KR101817665B1 - Ｈｇｆ 이형체를 이용한 당뇨병성 신경병증의 유전자 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HGF의 서로 다른 종류의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 HGF의 서로 다른 종류의 이형체들을 이용하여 당뇨병성 신경병증을 예방 및 치료할 수 있음을 규명한 최초의 발명이다. 본 발명에 따르면 당뇨병성 신경병증을 매우 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

ＨＧＦ 이형체를 이용한 당뇨병성 신경병증의 유전자 치료{Gene Therapy for Diabetic Neuropathy Using an HGF Isoform}

본 발명은 HGF (hepatocyte growth factor)의 서로 다른 종류의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간세포 성장인자 (HGF)는 분산인자 (scatter factor) 또는 헤파토포이에틴-A (hepatopoietin-A)로도 알려진 헤파린 결합 당단백질이다. 강력한 간영양성 (hepatotrophic) 성장인자로 처음 확인된 (Nakamura et al., Nature 342:440 (1989)) HGF는 다양한 형태의 세포의 미토게네시스 (mitogenesis), 모토게네시스 (motogenesis) 및 형태발생 (morphogenesis)과 같은 다수의 생물학적 효과를 갖는 간엽 유래의 헤파린 결합 단백질이다. HGF를 암호화하는 유전자는 염색체 7q21.1에 위치하고 18개의 엑손 (exon) 및 17개의 인트론 (intron)을 포함한다 (Seki T., et al., Gene 102:213-219 (1991)).

상기 HGF 유전자로부터 약 6kb의 전사체가 전사되고 난 다음, 이로부터 하기의 도메인: N-말단 헤어핀 루프 (hairpin loop)-크링글 (kringle)1-크링글2-크링글3-크링글4-불활성화된 세린 단백분해효소 도메인을 포함하는, 728개의 아미노산으로 이루어진 전장 폴리펩타이드 HGF 전구체 (flHGF)가 합성된다. 동시에, 상기 HGF 유전자의 선택적 스플라이싱 (alternative splicing)에 의해 몇 가지 다른 HGF 폴리펩타이드 이형체들 (isoforms)이 합성된다. 알려진 이형체들에는 결손된 변형 dHGF (deleted variant, 전장 HGF의 크링글1에서 5개의 아미노산이 결손된 형태), NK1 (N-말단 헤어핀 루프-크링글1), NK2 (N-말단 헤어핀 루프-크링글1-크링글2) 및 NK4 (N-말단 헤어핀 루프-크링글1-크링글2-크링글3-크링글4)이 포함된다. 또한, 각 이형체의 대립형질 변형체 (alleic variant)들이 존재한다. 상기 생물학적으로 불활성인 전구체들은 혈청 내 단백질 분해효소에 의해 활성화된 형태의 이황화 결합된 이종이합체 (disulfide-linked heterodimer)로 변환될 수 있다. 상기 이종이합체들에서, 고분자량을 갖는 알파 사슬은 4개의 크링글 도메인 및 플라스미노겐 (plasminogen)의 전활성화된 (preactivated) 펩타이드 부분과 유사한 N-말단 헤어핀 루프를 형성한다. 약 80개의 아미노산으로 구성된 삼중 이황화 결합된 루프 (triple disulfide-bonded loop) 구조의 크링글 도메인들은 단백질-단백질 상호작용에서 중요한 역할을 할 수 있다. 저분자량 베타 사슬은 불활성화인 세린 단백분해효소-유사 도메인을 형성한다. 723개의 아미노산으로 이루어진 dHGF는 엑손 4와 엑손 5 사이의 선택적 스플라이싱으로 인하여, 알파 사슬의 첫 번째 크링글 도메인 내의 5개의 아미노산, 즉 F, L, P, S 및 S가 결손된 폴리펩타이드이다.

생체 내 (in vivo)에서, HGF의 두 가지 이형체 (728개의 아미노산을 갖는 flHGF 및 723개의 아미노산을 갖는 dHGF)는 엑손 4와 엑손 5 사이의 선택적 스플라이싱을 통해 생성된다. flHGF 및 dHGF 모두 몇 가지 생물학적 기능이 동일함에도 불구하고, 면역학적 특성 및 몇 가지 생물학적 특성들의 관점에서 상이하다. 예를 들면 flHGF는 인간 탯줄 정맥내피세포와 동맥평활근세포, NSF-60 (murine myeloblast cells)의 DNA 합성을 촉진하는 면에서는 dHGF에 비하여 각각 20배, 10배 및 2배 정도 우수하며, dHGF는 LLC-PK1 (pig kidney epithelial cells), OK (American opossum kidney epithelial cells) 및 쥐의 간세포의 DNA 합성을 촉진하는 면에서는 flHGF에 비하여 각각 3배, 2배 및 2배 우수하다. 또한, flHGF는 dHGF에 비해 PBS에서 70배 이상 용해도가 우수하며, 몇몇 dHGF에 대한 단일클론항체가 dHGF만을 인지하고 flHGF 또는 환원된 형태의 dHGF는 인지하지 못하는 것은 두 단백질의 3차 구조가 서로 다름을 제시한다.

HGF는 내피세포 (endothelial cell)의 성장 및 혈관 평활근 세포 (vascular smooth muscle cell)의 이동을 조절함으로써 혈관신생 (angiogenesis)을 자극하는 것으로 나타났다. 그의 혈관신생 활성 때문에, HGF는 혈관신생 치료에 있어서 유망한 후보물질 중 하나로 간주된다. "혈관신생 치료 (therapeutic angiogenesis)"는 관상동맥질환 (coronary artery disease, CAD) 또는 말초동맥질환 (peripheral artery disease, PAD)과 같은 허혈성 질환 (ischemic disease)의 치료를 위해, 재조합 단백질이나 유전자로서 혈관신생인자들을 이용하는 개입 (intervention)을 의미한다. HGF는 내피세포의 성장뿐만 아니라, 이동을 자극한다고도 알려져 있고 (Bussolino et al., J Cell Biol. 119:629 (1992); Nakamura et al., J Hypertens 14:1067 (1996)), 재-내피세포화 자극제 (re-endothelialization stimulating agent)로서의 역할도 시험되어 왔다(Yasuda et al., Circulation 101:2546 (2000); Hayashi et al., Gene Ther 7:1664 (2000)). 상기 기술된 HGF 유전자 치료법에 관한 모든 연구들은 723개의 아미노산을 암호화하는 dHGF cDNA가 아닌 728개의 아미노산을 암호화하는 flHGF cDNA를 이용하여 수행되어 왔다.

당뇨병성 신경병증 (Diabetic Neuropathy)은 심각하고 위험한 당뇨합병증으로 여러 종류의 신경병증이 동시에 나타나는 경우가 많다. 당뇨병성 신경병증은 크게 다발성 말초신경병증과 국소성 말초신경병증으로 분류된다. 다발성 말초신경병증으로는 고혈당성 신경병증, 원위부 대칭성 다발신경병증, 자율신경병증, 급성 감각신경병증, 급성 통증성 감각신경병증, 만성 운동성 감각신경병증 등이 포함된다. 국소성 말초신경병증은 뇌신경병증, 몸통 및 사지 신경병증, 흉요추신경병증, 요천골 신경총근병증 등으로 분류된다 (Andrew J.M. etal., Diabetescare 28:956-962 (2005);J Gareth Llewelyn et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 74:15-19 (2003)). 당뇨병성 신경병증은 심한 통증 및 운동성 상실 등을 그 대표적인 증상으로 가진다. 미국의 통계에 따르면, 당뇨병 환자 중 60 내지 70%에서 결국 당뇨병성 신경병증이 발생하는 것으로 알려져 있으며 (American Diabetes Association (ADA), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Disease (NIDDK)), 40세 이상인 당뇨병 환자 중에서 3.9백만 명 이상이 당뇨병성 신경병증을 가지고 있는 것으로 파악되고 있다. 이들에게 소요되는 경제적인 비용은 연간 최대 137억 달러로 추산되고 있으며, 이 비용은 지속적으로 증가할 것으로 예상되고 있다.

