性成分需要相当数量的蛋白质，使得有效率和节约成本的生产有价值。
细菌细胞表达系统长期以来一直且目前仍是用于生产这些类型分子的主要工具之一。过程优化的关键目标是以尽可能低的成本获得高产量的具有所要求质量的产品，其通常由特定的表达构建体或系统的特性决定。例如，重组蛋白的高水平表达可能抑制宿主细胞的代谢能力，从而导致质粒损失、氧转移减少、毒副产物的产生、包涵体的形成、和/或触发经常损害有效的蛋白质生产的应激反应。还已知有时编码目的蛋白质的mRNA的高表达不一定带来蛋白质的高量。科学家已经采取了不同的方法来解决这些问题。
例如，通过优化编码目的蛋白质的基因剂量，通过使用合适的启动子，或者根据所用宿主细胞通过优化编码目的蛋白质的基因的密码子使用，可以进一步提高重组蛋白的表达。其它几种参数也显示会影响宿主细胞中重组蛋白的表达水平，例如表达载体设计、培养基组成、生长温度、伴侣共表达、mRNA稳定性、翻译起始和表观遗传过程。
然而，宿主细胞中蛋白质的高水平生产可能受限于一个或多个不同步骤，如折叠、二硫键形成、糖基化、细胞内转运或从细胞释放。所涉及的许多机制尚未完全了解，即使可得到宿主生物体的整个基因组的DNA序列，也不能基于现有技术的现有知识进行预测。
在宿主细胞中生产蛋白质的另一个问题是这种蛋白质对宿主细胞的潜在毒性。因此，发展出了所谓的静止细胞(Q细胞)的概念(WO 2007/071959)。在Q细胞中，可以关闭正常的允许产生有毒蛋白质的细胞机制。为了关闭Q-细胞，必须加入吲哚。然而，对于一些应用来说，吲哚可能是不期望的。另一个将宿主细胞的生产机构朝向生产目的蛋白质转变的概念是大肠杆菌中的单一蛋白质生产(SSP)系统。表达所谓的mRNA干扰酶，其在ACA核苷酸序列处切割RNA，而编码目的蛋白质的mRNA缺少ACA碱基三联体(Suzuki等人，(2007)，NatureProtocols 2(7)，1802-1810)。引导宿主细胞的代谢能力朝向产生重组蛋白而不是生长的另一种选择是利用RNA干扰引起细胞周期停滞并因此将代谢通量引导朝向产物形成(Ghosh等人，(2012)，Microbial Cell Factory 11：93)。
鉴于现有技术中关于以合理量生产蛋白质(也包括在宿主细胞中的潜在毒性蛋白质)存在的各种问题，尽管在过去几年中已经得到许多优势，仍然需要识别和开发另外的/替代的方法来改善宿主细胞产生大量重组蛋白质包括潜在毒性蛋白质的能力。因此，本发明的技术问题是符合这一需求的。
发明内容
作为上述技术问题的解决方案，本发明提供了提高宿主细胞中重组蛋白质产量的新手段和新方法，该新手段和新方法简单有效，适用于工业方法中。这些手段和方法在本文中描述，在实施例中说明，并在权利要求中反映。
特别地，本发明人发现了一种新的将宿主细胞的生长与生产目的蛋白质解偶联的分子机制。由其增殖和同时表达异源蛋白质带给宿主细胞的双重负担降低了目的蛋白质的产量。事实上，宿主细胞在生产目的蛋白质期间的增殖造成宿主细胞的过负荷，导致细胞资源分配的冲突。由此，引发了诸如产生有毒副产物、降低氧转移和诱发应激反应等多种不希望的副作用，最终导致限制转录和翻译以及可能导致细胞死亡的细胞代谢重新定向。鉴于细胞合成能力是异源蛋白质表达的基础，必须考虑宿主细胞的能力。为了减少或消除异源蛋白质表达的不利的副作用，本发明人开发了一种表达系统，其将目的蛋白质的生产与宿主细胞的增殖解偶联，由此显著降低宿主细胞的负荷，提高目的蛋白质的产量。
更具体地，本发明人通过设计包含在诱导型启动子控制下的抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质的宿主细胞，利用抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质。这允许当达到所需的细胞密度时，在生产过程中随意关闭宿主细胞增殖，同时只要所需资源存在就保持宿主细胞生产目的蛋白质的能力。于是，氧消耗、营养需求和代谢热发展被减少，应激反应被避免，因此可得到足够的资源用于生产目的蛋白质。异源蛋白质表达的另外一个问题是目的蛋白质掺入包涵体，导致溶解度和产量降低。这种作用可以如由Vernet等人所示的(2010，Protein Expression and Purification，Vol.77，Issue 1：104-111)通过减少细胞增殖和降低诱导温度来避免，也因此可以通过本发明的生长解偶联生产系统来避免。
本发明人已经发现抑制细胞生长的噬菌体蛋白可用于使宿主细胞的生长和所述宿主细胞生产目的蛋白质解偶联。事实上，噬菌体蛋白质理想地使宿主细胞中止，而对所述噬菌体蛋白不敏感的表达系统则可以理想地充分利用中止的宿主细胞的蛋白质生产机构。例如，在感染后，噬菌体T7利用其gpo.7和Gp2蛋白关闭大肠杆菌RNA聚合酶。在细菌启动子控制下的噬菌体T7的早期病毒I类基因，例如对在T7启动子控制下的病毒基因具有高度特异性的T7RNA聚合酶，在感染之后立即表达。Gp0.7即所述I类基因，其尤其磷酸化大肠杆菌RNA聚合酶，导致早期基因转录终止，并且从宿主转向病毒RNA聚合酶。随后，病毒基因Gp2被表达，结合并进一步抑制宿主RNA聚合酶的β亚基。Gp0.7和/或Gp2一起抑制大肠杆菌RNA聚合酶，并且由此抑制细胞增殖，导致细菌蛋白质合成机构接管用于病毒目的。通过Gp2抑制大肠杆菌RNA聚合酶由Studier和Moffat示出(1986，J.Mol.Biol.，189，133-130)，但他们没有揭示对细胞增殖的影响。
然而，除了Gp0.7和Gp2之外，还有其它这样的噬菌体蛋白质，并且已被本发明人用来显示他们这样的概念：使用噬菌体蛋白质，通过使用对这种噬菌体蛋白不敏感的表达系统，使宿主细胞生长与其生产目的蛋白质的能力解偶联。其它这样的噬菌体蛋白质是，例如Nun、Gp6、Gp8或A*，芽孢杆菌(Bacillus)噬菌体SPO1 GP40 SPO1 GP40，葡萄球菌(Staphylococcus)噬菌体G1 GP67，嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)噬菌体P23-45GP39，肠杆菌(Enterobacteria)噬菌体PhiEco32 GP79，水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzae)噬菌体Xp10 P7蛋白，肠杆菌噬菌体T4 Alc蛋白，肠杆菌噬菌体T4Asia或枯草芽孢杆菌ykzG蛋白，它们是本领域已知的并且也在本文描述。
为生产目的蛋白质的目的，本发明人通过产生一种细菌宿主细胞采用了上述功能性原理，所述细菌宿主细胞包含(i)在诱导型启动子控制下的抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质，(ii)在细菌宿主细胞中不存在的异源RNA聚合酶，和(iii)在由所述异源RNA聚合酶识别的启动子控制下的目的蛋白质，由此便于抑制细胞增殖并将宿主细胞的能力集中在目的蛋白质的生产上。
作为示例，本发明人使用包含在阿拉伯糖诱导型启动子控制下的噬菌体T7 Gp2蛋白的NEB10-β大肠杆菌宿主细胞。在诱导Gp2表达时，观察到强的剂量依赖性生长抑制。随后，他们使用包含在T7启动子控制下的GFP基因的基因组整合拷贝和编码在阿拉伯糖诱导型启动子控制下的Gp2基因的表达载体的大肠杆菌菌株HMS174(DE3)TN7：：<T7GFP>。他们可以示出，与单独表达GFP的宿主细胞相比，在Gp2的伴随表达下增加了GFP的表达。
必须指出，如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，单数形式“一种”、“一个”和“该/所述”包括复数指代。因此，例如，提及“一种表达盒”包括本文公开的一种或多种表达盒，提及“该/所述方法”包括提及本领域普通技术人员已知的可以被修饰或代替本文所述的方法的等同步骤和方法。
本公开引用的所有出版物和专利的全部内容通过引用并入本文。在通过引用并入的材料与本说明书相矛盾或不一致的情况下，本说明书将取代任何此类材料。
除非另有说明，在一系列要素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个要素。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方式。意在本发明涵盖这样的等同方式。
在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，单词“包括/包含(comprise)”和诸如“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”之类的变形将被理解为指的是包含所述要素或步骤或者要素组或步骤组，但不排除任何其他要素或步骤或者要素组或步骤组。当在本文中使用时，术语“包括/包含(comprising)”可以用术语“含有(containing)”代替，有时用于本文中时可以用术语“具有(having)”代替。
用于本文中时，“由……组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”不排除不会实质上影响权利要求的基本特征和新颖性特征的材料或步骤。在本文中的每一情况下，术语“包括/包含(comprising)”、“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“由……组成(consisting of)”中的任何一个可以用其他两个术语中的任一个替代。
如本文所使用的术语“约”或“近似”是指在给定值或范围的20％内，优选在10％内，更优选在5％内。它还包括具体数字，例如约20个包括20个。
除非本文另有定义，与本发明相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行。通常，本文所述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交技术相关使用的命名是本领域熟知和常用的那些。
