KR20220135215A - 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents
샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220135215A KR20220135215A KR1020220039189A KR20220039189A KR20220135215A KR 20220135215 A KR20220135215 A KR 20220135215A KR 1020220039189 A KR1020220039189 A KR 1020220039189A KR 20220039189 A KR20220039189 A KR 20220039189A KR 20220135215 A KR20220135215 A KR 20220135215A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- pharmaceutical composition
- hgf
- present
- gly
- leu
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
본 발명은 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 샤르코-마리-투스병의 질환동물 모델에 투여시, 운동능력, 전기생리학적 검사 결과 및 신경병리조직학적 소견을 개선시키는 효과가 우수한 바, 샤르코-마리-투스병의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체, 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
희귀 유전성 질환의 하나인, 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT)은 특정 유전자 돌연변이로 인해 운동신경과 감각신경이 손상되는 질환이다. 샤르코-마리-투스병은 대표적인 유전성 말초신경변증(Inherited peripheral neuropathy)으로 인구 2500명 중 1명 정도로 발생하는 희귀 질환 중에서 가장 높은 발병 빈도를 가지며, 근력약화, 근육위축, 감각 소실 및 이상 감각이 주된 증상이다. 샤르코-마리-투스병은 유전운동감각신경병이라고도 하며, 약자로 CMT라 한다. 유전성 말초신경병증에는 샤르코-마리-투스병 외에도 압박마비 유전신경병(hereditary neuropathy with liability to pressure palsy), 유전운동신경병(hereditary motor neuropathy) 및 유전성 감각 자율신경병증(hereditary sensory and autonomic neuropathy)이 있다.
샤르코-마리-투스 질환의 발병 원인으로 80개 이상의 다양한 원인 유전자가 있다고 알려졌다. 유전 양상에 따라 (1) 상염색체 우성 유전의 양상을 보이면서 신경전도속도의 감소가 있는 경우는 CMT1(관련 유전자로 PMP22, MPZ, EGR2, LITAE, NEFL 등이 있음), (2) 우성 유전의 양상을 보이면서 신경전도속도는 정상에 가까우면서 운동신경 또는 감각신경의 활동전위가 저하된 경우는 CMT2(관련 유전자로 MFN2, RAB7 등이 있음), (3) X염색체 관련 유전 양상을 보이는 경우는 CMTX, 및 (4) 상염색체 열성 유전의 양상을 보이는 경우는 CMT4(관련 유전자로 GDAP1, MTMR2, SBF2 등이 있음)로 분류된다(J Korean Society for Clinical Neurophysiology 7(2):65-74, 2005). 샤르코-마리-투스 질환의 치료제로는 오나프리스톤(onapristone, 프로게스테론 길항제), 아스코르빈산(ascorbic acid), 및 NT-3(neurotrophin-3) 등이 연구되고 있다.
Kim et al., J Korean Society for Clinical Neurophysiology 7(2):65-74, 2005
본 발명자들은 샤르코-마리-투스병의 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 샤르코-마리-투스병의 질환모델 동물에 간세포 성장인자의 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미스 벡터 및 바이러스 벡터를 투여한 결과, 운동능력, 전기생리학적 검사 결과 및 신경병리조직학적 소견이 개선됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스병의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)"는 간엽 세포에 의해 생성되는 다기능성 이종이량체 폴리펩타이드이다. HGF는 다양한 세포 형태의 성장 및 분산(scattering) 뿐만 아니라 혈관신생(angiogenesis), 형태형성(morphogenesis), 및 모토제네시스(motogenesis)를 자극하는 것으로 알려져 있다(Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar and Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier and Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001). HGF의 다면발현성 특성은 이의 수용체, 원발암유전자(proto-oncogene) c-Met에 의해 인코딩되는 막투과성 티로신 키나아제를 통해 매개된다.
본 발명에서 상기 간세포 성장인자 이형체는 모든 대립 유전자 변형체들(variants)을 포함하는, 동물에서 자연적으로 생성되는(naturally occurring) HGF 아미노산 서열과 적어도 80%, 바람직하게는 90%, 95%, 또는 99% 이상의 동일한 아미노산 서열을 갖는 HGF 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 HGF 이형체는 HGF의 정상형(normal form) 또는 야생형(wild type), 및 HGF의 다양한 변이체(예컨대, 스플라이싱 변이체 및 결손 변이체)를 모두 포괄하는 의미를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체들은 전장 HGF(full length HGF; flHGF)와 결손된 변이형 HGF(deleted variant HGF; dHGF)를 포함한다. 전장 HGF 및 결손된 변이형 HGF, 또는 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 모두 포함하는 조성물을 이용하는 경우, 샤르코-마리-투스병을 더욱 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "flHGF"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 HGF의 아미노산 1-728 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "dHGF"는 동물, 바람직하게는 포유동물에서 HGF 유전자의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 HGF 단백질의 결손된 변형체, 보다 바람직하게는 전장 HGF 서열로부터 알파 사슬의 첫 번째 크링글 도메인에서 5 개의 아미노산(F, L, P, S 및 S)이 결손된 723 개의 아미노산으로 이루어지는 인간 HGF를 지칭한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 flHGF는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 dHGF는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 HGF의 이형체들은 별도의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나, 또는 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화된다.
본 발명인 약제학적 조성물은, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들이 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에는 상기 단일의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 HGF 이형체들의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열(예컨대, 프로모터 또는 인핸서)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
HGF의 두 종류 이상의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우, 두 가지 방식으로 발현 카세트를 구축할 수 있다. 첫 번째 방식에 따르면, 이형체 각각에 대한 CDS(coding sequence)에 발현 조절 서열을 연결하여 발현 카세트를 구축한다. 두 번째 방식에 따르면, "발현조절서열-제1 이형체 CDS-IRES-제2 이형체 CDS-전사종결 서열"과 같은 방식으로 IRES(internal ribosomal entry site) 또는 2A 펩타이드를 이용하여 발현 카세트를 구축한다. IRES는 유전자의 번역이 IRES 서열에서 시작되도록 함으로써 2 개 이상의 관심 유전자가 동일한 구조물에서 발현되도록 한다.
