CN111836637A - 减少加巴喷丁类似物的干扰并表达肝细胞生长因子异构体的利用脱氧核糖核酸结构的神经病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及给药加巴喷丁类似物的神经病患者的治疗方法。尤其，上述方法包括在中断加巴喷丁类似物后，给药对人肝细胞生长因子(HGF)蛋白进行编码的核酸结构的步骤。本发明提供如下的新方法，即，通过避免加巴喷丁类似物引起的治疗效果的干扰，来使特定患者群体(population)实现更优秀的治疗结果。

Description

减少加巴喷丁类似物的干扰并表达肝细胞生长因子异构体的 利用脱氧核糖核酸结构的神经病的治疗
背景技术
加巴喷丁类似物(Gabapentinoids)为作为抑制性(inhibitory)神经传递物质γ－氨基丁酸(GABA)的衍生物的药品分类(class of drugs)。不仅研发了加巴喷丁药物前体、加巴喷丁酯(gabapentin enacarbil；Horizant)，还研发了包括加巴喷丁(gabapentin；Neurontin)和普瑞巴林(pregabalin；Lyrica)的多个加巴喷丁类似物，并得到临床认可。
加巴喷丁类似物主要作用于突触前(pre-synaptic)钙通道的α2δ亚单位，抑制神经元钙内流(neuronal calcium influx)。这通过减少从神经纤维如谷氨酸、物质P及降钙素基因相关肽的兴奋性(excitatory)神经传递物质的释放来抑制神经或组织损伤后的神经元兴奋性(neuronal excitability)。此药物不仅用于治疗如神经病疼痛(neuropathicpain)的与神经损伤相关的多种状态，还用于治疗包括癫痫(epilepsy)、纤维肌痛(fibromyalgia)、广泛性焦虑症(generalized anxiety disorder)及不宁腿综合征(restless leg syndrome)的多种其他神经系障碍。这些药物还可有效地用于治疗偏头痛(migraine)、社交恐惧症(social phobia)、恐慌症(panic disorder)、狂躁症(mania)、双相情感障碍(bipolar disorder)及酒精戒断(alcohol withdrawal)。
最近，有研究表明，神经性疼痛可以通过表达人肝细胞生长因子蛋白的两种异构体(isoform)的脱氧核糖核酸(即，还称为“VM202”的pCK-HGF-X7)结构来治疗。在一项II期临床试验中，若向糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy)患者的小腿肌肉注射VM202，则可显著减轻疼痛——若间隔2周治疗2日，则缓和症状，使得改善3个月的生活质量(Kessler et al.，Annals Clin.Transl.Neurology 2(5)：465-478(2015))。
虽然证明了VM202能够有效地治疗患有糖尿病周围神经病变的患者，但II期临床试验数据的进一步分析表明，相比于服用加巴喷丁类似物的患者，VM202可更有效地缓和未服用普瑞巴林或加巴喷丁的患者的疼痛(Kessler et al.，AnnalsClin.Transl.Neurology 2(5)：465-478(2015))。但是，事后分析(post hoc analysis)无法阐明称为这一观察的基础的胜利机制。尤其，这些数据无法预测先前服用加巴喷丁类似物是否会妨碍VM202的后期功效(later efficacy)，并且，无法预测向先前服用加巴喷丁类似物的患者有效地给药VM202的方法。
因此，需要有效地向先前服用加巴喷丁类似物的患者有效地给药VM202的方法。
发明内容
技术问题
本发明基于如下的新发现，即，涉及对与借助加巴喷丁类似物的神经病有关的肝细胞生长因子(例如，VM202)进行编码的核酸结构的治疗效果和干扰。具体地，本发明人发现，当在给药VM202时或给药VM202之后给药加巴喷丁类似物时，在神经性疼痛的动物模型中，加巴喷丁类似物对VM202具有有害影响。与VM202一同给药或给药VM202之后给药的加巴喷丁类似物的上述抑制效果在加巴喷丁类似物的中断之后仍然持续。但是，在给药VM202后经过一周以上之后给药的加巴喷丁类似物不影响VM202的治疗效果。这种结果教示，为了使VM202的治疗功效(efficacy)及效果(potency)最大化，在VM202给药前、给药过程中及给药后的几天内需中断加巴喷丁类似物治疗是很重要的。
技术方案
因此，在第一实施方式中，提出利用在给药加巴喷丁类似物的患者中对肝细胞生长因子(例如，VM202)的异构体进行编码的核酸结构治疗神经病的方法。
具体地，在上述方法中，在核酸结构的给药前、给药过程中及给药后的特定时间内，中断加巴喷丁类似物的给药。因此，本发明提供如下的新方法，即，通过避免加巴喷丁类似物引起的干扰，来使特定患者群体实现更优秀的治疗结果。
具体地，本发明的一部分实例涉及神经病(neuropathy)治疗方法，包括：步骤(1)，选择给药加巴喷丁类似物的神经病患者；步骤(2)，中断向上述患者给药加巴喷丁类似物；以及步骤(3)，向上述患者给药VM202。在一部分实例中，在VM202给药步骤后，上述方法还包括将加巴喷丁类似物的给药保留至少一周的步骤。在一部分实例中，在VM202给药步骤后，上述方法还包括将加巴喷丁类似物的给药保留至少10日的步骤。
在一部分实例中，在中断给药上述加巴喷丁类似物的步骤中，逐渐减少(tapering)加巴喷丁类似物给药。在一部分实例中，给药VM202的步骤在完全中断给药加巴喷丁类似物后执行。在一部分实例中，上述给药VM202的步骤在完全中断给药加巴喷丁类似物后的至少1日、2日、3日、5日、7日、14日、21日、30日、60日或90日后执行。
在一部分实例中，上述神经病为糖尿病神经病变。在一部分实例中，上述神经病为带状疱疹后神经病变(post-herpetic neuropathy)。
在一部分实例中，上述加巴喷丁类似物为加巴喷丁或普瑞巴林。
在一部分实例中，在上述给药VM202的步骤中，在患者的每个患肢(affectedlimb)按多次肌肉注射及多次就诊平分给药8mg的VM202，规定的一次就诊过程中的多次肌肉注射分别在隔开的注射部位执行。
在一部分实例中，以将16mg的剂量的VM202等分64次向肌肉注射的方式给药，在上述内容中，在第一次就诊中，在第一个小腿的隔开的注射部位进行16次肌肉注射给药，在第一次就诊中，在第二个小腿的隔开的注射部位进行其他16次肌肉注射给药，在第二次就诊中，在第一个小腿的隔开的注射部位进行其他16次肌肉注射给药，在第二次就诊中，在第二个小腿的隔开的注射部位进行其他16次肌肉注射给药，在上述内容中，分别利用0.5ml的体积内的0.25mg的VM202来执行64次的肌肉注射。
在再一实施方式中，本发明提供给药VM202的神经病治疗方法，包括：选择给药加巴喷丁类似物的神经病患者的步骤；中断向上述患者给药加巴喷丁类似物的步骤；以及，向上述患者给药VM202的步骤。
在另一实施方式中，本发明提供神经病治疗方法，包括：确定在之前的一周(week)内是否向患有神经病的患者给药加巴喷丁类似物的步骤；在之前的一周内向患者给药加巴喷丁类似物的情况下，在中断向患者给药加巴喷丁类似物之后，向患者给药VM202的步骤；以及在之前的一周内未向患者给药加巴喷丁类似物的情况下，向患者给药VM202的步骤。
本发明还提供对给药加巴喷丁类似物的患者中用于神经病治疗方法的肝细胞生长因子异构体进行编码的核酸结构(例如，VM202)，上述方法包括：中断向患者给药加巴喷丁类似物的步骤；以及向患者给药核酸结构的步骤。一部分实例提供对用于治疗神经病的方法的肝细胞生长因子异构体进行编码的核酸结构(例如，VM202)，上述方法包括：选择给药加巴喷丁类似物的神经病患者的步骤；中断向上述患者给药加巴喷丁类似物的步骤；以及向上述患者给药核酸结构的步骤。一部分实例提供对用于治疗神经病的方法的肝细胞生长因子异构体进行编码的核酸结构(例如，VM202)，上述方法包括：选择给药加巴喷丁类似物的神经病患者的步骤；仅在中断加巴喷丁类似物之后给药核酸结构的步骤；以及在至少一周内不给药追加剂量的加巴喷丁类似物的步骤。
本发明还提供在给药加巴喷丁类似物的患者中对用于配制治疗神经病的医药(medicament)的肝细胞生长因子的异构体进行编码的核酸结构(例如，VM202)的用途(use)。
一部分实例涉及在给药加巴喷丁类似物的患者中用于配制治疗神经病的医药的核酸结构的用途，但是，加巴喷丁类似物给药被中断或正在中断或将要中断。一部分实例涉及在给药加巴喷丁类似物的患者中用于配制治疗神经病的医药的核酸结构的使用，但是，在上述核酸结构的给药前及给药后的至少一周内中断加巴喷丁类似物给药。
附图说明
图1a摘自Kessler et al.，Annals Clin.Transl.Neurology 2(5)：465-478(2015)，示出在给药高剂量VM202(第0天每个腿8mg，第14日每个腿8mg；两次就诊及两个腿的总剂量为32mg)、低剂量VM202(第0天每个退4mg，第14日每个腿4mg；两次就诊及两个腿的总剂量为16mg)或盐水(安慰剂)之后，在3个月、6个月及9个月后的II期临床试验中，对所有患者测定的疼痛水平的时间进程变化(time-course change)。
图1b也摘自Kessler et al.，Annals Clin.Transl.Neurology 2(5)：465-478(2015)，示出在给药高剂量VM202、低剂量VM202或盐水(安慰剂)之后，在3个月、6个月及9个月后在未服用普瑞巴林(Lyrica；pregabalin)和/或加巴喷丁(Neurontin；gabapentin)的患者组中测定的疼痛水平的时间进程变化。通常，相比于总患者组(the total group)(图1a)，向未服用普瑞巴林和/或加巴喷丁的患者(图1b)给药低剂量VM202后，疼痛比基线(baseline)大大减少。
图2示出通过使用慢性收缩损伤(CCI)小鼠来试验与VM202-媒介疼痛减少有关的加巴喷丁的效果的实验步骤。执行了与坐骨神经(慢性收缩损伤(CCI)或假手术(sham))有关的手术步骤，在低0天，向5周龄雄小鼠给药质粒(pCK或VM202)，从第1天至第15天为止，每天向小鼠给药加巴喷丁或磷酸盐缓冲液(PBS)，通过Von Frey纤维丝测痛仪(von Freyfilament test)测定的它们的疼痛水平从第14日开始至第16天为止。
图3示出在4个不同的动物组中测定的疼痛水平(y轴中的机械缩足频率(pawwithdrawal frequency)％)。(a)没有慢性收缩的假手术组(Sham)动物根据时间进程呈现低水平的疼痛(“假手术组”，具有菱形的线)；(b)未每天注射加巴喷丁并注射pCK的慢性收缩损伤-动物持续具有高水平的疼痛(“pCK-磷酸盐缓冲液(PBS)”，具有三角形的线)；(c)每天注射加巴喷丁并注射pCK的慢性收缩损伤-动物在加巴喷丁给药之后疼痛水平暂时减少(“pCK+加巴喷丁”，具有圆形的线)；以及(d)未每天注射加巴喷丁并注射VM202的慢性收缩损伤-动物具有低水平的疼痛(“VM202”，具有×的线)。