除非另有说明，本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书中引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中描述的进行。参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Cold SpringLaboratory Press，Cold Spring Hobor，N.Y.(2001)；Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，J，Greene Publishing Associates(1992，and Supplements to2002)；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol I 1976 CRC Press；Handbook of Biochemistry：Section A Proteins，Vol II 1976 CRC Press。本文所述的与分子和细胞生物学、蛋白质生物化学、酶学以及医药学和药物化学相关使用的命名以及分子和细胞生物学、蛋白质生物化学、酶学以及医药学和药物化学的实验室程序和技术是本领域熟知和常用的那些。
在本说明书的整个文本中引用了数篇文件。本文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)，无论是上文还是下文都通过引用整体并入本文。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明由于在先的发明而无权先于这种公开。
本发明一般涉及在生产过程中增加从宿主细胞的目的蛋白质表达水平的方法。本发明特别涉及通过在生产过程中表达抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质来提高细菌宿主细胞表达目的蛋白质的能力。在生产过程中使制造目的蛋白质的细菌宿主细胞的生长解偶联减少(i)代谢负担，(ii)氧需求，(iii)代谢热发育，和(iv)避免由异源蛋白质表达引起的应激反应，由此提高宿主细胞生产目的蛋白质的能力。本发明还涉及宿主细胞在蛋白质表达、细胞培养技术中的用途，还涉及培养宿主细胞以生产目的蛋白质。
因此，本发明的目的在于提供一种细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞
(i)包含在诱导型启动子控制下的编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列；和
(ii)包含编码对于所述细菌宿主细胞是异源的RNA聚合酶的核苷酸序列；和
(iii)包含在由所述RNA聚合酶识别的启动子控制下的编码目的蛋白质的核苷酸序列。
如本文所使用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)意在是指已经向其中引入了包含表达盒或载体的核酸的任何原核细胞，即已经是基因工程化的任何原核细胞。原核宿主细胞的优选例子是大肠杆菌。然而，还设想了假单胞菌(Pseudomonas)属、沙门氏菌(Salmonella)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、乳杆菌(Lactobacillus)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、微杆菌(Microbacterium)属或放线菌(Actinomycetes)属。应当理解，这些术语意在不仅指特定的受试细胞，而且还指所述细胞的后代。在以后的传代中，由于突变或环境影响，可能发生某些修饰，所以这种后代实际上可能与亲本细胞不相同，但仍包括如本文所使用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞可以是分离的细胞，优选在培养物中生长的。
在优选的实施方案或本发明中，细菌宿主细胞是大肠杆菌。
为了产生本发明的细菌宿主细胞，技术人员知晓本领域已知的遗传工程技术。例如，多种试剂盒可用于基因工程化细菌宿主细胞，以将包含核苷酸序列的核酸随机或靶向整合到细菌基因组中；参见例如Zhang等人(1998)，Nature Genetics 20，123-128或Sharan等人(2009)，Nature Protocols 4(2)，206-223。技术人员还进一步知晓用于转化细菌宿主细胞的技术以及可用于产生染色体外元件如质粒、粘粒、杆粒等的任何其他克隆技术。
如本文所使用的术语宿主细胞的“生长”是指由于细胞分裂引起的细胞数目的增加。
如本文所使用的启动子序列是非编码表达控制序列，优选被插入在表达盒的编码序列的起点附近并调节所述序列表达。以简单但基本正确的方式描述，是启动子与被称为转录因子的各种专门化蛋白质的相互作用决定了给定编码序列是否可被转录并最终翻译为由该基因编码的实际的蛋白质。本领域技术人员将认识到，任何相容的启动子都可用于宿主细胞中的重组表达。上游激活序列、增强子序列或其组合可以在启动子本身前面。这些序列在本领域已知为在细胞中表现出强转录活性且来自编码细胞外或细胞内蛋白的基因的任何DNA序列。本领域技术人员还将认识到，终止和聚腺苷酸化序列可以适当地与所述启动子来自相同的来源。
如本文所使用的术语“诱导型启动子”是指响应于内源性或外源性刺激的存在与否而调节可操作连接的基因或功能性RNA的表达的启动子。所述刺激可以是但不限于化学化合物或环境信号。
“可操作连接的”表达控制序列是指表达控制序列与表达盒相邻的连接，以及以反式或在一定距离处作用为控制表达盒表达的表达控制序列。
如本文所使用的术语“核苷酸序列”或“核酸分子”是指通常从一个脱氧核糖或核糖连接至另一个脱氧核糖或核糖的核苷酸的聚合物形式(即多核苷酸)。术语“核苷酸序列”优选包括DNA或RNA的单链和双链形式。本发明的核酸分子可以包括RNA(含有核糖核苷酸)的有义链和反义链、cDNA、基因组DNA以及上述的合成形式和混合聚合物。如本领域技术人员将容易理解的，它们可以被化学或生物化学修饰或者可以含有非天然或衍生化的核苷酸碱基。所述修饰包括，例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及核苷酸间修饰如不带电荷的键合(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带电键合(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧链基团(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷基化剂和修饰的键合(例如，α异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸通过氢键合和其他化学相互作用结合指定序列的能力的合成分子。所述分子是本领域已知的，包括例如其中肽键替代分子主链中的磷酸酯键的那些分子。
在这方面，作为表达产物的核酸优选为RNA，而待引入细胞的核酸优选为DNA，例如基因组DNA或cDNA。
核酸可以是任何拓扑构象。例如，核酸可以是单链的、双链的、三链的、四链的、部分双链的、带支链的、发夹状的、环状的或挂锁形构象。
“多肽”是指包含通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物的分子。所述术语在本文中并不是指所述分子的特定长度，因此在本文中可与术语“蛋白质”互换使用。当在本文中使用时，术语“多肽”或“蛋白质”还包括由表达盒或载体表达或者可以从本发明的宿主细胞中分离的“目的多肽”或“目的蛋白质”。目的蛋白质还包括可能潜在地对宿主细胞有害或甚至有毒的蛋白质。
目的蛋白质的例子为酶，更优选为淀粉分解酶、脂肪分解酶、蛋白水解酶、纤维素分解酶(cellulytic enzyme)、氧化还原酶或植物细胞壁降解酶；最优选为具有选自氨基肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖苷酶、卤代过氧化物酶、半纤维素酶、转化酶、异构酶、漆酶、连接酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、植酸酶、酚氧化酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转移酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶的活性的酶。此外，目的蛋白质也可以是生长因子、细胞因子、受体、受体配体、治疗性蛋白质(如干扰素、BMP、GDF蛋白、成纤维细胞生长因子)、肽(如蛋白质抑制剂、膜蛋白、膜相关蛋白、肽/蛋白激素、肽类毒素、肽抗毒素)、抗体或其功能片段(如Fab或F(ab)2)或抗体的衍生物例如双特异性抗体(例如scFv)、嵌合抗体、人源化抗体、单结构域抗体(如纳米抗体)或结构域抗体(dAb)或anticalin等。
如本文所使用的“多肽”涵盖天然存在的和非天然存在的蛋白质、及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是与宿主细胞同源的(天然的)或异源的多肽。目的多肽还可以涵盖宿主细胞天然多肽，其由核酸序列编码，其表达由一个或多个对编码该多肽的核酸序列外源的控制序列控制。多肽可以是任何长度的。多肽包括任何活性或生物活性的蛋白质和/或肽。“肽”涵盖模拟结构性功能以及生物学功能的类似物和模拟物。
多肽可以进一步形成二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由超过一个多肽分子组成。形成所述二聚体、三聚体等的多肽分子可以相同或不相同。因此，相应的更高级结构称为同二聚体或异二聚体，同三聚体或异三聚体等。
此外，多肽可以包含多个不同的结构域，每个结构域具有一个或多个不同的活性。
编码本发明的蛋白质或目的蛋白质的核酸序列可以从任何原核、真核或其它来源获得。