현재 당뇨병성 신경병증에 대해 허가를 받아 사용되고 있는 약물로는 Pfizer의 Lyrica^??와 Eli Lilly의 Cymbalta^??가 유일하다. 이 두 약물은 당뇨병성 신경병증에서 나타나는 통증만을 완화시키는 일종의 진통제일 뿐, 질병의 진행을 지연시키거나 증상을 근본적으로 개선하지 못하는 한계가 있다. 이러한 약물치료 외에는 통증 완화, 운동기능 향상, 정신적 스트레스 감소를 위한 대증적인 요법이 이용되고 있다. 근본적인 치료제가 없는 현재로서는 식이조절을 통한 당뇨병의 조절이 당뇨병성 신경병증의 발생률을 최소화할 수 있는 유일한 방법이다. 따라서, 당뇨병성 신경병증의 진행을 억제하거나 호전시킬 수 있는 새로운 개념의 치료제 개발이 절실하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 당뇨병성 신경병증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들을 발현시킴으로써 당뇨병성 신경병증을 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 당뇨병성 신경병증을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 HGF (Hepatocyte growth factor)의 서로 다른 종류의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 HGF의 서로 다른 종류의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명자들은 당뇨병성 신경병증을 효과적으로 치료할 수 있는 치료제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들을 발현시킴으로써 당뇨병성 신경병증을 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 가장 큰 특징은 HGF의 두 종류 이상의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 당뇨병성 신경병증의 예방 및 치료에 이용하는 것이다.

본 발명의 치료 전략은 크게 두 가지로 분류될 수 있다: 단백질 치료 및 유전자 치료.

본 발명의 단백질 치료제 전략에 따르면, HGF의 두 종류 이상의 이형체 단백질을 이용한다. HGF의 두 종류 이상의 이형체 단백질은 하나의 폴리펩타이드로 제공될 수 있고, 별도의 폴리펩타이드로 제공될 수 있다. 바람직하게는, HGF의 두 종류 이상의 이형체 단백질은 하나의 폴리펩타이드로 제공된다.

본 발명의 유전자 치료제 전략에 따르면, HGF의 두 종류 이상의 이형체를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 이용한다. 두 종류 이상의 HGF 이형체-암호화 뉴클레오타이드 서열은 하나의 폴리뉴클레오타이드로 제공될 수 있고, 별도의 폴리뉴클레오타이드로 제공될 수 있다. 바람직하게는, HGF의 두 종류 이상의 HGF 이형체-암호화 뉴클레오타이드 서열은 하나의 폴리뉴클레오타이드로 제공된다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 기재한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "HGF 이형체 (isoform)" 는 모든 대립 유전자 변형체들 (variants)을 포함하는, 동물에서 자연적으로 생성되는 (naturally occurring) HGF 아미노산 서열과 적어도80% 동일한 아미노산 서열을 갖는HGF 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, HGF 이형체는 HGF의 정상형 (normal form) 또는 천연형 (wild type), 그리고 HGF의 다양한 변이체 (예컨대, 스플라이싱 변이체 및 결손 변이체)를 모두 포괄하는 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF의 서로 다른 종류의 이형체들은 전장 HGF (full length HGF, flHGF), 결손된 변이형 HGF (deleted variant HGF, dHGF), NK1, NK2 및 NK4로 구성된 군으로부터 선택되는 둘 이상의 이형체들을 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF의 서로 다른 종류의 이형체들은 flHGF 및 dHGF를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "flHGF" 는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간HGF 의 아미노산1-728 서열을 지칭한다. 인간 flHGF는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "dHGF" 는 동물, 바람직하게는 포유동물에서HGF 유전자의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는HGF 단백질의 결손된 변형체, 보다 바람직하게는 전장HGF 서열로부터 알파 사슬의 첫 번째 크링글 도메인에서5 개의 아미노산 (F, L, P, S및S) 이 결손된723 개의 아미노산으로 이루어지는 인간HGF 를 지칭한다. 인간 dHGF는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "NK1" 은N-말단 헤어핀 루프 및 크링글1 도메인으로 이루어지는, 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간HGF 이형체를 지칭한다. 인간 NK1는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "NK2" 는N-말단 헤어핀 루프, 크링글1 및 크링글2 도메인으로 이루어지는, 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간HGF 이형체를 지칭한다. 인간 NK2는 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "NK4" 는N-말단 헤어핀 루프, 크링글1, 크링글2, 크링글3, 및 크링글4 도메인으로 이루어지는, 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간HGF 이형체를 지칭한다. 인간 NK4는 서열목록 제5서열의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들은 별도의 폴리뉴클레오타이드 또는 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화될 수 있다. 본 발명에서, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들이 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는HGF 이형체들의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열 (예컨대, 프로모터 또는 인핸서)에 작동가능하게 연결될 수 있다.

HGF의 두 종류 이상의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우, 두 가지 방식으로 발현 카세트를 구축할 수 있다. 첫 번째 방식에 따르면, 이형체 각각에 대한 CDS (coding sequence)에 발현 조절 서열을 연결하여 발현 카세트를 구축한다. 두 번째 방식에 따르면, "발현조절서열-제1 이형체 CDS-IRES- 제2 이형체 CDS-전사종결 서열"과 같은 방식으로 IRES (internal ribosomal entry site)를 이용하여 발현 카세트를 구축한다. IRES는 유전자의 번역이 IRES 서열에서 시작되도록 함으로써 2개 이상의 관심 유전자가 동일한 구조물에서 발현되도록 한다.

HGF의 두 종류 이상의 이형체들이 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우, 상기 두 종류 이상의 이형체들을 모두 암호화하고 있는 폴리뉴클레오타이드는 단일의 발현조절서열에 작동가능하게 연결된다.

본 발명에 있어서, HGF의 이형체들은 둘 이상의 서로 다른 종류의 이형체들, 예컨대flHGF 및dHGF 를 동시에 발현하는 하이브리드 (hybrid) HGF 유전자에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 하이브리드HGF 유전자는 인간HGF 의 엑손 1 내지18 에 해당하는 cDNA, 및 상기 cDNA 의 엑손4 와5 사이에 삽입된 인간 HGF 유전자의 인트론 4 또는 이의 단편을 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 하이브리드HGF 유전자는 서열목록 제7서열 내지 제14서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상기 인트론 4를 포함하는 하이브리드HGF 유전자는7113bp 길이이며, 서열목록 제7서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 하이브리드HGF 유전자는 선택적으로HGF cDNA 의 엑손4 와5 사이에 인트론 4의 단편을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 엑손 4 및 5 사이에 추가적으로 삽입되는 서열은 인간 HGF 유전자의 인트론 4, 서열목록 제7서열의 392번째부터 2247번째까지의 뉴클레오타이드, 392번째부터 727번째까지의 뉴클레오타이드, 2229번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, 5117번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, 3167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, 4167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드 또는 이의 조합이다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 치료학적 뉴클레오타이드 서열의 엑손 4 및 5 사이에 추가적으로 삽입되는 서열은 (i) 서열목록 제7서열의 392번째부터 2247번째까지의 뉴클레오타이드와 2229번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, (ii) 서열목록 제7서열의 392번째부터 2247번째까지의 뉴클레오타이드와 5117번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, (iii) 서열목록 제7서열의 392번째부터 2247번째까지의 뉴클레오타이드와 3167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, (iv) 서열목록 제7서열의 392번째부터 2247번째까지의 뉴클레오타이드와 4167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, (v) 서열목록 제7서열의 392번째부터 727번째까지의 뉴클레오타이드와 2229번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, (vi) 서열목록 제7서열의 392번째부터 727번째까지의 뉴클레오타이드와 5117번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, (vii) 서열목록 제7서열의 392번째부터 727번째까지의 뉴클레오타이드와 3167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드, 또는 (viii) 서열목록 제7서열의 392번째부터 727번째까지의 뉴클레오타이드와 4167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드이다.