图4示出在4个不同动物组中测定的疼痛水平(y轴中的机械缩足频率％)。(a)没有慢性收缩的假手术组动物根据时间进程呈现低水平的疼痛(“假手术组”，具有菱形的线)；(b)未每天注射加巴喷丁并注射pCK的慢性收缩损伤-动物具有高水平的疼痛(“pCK-磷酸盐缓冲液”，具有三角形的线)；(c)未每天注射加巴喷丁并注射VM202的慢性收缩损伤-动物具有低水平的疼痛(“VM202”，具有×的线)，(d)每天给药加巴喷丁并注射VM202的慢性收缩损伤-动物在给药加巴喷丁之后疼痛暂时减少，之后，疼痛水平急剧增加后逐渐减少。
图5示出神经损伤小鼠(nerve crush mouse)模型中用于测试与VM202-媒介神经再生有关的加巴喷丁效果的实验步骤。诱导神经损伤，在第1天向9周龄雄C57BL/6给药VM202，从第2日至第6日为止每天注射加巴喷丁，在低7天之星神经压力测试(nerve pinchtest)。
图6示出在神经损伤小鼠模型中测定的神经再生(例如，再生的神经长度(mm))。杆从左侧至右侧为止示出(i)与VM202有关的阴性对照组(pCK载体)及与加巴喷丁有关的阴性对照组(每天注射磷酸盐缓冲液)；(ii)给药VM202及每天注射的磷酸盐缓冲液；(iii)给药pCK及每天注射的加巴喷丁；以及(iv)给药VM202及每天注射的加巴喷丁的小鼠中的神经再生的程度。在利用VM202处理的小鼠中，即使利用磷酸盐缓冲液或加巴喷丁处理或未处理，也显著呈现更优秀的神经再生。但是，相比于利用加巴喷丁处理的小鼠，VM202媒介神经再生在利用磷酸盐缓冲液处理的对照组小鼠中呈现显著地改善效果。
图7a示出从每天注射磷酸盐缓冲液或加巴喷丁的假手术组小鼠(通道1及4)；注射pCK并每天注射磷酸盐缓冲液或加巴喷丁的神经损伤小鼠(通道2及5)；及处理VM202并每天注射磷酸盐缓冲液或加巴喷丁的神经损伤小鼠(通道3及6)获取的蛋白质样品的免疫印迹分析结果。在各自的蛋白质通过特异性抗体检测c-Jun(上端)及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(下端)的表达。图7b示出各个样品中的c-Jun表达的相对水平，通过测定c-Jun的带强度而算出，对甘油醛-3-磷酸脱氢酶的带强度与强度进行比较。
图8a示出当给药VM202后在第一个两周或第二个两周(3～4周)内还利用加巴喷丁处理时，用于测试慢性收缩损伤小鼠中VM202-媒介的疼痛减少的实验步骤。图8b示出4个不同动物组中的疼痛水平(机械缩足频率，反应的#)。(a)没有慢性收缩的假手术组动物根据时间进程示出低水平的疼痛(“假手术”)、(b)未每天注射加巴喷丁并注射pCK的慢性收缩损伤-动物具有高水平的疼痛(“慢性收缩损伤-pCK”)、(c)未每天注射加巴喷丁并注射VM202的慢性收缩损伤-动物具有低水平的疼痛(“VM202”)、(d)在第一个两周内每天给药加巴喷丁并注射VM202的慢性收缩损伤-动物具有高水平的疼痛(“慢性收缩损伤-VM202-Gaba1”)及(e)在第二个两周内每天给药加巴喷丁并注射VM202的慢性收缩损伤-动物具有低水平的疼痛(“慢性收缩损伤-VM202-Gaba2”)。
图9a示出用于试验给药VM202后第0天(“GP1”)、第3日(“GP2”)、第7天(“GP3”)或第10天(“GP4”)开始的通过每天注射加巴喷丁来追加处理的慢性收缩损伤小鼠中的VM202-媒介的疼痛减少的试验步骤。图9b示出在6个不同动物组中测定的疼痛水平(y轴中的机械缩足频率％)。(a)注射VM202并每天注射加巴喷丁的慢性收缩损伤-动物具有高水平的疼痛，(b)注射VM202并未每天注射加巴喷丁的慢性收缩损伤-动物具有低水平的疼痛，(c)注射VM202并第0天开始每天注射加巴喷丁的慢性收缩损伤-动物具有高水平的疼痛(“GP1”)，(d)注射VM202并第3日开始每天注射加巴喷丁的慢性收缩损伤-动物具有高水平的疼痛(“GP2”)，(e)注射VM202并第7天开始每天注射加巴喷丁的慢性收缩损伤-动物具有高水平的疼痛(“GP3”)，(f)注射VM202并第10天开始每天注射加巴喷丁的慢性收缩损伤-动物具有低水平的疼痛(“GP4”)。
所有值均为3个独立实验的平均(mean)+标准误差平均(standard error mean；SEM)。通过单向方差分析(one-way ANOVA)和图基事后测试(Tukey’s post-hoc)确定多个值之间的差异。
附图仅以例示为目的示出本发明的多种实例。普通技术人员将从以下讨论中容易认识到，本说明说明书上示出的结构及方法的的代替性实例可在不超出在本说明书上说明的本发明的原理的范围内采用
具体实施方式
1.定义
除非另行定义，在本申请使用的所有技术术语及科学术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义。如在本说明书使用，以下术语具有如下的含义。
在本申请使用的术语“(多个)加巴喷丁类似物”指作为抑制性神经传递物质γ－氨基丁酸的衍生物的药物分类，用于醋各α2δ亚单元-包含电压-依赖性钙通道。加巴喷丁类似物不仅包括如加巴喷丁(Neurontin)及普瑞巴林(Lyrica)的得到临床认可的加巴喷丁类似物，还包括加巴喷丁药物前体、加巴喷丁酯(Horizant)，但并不限定于此。
在本说明书中使用的术语“中断(discontinue)”意味着阻断(breaking)持续给药药物的过程。这包括突然的给药终止及通过减少特定期间内的剂量和/或频率的给药终止，但并不限定于此。偶尔，上述过程可包括剂量和/或频率的暂时性增加、减少或维持。上述过程还可包括从一个加巴喷丁类似物转换为另一个加巴喷丁类似物的过程。
在本说明书中使用的术语“逐渐减少(taper)”意味着到终止(end)位置逐渐减少药物剂量或频率来中断药物给药的方法。
在本说明书中使用的术语“肝细胞生长因子的异构体(isoforms)”意味着具有与在动物自然产生的肝细胞生长因子多肽的氨基酸序列具有至少80％的相同性的氨基酸序列的多肽。上述术语包括具有与规定的全长野生型肝细胞生长因子(full length wildtype HGF)多肽相同至少80％的氨基酸序列的多肽，包括具有与自然产生肝细胞生长因子对立基因突变体(naturally occurring HGF allelic variant)、剪接突变体(splicevariant)、或缺失突变体(deletion variant)相同至少80％的氨基酸序列的多肽。为了在本发明中使用，优选的肝细胞生长因子的异构体包括选自由全长肝细胞生长因子(ffull-length HGF；flHGF)(同义词为fHGF)、缺失突变体肝细胞生长因子(deleted variant HGF；dHGF)、NK1、NK2及NK4组成的组中的两种以上的异构体。根据本发明的更优选实例，在本说明书上记载的方法中使用的肝细胞生长因子的异构体包括全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF)。
为了指由人肝细胞生长因子蛋白的1-728氨基酸构成的蛋白质，相互交换使用术语“人全长肝细胞生长因子”、“全长肝细胞生长因子(flHGF)”及“全长肝细胞生长因子(fHGF)”。全长肝细胞生长因子(flHGF)的序列在序列1中提供。
为了指通过人肝细胞生长因子基因的可变剪接(alte核糖核酸tive splicing)生成的肝细胞生长因子蛋白的缺失突变体，相互交换使用术语“人缺失突变体肝细胞生长因子”及“缺失突变体肝细胞生长因子”。具体地，“人缺失突变体肝细胞生长因子”或“缺失突变体肝细胞生长因子”制从全长肝细胞生长因子序列缺失α链的第一个三环结构(kringle)域的5个氨基酸(F、L、P、S及S)的人肝细胞生长因子蛋白。人缺失突变体肝细胞生长因子为长度为723个的氨基酸。人缺失突变体肝细胞生长因子的氨基酸序列在序列2提供。
在本说明书中使用的术语“VM202”指作为在pCK载体克隆的肝细胞生长因子-X7的还称为pCK-HGF-X7(序列11)的质粒脱氧核糖核酸。VM202根据布达佩斯条约在2002年3月12日以保藏号KCCM-10361保藏于韩国微生物保存中心(KCCM)。
在本说明书中使用的术语“载体”指核酸的克隆和/或用于向宿主细胞内传递核酸的一种媒介物(vehicle)。尤其，载体包括质粒、病毒载体、脂质体(阳离子脂质体-脱氧核糖核酸复合物)、人工合成多聚物(阳离子聚合物-脱氧核糖核酸复合物)及蛋白质-脱氧核糖核酸复合物。
在本说明书中使用的术语“表达载体”指以能够表达转化为宿主后插入的核酸序列的方式设计的载体。
术语“重组的(reconstituted)”或“重组(reconstitution)”指如为了保存及储存而之前变更的物质的再水化(rehydration)引起的复原为原型(original form)，如复原为之前干燥并储存的脱氧核糖核酸质粒剂型的液态(liquid state)。本发明的冻干的组合物可在用于制备适合给药的稳定且单一分散的溶液的任意水溶液重组。这种水溶液包括无菌水(sterile water)、TE缓冲液、磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或生理盐水，但并不限定于此。
在本发明的方法中重组的冻干脱氧核糖核酸的浓度根据包括所要传递的剂型的量、对象(subject)的年龄及体重、传递方法和路径及传递的抗原的免疫原性的诸多要素调整。
在本说明书中使用的术语“治疗”意味着(a)神经性疼痛抑制；(b)神经性疼痛的缓和；及(c)神经性疼痛的去除。在一部分实例中，本发明的组合物可通过神经细胞的生长或神经细胞凋亡的抑制治疗神经性疼痛。
在本说明书中使用的术语“治疗有效剂量(therapeutically effective dose)”或“有效量(effective amount)”指生成所要的效果的给药的剂量(dose)或量(amount)。在本方法的脉络中，治疗有效量为有效地整料神经病的症状的量。准确的剂量或量依赖治疗目的，普通技术人员可利用公知的技术(参照：例如，Lloyd(1999)The Art，Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding)确认。
在本说明书中使用的术语“足量(sufficient amount)”指可充分生成所要的效果的量。
在本说明书中使用的术语“简并序列(degenerate sequence)”指为了提供与从参考核酸序列翻译的相同的核酸序列而能够翻译的核酸序列。
2.其他解释规则
应理解的是，在本说明书中引用的范围被缩短。
例如，应理解的是，1至50的范围包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、4、49及50组成的组中的一种数、数的组合或子范围。
除非另行表示，与具有一种以上的立体中心(stereocenter)的化合物有关的提及意味着各个立体异构体及它们的立体异构体的所有组合。