如本文所述，编码本发明的蛋白质或目的蛋白质的核苷酸序列优选由启动子调控。所述启动子优选由对于所述宿主细胞是异源的并且其表达可以是诱导性的RNA聚合酶特异性转录。然而，所述RNA聚合酶也可以被组成性表达。
当在本文中使用时，术语“细菌宿主细胞(的)生长”是指与不表达抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质、包含编码对于所述细菌宿主细胞是异源的RNA聚合酶的核苷酸序列、并且包含在由所述RNA聚合酶识别的启动子控制下的编码目的蛋白质的核苷酸序列的宿主细胞相比，宿主细胞在其生长方面至少是受损的。值得注意的是，不排除这样的宿主细胞，该宿主细胞不表达所述噬菌体蛋白质，但是仍然包含在诱导型启动子控制下的编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列。事实上，这样的宿主细胞是优选的参照细胞，例如，用于测定如上所述的生长受损。换句话说，当应该测定生长受损时，本领域技术人员可以容易地将所述噬菌体蛋白质的表达被诱导时的本发明的宿主细胞与所述噬菌体蛋白质的表达不被诱导时的宿主细胞相比较。
当如本文所述“细菌宿主细胞(的)生长”受到抑制时，生长优选包括转录、DNA复制和/或细胞分裂。因此，优选的是噬菌体蛋白质，特别是本文所述的一种或多种噬菌体蛋白质抑制转录、DNA复制和/或细胞分裂。
本文所述的“噬菌体蛋白质”是来自(细菌)噬菌体的蛋白质。噬菌体感染细菌并且能够在所述细菌中复制。当感染细菌并在所述细菌中复制时，为了充分利用所述细菌的蛋白质合成机构，噬菌体可以具有一种或多种例如通过抑制转录、DNA复制和/或细胞分裂来抑制所述细菌生长的蛋白质。
因此，本发明可以使用任何通过引起例如宿主转录关闭而实现抑制细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白质来实施。在这种情况下，所述细菌宿主细胞包含在诱导型启动子控制下的编码来自噬菌体的引起所述细菌宿主细胞的转录关闭的蛋白质的核苷酸序列。如本文所使用的术语“宿主转录关闭”涉及抑制细菌宿主细胞的转录。本文描述了可用于引起宿主转录关闭的蛋白质，例如Gp2、GP0.7、Nun、Gp6、Gp8、A*、YkzGε-亚基。然而，也可以使用实现宿主转录关闭的其它蛋白质来实施本发明。这样的蛋白质可以是，例如芽孢杆菌噬菌体SPO1 GP40 SPO1 GP40、葡萄球菌噬菌体G1 GP67、嗜热栖热菌噬菌体P23-45 GP39、肠杆菌噬菌体PhiEco32 GP79、水稻黄单胞菌噬菌体Xp10 P7蛋白、肠杆菌噬菌体T4 Alc蛋白、肠杆菌噬菌体T4 Asia蛋白。
示例性地，实施例1结合图1说明了通过抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的噬菌体Gp2蛋白的诱导表达抑制宿主细胞的转录，根据诱导分子阿拉伯糖抑制了宿主细胞的生长。
因此，本发明的噬菌体蛋白优选为
(i)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有Seq Id No：1所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与Seq Id No：1所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质；
(ii)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有Seq Id No：2所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与Seq Id No：2所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质；
(iii)磷酸化细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)磷酸化细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有Seq Id No：3所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)磷酸化细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与Seq Id No：3所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质；
(iv)抑制细菌宿主细胞DNA复制的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有Seq Id No：4所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有与Seq Id No：4所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质；
(v)抑制细菌宿主细胞DNA复制的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有Seq Id No：5所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有与Seq Id No：5所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质；或者
(vi)抑制细菌宿主细胞DNA复制的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有Seq Id No：6所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有与Seq Id No：6所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质；
(vii)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有Seq Id No：7所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与Seq Id No：7所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质；
(viii)引起宿主转录关闭的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)引起宿主转录关闭的具有Seq Id No：8、9、10、11、12、13、14所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)引起宿主转录关闭的具有与Seq Id No：8、9、10、11、12、13或14所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质。
在本发明的另一个优选实施方案中，编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的所述核苷酸序列，编码所述RNA聚合酶的所述核苷酸序列，编码目的蛋白质的所述核苷酸序列被整合到所述宿主细胞的基因组中或者由染色体外载体包含。
如本文所使用的术语“载体”是指包含本发明基因或编码目的蛋白质的基因的表达盒可以插入或克隆到其中的核酸序列。此外，载体还可以编码赋予宿主细胞选择性的抗生素抗性基因。优选地，所述载体是表达载体。
所述载体可能能够在宿主细胞中自主复制(例如具有在宿主细胞中发挥作用的复制起点的载体)。载体可以是线性、环状或超螺旋结构，并且可以与其它载体或其它材料复合以用于某些目的。
本文使用的用于表达包含本发明基因或编码目的蛋白质的基因的表达盒的载体通常包含作为表达盒元件的适于驱动转录的转录控制元件，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录暂停或终止信号。为了适当表达多肽，载体中优选包括合适的翻译控制元件，例如，产生5′帽结构的5′非翻译区，所述5′帽结构适合于招募核糖体和终止翻译过程的终止密码子。特别地，作为选择性标记物基因的核苷酸序列以及编码目的蛋白质的核苷酸序列可以在存在于适当启动子中的转录元件控制下进行转录。选择性标记物基因产生的转录产物和目的蛋白质的转录产物携带促进显著水平的蛋白质表达(即翻译)和适当翻译终止的功能性翻译元件。
载体可以包含多接头(多克隆位点)，即包含许多限制性位点的短DNA段，这是用于分子克隆的很多质粒的标准特征。多克隆位点通常包含超过5个、10个、15个、20个、25个或超过25个的限制性位点。MCS(多克隆位点)内的限制性位点通常是唯一的(即，在该特定质粒内只存在一次)。MCS通常用于涉及分子克隆或亚克隆的程序中。
一种类型的载体是质粒，所述质粒是指可通过连接或通过无限制克隆向其中引入其它DNA区段的环状双链DNA环。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或微型染色体。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它DNA区段可以连接到病毒基因组中。
本发明还涉及可以整合到宿主细胞基因组中并由此与宿主细胞基因组一起复制的载体。所述表达载体可以包含预定义的限制性位点，所述限制性位点可以在转染前用于线性化载体核酸。技术人员知道如何整合到基因组中。例如，如何放置线性化限制性位点是重要的，因为所述限制性位点决定了载体核酸打开/线性化的位置，继而决定了在构建体整合到宿主基因组中时表达盒的顺序/排列。
根据本发明，抗生素抗性基因是指通过表达相应的基因产物为转化的细胞提供选择性优势(例如抗生素抗性)的基因。所述基因产物赋予表达所述抗生素抗性基因的细胞如下特征：如果细胞培养基中应用基因产物赋予对其的抗性的抗生素，该特征允许将该细胞与不表达抗生素抗性基因的细胞区分开(即细胞的选择性)。所述基因产物可以通过不同的分子机制(例如药物失活、外排增加)赋予细胞抗性。