상기 엑손 4 및 5 사이에 추가적으로 삽입되는 서열에 따라 본 발명의 치료학적 뉴클레오타이드 서열을 정리하면 다음과 같다: (i) (엑손 1 내지 엑손 4)-(서열목록 제7서열의 392번째부터 2247번째까지의 뉴클레오타이드-2229번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드)-(엑손 5 내지 엑손 18); (ii) (엑손 1 내지 엑손 4)-(서열목록 제7서열의 392번째부터 2247번째까지의 뉴클레오타이드-5117번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드)-(엑손 5 내지 엑손 18); (iii) (엑손 1 내지 엑손 4)-(서열목록 제7서열의 392번째부터 2247번째까지의 뉴클레오타이드-3167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드)-(엑손 5 내지 엑손 18); (iv) (엑손 1 내지 엑손 4)-(서열목록 제7서열의 392번째부터 2247번째까지의 뉴클레오타이드-4167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드)-(엑손 5 내지 엑손 18); (v) (엑손 1 내지 엑손 4)-(서열목록 제7서열의 392번째부터 727번째까지의 뉴클레오타이드-2229번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드)-(엑손 5 내지 엑손 18); (vi) (엑손 1 내지 엑손 4)-(서열목록 제7서열의 392번째부터 727번째까지의 뉴클레오타이드-5117번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드)-(엑손 5 내지 엑손 18); (vii) (엑손 1 내지 엑손 4)-(서열목록 제7서열의 392번째부터 727번째까지의 뉴클레오타이드- 3167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드)-(엑손 5 내지 엑손 18); 및 (viii) (엑손 1 내지 엑손 4)-(서열목록 제7서열의 392번째부터 727번째까지의 뉴클레오타이드-4167번째부터 5471번째까지의 뉴클레오타이드)-(엑손 5 내지 엑손 18).

본 명세서에서, 상기 인트론 4의 단편을 포함하는 하이브리드HGF 유전자는 "HGF-X" 로 명명된다. 상기 HGF-X에는 서열목록 제8서열 내지 제14서열의 뉴클레오타이드 서열을 갖는HGF-X2, HGF-X3, HGF-X4, HGF-X5, HGF-X6, HGF-X7 및HGF-X8 이 포함된다.

본 발명에서 이용 가능한 HGF 이형체들의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 인간 HGF이형체의 서열과 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 실질적인 동일성은, 야생형 인간 HGF이형체의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65 (1992) 및 Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "예방" 은 본 발명의 조성물의 투여로 당뇨병성 신경병증을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 (a) 당뇨병성 신경병증의 발전의 억제; (b) 당뇨병성 신경병증의 경감; 및 (c) 당뇨병성 신경병증의 제거를 의미한다.

당뇨환자의 약 15%는 당뇨병성 신경병증의 증상과 징후를 보이며, 약 50%는 신경전도검사상 말초신경 손상이 발견된다. 당뇨병성 신경병증은 50세 이상의 환자에게서 흔히 나타나며 다양한 임상적 아형이 존재한다. 통증은 당뇨신경병증의 흔한 증상 중 하나이며, 환자에 따라 발생하는 빈도가 다양하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 신경세포의 성장 또는 신경세포의 사멸 억제를 통하여 당뇨병성 신경병증을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에 따르면, PC12 신경세포주에 flHGF 및 dHGF 이형체를 처리한 경우, flHGF 및 dHGF를 각각 처리한 대조군에 비해 50% 및 70% 이상의 세포성장 효과를 나타내었다. 또한, SH-SY5Y 신경모세포에flHGF 및 dHGF이형체를 처리한 경우, flHGF 및 dHGF를 각각 처리한 대조군에 비해 약 25% 및 80% 이상의 세포성장 효과를 나타내었다.

본 발명에 따르면, 고농도의 글루코스를 처리한 PC12 신경세포주에 flHGF 및 dHGF 이형체를 처리한 경우 글루코스에 의한 신경세포의 사멸이 약 2배 감소하였으며, flHGF를 처리한 대조군에 비해서도 약 1.5배 높은 신경세포 사멸 억제 효과를 나타내었다.

본 발명에 따르면, flHGF 및 dHGF 이형체-암호화 폴리뉴클레오타이드를 당뇨병성 신경병증 환자에게 투여하는 임상시험을 통하여 HGF 이형체들의 안전성 및 상기 이형체들에 의한 통증 감소 효과를 확인하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 당뇨병성 신경병증의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 당뇨병성 신경병증은 다발성 말초신경병증 (polyneuropathy) 또는 국소성 말초신경병증 (focal neuropathy)을 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 다발성 말초신경병증은 고혈당성 신경병증 (hyperglycemic neuropathy), 원위부 대칭성 다발신경병증 (distal symmetric polyneuropathy), 자율신경병증 (autonomic neuropathy), 급성 감각신경병증 (acute sensory neuropathy), 급성 통증성 감각신경병증 (acute painful sensory neuropathy) 및 만성 운동성 감각신경병증 (chronic sensorimotor neuropathy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환을 포함하며, 상기 국소성 말초신경병증은 뇌신경병증 (cranial neuropathy), 몸통 신경병증 (truncal neuropathy), 사지 신경병증 (limb neuropathy), 흉요추신경병증 (thoracolumbar radiculoneuropathy) 및 요천골 신경총근병증 (lumbosacral radiculoplexus neuropathy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 질환을 포함하나, 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 유전자 치료 분야에서 통상적으로 공지된 다양한 운반 방법을 통하여 생체 내에 적용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 DNA (naked DNA) 이거나 또는 유전자 운반체에 포함되어 있다. 유전자 운반체의 예는 플라스미드, 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다.

(i) 플라스미드 (벡터)

본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 운반체로서 플라스미드 (벡터)가 이용될 수 있다.

벡터에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 발현 카세트 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 카세트에서 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 프로모터는 인간 CMV (hCMV)의 IE (immediately early) 유전자로부터 유래된 프로모터 또는 EF1 알파 프로모터이며, 가장 바람직하게는 hCMV IE 유전자의 프로모터/인핸서 및 엑손 1 전체서열부터 엑손 2의 ATG 개시코돈 직전까지를 포함하는 5'-UTR (untranslated region)이다.

본 발명에서 이용되는 발현 카세트는 폴리아네닐화 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터 (Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열 (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 polyA (Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), β-글로빈 polyA (Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK polyA (Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA (Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드의 운반체로서 pCK, pCP, pVAX1 또는 pCY 벡터를 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 pCK 벡터를 이용할 수 있다. 상기 pCK 벡터는 WO 2000/040737에 상세히 개시되어 있다.

(ii) 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159 (1983)). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara 등 (Science, 266:1373-1376 (1994))은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 레트로바이러스에 탑재될 수 있다.

(iii) 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스- 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 암호화한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 암호화한다.

현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551 (1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073 (1989)). 따라서, 본 발명의 폴리 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실"은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. 또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105% 까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징 할 수 있다 (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739 (1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 안전할 것으로 판단된다.

(iv) AAV 벡터

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제 5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.

유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37 (1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828 (1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945 (1991))를 동시 형질전환 시켜 제조된다.

(v) 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 생체 내로 운반하는 데 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10 (1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62 (1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415 (1995)) 로부터 유래된 벡터들도 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

(vi) 리포좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)에 개시되어 있다. 본 발명의 폴리 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포 내로 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반한다.

본 발명에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 네이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드 (벡터)에 탑재된 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456 (1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718 (1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87 (1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)) 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)) 방법에 의해 폴리 뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 이입시킬 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 운반할 수 있다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 근육내 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 역행 정맥내 투여 (retrograde intravenous injection)에 의해 투여될 수 있다.

바람직하게는 근육내 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 종아리 근육내 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 주사로 제제화되어 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 HGF의 이형체들은 각각 1 μg 내지 100 mg 의 투여량으로 투여되며, 상기 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 각각 1 μg 내지 40 mg의 투여량으로 투여된다. 상기 HGF의 이형체들 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 투여가 일회를 초과하여 반복될 때 투여량은 매회 동일하거나 다를 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 당뇨병성 신경병증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 HGF의 서로 다른 종류의 이형체들 또는 상기 이형체들을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함한다.

(b) 본 발명은 HGF의 서로 다른 종류의 이형체들 또는 이들을 발현하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 전장 HGF를 이용하는 경우에 비하여 보다 효과적으로 당뇨병성 신경병증을 치료할 수 있음을 규명한 최초의 발명이다.

(c) 본 발명에 따르면 당뇨병성 신경병증을 매우 효과적으로 치료할 수 있다.