3.对给药加巴喷丁类似物的患者治疗神经病的方法
一实施方式提出对给药加巴喷丁类似物的患者治疗神经病的方法。上述方法包括：选择给药加巴喷丁类似物的患有神经病的患者的步骤；中断加巴喷丁类似物的给药的步骤；以及给药表达人肝细胞生长因子蛋白的两个异构体的核酸结构的治疗有效量的步骤。在优选的实例中，核酸结构为VM202。
3.1.患有神经病的患者
在本申请记载的方法中，为了治疗而选择的患者患有神经病。上述患者可患有周围神经病(peripheral neuropathy)、颅神经病(cranial neuropathy)、自主神经病变(autonomic neuropathy)或局灶性神经病(focal neuropathy)。神经病可由疾病、受伤、感染或维生素缺乏状态引起。例如，神经病可由糖尿病、维生素缺乏、自身免疫性疾病、遗传性或遗传性疾病、淀粉样变性(amyloidosis)、尿毒症(uremia)、毒素(toxins)或毒物(poisons)、创伤(trauma)或伤害(injury)、肿瘤(tumors)诱发或特发性(idiopathic)。
在当前的优选实例中，患者患有糖尿病周围神经病变。
3.2.给药加巴喷丁类似物的患者
可通过以往周知的多种方法选择给药加巴喷丁类似物的患者。例如，能够以作为对于标准化的问卷的应答的一部分或采访过程中的从患者或患者的监护人获取的信息进行选择。上述选择还能够以与患者相关的医疗、临床、处方或保险记录或其他记录或从为了患者的医疗专家获取的信息为基础。与选择相关的信息包括所给药的药物的要命及其剂量、频率、给药路径、最初给药日期、最终给药日期等，但并不限定于此。选择性地，上述选择能够以通过如血液检查的诊断获取的信息为基础。
在一部分实例中，患者最近暴露于加巴喷丁类似物的时间可能在选择时间之前小于3个月。在一部分实例中，患者最近暴露于加巴喷丁类似物的时间在选择时间之前小于1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。在一部分实例中，上述患者最近暴露于加巴喷丁类似物的时间在选择时间之前小于1日、5日、10日、15日、20日、25日、30日、35日、40日45日或50日。
在一部分实例中，患者最近暴露于加巴喷丁类似物的时间在第一次给药VM202的时间之前小于3个月。在一部分实例中，患者最近暴露于加巴喷丁类似物的时间在第一次给药VM202的时间之前小于1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。在一部分实例中，患者最近暴露于加巴喷丁类似物的时间在第一次给药VM202的时间之前小于1日、5日、10日、15日、20日、25日、30日、35日、40日、45日或50日。
在一部分实例中，患者最后暴露于大于处方剂量(prescribed dose)的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的加巴喷丁类似物的时间在选择时间之前小于3个月。在一部分实例中，患者最后暴露于大于处方剂量的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的加巴喷丁类似物的时间在选择时间之前小于1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。在一部分实例中，患者最后暴露于大于处方剂量的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的加巴喷丁类似物的时间在选择时间之前小于1日、5日、10日、15日、20日、25日、30日、35日、40日、45日或50日。
在一部分实例中，患者最后暴露于大于处方剂量的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的加巴喷丁类似物的时间在第一次给药VM202时间之前小于3个月。在一部分实例中，患者最后暴露于大于处方剂量的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的加巴喷丁类似物的时间在第一次给药VM202时间之前小于1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周。在一部分实例中，患者最后暴露于大于处方剂量的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的加巴喷丁类似物的时间在第一次给药VM202时间之前小于1日、5日、10日、15日、20日、25日、30日、35日、40日、45日或50日。
在一部分实例中，先前暴露于加巴喷丁类似物3日、5日、7日、14日、21日、28日或35日以上的患者被选择为给药加巴喷丁类似物的患者。在一部分实例中，先前暴露于加巴喷丁类似物2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月或18个月以上的患者被选择为给药加巴喷丁类似物的患者。
在一部分实例中，先前暴露于大于处方剂量的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的加巴喷丁类似物3日、5日、7日、14日、21日、28日或35日以上的患者被选择为给药加巴喷丁类似物的患者。在一部分实例中，先前暴露于大于处方剂量的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的加巴喷丁类似物2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、12个月或18个月以上的患者被选择为给药加巴喷丁类似物的患者。
3.3.加巴喷丁类似物的中断(discontinuation)
若选择患者，则中断加巴喷丁类似物的给药。在一部分实例中，中断加巴喷丁类似物的给药。在一部分实例中，通过完全终止加巴喷丁类似物的给药来中断加巴喷丁类似物的给药。
在一部分实例中，通过逐渐减少(tapering)加巴喷丁类似物的给药来中断加巴喷丁类似物的给药。在一部分实例中，加巴喷丁类似物的剂量在1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周内减少。在一部分实例中，加巴喷丁类似物的剂量在1个月、2个月、3个月、4个月或5个月内减少。在一部分实例中，加巴喷丁类似物的给药频率在1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周内降低。在一部分实例中，加巴喷丁类似物的给药频率在1个月、2个月、3个月、4个月或5个月内降低。
在多种实例中，加巴喷丁类似物的给药减少10～100mg/周、20～100mg/周、20～90mg/周、30～80mg/周、40～80mg/周、50～75mg/周、55～70mg/周、55～65mg/周或约60mg/周。
在一部分实例中，加巴喷丁类似物的给药以小于500mg/4日、450mg/4日、400mg/4日、350mg/4日、300mg/4日、250mg/4日、200mg/4日、150mg/4日、100mg/4日或50mg/4日的比例减少。
在一部分实例中，加巴喷丁类似物的给药以小于500mg/3日、450mg/3日、400mg/3日、350mg/3日、300mg/3日、250mg/3日、200mg/3日、150mg/3日、100mg/3日或50mg/3日的比例减少。
在一部分实例中，以小于500mg/2日、450mg/2日、400mg/2日、350mg/2日、300mg/2日、250mg/2日、200mg/2日、150mg/2日、100mg/2日、50mg/2日、25mg/2日、10mg/2日或5mg/2日比例减少。
在一部分实例中，以小于500mg/日、450mg/日、400mg/日、350mg/日、300mg/日、250mg/日、200mg/日、150mg/日、100mg/日、50mg/日、25mg/日、10mg/日、5mg/日或2mg/日的比例减少。
在一部分实例中，加巴喷丁类似物的给药减少比例根据上述与减少有关的患者的反应调整。例如，特定比例可根据如反弹焦虑(rebound anxiety)、失眠症(insomnia)、头痛、神经质(nervousness)、忧郁症(depression)、疼痛(pain)、多汗(increasedsweating)、头晕(dizziness)等的患者的戒断症状(withdrawal)确定。在一部分实例中，特定比例可根据如疼痛的与神经病相关的症状确定。
在一部分情况下，加巴喷丁类似物的剂量可在根据患者的反应的中断过程中暂时增加或维持同一水平。例如，加巴喷丁类似物的剂量能够以如反弹焦虑、失眠症、头痛、神经质、忧郁症、疼痛、多汗、头晕等的患者的戒断症状为基础暂时增加或维持同一水平。在一部分情况下，加巴喷丁类似物的剂量能够以如疼痛的与神经病相关的患者的症状为基础暂时增加或维持同一水平。
在一部分实例中，加巴喷丁类似物的给药减少比例可根据患者过去暴露于加巴喷丁类似物的情况确定。例如，特定比例可根据加巴喷丁类似物的给药剂量或频率或者先前暴露于加巴喷丁类似物的量或长度确定。
3.4.给药对两种肝细胞生长因子异构体进行编码的核酸结构
向选择的患者给药表达人肝细胞生长因子蛋白的两种异构体的核酸结构的治疗有效量。
可在中断向患者给药加巴喷丁类似物后给药核酸结构。
在多种实例中，核酸结构在完全中断加巴喷丁类似物的给药后给药。在一部分实例中，核酸结构在完全中断加巴喷丁类似物的给药后的至少1日、2日、3日、4日、5日、7日、14日、21日、30日、60日或90日后给药。在一部分实例中，核酸结构在完全中断加巴喷丁类似物的给药后的至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后给药。
在特定实例中，核酸结构在完全中断加巴喷丁类似物的给药后第一次给药。在一部分实例中，核酸结构的第一次给药在完全中断加巴喷丁类似物的给药后的至少1日、2日、3日、4日、5日、7日、14日、21日、30日、60日或90日后。在一部分实例中，核酸结构的第一次给药在完全中断加巴喷丁类似物的给药后的至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周后。在一部分实例中，核酸结构的第一次给药在完全中断加巴喷丁类似物的给药后的至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月后。
在一部分实例中，核酸结构在逐渐减少加巴喷丁类似物的给药的过程中第一次给药。在一部分实例中，核酸结构的第一剂量在逐渐减少疗法(tapering regimen)的第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第10天、第14天、第21天、第28天或第35天给药。在特定实例中，核酸结构的第一剂量在逐渐减少过程的第1周、第2周、第3周、第4周、第5周或第6周给药。在一部分实例中，核酸结构的第一剂量在完全中断加巴喷丁类似物的给药后的0天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、28天或35天后给药。