将包含本发明基因或编码目的蛋白质的基因的表达盒作为DNA构建体插入到表达载体中。该DNA构建体可以由合成DNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子或其组合重组制备。该DNA构建体优选通过根据本领域已知的标准技术将不同的片段彼此连接而制备。
包含本发明基因或编码目的蛋白质的基因的所述表达盒可以是表达载体的一部分。优选地，所述表达载体是DNA载体。所述载体方便地包含促进编码目的蛋白质的基因和抗生素抗性基因的适当表达的序列。这些序列通常包括但不限于如本文所述的启动子序列、转录起始位点、转录终止位点和聚腺苷酸化功能。
所述表达盒可以包含增强子和/或内含子。内含子通常位于开放阅读框的5′末端。因此，为了提高表达率，内含子可以包含在用于表达目的多肽的表达盒中。所述内含子可以位于启动子和/或启动子/增强子元件与待表达的多肽的开放阅读框的5′末端之间。现有技术中已知的几种合适的内含子可以与本发明结合使用。
根据本发明的存在于宿主中的表达盒或载体可以整合到宿主的基因组中，或者可以以染色体外的某种形式维持。
此外，表达盒还可以包含适当的转录终止位点。因为从上游启动子通过第二转录单位的持续转录可能抑制下游启动子的功能，这种现象即被称为启动子闭塞或转录干扰。上述过程在原核生物和真核生物中都已所描述。在两个转录单位之间适当地放置转录终止信号可以防止启动子闭塞。转录终止位点被清楚地表征，并且它们整合到表达载体中已被证明对基因表达具有多种有益效果。
本文使用的术语“5”’和“3”’是指用于描述与遗传元件的位置和/或事件方向(5’至3’)有关的核苷酸序列的特征的惯例，所示事件例如按照5′至3′方向进行的通过RNA聚合酶的转录或通过核糖体的翻译。同义词是上游(5′)和下游(3′)。通常，从左到右以5′至3′绘制核苷酸序列、基因图、载体卡和RNA序列，或者用箭头指示5′至3′的方向，其中箭头指向3′方向。因此，遵循这样的惯例时，5′(上游)表示遗传元件位于左手侧，3′(下游)表示遗传元件位于右手侧。
如本文所用的术语“表达”是指核苷酸序列的转录。所述核苷酸序列优选编码蛋白质。因此，该术语还包括产生mRNA(作为来自核苷酸序列的转录产物)和该mRNA的翻译以产生相应的基因产物，例如多肽或蛋白质。
有利的是，RNA聚合酶与包含编码所述RNA聚合酶的核苷酸序列的细菌宿主细胞是异源的。“异源(的)”是指RNA聚合酶不天然存在于所述细菌宿主细胞中，即所述细菌宿主细胞不天然地包含所述RNA聚合酶，除非根据本发明教导通过本领域已知的手段和方法，编码所述RNA聚合酶的核苷酸序列被引入所述细菌宿主细胞中。因此，RNA聚合酶理想地对抑制所述细菌宿主细胞生长的噬菌体蛋白不敏感。
优选地，所述RNA聚合酶是噬菌体T3 RNA聚合酶、T7噬菌体RNA聚合酶、工程正交T7RNA聚合酶、噬菌体SP6 RNA聚合酶或噬菌体Xp10 RNA聚合酶。其他RNA聚合酶，如工程正交T7聚合酶在Temme等人，(2012)Nucleic Acids Research 40(17)，8773-8781中有所描述。
在本发明的一个优选实施方案中，编码RNA聚合酶的核苷酸序列在诱导型或结构型启动子控制下。诱导型启动子的例子在本文中描述于诱导型启动子的上下文中，该诱导型启动子控制编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列。这些诱导型启动子也是如下文中所述的控制RNA聚合酶的诱导型启动子的优选例子。
优选地，控制编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列的诱导型启动子由阿拉伯糖、IPTG、色氨酸、木糖、鼠李糖、磷酸盐或噬菌体λcl蛋白调控。
关于控制编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列的诱导型启动子或控制编码所述RNA聚合酶的核苷酸序列的诱导型启动子，优选应用相同的诱导型启动子。本文描述了优选的例子。所述优选实施方案允许同时诱导噬菌体蛋白质和RNA聚合酶的表达，以便使生长和蛋白质生产解偶联。但是，当然也可以根据本发明的教导使用不同的诱导型启动子。
在细菌宿主细胞的优选实施方案中，所述宿主细胞具有非功能性阿拉伯糖操纵子。
本发明还提供细菌宿主细胞的制剂，所述制剂
(i)包含在诱导型启动子控制下的编码来自如本文定义的噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列；和
(ii)包含编码对于所述细菌宿主细胞是异源的RNA聚合酶的核苷酸序列。
如本文所使用的“细菌宿主细胞”的“制剂”是指有利地不含完整的、活的细菌宿主细胞但是具有转录和翻译编码目的蛋白质的核苷酸序列的能力的任何制剂，由此所述核苷酸序列在由RNA聚合酶识别的启动子控制下，该RNA聚合酶对于所述制剂来源于其的所述细菌宿主细胞是异源的。这样的制剂可以例如通过细菌宿主细胞的温和裂解或通过机械力例如使所述细菌宿主细胞经受弗式压碎机(France press)来制备。
本发明还包括用于生产如本文所述的宿主细胞的方法，所述方法包括用编码来自噬菌体的抑制如本文定义的所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列、编码T7RNA聚合酶的核苷酸序列和编码目的蛋白质的核苷酸序列转化细菌宿主细胞。
如本文所用的术语“转化”是指通过引入核苷酸序列来改变宿主细胞的基因型。所述核苷酸序列不一定来自不同的来源，但是在某个时候，它是在其待被引入的细胞的外部。
在另一方面，本发明包括用于生产目的蛋白质的方法，所述方法包括在合适的条件下培养如本文所述的细菌宿主细胞和获得所述目的蛋白质。
本领域中有大量合适的方法来在本发明的宿主细胞中产生多肽。通过已建立的技术方便地从培养基、培养的宿主细胞的裂解物或分离的(生物)膜中收获产生的蛋白质。例如，可以通过PCR合成尤其包含编码目的蛋白质的核苷酸序列的表达盒，并将其插入到表达载体中。随后，可以用所述表达载体转化细胞。然后，培养细胞以生产/表达所需的蛋白质，所述蛋白质被分离和纯化。例如，可以通过常规程序从宿主细胞和/或培养基中回收产物，所述常规程序包括但不限于细胞裂解、宿主细胞破碎、离心、过滤、超滤、提取、蒸发、喷雾干燥或沉淀。可以通过本领域已知的各种程序进行纯化，包括但不限于色谱法(例如离子交换、亲和力、疏水性、色谱聚焦和尺寸排除)、电泳程序(例如制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)或提取。
“分离目的蛋白质”是指在引入的载体表达期间或之后分离产生的目的蛋白质。在蛋白质或肽作为表达产物的情况下，除对于蛋白质具有功能而言充分和必要的序列之外，所述蛋白质或肽还可以包含另外的N-或C-末端氨基酸序列。这种蛋白质被称为融合蛋白。
当目的多肽在本发明的宿主细胞中表达时，可能需要通过调整所述核苷酸序列的密码子使用以满足所述宿主细胞的优选密码子使用的频率，来修饰编码所述多肽的核苷酸序列。如本文所使用的，“优选密码子使用的频率”是指本发明的宿主细胞在使用核苷酸密码子以指定给定氨基酸时所表现的偏好。为了确定基因中特定密码子的使用频率，将所述基因中该密码子出现的次数除以所述基因中指定相同氨基酸的所有密码子出现的总次数。类似地，宿主细胞表现的优选密码子使用的频率可以通过将宿主细胞表达的大量基因中的优选密码子使用的频率取平均值而计算得到。优选地，该分析限于由宿主细胞高度表达的基因。首先通过测定宿主细胞使用的单个密码子的使用频率的百分比偏差，然后获得所有密码子的平均偏差，计算宿主细胞使用的合成基因的优选密码子使用频率的偏差百分比。如本文所定义，上述计算包括特别的密码子(即ATG和TGG)。
标签可用于允许目的蛋白质的鉴定和/或纯化。因此，优选地，目的蛋白质包括标签。因此，编码目的蛋白质的核苷酸序列优选也编码标签，所述标签有利地整框遗传融合到编码所述目的蛋白质的核苷酸序列。所述标签可以在所述目的蛋白质的C-末端或N-末端。根据本发明，可以使用的标签的例子包括但不限于HAT、FLAG、c-myc、血凝素抗原、His(例如，6xHis)标签、flag标签、strep标签、strepII标签、TAP标签、几丁质结合结构域(CBD)、麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白A(IgA)、His-6标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签、内含肽和链霉亲和素结合蛋白(SBP)标签。
在进一步的实施方案中，本发明提供了增加目的蛋白质的产量的方法，所述方法包括在合适的条件下培养如本文定义的细菌宿主细胞和获得所述目的蛋白质。
如本文所用的术语“产量”是指例如从重组宿主细胞收获的目的蛋白质的量，并且产量的提高可以是由宿主细胞的目的蛋白质或模型蛋白质的生产量或分泌量增加。产量可以表示为mg蛋白/g宿主细胞的生物量(以干细胞重量或湿细胞重量计)。本文中使用时的术语“滴度”类似地是指生产的目的蛋白质或模型蛋白质的量，表示为g蛋白/L培养液(包括细胞)。当从生产过程中增殖已被暂时抑制的重组宿主细胞中获得的产量与增殖未被改变的宿主细胞获得的产量进行比较时，可以测定产量的增加。
示例性地，实施例3结合图3说明了噬菌体Gp2蛋白的诱导表达导致了模型蛋白GFP的表达增加。
优选地，本文所述的方法包括培养步骤
(a)使细菌细胞生长至至少20g/L细胞干质量(CDM)的密度；
(b)诱导编码抑制宿主细胞生长的噬菌体蛋白质的核苷酸序列的表达；
(c)以允许0,05小时-1的初始生长速率的恒定线性补料速率给细菌细胞补料；和
(d)进一步培养所述细菌细胞至少12小时。
在另一个优选实施方案中，本发明包括用于增加目的蛋白质的产量的方法，所述方法包括用在诱导型启动子控制下的核苷酸序列转化细菌宿主，所述核苷酸序列编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质，所述细菌宿主包含编码对于所述细菌宿主细胞是异源的RNA聚合酶的核苷酸序列和编码目的蛋白质的核苷酸序列，所述核苷酸序列在由所述RNA聚合酶识别的启动子控制下。
