CN109628533A

CN109628533A - 成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法

Info

Publication number: CN109628533A
Application number: CN201910046629.2A
Authority: CN
Inventors: 谭长城; 杨辉; 李金星; 何勇; 曹宇; 范开
Original assignee: Chongqing Paijin Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chongqing Paijin Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明公开了成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，包括如下步骤：含编码重组成纤维细胞生长因子家族蛋白载体的大肠杆菌菌株，在诱导时通过添加一定剂量单糖能促进胞内活性蛋白的表达。所述成纤维细胞生长因子家族蛋白包括FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15、FGF18、FGF21、FGF23蛋白及其突变体。在诱导时通过添加一定剂量单糖是指在加入诱导剂前补入单糖或与诱导剂同时补入单糖或加入诱导剂后补入单糖。克服了本技术领域关于葡萄糖抑制lac和ara操纵子在大肠杆菌重组的表达的技术偏见，提供一种能够高效促进成纤维细胞生长因子蛋白在大肠杆菌中的表达的方法。

Description

成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法

技术领域

本发明涉及重组蛋白领域，具体具体涉及成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法。

背景技术

成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)是一类由Fgf基因家族成员编码的结构相关的蛋白质，对内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等多种中胚层和神经外胚层来源的细胞有促进DNA合成和细胞分裂作用，主要由成纤维细胞、内皮细胞、骨细胞、惰性细胞分泌，相对分子量一般在17～34kD(Itoh N等，2004，Trends in Genetics,20(11):563-569)。

成纤维细胞生长因子包含23各成员，可以排列成7个亚家族，每个亚家族包含2-4个成员。Fgf1，Fgf4，Fgf7，Fgf8和Fgf9亚家族基因编码分泌的经典FGFs，其以肝素作为辅因子结合并激活成纤维细胞生长因子受体。Fgf15/19亚家族成员编码内分泌FGFs，其与Klotho家族蛋白质作为辅因子结合并激活FGFRs。Fgf11亚家族基因编码细胞内FGFs是非信号蛋白，作为电压依赖性钠离子通道的辅助因子(Ornitz等.2015，Wiley Interdiscip RevDev Biol,4(3):215-266)。

FGF已被美国伤口愈合协会和欧洲伤口管理协会推荐用于治疗难治性溃疡。自20世纪80年代初以来，Amgen，Merck和Lilly等世界知名制药公司已大力投资开发基于FGF的药物。FGF2，FGF-7和FGF-10已被证明在皮肤伤口愈合中是不可或缺的。2004年美国FDA批准了Amgen公司的一种FGF7(palifermin)静脉注射制剂，用于治疗骨髓移植白血病患者化疗引起的粘膜炎。FGF2被更广泛地用于伤口愈合，并且rh-FGF2显示出治疗压疮，糖尿病足溃疡和二度烧伤的潜在治愈效果。2000年，中国食品药品监督管理局批准使用rh-FGF2治疗慢性伤口。2001年在日本被批准用于治疗压疮和皮肤溃疡(烧伤溃疡和足溃疡)。

FGF18在多种生理功能中起着关键作用，包括毛发生长和皮肤保持，皮质神经元活动(Hasegawa等，2004)，形态发生和血管生成(Ishibe等，2005)，以及骨骼生长和发育(Liuet al.2002；Long and Ornitz 2013)。默沙东(MSD)的重组FGF18(Sprifermin)已在临床上用于治疗晚期骨关节炎(OA)患者，其临床I期临床试验已经完成，其中发现使用安全，减少了软骨损失并改善了软骨厚度；目前正在进行不同关节内Sprifermin剂量对膝关节原发性骨关节炎患者的疗效和安全性的II期试验。