도 1은 pVAX1-cHGF의 제작 과정을 나타내는 도면이다.
도 2는 pVAX1-HGF-X7의 제작 과정을 나타내는 도면이다.
도 3은 pCY-cHGF 및 pCY-dHGF의 제작 과정을 나타내는 도면이다.
도 4는 pCY-HGF-X3, pCY-HGF-X4, pCY-HGF-X7 및 pCY-HGF-X8의 제작 과정을 나타내는 도면이다.
도 5는 pCY-HGF-X2 및 pCY-HGF-X6의 제작 과정을 나타내는 도면이다.
도 6은 pCY-HGF-X5의 제작 과정을 나타내는 도면이다.
도 7은 각HGF 이형체들의 RNA 발현을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 각 HGF 이형체들의 단백질 발현을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 PC12 세포의 성장에 미치는 HGF 이형체들의 영향을 나타내는 도면이다.
도 10은 PC12 세포의 성장에 미치는 pCK-HGF-X7의 영향을 나타내는 도면이다.
도 11은 SH-SY5Y 세포의 성장에 미치는 pCK-HGF-X7의 영향을 나타내는 도면이다.
도 12는 고농도의 글루코스에 의해 성장이 저해된 PC12 세포에 대한 pCK-HGF-X7의 영향을 나타내는 도면이다.
도 13은 고농도의 글루코스에 의해 유도된 PC12 세포사멸에 대한 pCK-HGF-X7의 영향을 나타내는 도면이다.
도 14는 VAS 평가 지표를 보여주는 도면이다.
도 15는 pCK-HGF-X7의 약력학 시험결과를 보여주는 도면이다.
도 16은 pCK-HGF-X7의 유효성 시험결과를 보여주는 도면이다.
도 17은 첫 번째 용량 그룹 (4 ㎎)에서 pCK-HGF-X7의 유효성 시험결과를 보여주는 도면이다.
도 18은 두 번째 용량 그룹 (8 ㎎)에서 pCK-HGF-X7의 유효성 시험결과를 보여주는 도면이다.
도 19는 세 번째 용량 그룹 (16 ㎎)에서 pCK-HGF-X7의 유효성 시험결과를 보여주는 도면이다.
도 20은 세 용량 그룹 (4, 8 및 16 ㎎) 간 통증 VAS 지표를 비교한 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: HGF 이형체를 발현하는 플라스미드 DNA 제조

본 발명자들은 하기의 다양한 실험을 수행하기 위하여 먼저 HGF 이형체를 발현할 수 있는 벡터로서 pCK 벡터를 이용하였다. pCK 벡터는 발현하고자 하는 대상 예컨대, HGF 유전자의 발현을 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV)의 인핸서/프로모터의 조절 하에 있도록 구축된 벡터이며, Lee et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272:230 (2000); WO 2000/040737에 상세히 개시되어 있다. 현재 pCK 벡터는 인체를 대상으로 한 임상시험에 사용되고 있으며, 안전성과 효율성이 확인되었다 (Henry et al., Gene Ther. 18:788 (2011)). 본 발명자들은 당뇨병성 신경병증에 대한 치료제로서 하이브리드 HGF를 발현하는 플라스미드 DNA를 제조하기 위하여, 미국 등록특허 제7,812,146호에 기재된 방법에 따라 각 하이브리드 HGF 유전자를 pCK 벡터로 삽입하였다.

실시예 2: HGF 이형체를 동시에 발현하는 하이브리드 HGF 유전자의 발현 확인

2-1. HGF 이형체 발현벡터 제작

HGF 이형체의 발현 여부를 확인하기 위하여, cHGF (flHGF), dHGF 및 이의 하이브리드 형태에 대한 유전자 발현벡터를 제조하여 하이브리드 HGF 유전자 발현벡터를 cHGF 또는 dHGF의 발현벡터와 비교하였다. 미국 등록특허 제7,812,146호에 개시된 pCK-cHGF에 BamHI을 처리하여 얻은 cHGF를 pVAX1 (Invitrogen, USA)의 BamHI 부위에 삽입하여 pVAX1-cHGF를 제작하였으며 (도 1), pCP-HGF-X7에 NheI 및 ApaI을 처리하여 얻은 HGF-X7을 동일한 효소를 처리한 pVAX1에 삽입하여 pVAX1-HGF-X7을 제작하였다 (도 2).

pVAX1-cHGF에 NdeI 및 BstEII를 처리하여 확보한 프로모터를 동일한 효소를 처리하여 프로모터를 제거한 pCK-cHGF 및 pCK-dHGF에 삽입하여 새로운 플라스미드를 제조하였으며, 이를 pCY라 명명하여 pCY-cHGF와 pCY-dHGF를 제작하였다 (도 3). pVAX1-HGF-X7에 NdeI, BstEII를 처리하여 프로모터를 확보한 후 동일한 효소를 처리하여 프로모터를 제거한 pCK-HGF-X3, pCK-HGF-X4, pCK-HGF-X7 및 pCK-HGF-X8에 삽입하여 pCY-HGF-X3, pCY-HGF-X4, pCY-HGF-X7 및 pCY-HGF-X8을 제작하였다 (도 4). pCY-HGF-X7에 SpeI 및 BstEII를 처리하여 프로모터를 확보한 후 동일한 효소를 처리하여 프로모터를 제거한 pCK-HGF-X2와 pCK-HGF-X6에 삽입하여 pCY-HGF-X2와 pCY-HGF-X6를 제작하였다 (도 5). SnaBI과 NheI을 처리한 pCY-HGF-X7으로부터 프로모터를 확보하고 동일한 효소를 처리하여 프로모터를 제거한 pCK-HGF-X5에 삽입하여 pCY-HGF-X5를 제작하였다 (도 6).

2-2. HGF 이형체들의 RNA 발현 확인

각 플라스미드 DNA들을 FuGENE6 (Roche, USA)를 이용하여 제조사의 지시대로 1 X 10⁶개의 293T 세포 (ATCC CRL 1573)에 각각 트랜스펙션 하였다. 트랜스펙션을 수행한 후 48시간째에 각 세포를 수확하였다. 수확한 293T 세포로부터 트라이졸 (Trizol; Invitrogen, USA) 방법을 이용하여 RNA를 추출하고 이 RNA를 역전사 효소 (RT) 중합 반응시켜 cDNA를 얻었다. 얻은 cDNA를 주형으로 서열번호 15 및 16의 합성 뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. PCR은 주형 DNA 3㎕, 10 p㏖/㎕ 프라이머 각 1㎕, 2.5 mM dNTP 5㎕, High fidelity enzyme mix (Roche, USA) 3.5 단위와 효소용 완충액 5㎕를 혼합하여 총 50㎕의 혼합액을 만든 후, 이 용액을 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 반응시키는 과정을 40회 반복하여 수행하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 엑손 4와 엑손 5의 경계부분으로, cHGF cDNA는 142bp, dHGF cDNA는 127bp의 염기서열이 증폭된다.

HGF-X 유전자의 경우 스플라이싱이 일어나지 않은 경우엔 1kb 이상의 염기서열이 증폭되며, 선택적인 스플라이싱이 일어나 cHGF와 dHGF가 동시에 만들어질 경우에는 142bp와 127bp가 동시에 증폭된다. 증폭된 PCR 산물은 15% 폴리아크릴아마이드젤 (polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 확인하였다. 그 결과, cHGF cDNA의 경우에는 142bp, dHGF의 경우에는 127b 크기의 밴드가 나타났으며, 하이브리드 HGF의 경우 142bp 및 127bp 크기의 밴드가 동시에 나타났다 (도 7).

2-3. HGF 이형체들의 단백질 발현 확인

각 플라스미드 DNA들을 FuGENE6 (Roche, USA)를 이용하여 제조사의 지시대로 1 X 10⁶개의 293T 세포 (ATCC CRL 1573)에 각각 트랜스펙션 하였다. 트랜스펙션을 수행한 후 48시간째에 각 세포의 상등액을 수확하였다. 상등액 속에 포함된 HGF 단백질의 양을 효소-결합 면역분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); R&D System, MN, USA)을 이용하여 측정하였다. 그 결과, 하이브리드 HGF 유전자 중에서 HGF-X7의 단백질 발현이 가장 높음을 확인할 수 있었다 (도 8).