一种用于生产目的蛋白质的方法，所述方法包括在合适的条件下使如本文所述的制剂与核苷酸序列接触，所述核苷酸序列包含在由如本文定义的RNA聚合酶识别的启动子控制下的编码所述目的蛋白质的核苷酸序列。
此外，本文所述的方法涉及蛋白质，所述蛋白质对于细胞是毒性的，不利地影响活力、细胞生长和/或细胞分裂。
如本文所使用的术语“毒性(的)”是指目的蛋白质或其衍生物或其前体在表达时对宿主细胞具有不利影响，或者目的蛋白质或其衍生物或其前体代谢为对宿主细胞具有不利影响的衍生物。不利影响的例子是生长抑制。该术语还包括宿主细胞的死亡。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括修饰所述目的蛋白质和/或将所述目的蛋白质配制成包含至少一种另外组分的组合物。
如本文所使用的术语“修饰目的蛋白质”可以是但不限于，与另一种蛋白质融合，添加标记，截短目的蛋白质，添加翻译后修饰，例如乙酰化、葡糖基化、生物素化、氧化、核苷酸添加、酰胺化、氨基酸添加、烷基化、棕榈酰化等等，交联目的蛋白质，目的蛋白质的化学修饰，如聚乙二醇化、胺转化为巯基、巯基封端等等。“标记”可以是荧光标记、生物发光标记、放射性标记、酶标记等等。
本文还设想，本发明的方法可用于通过将化合物引入目的蛋白质中来修饰目的蛋白质。所述化合物的引入可用于标记所述目的蛋白质。这对于蛋白质结构分析可能特别有用。所述化合物的例子是C12、N15、D2O或其任意组合。本发明的方法优势在于所述化合物被专门用于生产目的蛋白质但不用于生产细胞蛋白质。因此，标记目的蛋白质仅需要较少的标记化合物。
此外，本发明的方法可用于通过将非标准氨基酸引入目的蛋白质中来修饰目的蛋白质。这种非标准氨基酸的一个例子是氟代氨基酸(例如4-氟-L-苏氨酸)，该氟代氨基酸可用于氟化目的蛋白质。通过一个或多个标准氨基酸被它们的非标准类似物取代的残基特异性取代，或者通过将琥珀终止密码子整框插入到目的蛋白质的编码序列中的位点特异性取代，非标准氨基酸可以被全局地引入蛋白质中。所述琥珀终止密码子由正交tRNA(例如通过错误酰化的抑制子tRNA)识别，其中所述正交tRNA主要通过正交tRNA合成酶装载非标准氨基酸。
如本文所使用的术语“将目的蛋白质配制成组合物”是指目的蛋白质与一种或多种组分混合，所述组分例如保护目的蛋白质免于降解、变性、恶劣环境或被蛋白酶水解，或者稀释目的蛋白质，或者作为药物施用给患者时提高所述目的蛋白质的药物活性，或者有利于制造过程等等。
在本发明的优选实施方案中，所述目的蛋白质用标记修饰。
如本文所使用的术语“标记”可以是但不限于标签，例如生物素、Strep-标签II、FLAG标签、HA标签、Myc标签、聚(组氨酸)标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)等等，或者荧光探针，例如GFP、RFP、BFP、YFP、mCherry、FITC、TRITC、DyLight荧光素(DyLight Fluor)、PE、量子点(Quantum dot)、Alexa荧光素(Alexaflour)等等，或者酶，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶等等，或者活性位点探针，例如脱硫生物素-FP丝氨酸水解酶探针等等。
一种用于生产目的化合物的方法，所述方法包括培养如本文所述的细菌宿主细胞，和添加待被所述细菌宿主细胞转化和/或使用以用于产生所述目的化合物的化合物。
如本文所使用的术语“目的化合物”可以是但不限于用于塑料的前体或构建块分子，例如将双环[3.2.0]-庚-2-烯-6-酮转化为内酯、醇，例如将前手性羰基化合物转化为手性的，将阿魏酸转化为松柏醛、再转化为松柏醇，或将丁香酚转化成阿魏酸、再转化为松柏醇、再转化为香草醛。
本发明还涉及如本文所述的宿主细胞或制剂用于生产目的蛋白质的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的宿主细胞或制剂用于增加目的蛋白质的产量的用途。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码如本文所定义的噬菌体蛋白质的核苷酸序列用于增加宿主细胞中目的蛋白质的产量的用途。
如本文所述的噬菌体蛋白质的用途，其中目的蛋白质在T7启动子控制下，并且所述宿主细胞包含编码T7RNA聚合酶的核苷酸序列。
附图说明
图1：Gp2的诱导表达以剂量依赖性方式抑制大肠杆菌菌株NEB10-β的宿主细胞生长。
将在阿拉伯糖诱导型启动子控制下的Gp2编码序列克隆在低拷贝f-质粒pKLJ12中(Jones和Keasling(1998)，Biotechnol Bioengineer 59：659-665)。将质粒pKLJ12+Gp2转化在包含araD139突变的大肠杆菌菌株NEB10-β中。结果，NEB10-β不能代谢诱导剂阿拉伯糖。添加不同浓度的阿拉伯糖和由此的Gp2表达以剂量依赖性方式引起增殖抑制。
图2：阿拉伯糖的添加对宿主细胞生长没有影响。
为了排除化合物阿拉伯糖对宿主细胞生长的任何影响，使用了质粒pKLJ12+Gp2的衍生物，该衍生物缺少Gp2表达盒的核糖体结合位点。结果，不能诱导出Gp2的表达，因此添加或不添加阿拉伯糖都没有观察到增殖的差异。
图3：Gp2的诱导表达提高模型蛋白GFP的表达水平。
用质粒pKLJ12+Gp2转化包含在T7启动子控制下的GFP编码序列和在IPTG诱导型启动子控制下的T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株HMS174(DE3)TN7：：<T7GFP>，所述质粒携带在阿拉伯糖诱导型启动子控制下的Gp2编码序列。三个连续的实验表明，与只用IPTG诱导因此表达T7RNA聚合酶而不表达Gp2的宿主细胞相比，用IPTG和阿拉伯糖诱导的表达T7RNA聚合酶和Gp2的宿主细胞在更高程度上表达GFP。
图4：无载体情况下来自pKLJ12+Gp2插入物的Gp2表达增加GFP表达。
用包含Gp2表达盒的pKLJ12+Gp2的插入物转化包含在T7启动子控制下的GFP编码序列和在IPTG诱导型启动子控制下的T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株HMS174(DE3)TN7：：<T7GFP>。在三种情况的两个中，Gp2表达盒的转化导致在IPTG诱导后3小时GFP表达增加。
图5：抑制细菌宿主细胞生长的示例性但仍然优选的(噬菌体)蛋白质的氨基酸序列。
图6：缺少Gp2表达的参照发酵过程。
在参照发酵过程中，Gp2不被表达，因此如所预期的，在生产模型蛋白GFP期间细胞继续生长。因此，在整个发酵过程中，总CDM(细胞干质量)和不含重组蛋白质的CDM增加。GFP的诱导表达导致在整个发酵过程中，特定可溶性GFP和总可溶性GFP都不断增加。
图7：生长和蛋白质生产已被Gp2表达解偶联的示例性发酵过程。
在示例性发酵过程中，Gp2表达引起细胞的生长停滞。结果，在时间点11小时诱导Gp2表达时，不含重组蛋白质的CDM保持恒定，而总CDM由于重组GFP的产生而适度增加。尽管细胞生长停滞，但在发酵过程中，特定可溶性GFP和总可溶性GFP均增加。
图8：Gp2的表达增加GFP的表达水平以及GFP与上清液中可溶性宿主细胞蛋白质(HCP)的比率。
考马斯(coomassie)染色的SDS PAGE凝胶显示，与标准系统(没有基因组整合的诱导型Gp2蛋白的大肠杆菌BL21(DE3))相比，使用生长解偶联系统(具有基因组整合的诱导型Gp2蛋白的大肠杆菌BL21(DE3))的上清液(S)中可溶性GFP增加。而且，与标准系统相比，使用生长解偶联系统的上清液中GFP与HCP(不包括溶菌酶)的相对量要高很多。另外，与标准系统相比，通过使用生长解偶联系统，提高GFP的溶解度。
图9：参照发酵方案。用0.1mM IPTG诱导。
图10：补料分批培养的过程方案以及用阿拉伯糖和IPTG的诱导策略。
图11：BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-蛋白酶)和BL21(DE3)pET30(HIV1-蛋白酶)的摇瓶培养的SDS PAGE分析。
比较了诱导和非诱导的参照菌株和模型菌株培养样品。HIV1-蛋白酶条带位于11kDa。
图12：菌株BL21(DE3)pET30a(HIV1-蛋白酶)和BL21(DE3)：TN7<Gp2ΔAra>pET30a(HIV1-蛋白酶)的生长和产物形成动力学。
(A)参照发酵过程：在补料21小时用20μmol IPTG/g CDM诱导，指数补料速率μ＝0.10h-1；(B)模型发酵过程：在补料11小时用0.1M阿拉伯糖+20μmol IPTG/g诱导，其中指数补料(μ＝0.20h-1)转换为线性补料。
图13：用BL21(DE3)pET30(HIV1-蛋白酶)的参照过程发酵的SDS PAGE分析。
图14：SDS PAGE分析：BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-蛋白酶)的培养。
图15：BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-蛋白酶)[模型过程，绿色]和BL21(DE3)pET30a(HIV1-蛋白酶)[参照过程，红色]的HIV1-蛋白酶产量的比较。
(A，C，E)产生的总HIV1-蛋白酶、可溶性HIV1-蛋白酶和不溶性HIV1蛋白酶的比较；(B，D)总CDM和净CDM的比较；(F)两种系统产生的总HIV1-蛋白酶。
图16：在HCD生物反应器补料分批培养中建立的用于生长解偶联蛋白质表达的补料方案(profile)。
生长曲线和生长速度的理论趋势，计算基于整个培养中恒定的葡萄糖产量系数。
图17：BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)的HCD培养的SDS PAGE分析。
在补料15小时用20μmol IPTG/g CDM和0.1M阿拉伯糖诱导，其中指数补料(μ＝0.17h-1)转换为线性补料。GFP条带位于27kDa。