在一部分实例中，在给药表达两种肝细胞生长因子异构体的核酸结构之后，不再给药加巴喷丁类似物至少4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一部分实例中，在给药表达两种肝细胞生长因子异构体的核酸结构之后，不再给药加巴喷丁类似物至少1周、2周、3周、4周或5周。在一部分实例中，在给药表达两种肝细胞生长因子异构体的核酸结构之后，不再给药加巴喷丁类似物5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一部分实例中，在给药表达两种肝细胞生长因子异构体的核酸结构之后，不再给药加巴喷丁类似物至少1个月、2个月、3个月、6个月、9个月、12个月、24个月或36个月。
在一部分实例中，表达两种肝细胞生长因子异构体的核酸结构在多次就诊过程中给药。在此情况下，加巴喷丁类似物的给药在各个就诊之前中断。在一部分实例中，加巴喷丁类似物在每次就诊前不给药至少1周、2周、3周、4周、5周或6周。在一部分实例中，加巴喷丁类似物在每次就诊前不给药至少5天、6天、7天、8天、9天、10天或15天。在一部分实例中，加巴喷丁类似物在每次就诊后不给药至少1周、2周、3周、4周、5周或6周。在一部分实例中，加巴喷丁类似物在每次就诊后不给药至少5天、6天、7天、8天、9天、10天或15天。在一部分情况下，在多次就诊过程中，到核酸结构的给药结束为止不给药加巴喷丁类似物。
3.5.表达两种肝细胞生长因子异构体的核酸结构
在本说明书上记载的方法中，核酸结构表达人肝细胞生长因子蛋白的至少两种异构体。在一部分实例中，上述核酸结构表达另种异构体。在典型实例中，上述核酸结构表达至少一种全长肝细胞生长因子及缺失突变体肝细胞生长因子。在特定实例中，上述核酸结构表达全长肝细胞生长因子及缺失突变体肝细胞生长因子两者。
3.5.1.表达的序列(Expressed sequences)
在一部分实例中，上述结构包括与各个异构体编码序列(CDS)有关的表达调节序列，表达两种或两种以上的肝细胞生长因子异构体。在一部分实例中，例如，上述结构以(1)表达调节序列-(2)第一异构体的编码序列-(3)内部核糖体进入位点(IRES)-(4)第二异构体的编码序列-(5)转录终止序列的顺序包括两个编码序列之间的内部核糖体进入位点(IRES，inte核糖核酸l ribosomal entry site)。内部核糖体进入位点可在内部核糖体进入位点序列开始翻译来从单一结构表达所关注的两个基因。在另一具体例中，对各个肝细胞生长因子的单一异构体进行编码的多个结构为了诱导所给药的对象中的肝细胞生长因子的一种以上的异构体而一同使用。
本方法的优选实例通过包含选择性剪接位点来使用同时表达肝细胞生长因子的两种或两种以上的其他类型的异构体，如全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF)的结构。在本说明书引用的美国专利第7812146号已证明，通过可变剪接的对肝细胞生长因子的两种异构体(全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF))进行编码的结构具有比对一种肝细胞生长因子异构体进行编码的结构更多的(几乎多250倍)表达效率(expression efficiency)。在典型实例中，上述结构包括：(1)包含人肝细胞生长因子基因的外显子1-4的第一序列或上述第一序列的简并序列；(2)包含人肝细胞生长因子基因的内含子4的第二序列或上述第二序列的片段；以及(3)包含人肝细胞生长因子基因的外显子5-18的第三序列或上述第三序列的简并序列。从上述结构可通过外显子4与外显子5之间的可变剪接生成肝细胞生长因子的两种异构体(全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF))。
在一部分实例中，上述结构包含内含子4的所有序列。在一部分实例中，上述结构包含内含子4的片段。在优选的实例中，上述结构包含选自由序列3至10组成的组中的核苷酸序列。上述序列3的核苷酸序列与对全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF)进行编码的7113bp多核苷酸相应，包含内含子4的所有序列。序列4-10的核苷酸序列与对全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF)进行编码的多核苷酸相应，包含内含子4的多种片段。
将包含与人肝细胞生长因子的外显子1-18相应的互补脱氧核糖核酸(cDNA)及人肝细胞生长因子基因的内含子4或其片段的多种核酸结构命名为“肝细胞生长因子-X”，后跟如在美国专利第7812146号所记述的唯一编号。申请人测试的肝细胞生长因子-X包含具有序列3至10的核苷酸序列的肝细胞生长因子-X1、肝细胞生长因子-X2、肝细胞生长因子-X3、肝细胞生长因子-X4、肝细胞生长因子-X5、肝细胞生长因子-X6、肝细胞生长因子-X7及肝细胞生长因子-X8，但并不限定于此。
先前的研究表明，肝细胞生长因子的两种异构体(例如，全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF))可通过各个结构的外显子4与外显子5之间的可变剪接生成。而且，如在本说明书上引用的美国专利第7812146号所揭示的整体内容，在多种肝细胞生长因子结构中，肝细胞生长因子-X7呈现肝细胞生长因子的两种异构体(例如，全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF))的最高表达水平。因此，包含肝细胞生长因子-X7的核酸结构可在本发明的方法的优选实例中使用。
尤其，在优选实例中，pCK-HGF-X7(还称为“VM202”)(序列11)用于在本说明书上记载的方法。pCK-HGF-X7根据布达佩斯条约在2002年3月12日以保藏号KCCM-10361在韩国微生物保存中心(KCCM)保藏。
在本说明书上记载的方法中使用的肝细胞生长因子异构体的氨基酸序列及核苷酸序列还包含与野生型人肝细胞生长因子异构体的序列实质上相同的氨基酸序列及核苷酸序列。实质性同一性包含具有至少80％的同一性，更优选地，具有至少90％同一性，以及最优选地，具有至少95％的同一性的序列，上述野生型人肝细胞生长因子异构体的氨基酸序列或核苷酸序列最大限度地(in the maximal manner)与其他序列比对。用于比较的序列的比对方法在本技术领域周知。具体地，比对算法在美国国家生物信息中心(NCBI，Bethesda，Md.)的美国国家生物信息中心局部相似性基本查询工具(NCBI BLAST，BasicLocal Alignment Search Tool)网页公开，并与作为可用于确定同源性而使用的序列分析程序的blastp、blasm、blastx、tblastn及tblastx结合来使用。
3.5.2.载体
在本发明的方法中使用的结构通常包含具有以可操作的方式连接于表达的序列的一种或一种以上的调节序列(例如，启动子或增强子)的载体。
优选地，对肝细胞生长因子蛋白的一种或一种以上的异构体进行编码的多核苷酸以可操作的方式连接于表达结构内的启动子。术语“以可操作的方式连接(operativelylinked)”意味着核酸表达调节序列(与启动子、信号序列或转录因子结合部位的阵列相同)连接于第二核酸序列之间的功能性，上述表达调节序列影响与上述第二序列相应的核酸的转录和/或翻译。
在典型实例中，优选地，在动物内，更优选地，在哺乳动物细胞内，连接于多核苷酸的启动子为了控制多核苷酸的转录而进行工作，包含来源于哺乳动物细胞的基因组或哺乳动物病毒的启动子，例如，包含巨细胞病毒(CMV)启动子、腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、HSV tk启动子、RSV启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人IL-2基因启动子、人IFN基因启动子、人IL-4基因启动子、人淋巴毒素基因启动子及人GM-CSF基因启动子，但并不限定于此。更优选地，对本发明有用的启动子来源于人巨细胞病毒(hCMV)或EFlα启动子的立早(IE，immediately early)基因的启动子，最优选地，为来源于包含ATG起始密码子之前的序列的外显子1及外显子2的所有的序列的人巨细胞病毒立早基因的启动子/增强子及5'-UTR(非翻译区域)。
例如，在本发明中使用的表达盒可包含聚腺苷酸化序列，上述聚腺苷酸化序列包含牛生长激素终止子(bovine growth hormone terminator)(Gimmi，E.R.，et al.，Nucleic Acids Res.17：6983-6998(1989))、SV40-衍生的聚腺苷酸化序列(Schek，N，etal.，Mol.Cell Biol.12：5386-5393(1992))、HIV-1聚A(Klasens，B.I.F.，et al.，NucleicAcids Res.26：1870-1876(1998))、β-珠蛋白聚A(Gil，A.，et al，Cell 49：399-406(1987))、HSV TK聚A(Cole，C.N.and T.P.Stacy，Mol.Cell.5Biol.5：2104-2113(1985))或多瘤病毒聚A(Batt，D.Band G.G.Carmichael，Mol.Cell.Biol.15：4783-4790(1995))，但并不限定于此。
3.5.2.1.非-病毒性载体
在具体实例中，核酸结构为可表达两种或两种以上的肝细胞生长因子异构体的非-病毒性载体。
在典型实例中，非-病毒性载体为质粒。在当前的优选实例中，质粒为pCK、pCP、pVAX1或pCY。在尤其优选的实例中，质粒为pCK，详细内容可在WO2000/040737及Lee etal.，Biochem.Biophys.Res.Comm.272：230-235(2000)查找，两个文献作为参考文献引用于本说明书上。利用pCK转化的大肠杆菌(E.coli)(Top 10-pCK)根据布达佩斯条约在2003年3月21日保藏于韩国微生物保存中心(KCCM)(保藏号KCCM-10476)。利用pCK-VEGF165转化的大肠杆菌(即，具有VEGF编码序列的pCK载体-Top10-pCK/VEGF165')在1999年12月27日根据布达佩斯条约的条件保藏于韩国微生物保存中心(KCCM)(保藏号：KCCM-10179)。
如Lee et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.272：230(2000)；WO2000/040737(两个文献作为参照被引用)的详细公开，pCK载体以使基因，如肝细胞生长因子基因的表达在人巨细胞病毒的增强子/启动子下调节的方式构成。pCK载体用于对于人体的临床试验，已确认安全性及功效(Henry et al.，Gene Ther.18：788(2011))。