HGF의 두 종류 이상의 이형체들이 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우, 상기 두 종류 이상의 이형체들을 모두 암호화하고 있는 폴리뉴클레오타이드는 단일의 발현조절서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명에 있어서, HGF의 이형체들은 둘 이상의 서로 다른 종류의 이형체들, 예컨대 flHGF 및 dHGF를 동시에 발현하는 하이브리드(hybrid) HGF 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 인간 HGF 의 엑손 1 내지 18 에 해당하는 cDNA, 및 상기 cDNA 의 엑손 4 와 5 사이에 삽입된 인간 HGF 유전자의 인트론 4 또는 인트론 4의 단편을 포함한다. 즉 아래와 같은 구조로 이루어진 핵산 분자를 포함한다.
'HGF의 엑손 1 내지 4-HGF의 인트론 4 또는 그의 단편-HGF의 엑손 5 내지 18'
상기 '-'는 각 엑손과 인트론 단편을 구별하기 위한 표현일 뿐, 특정한 구조를 의미하는 표현은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 둘 이상의 HGF의 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 둘 이상의 HGF의 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1(pCK-HGF-X7), 서열번호 5(HGF-X7-d4) 또는 서열번호 6(HGF-X7)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 "HGF 이형체", 및 "하이브리드 HGF 유전자(예컨대, HGF-X7)"에 관하여서는 WO 2003/078568에 보고된 바 있으며, 상기 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에서 이용 가능한 HGF 이형체의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 HGF 이형체의 서열과 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 실질적인 동일성은, HGF 이형체의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성, 또는 100%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "% 상동성"은 예를 들어 다음과 같이 계산될 수 있다. CLUSTAL W 알고리즘 (Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22:4673-4680 (1994))을 이용하여, 분석하고자 하는 서열을 타겟 서열에 맞추어 조정한다(align). 조정된 서열들 중 가장 짧은 것에 일치하는 윈도우에 대해 비교가 이루어진다. 조정된 서열들 중 가장 짧은 것이 어떤 경우에는 타겟 서열일 수도 있다. 다른 경우에는, 분석하고자 하는 서열이 조정된 서열들 중 가장 짧은 서열을 구성할 수도 있다. 각 위치에서의 아미노산 잔기, 또는 뉴클레오타이드의 염기를 비교하고, 타겟 서열에서와 동일성을 가지는 분석하고자 하는 서열의 위치의 비율을 % 상동성으로 보고한다.
본 발명의 HGF 이형체(flHGF 및 dHGF)를 인코딩하는 유전자는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 flHGF 및 dHGF 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 HGF 이형체를 인코딩하는 유전자는 서로 다른 뉴클레오타이드 서열을 가지면서, 서로 동일한 아미노산 서열을 가진 HGF 이형체(flHGF 및 dHGF)를 인코딩하는 축퇴성 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 상동성은 코돈의 축퇴성으로 인하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 나타낼 수 있다.
또한, 코딩 영역을 제외한 부분(예컨대 인트론 영역)에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 뉴클레오타이드의 다양한 변형(삽입, 치환, 제거) 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
예컨대, 본 발명의 구체적인 구현예에 따른, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 서열번호 5(HGF-X7-d4), 서열번호 6(HGF-X7), 또는 서열번호 10(optimized HGF-X7-d4)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이들 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서로 상이하지만 코딩 영역을 제외한 부분(인트론 영역)의 뉴클레오타이드 서열이 상이하고, 코딩 영역(엑손 영역)의 뉴클레오타이드 서열은 동일하므로, 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의하여 서로 동일한 아미노산 서열을 가진 flHGF 및 dHGF 단백질을 인코딩한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 서열번호 10(optimized HGF-X7-d4)의 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열번호 5(HGF-X7-d4)의 뉴클레오타이드 서열과 약 82%의 서열 상동성을 가지나, 동일한 아미노산 서열을 가진 flHGF 및 dHGF 단백질을 인코딩한다.
본 발명의 하이브리드 HGF 유전자는 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 10의 하이브리드 HGF 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드란 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.
다만, 상술한 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열은 AAV 벡터에 삽입하는데 있어서, 큰 뉴클레오타이드 사이즈로 인하여 제한이 있다. 본 발명의 서열번호 5 또는 10의 뉴클레오타이드 서열은 상술한 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열의 인트론 4 단편에 해당하는 서열 중 일부를 제거하여 다운사이징한 서열 중 유의하게 상승된 유전자 전달 효율을 보이는 서열에 해당한다. 구체적으로, 서열번호 5 또는 10의 뉴클레오타이드 서열을 AAV 벡터에 도입하여 대상(subject)에 전달하는 경우, 종래 알려진 서열번호 7의 HGF-X8을 AAV 벡터에 도입하여 이용하는 경우에 비하여 유의하게 상승된 유전자 전달 효율 및 발현 효율을 보인다.
본 발명의 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열(HGF-X7-d4)를 포함하는, 서열번호 6의 서열로부터 유래한 사이즈가 감소된 변형 뉴클레오타이드 서열은 WO 2019/132624에 보고된 바 있으며 상기 특허문헌의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 naked DNA 또는 유전자 전달 시스템에 포함되어 있는 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 조성물은 유전자 치료 분야에서 통상적으로 공지된 다양한 운반 방법을 통하여 생체 내에 적용될 수 있으며, 상기 유전자 전달 시스템은 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(i) 플라스미드(벡터)
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 운반체로서 플라스미드(벡터)가 이용될 수 있다. 플라스미드(벡터)에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 발현 카세트 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 카세트에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 핵산 발현조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는 일 구현예에 따르면 동물세포, 다른 구현예에 따르면 포유동물 세포, 특정 구현예에 따르면 인간 세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다
본 발명에서 이용되는 발현 카세트는 폴리아네닐화 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 poly A(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), beta-글로빈 poly A(Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) 또는 폴리오마바이러스 poly A(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 pCK, pCP, pVAX1 또는 pCY 벡터를 이용할 수 있으며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 pCK 벡터를 이용할 수 있다. 상기 pCK 벡터를 이용하여 HGF의 둘 이상의 이형체를 발현하는 단일 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터들은 WO 2000/040737 및 WO 2003/078568에 자세히 기재되어 있으며, 상기 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
(ii) 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159 (1983)). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, LTR 및 ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2 세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara 등(Science, 266:1373-1376 (1994))은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열도 이와 같은 2 세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 레트로바이러스에 탑재될 수 있다.