图18：菌株BL21(DE3)：TN7<Gp2ΔAra>pET30a(GFPmut3.1)的HCD培养的生长和产物形成动力学。
在补料15小时用0.1M阿拉伯糖+20μmol IPTG/g诱导，其中指数补料(μ＝0.20h-1)转换为线性补料。
图19：在生长解偶联系统的HCD培养期间每小时(A)和总(B)O2消耗和CO2形成。
在补料15小时用0.1M阿拉伯糖+20μmol IPTG/g CDM诱导，其中指数补料速率μ＝0.17h-1；补料培养基补充有(NH4)2SO4。
图20：BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)的HCD和非HCD培养的GFPmut3.1产量的比较。
(A，C，E)产生的总GFPmut3.1、可溶性GFPmut3.1和不溶性GFPmut3.1的比较；(B，D)总CDM和净CDM的比较；F)产生的总GFPmut3.1。
具体实施方式
以下实施例说明本发明，但不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：抑制宿主细胞RNA聚合酶而抑制宿主细胞的生长。
为了评估抑制宿主细胞RNA聚合酶对宿主细胞增殖的作用，将在阿拉伯糖诱导型启动子控制下的Gp2编码序列克隆在低拷贝f-质粒pKLJ12中(Jones和Keasling(1998)Biotechnol Bioeng Vol.59，Issue 6：659-665)，锁住质粒仅对宿主细胞构成很小的负担，并且被稳定地维持。已知Gp2蛋白通过结合宿主细胞RNA聚合酶的β-亚基来抑制该酶。将质粒pKLJ12+Gp2转化在包含araD139突变的大肠杆菌菌株NEB10-β中。结果，NEB10-β不能代谢诱导剂阿拉伯糖。在时间点0小时，接种几种培养物，在2小时后通过添加1.5％、0.1％或0.001％的阿拉伯糖来诱导Gp2表达。通过测定OD600nm值来测量细菌的增殖。与省略阿拉伯糖的细菌培养物相比，添加不同浓度的阿拉伯糖和由此的Gp2表达以剂量依赖性方式引起增殖抑制(图1)。为了排除化合物阿拉伯糖对宿主细胞生长的任何影响，使用了质粒pKLJ12+Gp2的衍生物，该衍生物缺少Gp2表达盒的核糖体结合位点。结果，不能诱导出Gp2的表达，因此添加或不添加阿拉伯糖都没有观察到增殖的差异(图2)。
实施例2：Gp2编码表达盒整合在宿主细胞基因组中。
为了在宿主细胞群中赋予Gp2蛋白的稳定表达，通过在TN7基因座处的同源重组将Gp2编码表达盒整合在NEB10-β的基因组中。插入的序列包含在阿拉伯糖启动子控制下的Gp2基因、调节子、终止子和氨苄青霉素抗性基因。为此，通过PCR将50bp的突出端添加到插入元件。该线性PCR产物伴随地用pSIM辅助质粒转化到NEB10-β宿主细胞中，该pSIM辅助质粒赋予介导PCR产物整合在宿主细胞基因组中的蛋白的热休克诱导表达。成功整合后，pSIM质粒可从宿主细胞中撤出(Sharan等人，2009，Nat Protoc.4(2)：206-23)。
实施例3：大肠杆菌中Gp2的诱导表达增加模型蛋白GFP的表达。
用质粒pKLJ12+Gp2转化包含在T7启动子控制下的GFP编码序列和在IPTG诱导型启动子控制下的T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株HMS174(DE3)TN7：：<T7GFP>，所述质粒携带在阿拉伯糖诱导型启动子控制下的Gp2编码序列。培养物接种后约2小时后，添加IPTG以诱导T7RNA聚合酶的表达，由此诱导GFP的表达。接种后约3小时添加阿拉伯糖以便表达Gp2。三个连续的实验表明，与只用IPTG诱导因此表达T7RNA聚合酶而不表达Gp2的宿主细胞相比，用IPTG和阿拉伯糖诱导的表达T7RNA聚合酶和Gp2的宿主细胞在更高程度上表达GFP。在缺少IPTG且添加或不添加阿拉伯糖的两个样品中，由于启动子的渗漏微弱表达GFP(图3)。
实施例4：无载体情况下来自pKLJ12+Gp2插入物的Gp2表达增加GFP表达。
用包含Gp2表达盒的pKLJ12+Gp2的插入物转化包含在T7启动子控制下的GFP编码序列和在IPTG诱导型启动子控制下的T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株HMS174(DE3)TN7：：<T7GFP>。在三种情况的两个中，Gp2表达盒的转化导致在IPTG诱导后3小时GFP表达增加(图4)。
实施例5：示例性发酵过程的描述，其中评估了Gp2表达对模型蛋白GFP产量的影响。
培育模式与过程分析
使细胞在配备有标准控制单元的12L(8L净体积，4L批量体积)计算机控制的生物反应器(MBR；Wetzikon，CH)中生长。通过添加25％氨溶液(ACROS Organics)使pH值保持在7.0±0.05的设定值，温度设定为37℃±0.5℃。为了避免缺氧，通过搅拌器速度和通气速率控制使溶解氧水平稳定在30％饱和度以上。使用专门设计用于在工业环境中在线测量的多波长分光荧光计，(DELTA Light&Optics，Lyngby，丹麦)进行荧光测量。通过添加浓度为0.5ml/l培养基的消泡剂悬浮液(PBG2000)抑制发泡。对于接种，将深冻(-80℃)工作细胞库小瓶解冻，并将1ml(光密度OD600＝1)无菌转移至生物反应器。当培养物在4L批量培养基中已生长至22.5g的细菌干物质进入静止期时，开始补料。随着补料期的开始，培养温度降低到30℃。补料培养基提供足够的组分以产生另外363g的细菌干物质(4次倍增)。
在参照过程(图6)中，使用了(标准)表达系统大肠杆菌BL21(DE3)pET30aGFPmut3.1。补料期的生长速率设定为0.1小时-1，补料开始后经3次倍增，用20μmol IPTG/克CDM通过直接向生物反应器的单个脉冲，进行重组基因表达的诱导。
在采用含有基因组整合的诱导型Gp2蛋白的(标准)表达系统大肠杆菌BL21(DE3)pET30a GFPmut3.1的过程中(图7)，补料期的生长速率设定为0.2小时-1，通过指数底物补料实现3次倍增。然后用20μmol IPTG/克细胞干质量和10mmol阿拉伯糖进行诱导，并将培养基补料转换为线性补料再进行16小时，初始生长速率为0.05小时-1。通过根据指数增长算法x＝xo.eμt提高泵速来控制底物补料，其中叠加底物槽中重量损失的反馈控制。
培养基组成
本研究中使用的基本培养基每升含有3g KH2PO4和6g K2HP04*3H2O。这些浓度提供了所需的缓冲能力，同时也用作磷源和钾源。根据待产生的细菌干物质克数添加其他组分：柠檬酸钠(三钠盐*2H2O；ACROS organics)0.25g，MgSO4*7H2O 0.10g，CaCl2*2H2O 0.02g，微量元素溶液50μl和葡萄糖*H2O 3g。为了加速细胞群的初始生长，将0.15g复合组分的酵母提取物添加到基本培养基中以获得批量培养基。对于补料期，根据待在补料期中产生的363g生物干物质的量制备8L基本培养基，由此每升再次添加磷盐。微量元素溶液：在5N HCl(g/L)中配制：FeSO4*7H2O 40.0，MnSO4*H2O 10.0，AlCl3*6H2O 10.0，CoCl2(Fluka)4.0，ZnSO4*7H2O 2.0，Na2MoO2*2H2O 2.0，CuCl2*2H2O 1.0，H3BO30.50。
离线分析
在600nm处测量光密度(OD)。通过下述测定细菌干物质：将10ml细胞悬浮液离心，在蒸馏水中重新悬浮，然后离心，再重新悬浮以转移到预先称重的烧杯，然后将烧杯在105℃下干燥24小时，重新称重。通过计算细胞干物质的总量(总CDM)来测定细菌生长的过程。
重组蛋白GFP的含量通过ELISA和使用SDS-PAGE凝胶上条带的密度计定量的电泳蛋白质定量法测定。可溶性重组产物通过GFP-ELISA定量，而包涵体中的重组产物使用SDS-PAGE凝胶电泳测定。
另外，使用SDS-PAGE凝胶电泳分析上清液和包涵体。考马斯染色的SDS PAGE凝胶显示，与标准系统相比，使用生长解偶联系统的上清液中可溶性GFP增加。而且，与标准系统相比，使用生长解偶联系统的上清液中GFP与HCP的相对量要高很多。另外，与不生长解偶联的标准系统(BL21(DE3)pET30a GFPmut3.1)相比，通过使用生长解偶联系统，提高GFP的溶解度(图8)。
实施例6：使用生长解偶联系统生产HIV-1蛋白酶。
为了证明开发的生长解偶联过程的适用性，需要替代的重组蛋白。为此目的，选择HIV-1蛋白酶作为第二个模型蛋白，用于验证生长解偶联系统和模型过程；选择HIV-1蛋白酶的原因在于它对于大肠杆菌是高毒性的(Korant和Rizzo，(1991)，Biomed Biochim Acta50：643-6)，因而难以生产。在大肠杆菌中这种来自人免疫缺陷病毒1型的天冬氨酸蛋白酶的过度表达通常伴随着对生产细胞的毒性作用(Fernández等人，(2007)，Biotechnol Lett29：1381-6)，可能与其蛋白水解活性有关。因此，这种蛋白质通常难以在微生物系统中表达。逆转录病毒蛋白质作为聚蛋白质前体被合成，并经特异性蛋白酶加工(Volontè等人，(2011)，Microb Cell Fact 10：53)。这些前体是Gag和Gag-Pol多肽，其被HIV-1蛋白酶蛋白水解加工为成熟蛋白质(Kohl等人，(1988)，Proc Natl Acad Sci U S A 85：4686-90)。
HIV-1蛋白酶由HI病毒编码，由此在病毒成熟中起重要作用。开发获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的可能治疗是一个吸引人的目标。得到在细菌培养系统中可以表达大量HIV-1蛋白酶的系统是获得大量该蛋白质的最终目标(Volontè等人，(2011)，Microb Cell Fact10：53)。
参照发酵过程：
培养的间歇期在37℃的温度下进行，接种1ml的工作细胞库(WCB)。根据实验，如下含有两种不同模型蛋白的菌株用于本过程方案：