在尤其优选的实例中，包含HGF-X7表达序列的pCK质粒利用为本发明的方法中的核酸结构。作为优选的一实例的pCK-HGF-X7(还称为“VM202”)根据布达佩斯条约的条款以保藏号KCCM-10361保藏于韩国微生物保存中心(KCCM)(以利用上述质粒转化的大肠杆菌菌株的形态保藏)。
3.5.2.2.病毒性载体
在另一实例中，以往公知的多种病毒性载体可利用于搬运并表达本发明的一种或两种以上的肝细胞生长因子异构体蛋白。例如，利用逆转录酶病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒研发的载体可利用于本发明的一部分实例。
(a)逆转录酶病毒
可搬运表达外因性基因的逆转录酶病毒将它们的基因组整合于宿主基因组并具有宽宿主光谱，因此用于病毒基因传递载体。
为了构建逆转录酶病毒载体，本发明的多核苷酸代替特定病毒序列向病毒基因组插入来生成复制缺陷病毒(replication-defective virus)。为了生成病毒粒子，还构建包含gag、pol以及env基因且不包含长末端重复(LTR，long terminal repeat)序列及W序列成分的包装细胞系(Mann et al.，Cell，33：153-159(1983))。当本发明的多核苷酸、包含长末端重复序列及W序列的重组质粒向此细胞系导入时，W序列可使重组质粒的核糖核酸(RNA)转录物向病毒粒子内包装，接着，分泌到培养基(Nicolas and Rubinstein“Retroviralvectors，”In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors and their uses，Rodriguez and Denhardt(eds.)，Stoneham：Butterworth，494-513(1988))。之后包含重组逆转录酶病毒的培养基，选择性浓缩，并为了传递基因而利用。
据报告，利用第二代逆转录酶病毒载体成功传递基因。Kasahara et al.(Science，266：1373-1376(1994))制备了莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemiavirus)的变异体，上述莫洛尼鼠白血病病毒代替包膜区插入促红细胞生成素(EPO，Etythropoietin)序列来生成具有新结合特性的嵌合蛋白。相同地，本基因传递系统可根据第二代逆转录酶病毒载体的构建战略构建。
(b)慢病毒
慢病毒还可在本发明的一部分实例使用。慢病毒的逆转录酶病毒的亚类。但是，慢病毒可整合到非-分裂细胞的基因组，相反，逆转录酶病毒可仅感染分裂细胞(dividingcells)。
慢病毒载体通常有利用多种质粒转化的包装细胞系，通常由HEK293生产。质粒包含(1)对如衣壳及逆转录酶的病毒粒子蛋白进行编码的包装质粒、(2)包含向靶传递的外因性基因的质粒。
当病毒进入细胞时，核糖核酸形态的病毒基因组逆转录来生成脱氧核糖核酸，接着，通过病毒整合酶(integrase)插入到基因组。因此，与慢病毒载体一同传递的外源基因(exogenous)可留在基因组，当细胞分裂时，向细胞的后代传递。
(c)腺病毒
通常，腺病毒由于其中间大小基因组(mid-sized genome)、操作容易性、高滴度(high titer)、宽靶细胞范围及高感染性采用为基因传递系统。病毒基因组的两侧末端包含100-200bp末端反向重复序列(ITR，inverted terminal repeats)，这为病毒脱氧核糖核酸复制及包装所需的顺式元件(cis elements)。El区域(ElA及ElB)对病毒基因组及负责调节多个细胞基因的转录的蛋白进行编码。E2区域(E2A及E2B)的表达导致用于复制病毒脱氧核糖核酸的蛋白质的合成。
在至今开发的腺病毒载体中，通常使用具有所删除的E1区域的复制缺陷型腺病毒(replication incompetent adenovirus)。在腺病毒载体缺失的E3区域可提供与转基因(transgene)有关的插入部位(Thimmappaya，B.et al.，Cell，31：543-551(1982)；及Riordan，JR et al.，Science，245：1066-1073(1989))。因此，优选地，核心蛋白聚糖-编码核苷酸序列插入于缺失的El区域(ElA区域和/或ElB 5区域，优选地，ElB区域)或缺失的E3区域。本发明的多核苷酸可插入于缺失的E4区域。与病毒基因组序列相关地，术语“删除”包含整体缺失及部分缺失。事实上，腺病毒包装约105％的野生型基因组来可收容约2extrakb的脱氧核糖核酸(Ghosh-Choudhury et al.，EMBO J.'6：1733-1739(1987))。与此相关地，插入于腺病毒的上述所记载的外源序列还可插入于腺病毒野生型基因组。
腺病毒可以为公知的血清型或亚群A-F中的一种。C亚群的5型腺病毒为用于构建本发明的腺病毒基因传递系统的最优选起始物质。与5型腺病毒有关的生物信息及遗传信息已周知。通过腺病毒基因传递系统传递的外源基因为游离基因外源基因(episomal)，对于宿主细胞呈现遗传毒性。因此，使用腺病毒基因传递系统的基因治疗相当安全。
(d)腺相关病毒(AAV)
腺相关病毒可感染非分裂细胞内及多种型的细胞，将它们有用地构建本发明的基因传递系统。与腺相关病毒载体的使用及制备有关的详细说明记载于美国专利第5139941号及第4797368号。
作为基因传递系统的与腺相关病毒有关的研究结果在LaFace et al，Viology，162：483-486(1988)，Zhou et al.，Exp.Hematol.(NY)，21：928-933(1993)，Walsh et al.，J.Clin.Invest.，94：1440-1448(1994)及Flotte et al.，Gene Therapy，2：29-37(1995)公开。通常，重组腺相关病毒病毒通过对包含侧面与2个腺相关病毒末端重复(terminalrepeats)结合的(flanked)关注基因(即，所要传递的核苷酸序列)的质粒(McLaughlin etal.，1988；Samulski et al.，1989)及不具有末端重复的野生型腺相关病毒编码序列的表达质粒(McCarty et al.，J.Viral.，65：2936-2945(1991))进行共转染(co-transfection)来制备。
(e)其他病毒载体
其他病毒载体可用作本发明中的基因传递系统。来源于如牛痘病毒(PuhlmannM.et al.，Human Gene Therapy 10：649-657(1999)；Ridgeway，“Mammalian expressionvectors，”In：Vectors：A survey of molecular cloning vectors and theiruses.Rodriguez and Denhardt，eds.Stoneham：Butterworth，467-492(1988)；Baichwaland Sugden，“Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses：Transient and stable expression of transferred genes，”In：Kucherlapati R，ed.Gene transfer.New York：Plenum Press，117-148(1986)and Coupar et al.，Gene，68：1-10(1988))、慢病毒(Wang G.et al.，J.Clin.Invest.104(11)：RS 5-62(1999))及单纯疱疹病毒(Chamber R.，et al.，Proc.Natl.1015Acad.Sci USA 92：1411-1415(1995))的病毒的载体可在用于向细胞内转移所有本发明的多核苷酸的本发明的传递系统使用。
3.6.给药表达两种肝细胞生长因子异构体的核酸结构
3.6.1.传递方法
在本说明书中记载的方法中，为了给药表达肝细胞生长因子的一种以上的异构体的多核苷酸结构，可使用多种传递方法。
3.6.1.1.注射
在典型实例中，核酸结构通过液态药剂学组合物的注射而给药。
在当前的优选实例中，多核苷酸结构通过肌肉注射(intramuscular injection)给药。通常，多核苷酸结构通过与疼痛部位或患者认知的疼痛部位接近的肌肉注射给药。在一部分实例中，多核苷酸结构向对象的手、脚、腿或臂的肌肉给药。
在一部分实例中，结构皮下(subcutaneously)注射或皮内(intradermally)注射。
在一部分实例中，多核苷酸结构通过血管内传递(intravascular delivery)给药。在特定实例中，结构通过逆行静脉注射(retrograde intravenous injection)注射。
3.6.1.2.电穿孔法(Electroporation)
在一些情况下，可通过执行注射和电穿孔(electroporation)来改善利用质粒脱氧核糖核酸的体内(in vivo)细胞的转化效率。因此，在一部分实例中，通过注射和电穿孔给药多核苷酸。在特定实例中，电穿孔通过使用TriGridTMDelivery System(Ichor MedicalSystems，Inc.，San Diego，USA)。
3.6.1.3.声穿孔法(Sonoporation)
在一部分实例中，为了提高本发明的结构的转化效率而使用声穿孔法(Sonoporation)。声穿孔法利用超声波暂时渗透细胞膜来允许脱氧核糖核酸的细胞内吸收。多核苷酸结构可整合到微泡内，在向全身循环给药后，进行超声波的外部适用。超声波通过诱导靶组织内的微泡的空化(cavitation)来诱导结构的释放及转染的结果。
3.6.1.4.磁转染(Magnetofection)
在一部分实例中，磁转染用于提高本发明的结构的转化效率。上述结构与磁性纳米粒子结合后给药。高梯度(gradient)外部磁铁的适用使靶捕获复合物并维持。多核苷酸结构可通过酶解交联分子、电荷相互作用或基质分解释放。
3.6.1.5.脂质体
在一部分实例中，本发明的多核苷酸可通过脂质体传递。当磷脂悬浮于过量的水介质时，自动形成脂质体。如Nicolau and Sene，Biochim.Biophys.Acta，721：185-190(1982)及Nicolau et al.，Methods Enzymol.，149：157-176(1987)所记述，脂质体-媒介核酸传递非常成功。为了通过使用脂质体转染动物细胞而销售的试药的例包括阳离子脂质体(Gibco BRL)。捕获本发明的多核苷酸的脂质体与如内吞作用、吸附(adsorption)及融合(fusion)的机制与细胞相互作用后，向细胞内搬运。
3.6.1.6.转染(Transfection)