실시예 3: pCK 벡터에서 발현한 하이브리드 HGF의 신경세포의 성장 및 생존에 미치는 영향 분석

3-1. 하이브리드 HGF의 신경세포 성장에 미치는 영향 분석

(1) 세포주 및 세포배양

본 실험에서는 쥐 유래의 PC12 크롬친화성세포종 (CRL-1721; ATCC, MD, USA)을 사용하였다. PC12 세포는 당뇨병성 신경병증 연구에 많이 사용되는 세포주이다. 최근 글루코스가 PC12 세포의 신경돌기를 감소시킨다는 것이 입증되었다 (Fan Zhang et al., THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS. 323:508-515 (2007)). 또한, 글루코스는 PC12 세포의 세포증식 감소와 DNA의 파쇄 등을 유발하여 결과적으로 PC12 세포의 세포사멸을 야기한다는 보고가 있었다 (EFRAT LELKES et al., Neurotoxicity research. 3:189-203 (2000)). PC12 세포는 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였으며, 15% 소태아 혈청 및 항생물질이 보충된 둘베코스 모디파이드 이글 미디엄 (DMEM) 내에서 배양하였다. 세포배양매질, 시약 및 혈청은 Gibco 사 (Gibco BRL life technologies, inc., MD, USA)에서 구입하였고, 배양 플라스틱류들은 모두 BD Falcon 사 (BD Falcon, NJ, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다.

(2) 하이브리드 HGF 단백질을 포함하는 상등액 및 재조합 인간 HGF 단백질의 준비

하이브리드 HGF 즉, HGF-X2, HGF-X3, HGF-X4, HGF-X5, HGF-X6, HGF-X7 및 HGF-X8을 발현하는 상등액은 DNA 트랜스펙션법을 이용하여 생산하였다. 트랜스펙션은 Cellphect 칼슘인산염 트랜스펙션 시스템 (GE Healthcare BioSciences, NJ, USA)을 이용하였고, 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 전날 1 X 10⁶개로 파종한 293T 세포주에 pCK, pCK-HGF-X2, pCK-HGF-X3, pCK-HGF-X4, pCK-HGF-X5, pCK-HGF-X6, pCK-HGF-X7, pCK-HGF-X8 등을 각각 트랜스펙션 한 후 세포를 48시간 배양하였다. 배양완료 후 상등액을 모두 수확하여 0.22 μm 필터를 이용하여 여과하였다. 수확한 단백질 상등액은 사용 전까지 - 80℃에 냉동 보관하였다.

재조합 인간 HGF 단백질은 R&D사 (R&D Systems, Inc., MSP, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다.

(3) 단백질 발현 확인 및 정량

293T 세포의 상등액에서 각 단백질의 발현을 확인하기 위하여 R&D 사 (R&D Systems, Inc., MSP, USA)의 인간 HGF 면역분석법을 이용하였다. 각 단백질의 발현량을 측정한 후, 각 상등액을 다시 1 ㎍/㎖로 희석하여 실험에 사용하였다.

(4) PC12 세포에서 하이브리드 HGF 단백질에 의한 세포성장 비교

신경세포의 세포성장에 미치는 하이브리드 HGF 단백질의 효과를 비교하기 위하여 PC12 세포를 이용하여 다음의 실험을 진행하였다. PC12 세포를 1 X 10⁵개로 6 웰 플레이트에 파종하고, 다음 날 1% FBS가 포함된 배지로 교체하였다. 각 단백질이 발현된 293T 세포의 상등액을 5 ng/㎖의 농도로 첨가하고, 7일간 배양한 후 세포 수를 측정하였다. 대조군으로는 pCK 벡터를 트랜스펙션한 293T의 상등액과 재조합 인간 HGF 단백질을 사용하였다. 그 결과, HGF-X4를 제외한 모든 하이브리드 HGF 단백질을 발현하는 상등액을 첨가한 실험군에서 대조군 보다 높은 세포성장이 관찰되었다. HGF-X6, HGF-X7 및 HGF-X8을 발현하는 상등액을 첨가한 실험군은 대조군 (pCK 벡터)에 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (P < 0.05 또는 P < 0.005; 도 9).

하이브리드 HGF 유전자 중에서, 유전자 발현이 가장 높게 나타났으며 (도 8 참조), PC12 세포의 성장에 가장 뚜렷한 통계적 유의성 (P < 0.005)을 보인 pCK-HGF-X7을 하기의 실험 및 임상시험에 적용하였다.

3-2. 신경세포의 성장에 미치는 HGF-X7 및 cHGF의 영향 비교 분석

(1) 세포주 및 세포배양

본 실험에 사용된 세포주는 총 2가지로 PC12 세포주와 사람 유래의 SH-SY5Y 신경모세포 (22266; KCLB, Korea)이다. PC12 세포주와 마찬가지로SH-SY5Y 세포주 역시 당뇨병성 신경병증 연구에 가장 많이 사용되는 세포주 중 하나이다. SH-SY5Y 세포를 이용한 당뇨병성 신경병증에 관한 연구에 따르면, 글루코스가 SH-SY5Y 세포의 미토콘드리아 막의 탈분극을 증가시키며, 비활성화 상태의 케스페이즈-3 (caspase-3)를 활성화시켜 SH-SY5Y 세포의 사멸을 유도한다고 알려져 있다(GM Leinninger et al., Cell Death and Differentiation.11:885??896 (2004)). 상기 세포들은 모두 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였으며, PC12 세포는 15% 소태아 혈청 및 항생물질이 보충된 둘베코스 모디파이드 이글 미디엄 (DMEM) 내에서 배양하였으며, SH-SY5Y 세포는 10% 소태아 혈청 및 항생물질이 보충된 미니멈 이센셜 미디엄 (MEM) 내에서 배양하였다. 세포배양매질, 시약 및 혈청은 Gibco 사와 ATCC 사 (American Type Culture Collection, MD, USA)에서 구입하였다.

(2) HGF 단백질을 발현하는 상등액 생산 및 정량

293T 세포를 1 X 10⁶개로 파종한 후, 다음 날 pCK, pCK-cHGF, pCK-dHGF 및 pCK-HGF-X7을 트랜스펙션 하였다. 48시간 배양 후, 상등액을 모두 수확하여 0.22 μm 필터를 이용하여 여과하였다. 인간 HGF 면역분석법을 이용하여 각 상등액에 포함된 HGF 단백질의 발현량을 측정하였다. 각 상등액을 다시 1 ㎍/㎖로 희석하여 실험에 사용하였다.

(3) PC12 세포에서 HGF-X7과 cHGF에 의한 세포성장 비교

신경세포의 세포성장에 미치는 효과를 비교하기 위하여, PC12 세포를 이용하여 각 단백질에 의한 세포의 증식 정도를 평가하였다. 이를 위하여 1 X 10⁵개의 PC12 세포를 6 웰 플레이트에 파종한 다음 날, 배지를FBS가 포함된 배지로 교체하였다. pCK, pCK-cHGF, pCK-dHGF 및 pCK-HGF-X7을 트랜스펙션 한 293T 세포에서 얻은 각 단백질을 5 ng/㎖의 농도로 첨가하였다. pCK 벡터를 대조군으로 사용하였다.

7일간 배양한 후 세포수를 측정한 결과, HGF-X7을 포함하는 293T 세포 상등액을 첨가한 실험군에서 가장 높은 세포수가 확인되었다. HGF-X7을 첨가한 실험군은 cHGF 보다는 약 50%, dHGF 보다는 약 70% 이상의 세포성장 효과를 보였다 (도 10).

(4) SH-SY5Y 세포에서 HGF-X7와 cHGF에 의한 세포성장 비교

신경세포인 SH-SY5Y 세포의 성장에 미치는 효과를 비교하기 위하여 각 단백질에 의한 세포의 증식 정도를 측정하였다. 이를 위하여 SH-SY5Y 세포주를 5 X 10⁴개로 6 웰 플레이트에 파종하였다. 하루가 지난 후, 1% FBS가 포함된 배지로 교체한 다음 pCK, pCK-cHGF, pCK-dHGF, pCK-HGF-X7을 트랜스펙션한 293T 세포에서 얻은 각 단백질을 5 ng/㎖의 농도로 첨가하였다. pCK 벡터를 대조군으로 사용하였다.