研究表明FGF21可以独立于胰岛素摄取葡萄糖,并与胰岛素有协同作用；可以显著降低血糖及血脂水平，改善胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能。随着研究的深入，FGF21将有望成为与胰岛素替代、竞争或联合用药的2型糖尿病治疗的一线药物(于聪等,2015，中国当代医药,(15):25-27)。目前美国礼来公司PEG化的FGF21已经进入II期临床试验阶段；美国安进公司(Amgen)的FGF-21同类产品也处于临床前研究阶段；美国Bristol-Myers Squibb和美国Am-brx也在2011年宣布将围绕FGF21蛋白合作开发系列治疗2型糖尿病的药物；中国李校堃教授团队的FGF21同类产品也处于临床前研究阶段。最新研究表明，FGF21也与非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发病机制和治疗有关。美国BMS公司的聚乙二醇化FGF21类似物(PEG-FGF21，BMS-986036)2a期临床研究表明，NASH患者的脂肪变性减少，纤维化和肝损伤标志物得到改善(Kim,Kook等，2018，Frontiers in Endocrinology)。目前开始了用于评估BMS-986036在患有严重3期纤维化或肝硬化的人NASH患者中的安全性和功效的2b期临床研究。

鉴于以上报道FGF蛋白在临床和生物医药领域具有较高应用和经济价值。FGF蛋白分子量小且无糖基化问题，适于原核表达，但是根据文献报道FGF蛋白在大肠杆菌体系中难以获得高效稳定的非融合可溶性表达(姜媛媛等，2009，生物化学与生物物理进展,36(2):157-164)。

发明内容

本发明的目的在于提供成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，解决了成纤维细胞生长因子蛋白在大肠杆菌体系中难以获得高效、稳定表达的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，包括如下步骤：

含编码重组成纤维细胞生长因子家族蛋白载体的大肠杆菌菌株，在诱导时添加单糖促进胞内活性蛋白的表达。

进一步，所述成纤维细胞生长因子家族蛋白包括FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15、FGF18、FGF21、FGF23蛋白及其突变体。

进一步，在诱导时添加单糖包括在加入诱导剂前补入单糖、与诱导剂同时补入单糖或加入诱导剂后补入单糖。

进一步，所述的单糖的浓度范围为0.5-50g/L。

进一步，单糖包括：三碳单糖、五碳单糖、六碳单糖、单糖衍生物。

进一步，所述三碳单糖包括赤藓糖、苏糖；所述五碳单糖包括木糖、核糖、阿拉伯糖；六碳单糖包括葡萄糖、甘露糖、果糖；所述单糖衍生物包括L-鼠李糖、L-岩藻糖。

进一步，所述的含编码重组FGF家族蛋白载体为T7启动子或BAD启动子调控的系列表达载体。

进一步，所述的大肠杆菌菌株为适宜T7启动子或BAD启动子调控的表达载体的所有大肠杆菌。

本发明提出在大肠杆菌重组表达FGF蛋白时加入一定剂量的单糖，例如葡萄糖，能够高效促进成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白在大肠杆菌中非融合、活性重组表达。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

一般认为葡萄糖会对启动子产生代谢阻遏，无论存不存在诱导物都会影响目标基因的表达，但是本发明通过加入一定量的葡萄糖能够促进成纤维细胞生长因子蛋白在大肠杆菌中非融合、活性重组高效表达，取得与现有技术产生相反的结果，这种促进表达的方法简便、有利于推广应用，使得成纤维细胞生长因子蛋白在生物医药和临床应用具有较好前景和经济价值。

附图说明

图1为实施例4中不同葡萄糖浓度促进重组FGF7变体诱导表达电泳图；

图2为实施例5中不同糖促进重组FGF7变体诱导表达电泳图；

图3为实施例6中葡萄糖促进重组FGF21表达电泳图；

图4为实施例6中葡萄糖促进重组FGF18表达电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：

含编码重组成纤维细胞生长因子家族蛋白载体的大肠杆菌菌株，在诱导时通过添加一定剂量单糖能促进胞内活性蛋白的表达。

所述成纤维细胞生长因子家族蛋白包括FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15、FGF18、FGF21、FGF23蛋白及其突变体。