(iii) 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 역가(titer), 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스-엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B) 은 전사 및 숙주세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 암호화한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 암호화한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서는, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551 (1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073 (1989)). 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실" 은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. 또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb 를 추가적으로 패키징 할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739 (1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료는 안전할 것으로 판단된다.
(iv) 아데노-연관 바이러스 벡터
아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus, AAV) 벡터는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제5,139,941 호 및 제4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37 (1995)에 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 타겟 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822- 3828 (1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945 (1991))를 동시 전달(transfection)하여 제조된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 벡터는 바이러스 벡터이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV)이다.
본 발명의 AAV 벡터는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 외래 유전자 서열을 세포 내로 운반하는데 이용될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV serotype을 갖는다.
상기 AAV는 serotype AAV1, AAV2, AAV5, 및 AAV6로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 AAV를 이용하여 HGF의 둘 이상의 이형체를 발현하는 단일 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 WO 2019/132624A1에 자세히 기재되어 있다.
(v) 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 생체 내로 운반하는 데 이용할 수 있다. 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10 (1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62 (1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415 (1995)) 로부터 유래된 벡터들도 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
(vi) 리포좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀을 이용하여 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)에 개시되어 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용 하여 세포 내로 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
본 발명에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 네이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드(벡터)에 탑재된 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980); 및 Harland 와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456 (1973); 및 Chen 과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718 (1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87 (1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)) 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 도입시킬 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 외래 유전자 서열을 세포 내로 운반할 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 상술한 AAV 벡터를 이용하여 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 293T와 같은 포유동물세포(mammalian cell) 또는 곤충세포(insect cell) 등에 형질 전환시킬 수 있고, 형질 전환된 숙주 세포를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 샤르코-마리-투스병을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 샤르코-마리-투스병의 진행/발전의 지연 또는 억제; (b) 샤르코-마리-투스병의 경감; 및 (c) 샤르코-마리-투스병의 제거를 의미한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 척수강내 투여, 뇌실 내 투여 (intracerebroventricular injection), 뇌 투여(intracerebral injection) 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 주사로 제제화되어 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대상체에 3주 이내의 간격으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 0.001 내지 100 mg/개체/일의 투여량으로 투여된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분이 HGF 이형체 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드인 경우 0.001 내지 100 mg의 투여량으로 투여된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분이 AAV 벡터인 경우, 1×108 내지 1×1012 genome copies (GC)/site 또는 1×108 내지 1×1012 genome copies (GC)/head의 투여량으로 투여된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 투여 간격은 예컨대, 3일, 5일, 6일, 7일, 9일, 10일, 12일, 14일, 15일, 18일, 20일, 또는 21일이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 투여량은 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 0.001 내지 100 mg/1개체/1일, 0.001 내지 90 mg/1개체/1일, 0.001 내지 80 mg/1개체/1일, 0.001 내지 70 mg/1개체/1일, 0.001 내지 60 mg/1개체/1일, 0.001 내지 50 mg/1개체/1일, 0.001 내지 40 mg/1개체/1일, 0.001 내지 30 mg/1개체/1일, 0.001 내지 20 mg/1개체/1일, 0.001 내지 15 mg/1개체/1일, 0.001 내지 14 mg/1개체/1일, 또는 0.001 내지 10 mg/1개체/1일의 투여량으로 투여되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 투여량은 14 mg/1개체/1일이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대상체에 3주 이내의 간격으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 1일에 다리당 0.0005 내지 50 mg의 투여량으로 근육 내 투여된다. 상기 다리당 투여량은 0.0005 내지 50 mg, 0.0005 내지 45 mg, 0.0005 내지 40 mg, 0.0005 내지 35 mg, 0.0005 내지 30 mg, 0.0005 내지 25 mg, 0.0005 내지 20 mg, 0.0005 내지 18 mg, 0.0005 내지 16 mg, 0.0005 내지 15 mg, 0.0005 내지 14 mg, 0.0005 내지 13 mg, 0.0005 내지 12 mg, 0.0005 내지 11 mg, 0.0005 내지 10 mg, 0.0005 내지 9 mg, 0.0005 내지 8 mg, 0.0005 내지 7 mg, 0.0005 내지 6 mg, 또는 0.0005 내지 5 mg 이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 투여량은 1일에 다리당 7 mg이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물이 1회 이상 투여되는 경우의 각 투여량은 매회 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 대상체는 포유류이고, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 랫트, 기니피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 바분(baboon), 또는 붉은털 원숭이(Macaca mulatta)이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 1 주기(1 cycle) 이상 투여된다. 상기 1 주기는 1회 이상의 투여 회수를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 주기 사이의 간격은 1개월 내지 6개월이다. 보다 구체적으로, 상기 주기 사이의 간격은 예컨대, 30일 내지 40일, 30일 내지 50일, 30일 내지 60일, 30일 내지 70일, 30일 내지 80일, 30일 내지 90일, 30일 내지 100일, 30일 내지 120일, 30일 내지 150일, 30일 내지 180일, 60일 내지 70일, 60일 내지 80일, 60일 내지 90일, 60일 내지 100일, 60일 내지 120일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 100일, 120일, 150일, 또는 180일 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 1 주기는 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 총 0.002 내지 200 mg/1개체의 투여량이 투여되는 것을 1 주기로 하고, 주기 간 60 내지 120일 간격을 두고 투여된다.
상기 1 주기는 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 총 0.2 내지 200 mg/1개체의 투여량이 투여되는 것을 기준으로 하므로, 1회 이상의 투여 회수를 포함할 수 있다. 예를 들면, 투여 용량이 10 mg/개체/일인 경우 2주 간격으로 3일 동안 총 30 mg/개체의 투여량이 투여되는 것을 1주기로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 1주기는 14 mg/개체/일의 용량으로 2주 간격으로 2일간 투여하였다. 즉, 28 mg/1개체의 투여량이 투여되는 것을 1주기로 하여, 주기(cycle) 사이에 90일의 간격을 두고 투여된 바 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 질환의 중증도 변화와 관련된 유효성 지표인 CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2)를 개선시키는 효과가 있다.