7일간 배양한 후 세포 수를 측정한 결과, HGF-X7을 포함하는 293T 세포 상등액을 첨가한 실험군에서 가장 높은 세포수가 확인되었다. HGF-X7을 첨가한 실험군은 cHGF 보다는 약 25%, dHGF 보다는 약 80% 이상의 세포성장 효과를 보였다 (도 11).

3-3. 고농도 글루코스 배양조건에서 PC12 세포의 성장에 미치는 HGF-X7의 효과 확인

(1) PC12 세포의 성장을 저해시키는 글루코스 농도와 배양시간 선정

고농도 글루코스 배양조건에서, PC12 세포의 성장에 미치는 HGF-X7의 효과를 확인하기에 앞서, PC12 세포의 성장을 저해시킬 수 있는 글루코스 농도와 배양시간을 선정하였다. 5 X 10⁴개의 PC12 세포를 96 웰 플레이트에 파종한 다음 날, 100, 200 mM의 글루코스를 포함한 1% FBS 배지로 교체하였다. 대조군으로는 PC12 세포의 배양 배지인 50 mM 글루코스를 포함한 배지를 사용하였다. 배지를 교체한 후, 24, 48, 72 시간째에 CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega, WI, USA)를 이용하여 세포성장을 측정하였다. 고농도의 글루코스 배지에서 PC12 세포의 성장이 감소되는 것을 확인하였으며, 특히 48, 72 시간째 200 mM 글루코스 배지에서 PC12 세포가 약 50% 성장이 저해되는 것이 관찰되었다. 이러한 결과를 바탕으로, PC12 세포의 세포성장을 저해시키는 글루코스 농도를 200 mM로, 배양시간을 72시간으로 선정하였다.

(2) 고농도 글루코스 배양조건에서 PC12 세포의 성장에 미치는 HGF-X7의 효과 확인

고농도 글루코스 배양조건에서 PC12 세포의 성장에 미치는 HGF-X7의 효과를 확인하였다. 96 웰 플레이트에 PC12 세포주를 5 X 10⁴개로 파종하였다. 다음 날 1% FBS가 포함된 200 mM의 글루코스 배지로 바꿔준 후 HGF-X7이 발현된 293T 세포 상등액을 50 ng/㎖로 첨가하였다.

72 시간 배양한 후 세포의 성장을 확인한 결과, HGF-X7을 발현하는 상등액을 첨가한 실험군의 세포성장이 대조군 (pCK 벡터)에 비해 약 23% 이상 증가되었음을 확인하였다. cHGF가 포함된 상등액을 동일한 농도로 첨가한 실험군과 비교했을 때에는 약 10% 이상의 세포성장 증가가 관찰되었다 (도 12).

3-4. 고농도 글루코스 배양조건에서 HGF-X7의 PC12 세포사멸 억제 효과 확인

(1) PC12 세포의 사멸을 유도하는 글루코스 농도와 배양시간 선정

고농도 글루코스 배양조건에서 PC12 세포의 사멸에 미치는 HGF-X7의 영향을 평가하기에 앞서, PC12 세포의 세포사멸을 유도하는 글루코스 농도와 배양시간을 선정하였다. PC12 세포주를 1 X 10⁵개로 6 웰 플레이트에 파종한 후, 다음 날 PC12 세포주를 1% FBS가 포함된 50, 100, 200 mM 글루코스 배지로 교체하였다. 48시간 또는 72 시간 배양한 후 세포를 모두 회수하였다. 12000 rpm 에서 3분 동안 원심 분리 한 후 상등액을 제거하고 PBS로 수세하였다. 이 과정을 한번 더 반복하였다. 회수한 세포는 아넥신 V 아폽토시스 분석 시스템 (BD Biosciences, NJ, USA)을 이용하여 세포사멸의 정도를 측정하였다. 회수한 세포에 1X 아넥신 V 바인딩 버퍼를 1 X 10⁶개의 세포 당 1 ㎖를 넣어 세포를 부유하였다. 부유한 세포 100 ㎕에 5 ㎕의 아넥신 V와 프로피디움 아이오다이드 (PI) 용액을 첨가하여 어두운 곳에서 20분 동안 염색하였다. 염색이 끝난 세포에 1X 아넥신 V 바인딩 버퍼를 400 ㎕ 더 넣어 유세포 분석기로 세포사멸을 확인하였다.

그 결과, 100 mM 글루코스 배지에서 48시간 배양하였을 때에는 대조군과 비교하여 PC12 세포의 세포사멸이 유도되지 않았으나, 200 mM 글루코스 배지에서는 대조군과 비교하여 약 2.5배의 세포사멸이 유도되었다. 반면, 72시간 배양 조건에서는 100, 200 mM 글루코스 배지에서 모두 대조군과 비교하여 세포사멸이 유도되는 것을 확인할 수 있었으며, 100 mM 및 200 mM 글루코스 배지 간 유의한 차이는 보이지 않았다. 이러한 결과를 바탕으로, PC12 세포의 세포사멸을 유도하는 글루코스 농도를 200 mM로, 배양시간을 48시간으로 선정하였다.

(2) 고농도 글루코스 배양조건에서 PC12 세포의 세포사멸에 미치는 HGF-X7의 효과 확인

PC12 세포주를 1 X 10⁵개로 6 웰 플레이트에 파종한 후, 다음 날 PC12 세포주를 1% FBS가 포함된 200 mM 글루코스 배지로 교체하였다. cHGF 또는 HGF-X7이 발현된 293T 세포 상등액을 50 ng/㎖로 첨가하였다. 대조군으로는 pCK 벡터를 트랜스펙션한 293T 세포의 상등액을 사용하였다. 48 시간 배양한 후 세포를 모두 회수하였다. 아넥신 V 아폽토시스 분석 시스템을 이용하여 염색한 후 유세포 분석기로 세포사멸이 일어난 정도를 확인하였다.

그 결과, pCK 벡터를 발현하는 293T 세포 상등액을 첨가한 대조군에 비해 HGF-X7을 발현하는 상등액을 첨가한 실험군에서 세포사멸이 약 2배 감소되었음을 확인하였다. cHGF가 포함된 상등액을 첨가한 실험군과 비교했을 때에도 약 1.5배 정도 높은 세포사멸 억제 효과를 나타내었다 (도 13).

실시예 4: pCK-HGF-X7을 이용한 당뇨병성 신경병증에 대한 임상 시험

4-1. 대상환자 및 투여방법

임상적으로 당뇨병성 신경병증으로 진단받은 12명의 환자를 대상으로, pCK-HGF-X7을 이용하여 안정성 및 유효성에 대한 임상 1상을 진행하였다. 투여시기 및 용량은 표 1과 같이 3개의 시험군으로 나누어 진행하였다.

시험군	투여용량	투여 횟수		투여총량
		Day 0	Day 14
		I	4 ㎎	8	8	8 ㎖
Ⅱ	8 ㎎	16	16	16 ㎖
Ⅲ	16 ㎎	32	32	32 ㎖

4-2. 시험방법

(1) 동의서 확보 및 스크리닝 과정

환자로부터 동의서를 받은 후, 환자의 본 임상시험 참여 가능성을 검사하는 스크리닝 과정을 진행하였다. 스크리닝 과정은 1차 투여일Day 0을 기준으로 이전 30일 이내에 진행하게 되며, 다음과 같은 항목에 대해 환자를 검사하여 본 임상시험 참여 가능성을 결정하였다.