在诱导时通过添加一定剂量单糖是指在加入诱导剂前补入单糖或与诱导剂同时补入单糖或加入诱导剂后补入单糖。

所述的单糖的浓度范围为0.5-50g/L。

单糖包括：三碳单糖、五碳单糖、六碳单糖、单糖衍生物。

所述三碳单糖包括赤藓糖、苏糖；所述五碳单糖包括木糖、核糖、阿拉伯糖；六碳单糖包括葡萄糖、甘露糖、果糖；所述单糖衍生物包括L-鼠李糖、L-岩藻糖。

所述的含编码重组FGF家族蛋白载体为T7启动子或BAD启动子调控的系列表达载体。

所述的大肠杆菌菌株为适宜T7启动子或BAD启动子调控的表达载体的所有大肠杆菌。

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。实施例所描述的氨基酸序列、工艺条件及结果仅用于说明本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

以下实施例所用的材料来源情况如下：

FGF7变体、FGF18变体、FGF21、DNA片段均由南京金斯瑞科技有限公司全基因合成；

DNA聚合酶(DNALigation Kit Ver.2.1)，购于宝生物工程(大连)有限公司；

pET-3c、pET-30a质粒，BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS菌种购于merck millipore；

葡萄糖、果糖、木糖、L-阿拉伯糖均购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。

实施例1：重组FGF7表达菌株构建。

根据NCBI数据库提供的人源FGF7氨基酸序列进行突变(序列SEQ ID NO:1)，并结合大肠杆菌密码偏爱原则，设计出编码FGF7变体氨基酸的cDNA序列，通过全基因合成得到含编码FGF7变体的DNA片段。将全基因得到的编码FGF7变体的DNA片段，和pET-3c载体质粒，其中为T7启动子调控表达载体，分别用Nde I+BamH I双酶切后，并且通过DNA聚合酶连接，得到含有编码FGF7变体的环形重组质粒。将得到的重组质粒，转化BL21(DE3)plysS感受态细胞，涂布于含有100ug/ml氨苄青霉素和25ug/ml氯霉素抗性的LB琼脂糖平板上，筛选出单克隆菌落，得表达重组FGF7变体的工程菌，命名为pET-3c-FGF7/BL21(DE3)plysS。

实施例2：重组FGF21表达菌株构建。

根据NCBI数据库提供的人源FGF21氨基酸序列(序列SEQ ID NO:2)，结合大肠杆菌密码偏爱原则，设计出编码FGF21氨基酸的cDNA序列，通过全基因合成得到含编码FGF21的DNA片段。将全基因得到的编码FGF21的DNA片段，和pET-30a载体质粒，其中为T7启动子调控表达载体，分别用Nde I+BamH I双酶切后，并且通过DNA聚合酶连接，得到含有编码FGF21的环形重组质粒。将得到的重组质粒pET-30a-FGF21质粒，转化BL21(DE3)plysS感受态，涂布于含有50ug/ml卡那霉素和25ug/ml氯霉素抗性的LB琼脂糖平板上，筛选出单克隆菌落，得到表达重组FGF21的工程菌，命名为pET-30a-FGF21/BL21(DE3)plysS。

实施例3：重组FGF18表达菌株构建。

根据NCBI数据库提供的人源FGF18氨基酸序列进行突变(序列SEQ ID NO:3)，结合大肠杆菌密码偏爱原则，设计出编码FGF18变体氨基酸的cDNA序列，通过全基因合成得到含编码FGF18的DNA片段。将全基因得到的编码FGF18的DNA片段，和pET-30a载体质粒，其中为T7启动子调控表达载体，分别用Nde I+BamH I双酶切后，并且通过DNA聚合酶连接，得到含有编码FGF18变体的环形重组质粒。将得到的重组质粒pET-30a-FGF18质粒，转化BL21(DE3)感受态，涂布于含有50ug/ml卡那霉素和25ug/ml氯霉素抗性的LB琼脂糖平板上，筛选出单克隆菌落，得到表达重组FGF18的工程菌，命名为pET-30a-FGF18/BL21(DE3)。