·BL21(DE3)pET30(GFPmut3.1)
·BL21(DE3)pET30(HIV1-蛋白酶)
11小时至13小时后间歇期结束(由溶解氧的峰值指示)，之后立即开始补料期。在指数补料期，为了减少表达的重组蛋白的包涵体形成以及达到更好的O2溶解度，将温度降低到30℃。通过指数底物补料使补料分批过程的生长速率(μ)保持恒定在0.10小时-1达4代。在细胞干质量(CDM)以4L批量体积中22.5g CDM达到间歇期期末之后开始补料。
在补料期中第3代(补料开始后21小时)之后，进行用IPTG单次脉冲(20μmol/克CDM)的诱导。采样程序持续1代。对参照过程方案的概述如图9所示。
发酵过程/生长解偶联生产系统：
培养的间歇期在37℃的恒温下进行，并用1mL的WCB接种。下述系统用该过程方案进行培养：
·BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)
·BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-蛋白酶)
11小时至13小时后间歇期结束，之后立即开始补料期。在指数补料期，为了达到表达的重组蛋白的更好溶解度并达到更好的氧传递速率(OTR)，将温度降低到30℃。生长速率保持恒定在μ＝0.20小时-1。在第3代(补料开始后21小时)之后，用0.1M阿拉伯糖(Gp2)和20μmol IPTG/g CDM(目的基因-GOI)的单次脉冲诱导重组蛋白质产生。在第4代期间进行采样，应用线性补料方案，开始时初始生长速率μ＝0.050小时-1，在实验过程中降低至μ＝0.025小时-1。采样过程持续1代。对参照过程方案的概述如图10所示。
HIV-1蛋白酶在大肠杆菌中的生产：
为了证明平台过程的广泛适用性，需要使用替代的重组蛋白进行试验。为此目的，选择HIV-1蛋白酶，一种难以在大肠杆菌中生产的蛋白质进行基准实验。
在进行参照菌株BL21(DE3)pET30a(HIV1-蛋白酶)和模型菌株BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-蛋白酶)的生物反应器培养之前，进行标准摇瓶培养以验证是否产生重组蛋白质。HIV1-蛋白酶条带位于11kDa，在溶菌酶条带下方。下述线性方程用于HIV1-蛋白酶的定量：
y＝0.0007x R2＝0.9708
根据图11，两种菌株均能够产生不溶形式的HIV1-蛋白酶。生长解偶联系统的生产产生浓度为69μg/mL的不溶性HIV1蛋白酶，而参照系统仅产生5μg/mL的不溶性HIV1蛋白酶。因此，BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1蛋白酶)能够产生是参照菌株13倍的HIV1-蛋白酶。
由于两个菌株均能够产生模型蛋白质，因此进行了两种系统的实验室规模培养。使用BL21(DE3)pET30a(HIV1-蛋白酶)作为参照系统，按照上面的说明进行发酵过程。平行地使用BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1蛋白酶)如图10所述进行了采用生长解偶联系统的新平台过程。在指数补料期间应用生长速率μ＝0.20小时-1。
如图12的图A所示，标准过程的HIV-1蛋白酶的最大比浓度为11.8mg/g CDM，没有表达可溶性的蛋白质。所获得的0.3g/L的体积产量也是非常低的。这个结果证实了HIV-1蛋白酶属于低产量和难以表达的一类蛋白质的结论(Volontè等人，(2011)，Microb CellFact 10：53；等人，(2011)，Science 331：589-92)。图B显示，在模型过程中，CDM的生长在诱导后停止，净CDM没有减少。在该过程结束时，生长解偶联系统总共生产了233.5g CDM。与生产了331.92g CDM的参照过程相比，模型过程产生的CDM少30％。诱导蛋白质生产后，模型过程也比参照过程少消耗155.2g的基料(base)。图13显示了参照过程的SDSPAGE分析。下述线性方程用于参照过程发酵的定量：
y＝0.0006x R2＝0.9981
根据图13，参照系统仅能够产生不溶形式(IB)的HIV1-蛋白酶。在蛋白质表达期开始时，BL21(DE3)pET30(HIV1-蛋白酶)产生2μg不溶性HIV1-蛋白酶/mL。在第4代结束时，参照过程产生19μg不溶性HIV1-蛋白酶/mL。
图14示出了生长解偶联过程发酵的SDS PAGE分析。下述线性方程用于HIV1-蛋白酶的定量：
y＝0.0009x R2＝0.9611
根据图14，生长解偶联系统能够产生可溶形式(S)和不溶形式(IB)的HIV1-蛋白酶。在蛋白质生产期开始时，BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-蛋白酶)表达79％可溶性HIV1-蛋白酶和21％不溶性HIV1-蛋白酶。可溶性蛋白质的比率随着过程持续的延长而降低。在第4代结束时(补料开始后27小时)，表达的12％为可溶性HIV1-蛋白酶，88％为不溶性HIV1-蛋白酶。
这些实验的结果的总结如图15所示。如图A所示，生长解偶联系统能够产生浓度为47mg/g CDM的HIV1-蛋白酶，而参照过程产生12mg/g CDM的总HIV1-蛋白酶浓度。因此，BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(HIV1-蛋白酶)产生的HIV1-蛋白酶/克CDM几乎是相比BL21(DE3)pET30a(HIV1-蛋白酶)的四倍。根据图C，模型过程在该过程结束时产生浓度为9mg/g的可溶性HIV1-蛋白酶，而参照菌株不能产生可溶形式的HIV1-蛋白酶。如图F所示，模型过程产生了总质量为11g的HIV1-蛋白酶，而参照过程仅达到4g的总产量。结论是，模型过程产生的HIV1-蛋白酶是相比参照过程的约三倍。图15的图D显示了以克计的不含产生的重组产物(X-P)的计算的净CDM。与总CDM的产量相比，X-P保持不变(图B)。在生长解偶联系统的诱导后，直到过程结束，制备了26g CDM，而参照系统在生产期产生了122g CDM。总之，生长解偶联系统生产的HIV1-蛋白酶相比参照系统多282％，生产的CDM则少约30％。
实施例7：使用生长解偶联系统的高细胞密度培养(HCDC)。
来自非HCD生物反应器培养的结果表明，生长解偶联表达系统应该允许诱导前生长速率可变，这对于HCD培养是重要的，因为难以维持μ＝0.2小时-1的生长速率而无缺氧的风险。过高的生长速率将导致次优条件，特别是在指数补料期。将HCD过程计划为在诱导时间点达到60g/L的CDM浓度。由于已进行的HCDC应该仅显示生长解偶联系统在半HCDC中达到与非HCDC相比可比较的特定量蛋白质和更高生产率的能力，GFPmut3.1用作唯一的模型蛋白。HCD发酵计划如图16所示。该间歇在37℃的温度下进行并在16小时后完成。指数补料期(μ＝0.17小时-1)在间歇期结束后立即开始，其持续约2代。补料培养基还补充有硫酸铵以保证非缺氮条件。之后，应用持续1代的第一线性补料方案。补料期开始后15小时，用0.1M阿拉伯糖+20μmol IPTG/g CDM诱导蛋白质产生。在生产期，应用第二个线性补料方案，其持续约1代，计算的生长速率从开始时的μ＝0.050小时-1开始，降低至过程结束时的μ＝0.020小时-1。蛋白质表达期持续33小时。得到低的生长速率的目的是给菌株提供足够的葡萄糖以刚好满足它表达POI之需。
图17显示了生长解偶联系统的HCD培养的SDS PAGE分析。在蛋白质生产33小时后，BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)能够产生63％的可溶性GFP和37％的不溶性GFP，与生长解偶联系统过程的非HCD培养相比是一种进步，而且表明放大规模到HCDC对表达的蛋白质的溶解度没有显着影响。
图18显示了生长解偶联系统的HCDC的结果。BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)能够产生268.4mg可溶性GFP/g CDM和157.6mg不溶性GFP/g CDM。在生产期，产生了总量为279.5g的GFP，其中176.1g为可溶形式。该过程产生浓度为30g/L的GFP，与生长解偶联系统的非HCDC相比增加了300％。在诱导蛋白质表达后，净CDM停止并大致保持恒定，这与来自生长解偶联系统的非HCDC的结果一致。
分析HCD模型发酵过程的蛋白质生产期间总O2消耗和总CO2形成，显示生长解偶联系统形成的大量的总CO2与生长解偶联系统的非HCDC相当。如图19的图A所示，在蛋白质生产诱导后，BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)的O2消耗和CO2形成保持不变，这表明HCD过程仍然是代谢活性的。
图20显示了生长解偶联系统的HCD培养和非HCD培养之间的结果的总结。图A显示BL21(DE3)：：TN7(Gp2ΔAra)pET30(GFPmut3.1)的非HCDC能够产生480.18mg GFP/g CDM，是所有已进行的培养中最高的比浓度。HCD过程以426mg GFP/g CDM达到可比较的高比浓度。此外，HCDC过程能够产生7％更多的可溶形式的特定GFP。如图D所示，在两个培养过程中，净CDM的增长在诱导蛋白质表达后停止并减少。在诱导之时，HCDC过程达到了57g/L的CDM浓度，并且产生的总(gross)CDM相比非HCDC过程多216％，而非HCDC过程在诱导之时达到22g/L(图B)。生长解偶联系统的HCDC产生的GFP总量为280g，与该系统的非HCDC相比增加了243％(图F)。考虑到图B所示的生产的总CDM和图F所示的生产的净CDM，HCDC产生的GFP相比非HCDC多243％，产生的净CDM相比非HCDC多300％。图D显示了以g计的不含产生的重组蛋白(X-P)的净CDM。净CDM的减少证明，两种系统诱导后都几乎完全仅产生重组GFPmut3.1。