a. 병력 조사 (complete medical history)

b. 일반 검사 (complete physical exam)

c. 암 검사 (cancer screening tests)

d. 안저 검사 (retinal fundoscopy)

e. 바이러스 검사 (viral screening tests)

f. 혈액 및 혈청 검사 (hematology and serum chemistry)

g. 뇨 검사 (Urinalysis)

h. 뇨 임신 검사 (여성만 시행)

i. 궤양 검사 (가능한 경우에만 실시)

j. ECG

k. Michigan Neuropathy Screening Instrument

l. Visual Analog Scale

(2) 시험약 투여 과정

스크리닝이 완료된 피험자는 오른쪽 종아리 근육에 pCK-HGF-X7을 2주 간격 (Day 0 및 Day 14)으로 투여 받았다. 시험군 I에 배정된 피험자는 Day 0에 2 ㎎의 pCK-HGF-X7을 투여 받았고, 2주 후인 Day 14에 다시 2 ㎎의 pCK-HGF-X7을 투여 받았다. 따라서, 시험군 I은 총 4 ㎎의 pCK-HGF-X7을 투여 받게 된다. Day 0에 방문한 피험자는 2 ㎎의 pCK-HGF-X7을 0.25 ㎎/0.5 ㎖/site의 양으로 나누어 종아리 근육 8곳에 투여 받았다. Day 14일째에도 동일한 방법으로 투여하였다. 시험군 Ⅱ는 총 8 ㎎의 pCK-HGF-X7 (Day 0에 4 ㎎, Day 14에 4 ㎎)을 투여 받았다. 투여 방법은 시험군 I과 유사하게 진행되었다. 즉, Day 0에 방문하는 시험군 Ⅱ의 피험자는 4 ㎎의 pCK-HGF-X7을 0.25 ㎎/0.5 ㎖/site의 양으로 나누어 종아리 근육 16곳에 투여 받았다. Day 14에도 동일한 방법으로 투여하였다. 시험군 Ⅲ은 총 16 ㎎의 pCK-HGF-X7 (Day 0에 8 ㎎, Day 14에 8 ㎎)을 투여 받았다. Day 0에 방문한 시험군 Ⅲ의 피험자는 8 ㎎의 pCK-HGF-X7을 0.25 ㎎/0.5 ㎖/site의 양으로 나누어 종아리 근육 32곳에 투여 받았다. Day 14에도 동일한 방법으로 32곳에 투여하였다.

4-3. 임상평가지표

본 임상시험의 일차평가항목 (primary endpoint)은 당뇨병성 신경증 환자의 종아리에 근주된 pCK-HGF-X7의 안전성을 확인하는 것이며, 이차평가항목 (secondary endpoint)은 당뇨병성 신경증의 주된 증상인 통증에 대한 pCK-HGF-X7의 치료제로서의 유효성을 확인하는 것이었다.

(1) 안전성 분석

본 임상시험에서 시험약을 투여 받은 모든 피험자는 안전성 분석의 대상이 된다. 투여 후 12개월 동안의 추적관찰을 통한 이상반응 (중증 이상반응 및 시험약 투여를 중단케 하는 이상반응도 포함)이 그 정도와 시험약과의 관계에 따라 모두 기록이 되었다. 가능한 경우 모든 통계적 분석을 통하여 안전성 분석을 하였다. 또한, 모든 피험자는 스크리닝 과정에서 암과 관련된 위험성을 피하기 위하여 American Cancer Society Cancer Screening Guideline에 명시된 방법을 통하여 검사를 실시하였다.

(2) 약동학적 (Pharmacokinetics) 분석

피험자 혈청 내의 HGF 단백질 수준과 혈액내의 pCK-HGF-X7의 양은 시험약의 Day 0 투여 전/후, Day 14 투여 전 후, Day 21, Day 30, Day 60, Day 90에 측정하였다.

(3) 유효성 분석

모든 피험자에 대해서 VAS(Visual Analogue Scale) 방법을 통하여 통증의 변화를 기록하였다. VAS는 건강상태에 대한 개인의 선호를 직접 측정하는 방법이다. 즉, 피험자에게 자신의 통증 정도에 대해 직접 점수를 매기게 하는 방법이다. 100 mm 길이의 선을 긋고 한쪽 끝에는 통증 없음, 다른 한쪽 끝에는 통증이 매우 심함으로 표시를 한다. 그리고 나서 피험자는 VAS 지표를 보고 자신의 통증 정도를 스스로 판단하여 기록하도록 되어있다. 이 방법은 각각 다른 피험자들 간의 비교는 불가능하지만, 동일한 피험자에 대해서는 통증이 어떻게 변동하고 있는지를 파악할 수 있다 (도 14). 임상적으로 유의미한 결과가 도출될 수 있도록 가능한 경우 모든 통계적 분석을 통하여 안전성 분석이 이루어졌다.

4-4. 시험결과

(1) 안전성 시험결과 (이상반응 보고)

본 발명의 pCK-HGF-X7의 투여에 따른 이상반응은, 시험군 I 그룹에서 총 3명의 피험자로부터 7건의 이상반응이 발생하였으며, 시험군 Ⅱ 그룹에서는 2명의 피험자로부터 2건, 시험군 Ⅲ 그룹에서는 2명의 피험자로부터 2건이 발생하였다. 시험군 I 그룹에서 보고된 이상반응은 안구건조, 주사부위의 통증, 구강건조, 설사 등이었으며, 시험군 Ⅱ 그룹에서는 허리통증, 축농증이, 시험군 Ⅲ에서는 오른쪽 갈비뼈의 통증, 바이러스성 증후군이 보고되었다. 약과 관련된 이상반응 (Adverse Drug Reaction)은 시험군 I 그룹의 2명의 피험자로부터 보고된 5건으로 안구건조 2건, 주사부위의 통증, 구강건조, 설사였으나 모두 mild 한 ADR로 회복되었다. 반면에, 중증 이상반응 (Serious Adverse Events)은 한 건도 보고되지 않았다.

(2) 약력학 (Pharmacodynamics, PD) 시험결과

pCK-HGF-X7 투여 후 혈청 내 생산된 HGF 단백질량 확인시험 결과, pCK-HGF-X7 투여 후 혈청 내 HGF 단백질의 수준은 시험기간 중 증가하지 않고 안정적으로 유지됨을 확인하였다 (도 15).

(3) 약동학 (Pharmacokinetics, PK) 시험결과

pCK-HGF-X7 투여 후 잔존하는 pCK-HGF-X7의 양을 확인한 시험결과, pCK-HGF-X7 DNA는 60일 추적 관찰 시에 10명의 피험자에서 검출되지 않았으며, 모든 피험자에서 ㎖ 당 100 카피 이하로 검출되었다 (표 2).

시험군	환자 ID	Day 0		Day 14		Day 21	Day 30	Day 60	Day 90
		선 투여	후 투여	선 투여	후 투여
		I	1-01	NEG	45846.3	NEG	62,762.8	10.0	7.1	NEG	NEG
	2-01		NEG	38401.5	NEG	18,215.9	NEG	NEG	NEG	NEG
	2-02		NEG	5871.8	NEG	38,401.5	NEG	NEG	NEG	NEG
	2-03		NEG	18215.9	NEG	5,871.8	NEG	NEG	NEG	NEG
Ⅱ	2-04	NEG	562,669.0	NEG	300,852.0	51.0	NEG	38.1	NEG
	1-02	NEG	114,319.0	333.0	139,297.0	56,266.9	219.0	91.1	NEG
	2-05	NEG	183,514.0	63.0	582,978.0	3,875.0	69.0	NEG	28.9
	1-03	5.1	177,131.0	319.0	1,532,729.0	262.8	108.1	NEG	NEG
	Ⅲ	1-04	NEG	1,920,770.8	148	6,252,606.8	1,637.5	162.2	NEG	42.7
		2-07	NEG	368,173.0	NEG	23,198.3	32.9	NEG	NEG	NEG
		2-08	NEG	76,888.4	170.7	101,424.0	157.6	58.6	50.6	NEG
		2-09	NEG	491,690.2	77.1	432,454.6	77.6	33.7	NEG	NEG

(4) 유효성 시험결과

통증의 정도를 Pain VAS (Visual Analogue Scale)를 통해 측정하였다. 12명 전체 피험자의 평균 기저치 (baseline) VAS 값은 48.0 이었으며, pCK-HGF-X7 투여 후 6개월째 평균 VAS 값은 25.4로 47%의 Pain VAS 값이 감소하였다 (도 16).

첫 번째 용량 그룹 (4 ㎎)의 경우, 평균 기저치 VAS 값은 39.5였으며, 투여 후 2개월째 VAS 값은 23.8로 39.7% 감소가 관찰되었으나, 투여 후 6개월째 평균 VAS 값은 31.3으로 기저치 대비 20.8%의 감소 효과만 관찰되었다. 첫 번째 용량 그룹에서의 통증 감소는 4명 중 3명에서 관찰되었고, 50% 이상의 통증 감소는 4명 중 2명에서 관찰되었다 (도 17).