实施例4：不同葡萄糖浓度促进重组FGF7诱导表达试验。

将实施例1构建的pET-3C-FGF7/BL21(DE3)pLysS工程菌菌种冻存液按1:100接入LB培养基中，37℃摇床震荡培养至OD₆₀₀值至0.8左右。将培养的菌液按体积比1：100转接至5个含100ml新鲜的LB培养基的摇瓶中，37℃摇床震荡培养至OD₆₀₀值达到0.8。摇瓶1补入终浓度0.2mmol/L IPTG；摇瓶2补入终浓度2g/L的葡萄糖和0.2mmol/L IPTG；摇瓶3补入终浓度4g/L的葡萄糖和0.2mmol/L IPTG；摇瓶4补入终浓度8g/L的葡萄糖和0.2mmol/L IPTG；摇瓶5补入终浓度16g/L的葡萄糖和0.2mmol/L IPTG；继续37℃震荡培养4h。将各摇瓶菌液用纯化水稀释至OD₆₀₀＝1后，取1ml稀释菌液离心收集沉淀并破进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图1，其中，M为蛋白分子量标准；1为0.2mmol/L IPTG诱导4h；2为0.2mmol/L IPTG+2g/L葡萄糖诱导4h；3为0.2mmol/L IPTG+4g/L葡萄糖糖诱导4h；4为0.2mmol/L IPTG+8g/L葡萄糖糖诱导4h；5为0.2mmol/L IPTG+16g/L葡萄糖糖诱导4h。结果显示，在诱导时添加了2g/L的葡萄糖后重组FGF7的表达量明显优于未补加葡萄糖诱导的，但FGF7的表达量不随葡萄糖浓度的增加而增加。

实施例5：不同糖促进重组FGF7诱导表达试验

将实施例1构建的pET-3C-FGF7/BL21(DE3)pLysS工程菌菌种冻存液按1:100接入LB培养基中，37℃摇床震荡培养至OD₆₀₀值至0.8左右。将培养的菌液按体积比1：100转接至5个含100ml新鲜的LB培养基的摇瓶中，37℃摇床震荡培养至OD₆₀₀值达到0.8。摇瓶1补入终浓度0.2mmol/L IPTG；摇瓶2补入终浓度2g/L的葡萄糖和0.2mmol/L IPTG；摇瓶3补入终浓度2g/L的果糖和0.2mmol/L IPTG；摇瓶4补入终浓度2g/L的木糖和0.2mmol/L IPTG；摇瓶5补入终浓度2g/L的L-阿拉伯糖和0.2mmol/L IPTG；继续37℃震荡培养4h。将各摇瓶菌液用纯化水稀释至OD600＝1后，取1ml稀释菌液离心收集沉淀并破进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2，其中，M为蛋白分子量标准；1为0.2mmol/L IPTG诱导4h；2为0.2mmol/LIPTG+2g/L葡萄糖诱导4h；3为0.2mmol/LIPTG+2g/L果糖诱导4h；4为0.2mmol/LIPTG+2g/L木糖诱导4h；5为0.2mmol/LIPTG+2g/L L-阿拉伯糖诱导4h。结果显示，在诱导前添加葡萄糖、果糖、木糖、L-阿拉伯糖的摇瓶FGF7蛋白表达量明显高于未加糖诱导的。