当病毒载体用于搬运对肝细胞生长因子进行编码的多核苷酸时，多核苷酸序列可通过现有的周知的多种病毒感染方法向细胞内传递。利用病毒载体的宿主细胞的感染记载于上述所提及的引用文献。
优选地，本发明的药剂学组合物可非口服给药。为了非口服给药，可采用静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射或局部注射。例如，药剂学组合物可通过逆行静脉注射(retrograde intravenous injection)注射。
优选地，本发明的药剂学组合物可肌肉给药。在一部分实例中，上述给药将受到神经病疼痛影响的肌肉当做靶。
3.6.2.剂量(Dose)
多核苷酸结构以治疗有效剂量给药。在本申请记载的方法中，治疗有效剂量为可有效治疗对象的神经病的剂量。
在本说明书中记载的方法地在一部分实例中，多核苷酸结构以总剂量1μg至200mg、1mg至200mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至20mg、5mg至10mg、16mg、8mg或4mg给药。
在典型实例中，总剂量分为多个单独注射剂量。在一部分实例中，总剂量分为多个相同的注射剂量。在一部分实施方式中，总剂量分为不等的的注射剂量。
在多种分剂量实例中，总剂量向4个、8个、16个、24个或32个不同的注射部位给药。
在一部分实例中，注射剂量为0.1～5mg。在特定实例中，注射剂量为0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg、0.35mg、0.4mg、0.45mg或0.5mg。
总剂量可在1次就诊过程中或2次以上的就诊过程中给药。
在常规分剂量实例中，多个注射剂量均在相互之间的1小时内给药。在一部分实例中，多个注射剂量均在相互之间的1.5小时、2小时、2.5小时或3小时内给药。
在本方法的在多种实例中，无论是以单一剂量给药或分为多个注射剂量，总剂量的多核苷酸结构仅向对象给药一次。
在一部分实例中，在1次、2次、3次或4次就诊中向多个注射部位给药总剂量的多核苷酸结构可包括单一循环。尤其，在2次就诊向多个注射部位给药32mg、16mg、8mg或4mg的多核苷酸结构可包括单一循环。2次就诊可间隔3日、5日、7日、14日、21日或28日。
在一部分实例中，上述循环可重复。上述循环可重复2次、3次、4次、5次、6次或6次以上。
在一部分实例中，循环可在上一循环之后重复1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或12个月以上。
在一部分实例中，在后续循环给药的总剂量与在上一循环中给药的总剂量相同。在一部分实例中，在后续循环给药的总剂量与上一循环中给药的总剂量不同。
在当前的优选实例中，核酸结构向每个患肢(limb)给药8mg的剂量，以多个肌肉注射及多个就诊平分，在任一单一就诊过程中，多个注射分别在分离的注射部位执行。在特定实例中，核酸结构向每个患肢(affected limb)给药8mg的剂量，在第0天向每个肢平分为4mg的第一剂量及在第14天向每个肢平分为4mg的第二剂量，其中，第一剂量及第二剂量平分为多个注射剂量。
实际剂量、给药速度及时间进程取决于所治疗的神经病的本质及重症程度。在典型实例中，多核苷酸结构以能够减少神经病症，例如，神经病疼痛(neuropathic pain)的症状的有效量给药。在一部分实例中，上述量可在给药1周内有效地减少神经病疼痛。在一部分实例中，上述量可在给药2周、3周或4周内有效地减少神经病疼痛。
在一部分实例中，同时给药两种不同型的结构(即，对全长肝细胞生长因子(flHGF)进行编码的第一结构及对缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF)进行编码的第二结构)，来诱导肝细胞生长因子的两种异构体的表达。在一部分实例中，通过传递对全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF)两者进行编码的单一结构来诱导全长肝细胞生长因子(flHGF)及缺失突变体肝细胞生长因子(dHGF)两者的表达。
根据向普通技术人员公知的常规技术，如上述记载的内容，药剂学组合物可剂型化为药剂学上允许的载体和/或媒介物，最终提供如单位剂量形态(unit dose form)及多剂量形态(multidose form)的多种形态。剂型(formulation)的非限制性例包括溶液(solition)、油或水介质中的悬浮液(suspension)或乳剂(emulsion)、提取物、酏剂(elixir)、粉末(powder)、颗粒(granule)片剂(tablet)及胶囊(capsule)，但并不限定于此，还可包括分散剂(dispersion agent)或稳定剂(stabilizer)。
3.6.3.变异型(Vatiations)
为了帮助确认最佳剂量范围，可选择性地使用体内和/或体外(Invitro)分析。用于制剂(formulation)的准确剂量还根据给药路径及状态的严重程度不同，需根据医生的判断及各个对象(subject)的情况(circumstances)确定。可从体外或动物模型测试系统诱导的剂量-反应曲线测定有效剂量。
多核苷酸结构可单独给药或与其他治疗联合给药。
4.药剂学组合物
在典型实例中，核酸结构能够以液态药剂学组合物给药。
4.1.药理学组合物(Pharmacological composition)及单位剂量形态
在静脉注射(intravenous)、肌肉注射(intramuscular)、皮内注射(intradermal)或皮下(subcutaneous)注射的情况下，核酸结构能够以允许非口服的水溶液形态存在，没有发热源(pyrogen-free)、具有适当的pH、等渗性及稳定性。例如，普通技术人员可通过使用如氯化钠注射液(Sodium Chloride Injection)、林格注射液(Ringer’s Injection)、乳酸林格注射液(Lactated Ringer’s Injection)的等渗性媒介物来制备适当的溶液。根据需要，还可包括防腐剂(preservatives)、稳定剂(stabilizers)、缓冲液(buffers)、抗氧化剂(antioxidants)和/或其他添加剂(other additives)。
在多种实例中，核酸结构以0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的浓度存在于液体组合物。在一部分实例中，单位剂量形态为以0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml或1mg/ml的浓度包含2ml的药剂学组合物的药瓶。
在一部分实例中，单位剂量形态为药瓶、安瓶、瓶或事先填充的注射器。在一部分实例中，单位给药形态包含0.01mg、0.1mg、0.2mg、0.25mg、0.5mg、1mg、2.5mg、5mg、8mg、10mg、12.5mg、16mg、24mg、25mg、50mg、75mg、100mg、150mg或200mg的本发明的多核苷酸。
在典型实例中，单位剂量形态中的药剂学组合物为液态。在多种实例中，单位剂量形态包含0.1ml与50ml之间的药剂学组合物。在一部分实例中，单位剂量形态包含0.25ml、0.5ml、1ml、2.5ml、5ml、7.5ml、10ml、25ml或50ml的药剂学组合物。
在特定实例中，单位剂量形态为适合皮下给药、皮内给药或肌肉给药的的单位剂量形态实例中包含1ml的药剂学组合物的药瓶，分别包括以规定量包含在上述内容记载的药剂学组合物的预载注射器(preloaded syringe)、自动注射器(auto-injector)及自动注射笔(auto-inject pen)。
在多种实例中，单位给药形态为注射器及包含规定量的药剂学组合物的预载的注射器。在特定的预载的注射器实例中，上述注射器适用于皮下给药。在特定实例中，上述注射器适合自我给药。在特定实例中，预载的注射器为一次性注射器。
在多种实例中，预载的注射器包含约0.1ml至约0.5ml的药剂学组合物。在特定实例中，上述注射器包含约0.5ml的药剂学组合物。在特定实例中，上述注射器包含约1.0ml的药剂学组合物。在特定实例中，上述注射器包含约2.0ml的药剂学组合物。
在特定实例中，上述单位剂量形态为自动注射笔。上述自动注射笔包括包含在本说明书上记载的药剂学组合物的自动注射笔。在一部分实例中，自动注射笔传递预定体积的药剂学组合物。在另一实例中，上述自动注射笔以传递使用人员设置的体积的药剂学组合物的方式构成。
在多种实例中，自动注射笔包含约0.1ml至约5.0ml的药剂学组合物。在特定实例中，自动注射笔包含约0.5ml的药剂学组合物。在特定实例中，自动注射笔包含约1.0ml的药剂学组合物。在另一实例中，自动注射笔包含约5.0ml的药剂学组合物。
4.2.冻干的脱氧核糖核酸剂型
在一部分实例中，本发明的核酸结构作为从冻干剂型重组的液态组合物给药。在具体实例中，在本说明书上引用的在美国专利第8389492号揭示的冻干的脱氧核糖核酸剂型在重组后使用。
在一部分实例中，本发明的核酸结构在冻干之前与包含碳水化合物及盐的特定赋形剂一同剂型化。用作诊断剂或治疗剂的冻干的脱氧核糖核酸剂型的稳定性可通过在冻干之前利用包含稳定量(stabilizing amount)的碳水化合物的水溶液将脱氧核糖核酸制剂化来增加。
本发明的脱氧核糖核酸制剂的碳水化合物为单糖类、寡糖或多糖类，如蔗糖(sucrose)、葡萄糖(glucose)、乳糖(lactose)、海藻糖(trehalose)、阿拉伯糖(arabinose)、戊糖(pentose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、半乳糖(galactose)、己糖(hexose)、艾杜糖(idose)、甘露糖(mannose)、塔罗糖(talose)、庚糖(heptose)、果糖(fructose)、葡萄糖酸(gluconic acid)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、甲基a-葡萄糖苷(methyl a-glucopyranoside)、麦芽糖(maltose)、异抗坏血酸(isoascorbicacid)、抗坏血酸(ascorbic acid)、内酯(lactone)、山梨糖(sorbose)、葡糖二酸(glucaricacid)、赤藓糖(erythrose)、苏糖(threose)、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、赤藓酮糖(erythrulose)、核酮糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)、阿洛酮糖(psicose)、塔格糖(tagatose)、葡糖醛酸(glucuronic acid)、半乳糖醛酸(galacturonicacid)、甘露糖醛酸(mannuronic acid)、氨基葡萄糖(glucosamine)、半乳糖胺(galactosamine)、神经氨酸(neuraminic acid)、阿拉伯聚糖(arabinan)、果聚糖(fructan)、聚海藻糖(fucan)、半乳聚糖(galactan)、聚半乳糖醛酸(galacturonan)、葡聚糖(glucan)、甘露聚糖(mannan)、木聚糖(xylan)、左聚糖(levan)、岩藻多糖(fucoidan)、卡拉胶(carrageenan)、半乳糖醛糖(galactocarolose)、果胶、果胶酸(pectic acids)、直链淀粉(amylose)、普鲁兰多糖(pullulan)、糖原(glycogen)、支链淀粉(amylopectin)、纤维素(cellulose)、右旋糖酐(dextran)、环糊精(cyclodextrin)、石耳葡聚糖(pustulan)、甲壳素(chitin)、琼脂糖(agarose)、角蛋白(keratin)、软骨素(chondroitin)、皮肤素(dermatan)、透明质酸(hyaluronic acid)、海藻酸(alginic acid)、黄原胶(xanthan gum)或店纷纷(starch)。