상기 CMTNS-v2는 감각이상, 통각 예민도, 진동 감각, 상지 근력, 하지 근력, 정중 신경의 운동신경 활동 전위, 척골 신경의 감각신경 활동 전위, 상지 운동증상, 및 하지 운동증상을 포함한다.
상기 개선된 CMTNS-v2의 항목은 감각이상, 통각 예민도, 및 진동 감각을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 질환의 중증도 변화와 관련된 유효성 지표인 FDS(functional disability scale)를 개선시키는 효과가 있다.
상기 FDS는 다음과 같은 9 단계의 scale을 포함한다:
0; 정상, 1; 정상이지만 피로감이나 통증이 있는 경우(normal but with cramps and fatigability), 2; 달리기를 할 수 없는 경우(inability to run), 3; 걷기가 어렵지만 도움 없이 걷는 것이 가능한 경우 (walking difficulty but still possible unaided), 4; 지팡이를 가지고 걸을 수 있는 경우(walk with cane), 5; 목발을 가지고 걸을 수 있는 경우(walk with crutches), 6; 보조기를 착용하고 걸을 수 있는 경우(walk with a walker), 7; 휠체어를 타고 다녀 야 하는 경우(wheelchair bound), 8; 누워서 생활하는 경우(bedridden).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 하지 기능의 변화를 나타내는 유효성 지표인 ONLS(overall neuropathy limitation score) leg scale을 개선시키는 효과가 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 하지 기능의 변화를 나타내는 유효성 지표인 10MWT (10 meter walk test)를 개선시키는 효과가 있다. 상기 10MWT는 이동성, 보행, 전정계 기능의 수행 정도를 결정하는데 사용되는 지표로, 초당 걸음 걸이(m/sec)를 측정한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 하지 근육의 소실을 방지하고, 지방 침윤을 감소시키는 효과가 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스병의 치료방법을 제공한다.
상기 본 발명의 다른 일 양태에 따른 치료방법은, 상술한 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명은 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 샤르코-마리-투스병의 질환동물 모델에 투여시, 운동능력, 전기생리학적 검사 결과 및 신경병리조직학적 소견을 개선시키는 효과가 우수한 바, 샤르코-마리-투스병의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pCK-HGF-X7으로부터 HGF-X7의 다운사이징 변이체들을 제조하는 방법을 보여주는 모식도이다.
도 2는 HGF-X7의 다운사이징 변이체들을 pCA 벡터에 클로닝하는 방법을 보여주는 모식도이다.
도 3은 실시예 2에 따른 본 발명의 조성물 투여 후 체중을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 2에 따른 본 발명의 조성물 투여 후 rotarod 실험결과를 나타낸 도이다.
도 5은 본 발명의 조성물을 투여한 후, 운동신경전도 검사에서 Distal CMAP 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 본 발명의 조성물을 투여한 후, 운동신경전도 검사에서 Proximal CMAP 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 7는 본 발명의 조성물을 투여한 후, 운동신경전도 검사에서 MNCV 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 조성물을 투여한 후, 감각신경전도 검사에서 SNCV 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 약물 투여 후, 마우스 대퇴신경 조직의 신경섬유 수초화 정도를 확인하기 위하여 마우스 대퇴조직 신경섬유의 조직학적 소견을 나타낸 도이다.
도 10a는 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 C22 마우스의 대퇴신경조직의 semi-thin 광학 현미경 사진을 나타낸 도이다(x400).
도 10b는 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 C22 마우스의 대퇴신경조직의 semi-thin 전자 현미경 사진을 나타낸 도이다(Bar = 2μm).
도 2는 HGF-X7의 다운사이징 변이체들을 pCA 벡터에 클로닝하는 방법을 보여주는 모식도이다.
도 3은 실시예 2에 따른 본 발명의 조성물 투여 후 체중을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 2에 따른 본 발명의 조성물 투여 후 rotarod 실험결과를 나타낸 도이다.
도 5은 본 발명의 조성물을 투여한 후, 운동신경전도 검사에서 Distal CMAP 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 본 발명의 조성물을 투여한 후, 운동신경전도 검사에서 Proximal CMAP 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 7는 본 발명의 조성물을 투여한 후, 운동신경전도 검사에서 MNCV 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 조성물을 투여한 후, 감각신경전도 검사에서 SNCV 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 약물 투여 후, 마우스 대퇴신경 조직의 신경섬유 수초화 정도를 확인하기 위하여 마우스 대퇴조직 신경섬유의 조직학적 소견을 나타낸 도이다.
도 10a는 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 C22 마우스의 대퇴신경조직의 semi-thin 광학 현미경 사진을 나타낸 도이다(x400).
도 10b는 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 C22 마우스의 대퇴신경조직의 semi-thin 전자 현미경 사진을 나타낸 도이다(Bar = 2μm).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: AAV1-HGF (AAV1-pCA-HGF-X7-d4)의 제작
HGF의 두 가지 이형체(flHGF 및 dHGF)를 발현하는 AAV 벡터를 제작하기 위해, 서열번호 1의 pCK-HGF-X7로부터 위치지정 돌연변이 (site-directed mutagenesis) 방법을 통해 HGF 유전자의 인트론 4에 해당하는 부분의 서열 일부를 제거한 4가지 유도체(derivative), pCK-HGF-X7-d1, pCK-HGF-X7-d2, pCK-HGF-X7-d3 및 pCK-HGF-X7-d4를 제작하였다. 이 때 사용한 프라이머 서열은 서열번호 11 내지 18과 같다.
상기 pCK-HGF-X7-d4에서 ClaI 및 SalI 제한효소를 처리하여 서열번호 5의 HGF-X7-d4를 절편을 얻었다. pCA 벡터(AAV Helper-Free System, Agilent, USA)에도 ClaI 및 SalI 제한효소를 처리하고 상기 HGF-X7-d4 절편과 함께 라이게이션 하여 pCA-HGF-X7-d4를 제작하였다.