比较非HCD和HCD过程之间产生的总GFP与产生的净CDM，表明，即使在放大规模的HCD过程中，生长解偶联系统也显示出生产的GFP与净CDM之间的线性关系。它还揭示了生长解偶联系统的HCD培养在进一步的HCDC发酵中很有潜力达到高得多的CDM浓度。以在诱导前CDM浓度达到100g/L的培养应该生产出巨大数量的GFP。

Claims (24)

1.一种细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞
(i)包含在诱导型启动子控制下的编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列；和
(ii)包含编码对于所述细菌宿主细胞是异源的RNA聚合酶的核苷酸序列；和
(iii)包含在由所述RNA聚合酶识别的启动子控制下的编码目的蛋白质的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的细菌宿主细胞，其特征在于，生长通过抑制转录、DNA复制和/或细胞分裂而被抑制。
3.根据权利要求1或2所述的细菌宿主细胞，其特征在于，所述噬菌体蛋白质是
(i)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有Seq Id No：1所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与Seq Id No：1所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；
(ii)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有Seq Id No：2所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与Seq Id No：2所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；
(iii)磷酸化细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)磷酸化细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有Seq Id No：3所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)磷酸化细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与Seq Id No：3所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；
(iv)抑制细菌宿主细胞DNA复制的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有Seq Id No：4所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有与Seq Id No：4所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；
(v)抑制细菌宿主细胞DNA复制的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有Seq Id No：5所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有与Seq Id No：5所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；或者
(vi)抑制细菌宿主细胞DNA复制的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有Seq Id No：6所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞DNA复制的具有与Seq Id No：6所示氨基酸序列的同一性为40％或更大的氨基酸序列的蛋白质；
(vii)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有Seq Id No：7所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)抑制细菌宿主细胞RNA聚合酶的具有与Seq Id No：7所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质；
(viii)引起宿主转录关闭的蛋白质，其中所述蛋白质是
(a)引起宿主转录关闭的具有Seq Id No：8、9、10、11、12、13或14所示氨基酸序列的蛋白质或其片段；或者
(b)引起宿主转录关闭的具有与Seq Id No：8、9、10、11、12、13或14所示氨基酸序列的同一性为40％或更大例如50％、60％、70％、80％或90％的氨基酸序列的蛋白质。
4.根据前述权利要求中任一项所述的细菌宿主细胞，其特征在于，编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的所述核苷酸序列、编码所述RNA聚合酶的所述核苷酸序列、编码目的蛋白质的所述核苷酸序列被整合到所述宿主细胞的基因组中或由染色体外载体包含。
5.根据前述权利要求中任一项所述的细菌宿主细胞，其特征在于，编码所述RNA聚合酶的所述核苷酸序列在诱导型启动子或组成型启动子控制下。
6.根据权利要求5所述的细菌宿主细胞，其特征在于，所述RNA聚合酶是噬菌体T3 RNA聚合酶、T7噬菌体RNA聚合酶、工程正交T7 RNA聚合酶、噬菌体SP6 RNA聚合酶或噬菌体Xp10RNA聚合酶。
7.根据前述权利要求中任一项所述的细菌宿主细胞，其特征在于，所述诱导型启动子由阿拉伯糖、IPTG、色氨酸、木糖、鼠李糖、磷酸盐或噬菌体λcI蛋白调控。
8.根据前述权利要求中任一项所述的细菌宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞具有非功能性阿拉伯糖操纵子。
9.根据前述权利要求中任一项所述的细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌。
10.一种细菌宿主细胞的制剂，所述制剂
(i)包含在诱导型启动子控制下的编码如权利要求3中定义的来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列；和
(ii)包含编码对于所述细菌宿主细胞是异源的RNA聚合酶的核苷酸序列。
11.一种用于生产权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞的方法，所述方法包括用编码如权利要求3中定义的来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质的核苷酸序列、编码T7 RNA聚合酶的核苷酸序列和编码目的蛋白质的核苷酸序列转化细菌宿主细胞。
12.一种用于生产目的蛋白质的方法，所述方法包括在合适的条件下培养权利要求1至9中任一项所述的细菌宿主细胞和获得所述目的蛋白质。
13.一种增加目的蛋白质的产量的方法，所述方法包括在合适的条件下培养如权利要求1至9中任一项中定义的细菌宿主细胞和获得所述目的蛋白质。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述培养步骤包括
(a)使所述细菌细胞生长至至少20g/L细胞干质量(CDM)的密度；
(b)诱导编码抑制所述宿主细胞生长的噬菌体蛋白质的核苷酸序列的表达；
(c)以允许0,05小时-1的初始生长速率的恒定线性补料速率给细菌细胞补料；和
(d)进一步培养所述细菌细胞至少12小时。
15.一种用于增加目的蛋白质的产量的方法，所述方法包括用在诱导型启动子控制下的核苷酸序列转化细菌宿主，所述核苷酸序列编码来自噬菌体的抑制所述细菌宿主细胞生长的蛋白质，所述细菌宿主包含编码对于所述细菌宿主细胞是异源的RNA聚合酶的核苷酸序列和编码目的蛋白质的核苷酸序列，所述核苷酸序列在由所述RNA聚合酶识别的启动子控制下。
16.一种用于生产目的蛋白质的方法，所述方法包括在合适的条件下使权利要求10所述的制剂与核苷酸序列接触，所述核苷酸序列包含在由如权利要求10中定义的RNA聚合酶识别的启动子控制下的编码目的蛋白质的核苷酸序列。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白质对于细胞是毒性的，不利地影响活力、细胞生长和/或细胞分裂。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的方法，所述方法还包括修饰所述目的蛋白质和/或将所述目的蛋白质配制成包含至少一种另外组分的组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述目的蛋白质用标记修饰。
20.一种用于生产目的化合物的方法，所述方法包括培养权利要求1至9中任一项所述的细菌宿主细胞，和添加待被所述细菌宿主细胞转化和/或使用以用于产生所述目的化合物的化合物。
21.权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞或权利要求10所述的制剂用于生产目的蛋白质的用途。
22.权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞或权利要求10所述的制剂用于增加目的蛋白质的产量的用途。
23.如权利要求3中定义的编码噬菌体蛋白质的核苷酸序列用于增加宿主细胞中目的蛋白质的产量的用途。
24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述目的蛋白质在T7启动子控制下，并且所述宿主细胞包含编码T7 RNA聚合酶的核苷酸序列。
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