实施例6：葡萄糖促进重组FGF21、FGF18诱导表达实验将实施例2构建的工程菌pET-30a-FGF21/BL21(DE3)pLysS，实施例3构建的pET-30a-FGF18/BL21(DE3)工程菌菌种保存液按1:100分别接入含100ml新鲜LB培养基的摇瓶，37℃震荡培养至OD₆₀₀值达到0.8。将培养好的pET-30a-FGF21/BL21(DE3)pLysS工程菌菌液按1:100分别转接含100ml LB培养基的摇瓶1和摇瓶2；将培养好的pET-30a-FGF18/BL21(DE3)工程菌菌液按1:100分别转接含100ml LB培养基的摇瓶3和摇瓶4；37℃摇床震荡培养至OD₆₀₀＝0.8。摇瓶1、摇瓶3补加终浓度0.2mmol/L IPTG，摇瓶2、摇瓶4补加终浓度2g/L的葡萄糖和0.2mmol/L IPTG，继续37℃摇床震荡培养4h。将各摇瓶菌液用纯化水稀释至OD₆₀₀＝1后，取1ml稀释菌液离心收集沉淀并破进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图3、图4。图3为葡萄糖促进重组FGF21表达电泳图，其中M为蛋白分子量标准；1为诱导前；2为0.2mmol/L IPTG诱导4h；3为0.2mmol/L IPTG+2g/L葡萄糖诱导4h；图4为葡萄糖促进重组FGF18表达电泳图，其中M为蛋白分子量标准；1为诱导前；2为0.2mmol/L IPTG诱导4h；3为0.2mmol/L IPTG+2g/L葡萄糖诱导4h。结果显示，重组菌pET-30a-FGF21/BL21(DE3)pLysS、pET-30a-FGF18/BL21(DE3)在诱导前添加2g/L葡萄糖的目的蛋白表达量均明显高于未加葡萄糖诱导的。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆派金生物科技有限公司

<120> 成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

Met Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu

1 5 10 15

Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val

20 25 30

Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg

35 40 45

Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe

50 55 60

Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys

65 70 75 80

Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn

85 90 95

Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val

100 105 110

Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys

115 120 125

Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

130 135 140

<210> 2

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 3

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

Met Glu Glu Asn Val Asp Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg

1 5 10 15

Ala Arg Asp Asp Val Ser Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr

20 25 30

Ser Arg Thr Ser Gly Lys His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser

35 40 45

Ala Arg Gly Glu Asp Gly Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr

50 55 60

Asp Thr Phe Gly Ser Gln Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe

65 70 75 80

Tyr Leu Cys Met Asn Arg Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly

85 90 95

Thr Ser Lys Glu Cys Val Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr

100 105 110

Thr Ala Leu Met Ser Ala Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr

115 120 125

Lys Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln

130 135 140

Asp Val His Phe Met Lys Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln

145 150 155 160

Lys Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys

165 170

Claims

1.成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：所述成纤维细胞生长因子家族蛋白包括FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF11、FGF15、FGF18、FGF21、FGF23蛋白及其突变体。

3.根据权利要求1或2所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：在诱导时添加单糖包括在加入诱导剂前补入单糖、与诱导剂同时补入单糖或加入诱导剂后补入单糖。

4.根据权利要求3所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：所述的单糖的浓度范围为0.5-50g/L。

5.根据权利要求4所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：单糖包括：三碳单糖、五碳单糖、六碳单糖、单糖衍生物。

6.根据权利要求5所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：所述三碳单糖包括赤藓糖、苏糖；所述五碳单糖包括木糖、核糖、阿拉伯糖；六碳单糖包括葡萄糖、甘露糖、果糖；所述单糖衍生物包括L-鼠李糖、L-岩藻糖。

7.根据权利要求1所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：所述的含编码重组FGF家族蛋白载体为T7启动子或BAD启动子调控的系列表达载体。

8.根据权利要求7所述的成纤维细胞生长因子蛋白可溶性高效重组表达的方法，其特征在于：所述的大肠杆菌菌株为适宜T7启动子或BAD启动子调控的表达载体的所有大肠杆菌。