AAV를 생산하기 위해, 293T 세포 (ATCC)를 전날 준비하여 24시간 동안 안정화시켰다. 이 293T 세포에 상기 플라스미드 DNA pCA-HGF-X7-d4와 AAV 생산에 필요한 DNA인 pHelper 및 pAAV-RC(AAV Helper-Free System, Agilent, USA)를 전달(transfection)한 후 3일 후 AAV를 수거하였다. 수거한 AAV는 titration kit(AAVpro Titration Kit, Takara, JP)를 이용하여 titer를 측정하였다. 상기 AAV는 serotype AAV1을 이용하여 제작되었다.
상기 pCK-HGF-X7을 "VM202"로, 상기 AAV1-pCA-HGF-X7-d4를 "AAV1-HGF"로, pCA-HGF-X7-d4를 클로닝하지 않은 pCA 벡터를 이용하여 제작한 AAV1-pCA-MCS를 "AAV1-MCS"로 명명하고 이하의 실시예에서 사용하였다.
실시예 2: AAV-HGF를 이용한 C22 마우스에서의 치료 효능 확인
2-1. 실험동물 준비 및 투여
AAV-HGF의 샤르코-마리-투스병 치료 효능을 확인하기 위해, CMT type 1A형의 환자와 같은 표현형을 보이는 형질전환 마우스 동물모델인 C22 모델을 사용하였다. 실험군은 다음과 같이 분류하였고, 실험 결과는 합산하여 정리하였다.
마우스모델 | 실험군 번호 | 투여물질 | 용량 (vg/head) |
개체수 |
Wild type | G1 (WT) | - | - | 5 |
C22 | G2 (C22 Con) | AAV1-MCS | 1 * 1011 | 10 |
G3 (C22 Ex1) | AAV1-HGF | 1 * 109 | 10 | |
G4 (C22 Ex2) | AAV1-HGF | 1 * 1010 | 10 | |
G5 (C22 Ex3) | AAV1-HGF | 1 * 1011 | 10 |
상기 표 1과 같이, C22에 마우스에 AAV1-MCS(WO2019/132624A1의 AAV1-MCS) 및 AAV1-HGF(WO2019/132624A1의 AAV1-pCA-HGF-X7-d4)를 용량별로 척수강내 투여하였고, 투여 후 2주 간격으로 체중 변화 및 행동평가분석을 하였고, 16주째 전기생리학적 검사 및 신경조직 병리학적 검사를 진행하였다.
2-2. 체중 분석
체중 분석 결과, 모든 그룹 간 유의미한 차이는 없이 체중이 유지되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
2-3. 행동평가분석
약물 투여에 따른 행동평가는 Rotarod 실험법을 이용하였다. 약물 투여 전, 이 실험방법에 대해 실험동물의 적응 훈련 및 테스트를 실시하였고 약물 투여 후 2주 간격으로 테스트를 실시하여 약효를 평가하였다. Rotarod 실험법은 회전하는 긴 원통 위에 마우스를 올려두고 그 위에서 떨어지지 않고 얼마나 버티는지에 대한 시간을 측정하는 것으로, 원통의 회전이 시작되는 순간부터 마우스가 바닥에 떨어지는 순간까지의 시간이 측정되며, 만점은 180초로 설정하였다.
실험 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물(AAV-HGF)을 1*109 (vg/head)를 투여한 군(C22 Ex1)에서 전반적으로 C22 Con군에 비해 운동능력이 호전되는 것을 확인할 수 있었는데, 특히 투여 2주째 유의미하게 개선된 운동능력을 나타내었다. 1*1010 (vg/head) 또는 1*1011 (vg/head)로 투여한 군에서도 투여 후 초반까지는 C22 Con군에 비해 운동능력이 호전되는 것을 확인할 수 있었는데, 1*1011 (vg/head)로 투여한 군은 투여 8주째 유의미하게 개선된 운동능력을 나타내었다.
2-4. 전기생리학적 검사
약물 투여 후, 마우스의 뒷다리에서 전기생리학적 검사를 실시하였다. 정확한 전기생리학적 검사를 수행하기 위해, 측정 전 마우스의 등부터 발까지의 털을 모두 제거하였다. 마우스는 마취 콘(cone)을 사용하여 1.5% 이소플루란(isoflurane)을 공급하여 호흡마취 하였다. 측정은 Nicolet VikingQuest 장치(Natus Medical, San Carlos, CA, USA)를 이용하여 복합근육활동전위(compound muscle action potential, CMAP) 및 신경전도속도(nerve conduction velocity, NCV)를 측정하였다. 실험은 2회에 걸쳐 진행하였고, 실험에 사용한 마우스는 아래와 같다.
실험1 | |||||
마우스모델 | 실험군 번호 | 투여물질 | 용량 (vg/head) |
개체수 | 성별 |
Wild type | G2 (C22 Con) | AAV1-MCS | 1 * 10^11 | 4 | Female |
C22 | G3 (C22 Ex1) | AAV1-HGF | 1 * 10^9 | 3 | Female |
G4 (C22 Ex2) | AAV1-HGF | 1 * 10^10 | 4 | Male | |
G5 (C22 Ex3) | AAV1-HGF | 1 * 10^11 | 4 | Male1/Female3 | |
실험2 | |||||
마우스모델 | 실험군 번호 | 투여물질 | 용량 (vg/head) |
개체수 | 성별 |
Wild type | G1 (WT) | - | - | 5 | Male2/Female3 |
C22 | G2 (C22 Con) | AAV1-MCS | 1 * 10^11 | 5 | Male |
G3 (C22 Ex1) | AAV1-HGF | 1 * 10^9 | 4 | Male | |
G4 (C22 Ex2) | AAV1-HGF | 1 * 10^10 | 5 | Female | |
G5 (C22 Ex3) | AAV1-HGF | 1 * 10^11 | 5 | Male3/Female2 |
결과는 도 5 내지 도 8에 나타내었다.