두 번째 용량 그룹 (8 ㎎)의 경우, 평균 기저치 VAS 값은 59.1 이었으며, 투여 후 1개월째부터 VAS 값이 급속히 감소하여 투여 후 6개월째 평균 VAS 값은 27.5로 기저치 대비 53.5%의 감소효과가 관찰되었다 (도 18).

세 번째 용량 그룹 (16 ㎎)의 경우, 평균 기저치 VAS 값은 45.3 이었으며, 두 번째 용량 그룹과 유사하게 투여 후 1개월째부터 VAS 값이 급속히 감소하여 투여 후 6개월째 평균 VAS 값은 17.3으로 기저치 대비 61.4%의 감소효과가 관찰되었다. 세 번째 용량 그룹에서의 통증 감소는 4명 모두에서 관찰되었으며, 50% 이상의 통증감소는 4명 중 3명에서 관찰되었다 (도 19).

Pain VAS 지표를 이용한 유효성 탐색 결과, pCK-HGF-X7 투여 후 당뇨병성 신경병증의 주요 증상인 통증이 감소되었으며, 저용량 그룹 (4 ㎎)에 비해 중용량 (8 ㎎) 혹은 고용량 그룹 (16 ㎎)에서 보다 뚜렷한 통증 감소율과 통증 감소 반응률이 나타났다. 이러한 결과는, 이번 임상시험에서 관찰된 통증 감소 현상이 위약 효과가 아닌 pCK-HGF-X7 투여에 의한 것임을 지지해주는 것이다 (도 20).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Viromed Co., Ltd. <120> Gene Therapy of Diabetic Neuropathy Using HGF Isoforms <130> PI140001D <150> KR10-2011-0113786 <151> 2011-11-03 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 728 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of flHGF <400> 1 Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu 1 5 10 15 Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln 20 25 30 Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr 35 40 45 Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val 50 55 60 Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu 65 70 75 80 Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys 85 90 95 Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe 100 105 110 Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys 115 120 125 Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys 130 135 140 Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His 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tatttgtgga tcccttcctt tctacctgta tttgtcctaa taaattgttg acttattaat 780 tcactacttc ctcacagctt ttttttggct ttacaaatcc actggaaagg tatatgggtg 840 tatcactttg tgtatttcgg tgtgcatgtg tagaggggac aaaaatcctc tctcaaacta 900 taaatattga gtatttgtgt attgaacatt tgctataact actaggtttc ttaaataatc 960 ttaatatata aaatgatata gaaaaaggga aattatagtt cgtattattc atctaagtga 1020 agagattaaa acccagggag taaataaatt gtctaaggac taaggttgta tactatttag 1080 gtgatagata tggggcaacc gtatgggttt tatgattaac aaataaactt ctcaccactc 1140 taccatatca acttttccat aaaagagagc tatagtattc tttgcttaaa taaatttgat 1200 tagtgcatga cttcttgaaa acatataaag caaaagtcac atttgattct atcagaaaag 1260 tgagtaagcc atggcccaaa caaaagatgc attaaaatat tctggaatga tggagctaaa 1320 agtaagaaaa atgacttttt aaaaaagttt actgttagga attgtgaaat tatgctgaat 1380 tttagttgca ttataatttt tgtcagtcat acggtctgac aacctgtctt atttctattt 1440 ccccatatga ggaatgctag ttaagtatgg atattaacta ttactactta gatgcattga 1500 agttgcataa tatggataat acttcactgg ttccctgaaa atgtttagtt agtaataagt 1560 ctcttacact atttgttttg tccaataatt tatattttct gaagacttaa ctctagaata 1620 cactcatgtc aaaatgaaag aatttcattg caaaatattg cttggtacat gacgcatacc 1680 tgtatttgtt ttgtgtcaca acatgaaaaa tgatggttta ttagaagttt cattgggtag 1740 gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc ttggacttca ctctaatttt 1800 agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat aaagcctgtt aacaaaacac 1860 aagctgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat gtttactggt attacctgta 1920 gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg cagacaaatg caatatctaa 1980 ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa aagacttggc cttttctaat 2040 gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag ggcactagaa attttaagtg 2100 aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta ttataaacca aaactgggat 2160 cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc 2220 tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat 2280 ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg 2340 taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag 2400 ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta 2460 actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa 2520 aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 2580 tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 2640 gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 2700 cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 2760 gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 2820 gaaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 2880 ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcaaaaaaa agttgcatgc 2940 tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 3000 aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt 3060 tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg 3120 aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca 3180 agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat 3240 atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat 3300 ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg 3360 acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag 3420 gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg 3480 attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac 3540 gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc 3600 caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag 3660 attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac 3720 taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac 3780 cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac 3840 cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg 3900 aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa 3960 cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta 4020 gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc 4080 ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa 4140 ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc 4200 tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc 4260 tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga 4320 ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac 4380 gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg 4440 tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg 4500 agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg 4560 tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag 4620 catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 4679 <210> 13 <211> 3679 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of HGF-X7 <400> 13 atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60 ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120 gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180 accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240 ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300 ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360 aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420 tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480 aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540 tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600 tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660 tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720 tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc 780 ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat 840 aaagcctgtt aacaaaacac aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat 900 gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg 960 cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa 1020 aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag 1080 ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta 1140 ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa 1200 gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg 1260 tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct 1320 caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 1380 agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 1440 gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 1500 tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 1560 taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1620 tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1680 aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1740 ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1800 caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1860 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tggatgattt tgttagtacg attgatttac 2340 ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca 2400 ctggattgat caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg 2460 agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg 2520 gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg 2580 agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc 2640 caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta 2700 ttttaacata taaggtacca cagtcatag 2729 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 caaatgtcag ccctggagtt ccatga 26 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 ctggattgct tgtgaaacac cagggt 26

Claims (21)

1. 서열목록 제1서열로 이루어진 전장 HGF(full length HGF, flHGF) 및 서열목록 제2서열로 이루어진 결손된 변이형 HGF(deleted variant HGF, dHGF)로 구성된 인간 HGF(Hepatocyte growth factor)의 서로 다른 종류의 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료는 신경세포의 성장에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병성 신경병증의 예방 또는 치료는 신경세포의 사멸 억제에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 1 항에 있어서, 상기 HGF 의 이형체들이 각각 별도의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 HGF 의 이형체들이 단일의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 네이키드 DNA (naked DNA) 이거나 또는 유전자 운반체에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 유전자 운반체는 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제 7 서열 내지 제 14 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
14. 삭제
15. 삭제
16. 제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병성 신경병증은 다발성 말초신경병증 (polyneuropathy) 또는 국소성 말초신경병증 (focal neuropathy)인 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 다발성 말초신경병증은 고혈당성 신경병증 (hyperglycemic neuropathy), 원위부 대칭성 다발신경병증 (distal symmetric polyneuropathy), 자율신경병증 (autonomic neuropathy), 급성 감각신경병증 (acute sensory neuropathy), 급성 통증성 감각신경병증 (acute painful sensory neuropathy) 및 만성 운동성 감각신경병증 (chronic sensorimotor neuropathy)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 당뇨병성 신경병증인 것을 특징으로 하는 조성물.
18. 제 16 항에 있어서, 상기 국소성 말초신경병증은 뇌신경병증 (cranial neuropathy), 몸통 신경병증 (truncal neuropathy), 사지 신경병증 (limb neuropathy), 흉요추신경병증 (thoracolumbar radiculoneuropathy) 및 요천골 신경총근병증 (lumbosacral radiculoplexus neuropathy)으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 당뇨병성 신경병증인 것을 특징으로 하는 조성물.
19. 서열목록 제1서열로 이루어진 전장 HGF(full length HGF, flHGF) 및 서열목록 제2서열로 이루어진 결손된 변이형 HGF(deleted variant HGF, dHGF)로 구성된 인간 HGF의 서로 다른 종류의 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 신경세포의 성장 촉진 또는 신경세포의 사멸 억제용 약제학적 조성물.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열목록 제7서열 내지 제14서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
    
21. 삭제

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