在一系列实例中，碳水化合物为甘露醇或蔗糖。
冻干之前的碳水化合物溶液可与水内的碳水化合物单独相应，或可包含缓冲液。这种缓冲液的例包括磷酸盐缓冲液、HEPES、TRIS或TRIS/EDTA。通常，碳水化合物溶液以约0.05％至约30％的蔗糖，通常，以0.1％至约15％的蔗糖，如以0.2％至约5％、10％或15％的蔗糖，优选地，以约0.5％至10％的蔗糖、1％至5％的蔗糖、1％至3％的蔗糖，以及优选地，以约1.1％的蔗糖的最终浓度与脱氧核糖核酸结合。
本发明的脱氧核糖核酸制剂的盐为NaC1或KCl。在特定实施方式中，脱氧核糖核酸制剂的盐为NaCl。在另一方面，脱氧核糖核酸制剂的盐以选自由约0.001％至约10％、约0.1％至5％、约0.1％至4％、约0.5％至2％、约0.8％至1.5％、约0.8％至1.2％w/v组成的组中的量存在。在特定实例中，脱氧核糖核酸制剂的盐以约0.9％w/v的量存在。
从冻干的制剂重组的液态组合物内的最终浓度为约1ng/ml至约30mg/ml的质粒。例如，本发明的制剂可具有约1ng/ml、约5ng/ml、约10ng/ml、约50ng/ml、约100ng/ml、约200ng/ml、约500ng/ml、约1μg/ml、约5μg/ml、约10μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约200μg/ml、约400μg/ml、约500μg/ml、约600μg/ml、约800μg/ml、约1mg/ml、约2mg/ml、约2.5mg/ml、约3mg/ml、约3.5mg/ml、约4mg/ml、约4.5mg/ml、约5mg/ml、约5.5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约9mg/ml、约10mg/ml、约20mg/ml或约30mg/ml的质粒的最终浓度。在本发明的特定实例中，脱氧核糖核酸的最终浓度为100μg/ml至2.5mg/ml。在本发明的特定实例中，脱氧核糖核酸的最终浓度为0.5mg/ml至1mg/ml。
本发明的脱氧核糖核酸制剂在本领域公知的标准条件下冻干。本发明的脱氧核糖核酸剂型的冻干方法可包括：步骤(a)，将具有脱氧核糖核酸剂型，如包含质粒脱氧核糖核酸、盐及碳水化合物的脱氧核糖核酸剂型的容器，例如药瓶向冻干机内装入(loading)，在此步骤中，质粒脱氧核糖核酸包含肝细胞生长因子基因或它们的变异体，上述冻干机具有约5℃至约-50℃的初始温度；步骤(b)，以零下温度(例如，-10℃至-50℃)冷却脱氧核糖核酸剂型；以及步骤(c)，对脱氧核糖核酸剂型进行干燥。普通技术人员可考虑影响冻干参数的因子，例如，所使用的冻干装置的类型、所使用的脱氧核糖核酸的量及所使用的容器的尺寸调整本发明的脱氧核糖核酸剂型的冻干条件，如温度及时间。
具有冻干的脱氧核糖核酸剂型的容器可在多种温度(例如，室温至约-180℃，优选地，约2-8℃至约-80℃，更优选地，约-20℃至约-80℃，最优选地，约-20℃)条件下以延伸的时间周期内密封并保存。在特定实施方式中，优选地，冻干的脱氧核糖核酸剂型可在约2-8℃至约-80℃的温度范围内以不丧失显著活性的方式稳定至少6个月。
质粒脱氧核糖核酸剂型的稳定储存还能够以使用如研究或基于质粒的治疗之前长期稳定的形态储存质粒脱氧核糖核酸。保存时间可以为数个月、1年、5年、10年、15年或20年。优选地，制剂至少稳定约3年。
5.实施例
下述实施例为了向普通技术人员提供制备本发明并与所使用的方法有关的完整揭示及说明而提出，本发明人并不限制视作本发明的范围，并不表示以下的实验为所执行的全部实验或唯一实验。为了确保所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性而努力，但需考虑一部分实验误差及偏差。除非另行表示，部分(parts)为重量份(parts by weight)，分子量(molecular weight)为重均分子量(weight average molecular weight)，温度为摄氏温度，压力为大气压或周围大气压(near atmospheric)。标准略语如下，即，bp为碱基对(base pair(s))、kb为千碱基(kilobase(s))、pl为微微升(picoliter(s))、s或sec为秒钟、min为分钟、h或hr为回见、aa为氨基酸、nt为核苷酸等。
除非另行表示，本发明的实施使用对于普通技术人员常规的蛋白化学、生物化学、重组脱氧核糖核酸技术及药理学公知的方法。
5.1.实施例1：加巴喷丁对与神经病有关的慢性收缩损伤(CCI)动物模型中的VM202-介导的疼痛减少的效果
图1a摘自Kessler et al.，Annals Clin.Transl.Neurology 2(5)：465-478(2015)，示出与糖尿病周围神经病变的治疗有关的VM202的II期临床实验中对所有患者测定的疼痛水平的时间进程变化。实验数据表示给药高剂量VM202(第0天每个腿8mg，第14天每个腿8mg；两次就诊及两个腿的总剂量为32mg)、低剂量VM202(第0天每个腿4mg，第14天每个腿4mg；两次就诊及两个腿的总剂量为16mg)或盐水(安慰剂)之后，在3个月、6个月及9个月后测定的疼痛程度。图1B也摘自Kessler et al.，Annals Clin.Transl.Neurology 2(5)：465-478(2015)，示出在给药高剂量VM202、低剂量VM202或盐水(安慰剂)之后，在3个月、6个月及9个月后在未服用普瑞巴林(Lyrica；pregabalin)和/或加巴喷丁(Neurontin；gabapentin)的患者组中测定的疼痛水平的时间进程变化。并且，如Kessler et al.的报告，通常，相比于总患者组(the total group)(图1a)，未服用普瑞巴林和/或加巴喷丁的患者(图1b)在给药低剂量VM202后，疼痛比基线(baseline)大大减少。
II期临床试验数据的事后分析(post hoc analysis)无法阐明加巴喷丁类似物和VM202的成为明显有害(deleterious)相互作用的基础的生理学机制。尤其，上述数据无法预测加巴喷丁类似物的事先给药是否排除VM202的之后功效，无法预测如何有效地向事先服用加巴喷丁类似物的患者给药VM202。
为了探讨VM202功效和加巴喷丁类似物干扰的机制，如图2所示，本发明人对慢性收缩损伤小鼠试验与VM202-介导疼痛减少有关的加巴喷丁的效果。慢性收缩损伤为在神经病变疼痛研究广泛使用的动物模型。具体地，对5周龄雄小鼠的坐骨神经(sciatic nerve)适用松弛的收缩性韧带(constructive ligature)，从而导入慢性收缩损伤。慢性收缩损伤小鼠分为3个组，在第一组中，向作为用于给药VM202的阴性对照组的两个大腿肌肉(cranial thigh muscle)给药200μg的pCK载体(pCK为用于VM202的载体，但没有搭载肝细胞生长因子载体)，在第二组中，向两个大腿肌肉给药200μg的VM202，在第三组中，未给药脱氧核糖核酸结构。见第一组及第二组的各个动物还分为2个亚组，第一亚组每天注射100mg/kg的加巴喷丁，第二亚组作为给药加巴喷丁的阴性对照组，通过腹腔(intraperitonealcavity)每天注射磷酸盐缓冲液2周。也维持了没有慢性收缩损伤的假手术组，每天注射了磷酸盐缓冲液。从第14天至第16天为止，通过执行Von Frey纤维丝测痛仪来评价了神经病疼痛(机械性痛觉超敏(mechanical allodynia))的水平。
在图3及图4示出在5个不同组中通过Von Frey纤维丝测痛仪(Von Frey filamenttest)测定的机械缩足频率(paw withdrawal frequencies)。假手术(Sham-operated)组(“Sham”，图3及图4的具有菱形的线)在实验期间内示出非常低的基准频率(very lowbasal frequency)的缩足(paw withdrawal)。相反，给药pCK(VM202的阴性对照组)并每天给哟磷酸盐缓冲液(加巴喷丁的阴性对照组)的慢性收缩损伤手术组(CCI-operated)(“pCK-磷酸盐缓冲液”，图3及图4的具有三角形的线)在实验期间内持续具有高疼痛水平。另一方面，如通过向慢性收缩损伤手术组给药pCK并每天注射加巴喷丁来减少缩足频率(paw withdrawal frequencies)所证明，在给药加巴喷丁之后，呈现疼痛水平的减少(“pCK-加巴喷丁”，图3的具有圆形的线)。但是，加巴喷丁的疼痛缓和效果仅持续约6个小时。
注射VM202的慢性收缩损伤手术组在实验期间内一直呈现显著低的疼痛水平(“VM202”，图3的具有×的线)。当向VM202处理的慢性收缩损伤小鼠每天注射加巴喷丁时(“VM202+加巴喷丁”，图4的具有×的线)，疼痛水平在非常短的时间内比通过VM202实现的水平进一步降低后，疼痛水平增加约10个小时并接近pCK-磷酸盐缓冲液水平，之后，到加巴喷丁的第二次给药为止逐渐减少。
当初始注射24小时候在第二个时间内给药加巴喷丁时，疼痛水平在非常短的时间内再次减少至VM202水平以下，之后，上升至pCK-磷酸盐缓冲液与VM202水平之间的稳定点。整体上，VM202的疼痛减少效果以从30.56％的频率至46.1％的频率被加巴喷丁损伤50％以上。
5.2.实施例2：加巴喷丁对与神经病有关的神经损伤动物模型(nerve crushanimal model)中的VM202-介导神经再生的效果
在神经损伤动物模型试验与VM202-介导神经再生有关的加巴喷丁类似物的效果。协议如图5所示。具体地，通过向9周龄C57BL/6小鼠施加短暂的压力来向其坐骨神经导入神经损伤。当天(第1天)在神经损伤之后向小鼠的两个大腿肌肉(cranial thigh muscle)注射200μg的VM202。从翌日(第2天)开始每天给药100mg/kg的加巴喷丁。