AAV-HGF를 투여한 모든 용량군에서 전반적으로 C22 Con군에 비해 Distal CMAP가 증가되는 양상이 나타났다. 그리고 1*109 (vg/head) 또는 1*1010 (vg/head)를 투여한 군에서 proximal CMAP 및 SNCV(sensory nerve conduction velocity)가 증가하는 양상을 보였는데, 특히 SNCV의 경우 C22 Con군에 비해 AAV-HGF 1*109 (vg/head)를 투여한 군에서 유의한 차이를 확인할 수 있었다.
2-5. 신경조직 병리학적 검사
본 발명의 약물 투여 후, 신경조직 병리학적 검사를 수행하기 위해 마우스 대퇴신경에 대해 semithin section을 진행하였다. 본 발명의 약물의 신경섬유 수초화(myelination)에 대한 유효성을 확인하기 위해, 수초화된 액손(myelinated axon) 및 탈수초화된 액손(unmyelinated axon)의 수를 측정하였다. 결과는 도 9에 나타내었다. 그 결과, AAV-HGF 1*109 (vg/head)를 투여한 군(C22 Ex1)에서 수초화된 액손(myelinated axon)의 증가 및 탈수초화된 액손(unmyelinated axon)의 감소가 관찰되어 신경섬유 수초화 정도의 면에서 개선되는 양상을 확인할 수 있었다.
실시예 3. pCK-HGF-X7(VM202)를 이용한 임상 1상 시험에서의 샤르코-마리-투스병의 치료 효능 확인
3.1 대상환자 및 투여방법
임상적으로 샤르코-마리-투스병으로 진단받은 12명의 환자를 대상으로, pCK-HGF-X7을 이용하여 안전성 및 유효성에 대한 임상 1상을 수행하였다. 본 발명의 HGF 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(pCK-HGF-X7)는 2주 간격으로, 다리당 7 mg의 투여량으로 투여되었다. 이 때 7 mg의 투여량은 0.25 mg/0.5 ml/site의 양으로 한 다리 근육의 28곳에 투여되었다. 2주 간격으로 총 28 mg이 투여되는 것을 한 주기(1 cycle)로 정의하였다. 상기 주기는 반복될 수 있으며, 바람직하게는 90일 간격으로 반복될 수 있다.
Cohort | Total dose | Dose Level per injection | Dose VM202 per Visit | |||
Day 0 | Day 14 | Day 90 | Day 104 | |||
n=12 | 56 mg | 0.25 mg/0.5 ml | 14 mg (0.5 ml * 56) |
14 mg (0.5 ml * 56) |
14 mg (0.5 ml * 56) |
14 mg (0.5 ml * 56) |
3.2 시험방법
(1) 동의서 확보 및 스크리닝 과정
환자로부터 동의서를 받은 후, 환자의 본 임상시험 참여 가능성을 검사하는 스크리닝 과정을 진행하였다. 스크리닝 과정은 1차 투여일(Day 0)을 기준으로 이전 30일 이내에 진행하게 되며, 다음과 같은 항목에 대해 환자를 검사하여 본 임상시험 참여 가능성을 결정하였다.
a. 병력 조사 (complete medical history)
b. 일반 검사 (complete physical exam)
c. 암 검사 (cancer screening tests)
d. 흉부 X선 검사 (Chest X-ray)
e. 바이러스 검사 (viral screening tests)
f. 혈액 및 혈청 화학 검사 (hematology and serum chemistry)
g. 뇨 검사 (Urinalysis)
h. 뇨 임신 검사 (여성만 시행)
i. 신경학적 검사
j. ECG
k. CMTNS-v2
l. 보조기구 사용여부
(2) 시험약 투여 과정
스크리닝이 완료된 시험대상자는 양측 하지에 pCK-HGF-X7을 2주 간격 (Day 0 및 Day 14)으로 투여되고, 90일 후 2주 간격 (Day 90 및 Day 104)으로 반복 투여되었다. 즉, 시험대상자는 각 방문일에 한 다리당 7 mg의 pCK-HGF-X7을 0.25 mg/0.5 ml/site의 양으로 28곳을 투여되는데, Day 0, 14, 90 및 104일에 각각 14 mg을 투여 받아 임상기간 동안 총 56 mg의 pCK-HGF-X7을 투여 받았다.
3.3. 임상평가지표
본 임상시험의 일차평가항목 (primary endpoint)는 샤르코-마리-투스병 환자를 대상으로 약화된 하지근육에 반복투여된 pCK-HGF-X7의 안전성을 확인하는 것이며, 이차평가항목 (secondary endpoint)는 pCK-HGF-X7의 반복치료에 따른 유효성을 확인하는 것이었다.
(1) 안전성 평가
본 임상시험에서의 시험약을 투여 받고 안전성에 대한 평가가 가능한 시험대상자는 안전성 분석의 대상이 된다. 투여 후 270일 동안의 추적 관찰을 통한 이상반응 (중증 이상반응 및 시험약 투여를 중단케 하는 이상반응도 포함)이 그 정도와 시험약과의 관계에 따라 모두 기록이 되었다. 가능한 경우 모든 통계적 분석을 통하여 안전성 분석을 하였다.
1) 이상반응
2) 실험실적 검사 및 활력징후
(2) 유효성 분석
모든 시험대상자의 pCK-HGF-X7 반복투여에 따른 유효성을 투여 후 270일 동안 수집하고, 투여 전 값과 비교 분석한다.
1) 질환의 중증도 변화
- CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2)
- FDS (functional disability scale)
2) 하지 기능의 변화:
- ONLS(overall neuropathy limitation score) leg scale
- 10MWT(10-meter walk test)
3) 하지 근육의 지방 침윤 정도 변화:
- MRI legs
4) 신경 재생 가능성:
- NCV(nerve conduction velocity)
3.4 시험결과
(1) 안전성 시험결과 (이상반응 보고)
본 발명의 pCK-HGF-X7의 투여에 따른 이상반응은 12명의 시험대상자 중 3명에서 4건이 발생하였다. 이 중 약과 관련된 이상반응 (Adverse Drug Reaction)은 시험대상자로부터 보고된 2건으로, 하나는 발목 부종, 다른 하나는 주사 부위 가려움증으로서 모두 경증이었으며 곧 회복되었다. 반면에 중증이상반응 (Serious Adverse Events)은 한 건도 보고되지 않았다.