在第7天，为了量化受损神经的功能恢复，执行了神经压力测试(nerve pinchtest)。为了神经压力测试，诱导轻微麻醉(light anesthesia)并暴露坐骨神经(sciaticnerve)。观察到反射反应(reflex response)为止，从远端(distal direction)向近端(proximal direction)方向挤压受损神经。之后，测定与受伤部位进行反应的最前部位之间的距离。通过此方法测定的距离表示再生的神经长度，在图6的y轴示出。
在VM202-处理的小鼠测定的再生神经的长度为比在作为阴性对照组质粒载体的pCK(1.5±0.5mm)处理的对照组小鼠测定的长度大致长2.7倍的约4±0.2mm。根据此结果确认VM202可有效地诱导受损神经元的再生(在图6，标记为“磷酸盐缓冲液”的左侧两个杆)。根据神经再生的VM202-介导提高在利用加巴喷丁处理的小鼠中大大减少。当每天注射加巴喷丁时，在VM202-处理的小鼠测定的再生神经的长度为1.95±0.3mm。因此，相比于虽相似的给药VM202并未每天注射加巴喷丁的小鼠(4±0.2mm)，小鼠中的神经再生(1.95±0.3mm)显著的少。此结果表示加巴喷丁妨碍VM202-介导神经再生。但是，即使具有加巴喷丁，相比于pCK对照组，，VM202依然可使神经再生增加2.3倍(在图6标记为“加巴喷丁”的右侧2个杆)。
5.3.实施例3：加巴喷丁对c-Jun的VM202介导提高调节的效果
c-Jun被确立为参与神经再生的主要因子，用过其过程的标记物。通过使用c-Jun抗体并免疫印迹分析测定利用从假手术组小鼠(“Sham”)或神经损伤小鼠(“Crush”)获取的背根神经节(Dorsal root ganglion；DRG)细胞制备的c-Jun蛋白的表达。相比于假手术组动物，c-Jun的表达在神经损伤模型中显著增加(比较图7a的通道1及通道2)。VM202处理使c-Jun表达水平增加1.3倍(比较图7a的通道2及通道3)，但是，当小鼠暴露于加巴喷丁时，未观察到这种诱导(比较图7a的通道5及通道6)。根据带强度量化免疫印迹分析结果，为了它们的分析及比较，在图7b示出。数据教示，从VM202生成的肝细胞生长因子利用钙信号传递路径增加c-Jun蛋白的水平，从而最终导致受损神经的再生。
5.4.实施例4：在不同时间给药的加巴喷丁的VM202的治疗效果的干扰
与VM202给药相关地，在慢性收缩损伤小鼠试验不同时间的加巴喷丁类似物给药效果。将慢性收缩损伤小鼠分到5个组，以如图8a所例示的方式处理并整理至下述表1。
表1
Figure BDA0002458196610000351
在慢性收缩损伤后述后，一周一次通过使用Von Frey纤维丝测痛仪来评价了机械性痛觉超敏(mechanical allodynia)的发展，根据机械频率评价计算了疼痛减少倍率水平。例如，为了适应环境，动物单独放在金属网地板上部的圆筒。为了检测机械灵敏度的频率，通过使用规定厚度的纤维(0.16g)刺激后爪来评价小鼠。
图8B的结果证明，相比于利用pCK体(慢性收缩损伤-pCK)注射的对照组小鼠，VM202的注射显著减少疼痛水平(慢性收缩损伤-VM202)。但是，当加巴喷丁与VM202一同每天给药2周时(慢性收缩损伤-VM202-Gaba1)，VM202的注射没有能够与以pCK载体缺失插入处理的慢性收缩损伤组(慢性收缩损伤-pCK)相比较的水平的效果。这教示，与VM202注射一同和/或之后给药加巴喷丁完全妨碍斌去除VM202的疼痛缓和效果。尤其，在未追加给药加巴喷丁的情况下，这种干扰仍持续。具体地，当未追加给药加巴喷丁时，VM202处理的慢性收缩损伤小鼠(慢性收缩损伤-VM202-Gaba1)从第14天至第28天为止持续具有与利用pCK载体(慢性收缩损伤-pCK)处理的慢性收缩损伤对照组小鼠相似的高水平地疼痛。
但是，在VM202注射14天后开始加巴喷丁治疗为止未观察到加巴喷丁干扰VM202的治疗效果(慢性收缩损伤-VM202-Gaba2)。在第一个2周内未给药加巴喷丁并利用VM202治疗慢性收缩损伤小鼠的情况下，在从第15天至第28天为止每天给药加巴喷丁的情况下，显著维持VM202的疼痛缓和效果。这教示，当VM202给药与加巴喷丁给药之间之间具有充分的时间延迟时，加巴喷丁不干扰VM202的治疗效果。
为了进一步了解防止干扰所需的时间延迟，在追加实验中，注射VM202的慢性收缩损伤小鼠延迟0天至14天的多种期间后利用加巴喷丁处理。具体地，如图9a所示并在下述表2整理，慢性收缩损伤小鼠分为6个组。在第0天，向慢性收缩损伤小鼠注射VM202或pCK。慢性收缩损伤小鼠未处理加巴喷丁(CONT1、CONT2)或在注射VM202后的第0天(当天注射VM202，GP1)或第3天(GP2)、第7天(GP3)或第10天(GP4)开始追加处理加巴喷丁。
组 VM202 加巴喷丁 开始加巴喷丁 动物数
CONT1 200μg/头pCK 未注射(No) 未进行(No) 4
CONT2 200μg/头VM202 未注射 未进行 4
GP1 200μg/头VM202 100mg/kg 0天 5
GP2 200μg/头VM202 100mg/kg 3天 4
GP3 200μg/头VM202 100mg/kg 7天 4
GP4 200μg/头VM202 100mg/kg 10天 5
在慢性收缩损伤手术及VM202或pCK注射2周后，通过使用Von Frey纤维丝测痛仪评价了机械性痛觉超敏的发展，根据与各个动物有关的机械频率评价计算疼痛减少倍率水平。在图9b提供结果。虽然上述结果未呈现VM202在GP1、GP2及GP3具有显著的疼痛减少效果，这表示VM202在CONT2或GP4提供显著的疼痛缓和效果。这教示，与VM202给药一同和/或第一周内的加巴喷丁治疗可能放在VM202的治疗效果，但是，在给药VM202后的约10日开始的加巴喷丁治疗对于VM202的治疗功效没有显著影响。
本研究表示，与VM202的功效及效果有关的加巴喷丁类似物的有害效果在VM202的第一次给药之前通过中断加巴喷丁类似物给药来显著减少，可通过在VM202的第一给药后的至少约1周内的加巴喷丁类似物给药来弱化。
参照并引用
在本说明书上引用的所有出版物、专利、专利申请及其他文件为单独以所有目的参照包括各个单独出版物、专利、专利申请或其他文件的程度相同，就所有目的而言，均作为参照包括于本说明书。
等同技术方案
虽示出并说明多种具体实例，上述详细说明并不具有限定性。可以理解的是，可在不超出本发明的思想及范围内进行多种变更。根据本发明的详细说明，普通技术人员可实施多种变形。
序列表
<110> VIROMED CO., LTD.
<120> 减少加巴喷丁类似物的干扰并表达肝细胞生长因子异构体的利用脱氧核糖核酸结构的神经病的治疗
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<150> 62/574,100
<151> 2017-10-18
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
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<223> 人工序列的描述: 合成多核苷酸
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acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 7260
ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 7320
gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatg 7377

Claims (12)

1.一种VM202，用于神经病的治疗方法，其特征在于，上述方法包括：
选择给药加巴喷丁类似物的神经病患者的步骤；
中断向上述患者给药加巴喷丁类似物的步骤；以及
向上述患者给药VM202的步骤。
2.根据权利要求1所述的VM202，其特征在于，在VM202给药步骤后，上述方法还包括将加巴喷丁类似物的给药保留至少一周的步骤。
3.根据权利要求1所述的VM202，其特征在于，在VM202给药步骤后，上述方法还包括将加巴喷丁类似物的给药保留至少10日的步骤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的VM202，其特征在于，在中断给药上述加巴喷丁类似物的步骤中，逐渐减少加巴喷丁类似物给药。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的VM202，其特征在于，给药VM202的步骤在完全中断给药加巴喷丁类似物后执行。
6.根据权利要求5所述的VM202，其特征在于，上述给药VM202的步骤在完全中断给药加巴喷丁类似物后的至少1日、2日、3日、5日、7日、14日、21日、30日、60日或90日后执行。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的VM202，其特征在于，上述神经病为糖尿病神经病变。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的VM202，其特征在于，上述神经病为带状疱疹后神经病变。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的VM202，其特征在于，上述加巴喷丁类似物为加巴喷丁或普瑞巴林。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的VM202，其特征在于，在上述给药VM202的步骤中，在患者的每个患肢按多次肌肉注射及多次就诊平分给药8mg的VM202，规定的一次就诊过程中的多次肌肉注射分别在隔开的注射部位执行。
11.根据权利要求10所述的VM202，其特征在于，
上述给药VM202的步骤中，包括以将16mg的剂量的VM202平分64次向肌肉注射的方式给药的步骤，
在第一次就诊中，在第一个小腿的隔开的注射部位进行16次肌肉注射给药，
在第一次就诊中，在第二个小腿的隔开的注射部位进行16次肌肉注射给药，
在第二次就诊中，在第一个小腿的隔开的注射部位进行16次肌肉注射给药，
在第二次就诊中，在第二个小腿的隔开的注射部位进行16次肌肉注射给药，
肌肉注射分别利用0.5ml的体积内的0.25mg的VM202来执行64次的肌肉注射。
12.一种VM202，用于治疗患者的神经病，其特征在于，上述方法包括：
确定在之前的一周内是否向患有神经病的患者给药加巴喷丁类似物的步骤；
在之前的一周内向患者给药加巴喷丁类似物的情况下，在中断向患者给药加巴喷丁类似物之后，向患者给药VM202的步骤；以及
在之前的一周内未向患者给药加巴喷丁类似物的情况下，向患者给药VM202的步骤。
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