(2) 유효성 시험결과
1) CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2)
질환의 중증도 변화와 관련된 유효성 지표인 CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2) 결과는 표 4에 나타내었다.
- | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
Sensory symptoms | 2.67±0.89 | 1.75±0.62 | -0.92±0.79 (p = 0.0078) |
Motor symptoms(legs) | 1.25±0.45 | 1.17±0.58 | -0.08±0.29 |
Motor symptoms(arms) | 0.92±0.51 | 0.92±0.51 | 0.00±0.00 |
Pinprick sensibility | 1.92±0.67 | 1.08±0.67 | -0.83±0.39 (p = 0.0020) |
Vibration | 3.08±1.00 | 2.42±0.90 | -0.67±0.49 (p = 0.0078) |
Strength(legs) | 1.17±0.39 | 1.17±0.39 | 0.00±0.00 |
Strength(arms) | 1.08±0.29 | 1.08±0.29 | 0.00±0.00 |
Ulnar CMAP | 0.08±0.29 | 0.17±0.39 | 0.08±0.29 |
Radial SAP amplitude, antidromic testing | 3.42±0.79 | 3.67±0.49 | 0.25±0.45 |
CMTNS-v2 Total Score | 15.58±3.37 | 13.42±2.75 | -2.17±1.11 (p < 0.0001) |
표 4에 나타낸 바와 같이, 질환의 중증도 변화와 관련된 유효성 지표인 CMTNS-v2는, 기저치 15.58점 대비 270일 시점에서 13.42점으로 2.17점이 감소되어 14%의 호전을 보였으며 매우 유의한 감소를 보였다(p < 0.0001). 세부항목을 살펴보면, CMTNS-v2의 9개 항목 중 3개 항목 (감각이상, 통각 예민도, 진동 감각)에서 기저치 대비 유의미한 개선이 관찰되었다. 즉, 감각이상(sensory symptoms)에서 기저치 대비 -0.92±0.79 (p = 0.0078), 통각 예민도(pinprick sensibility)에서 기저치 대비 -0.83±0.39 (p = 0.0020), 진동감각(vibration)에서 기저치 대비 -0.67±0.49 (p = 0.0078)로서 유의한 개선을 보였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 pCK-HGF-X7 DNA는 샤르코-마리-투스 질환을 개선하거나 질병의 진전을 막을 수 있음을 알 수 있었다.
2) FDS (functional disability scale)
- | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
FDS Score | 2.67±0.65 | 2.08±0.79 | -0.58±0.51(p = 0.0156) |
또 다른 유효성 지표인 FDS(functional disability scale)의 경우, 시험대상자 12명 중 7명에서 감소를 보여 증상 개선을 보였으며, 12명의 기저치 대비 270일 시점에서 총 평균 변화량이 0.58±0.51 (p = 0.0156) 감소하여 유의한 개선을 보였다.
3) ONLS (overall neuropathy limitation score) leg scale
- | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
ONLS leg scale Score | 2.08±0.29 | 1.75±0.45 | -0.33±0.49 |
하지 기능의 변화를 나타내는 유효성 지표인 ONLS(overall neuropathy limitation score) leg scale의 경우, 시험대상자 12명 중 4명에서 감소를 보여 개선되었으며, 8명에서는 변화가 없었다. 12명의 기저치 대비 270일 시점에서 총 평균 변화량이 0.33±0.49 감소하여 임상적 개선을 보였다.
4) MRI legs (fat contents in muscle %)
MRI를 통하여 샤르코-마리-투스 질환에 의한 하지 근육의 소실 및 지방 침윤 정도의 변화를 측정하였다. 근육의 소실은 지방의 증가로 이어지기 때문에, 해당 부위의 영상 이미지에서 지방의 퍼센티지를 계산하여 근육 소실의 정도를 측정하였다. 결과는 표 7에 나타내었다.
- | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
Rt. Gastrocnemius(%) | 24.27±22.51 | 24.48±22.30 | 0.22±1.66 |
Rt. Tibialis anterior(%) | 12.70±13.76 | 14.61±13.23 | 1.91±2.34(p = 0.0164) |
표 7에 나타낸 바와 같이, MRI를 통해 측정된 근육 소실의 정도(=지방 증가의 정도)는, 장딴지근육(Gastrocnemius)에서 0.22, 앞정강이근(tibialis anterior)에서는 1.91로서, 이는 이미 알려진 연간 1.8 변화와 유사하였다. 그러나 임상시작 시에 지방의 기저값이 10% 이상으로 측정되었던 환자를 별도로 분석하면, 본 발명의 pCK-HGF-X7을 투여받은 환자들의 장딴지 및 정강이 근육에서 지방의 증가 정도가 (부위에 따라) -0.6% 부터 1.3%로 나타났다.
지방 기저치가 10% 이상 되는 환자에서의 지방증가의 정도가 연간 3%로 알려져 있음을 감안할 때, 이 결과는 본 발명의 pCK-HGF-X7가 근육의 소실을 방지할 수 있음을 시사하는 것임을 알 수 있었다.
5) 10MWT (10 meter walk test)
10 미터를 걷는 속도를 표 8에 나타내었다.
- | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
10MWT: Average Speed (m/sec) | 1.16±0.24 | 1.22±0.18 | 0.06±0.20 |
시험대상자 12명 중 8명에서 속도의 증가를 보여 개선되었으며, 12명의 베이스라인 시점 대비 270일 시점에서 총 평균 변화량이 0.06±0.20 증가하였다.
6) NCV (nerve conduction velocity)
신경전도속도(nerve conduct velocity)를 측정한 결과를 표 9에 나타내었다.
- | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
Right, Median nerve | 19.58±4.44 | 19.67±3.68 | 0.08±1.73 |
Right, Ulnar nerve | 19.58±4.21 | 19.58±3.26 | 0.00±2.04 |
Right, Radial nerve | 20.58±4.50 | 19.33±4.10 | -1.25±2.90 |
Right, Tibial nerve | 9.75±10.80 | 9.50±10.23 | -0.25±1.86 |
Right, Peroneal nerve | 1.58±5.48 | 2.92±6.89 | 1.33±4.31 |
Right, Sural nerve | 3.58±8.39 | 3.42±8.01 | -0.17±0.39 |
Left, Median nerve | 19.58±3.65 | 19.83±3.46 | 0.25±1.36 |
Left, Ulnar nerve | 19.50±3.66 | 19.42±3.85 | -0.08±1.83 |
Left, Radial nerve | 21.92±6.40 | 20.08±5.00 | -1.83±5.54 |
Left, Tibial nerve | 9.92±11.10 | 11.25±10.44 | 1.33±6.21 |
Left, Peroneal nerve | 5.33±8.12 | 4.00±7.39 | -1.33±4.44 |
Left, Sural nerve | 3.58±8.39 | 3.25±7.62 | -0.33±0.78 |
표 9에 나타낸 바와 같이, 신경전도속도는 시험대상자의 우측 비골(peroneal nerve), 좌측 경골 신경(Tibial nerve)에서 증가를 보였으며, 그 외 신경에서는 감소를 보였다.
7) 소결
이번 임상에서는 pCK-HGF-X7의 뛰어난 안전성 및 CMTNS-v2, FDS, ONLS leg scale 등 임상적 지표에서 유의한 결과를 확인하였다. 또한 MRI legs 결과에서 근육손실방지를 시사하였고, 10MWT에서 개선되는 결과를 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 pCK-HGF-X7은 안전성이 높으면서도 샤르코-마리-투스 질환을 개선하는 효과가 우수함을 확인하였다.
실시예 4. pCK-HGF-X7를 이용한 C22 마우스에서의 치료 효능 확인
4.1 실험동물 준비 및 투여
본 발명의 pCK-HGF-X7의 샤르코-마리-투스병 치료 효능을 확인하기 위해, CMT type 1A형의 환자와 같은 표현형을 보이는 형질전환 마우스 동물모델인 C22 모델(5주령)을 사용하였다. 마우스는 Naive 군(wild type, 7마리), Control 군(C22, 9마리), pCK-HGF-X7 처리군(C22, 8마리)로 나누어 실험을 진행하였다. Naive 군은 아무 처리를 하지 않았으며, Control 군 및 pCK-HGF-X7 처리군은 각각 pCK와 pCK-HGF-X7을 600 μg/head의 용량으로 다음과 같이 근육 내 투여하였다.
근육 | 좌/우 | 농도(μg/μl) | volume (μl) | 최종 용량 (μg) |
Bicep femoris | 좌 | 2 | 50 | 100 |
tibialis anterior | 좌 | 2 | 50 | 100 |
gastrocnemius | 좌 | 2 | 50 | 100 |
Bicep femoris | 우 | 2 | 50 | 100 |
tibialis anterior | 우 | 2 | 50 | 100 |
gastrocnemius | 우 | 2 | 50 | 100 |
본 발명자들은 상기와 같은 용량으로 단회 투여를 하고 16주 후 유효성을 확인하기 위해, 신경조직병리학적 분석을 수행하였다.
4.2 신경조직병리학적 분석
마우스의 대퇴신경조직에 대해서 좌골신경 상태를 조사하기 위해 semi-thin section을 진행하였고, axon myelination 상태를 현미경으로 관찰하였다. 실험 결과는 도 10a 및 도 10b에 나타내었다.
분석 결과, Control 군의 경우 Naive 군에 비해 신경 내 demyelination된 병소가 많이 관찰되었다. 반면 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 군의 경우 myelinated axon fiber들이 다수 관찰되었고, large myelinated fiber 수는 증가하고 small unmyelinated fiber 수는 감소하여 전반적으로 수초화(myelination)가 회복되는 양상을 확인할 수 있었다(도 10a).
또한 전자현미경 분석을 통해 sciatic nerve의 수초화(myelination) 정도 및 수초(myelin)의 기형 여부를 관찰하였다. 그 결과, Control 군의 경우 Naive 군에 비해 탈수초화(demyelination)가 확연히 진행되었다. 반면, 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 군의 경우, Naive 군에 근접한 수준의 수초화(myelination) 회복 소견이 관찰되었다(도 10b).
따라서, 본 발명의 pCK-HGF-X7는 CMT type 1A형의 환자와 같은 표현형을 보이는 형질전환 마우스 동물모델 C22 마우스의 신경수초의 회복을 증가시키는 바, 샤르코-마리-투스병의 치료제로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
<110> Helixmith Co., Ltd
<120> Pharmaceutical composition for treating Charcot-Marie-Tooth
disease
<130> PN210104P
<150> KR 10-2021-0040695
<151> 2021-03-29
<150> KR 10-2021-0152171
<151> 2021-11-08
<160> 18
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 7377
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of pCK-HGF-X7
<400> 1
cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtccgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tacgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacacc aatgggcgtg 420
gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480
tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taataacccc gccccgttga 540
cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga 600
accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg 660
accgatccag cctccgcggc cgggaacggt gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga 720
gtgacgtaag taccgcctat agactctata ggcacacccc tttggctctt atgcatgcta 780
tactgttttt ggcttggggc ctatacaccc ccgcttcctt atgctatagg tgatggtata 840
gcttagccta taggtgtggg ttattgacca ttattgacca ctcccctatt ggtgacgata 900
ctttccatta ctaatccata acatggctct ttgccacaac tatctctatt ggctatatgc 960
caatactctg tccttcagag actgacacgg actctgtatt tttacaggat ggggtcccat 1020
ttattattta caaattcaca tatacaacaa cgccgtcccc cgtgcccgca gtttttatta 1080
aacatagcgt gggatctcca cgcgaatctc gggtacgtgt tccggacatg ggctcttctc 1140
cggtagcggc ggagcttcca catccgagcc ctggtcccat gcctccagcg gctcatggtc 1200
gctcggcagc tccttgctcc taacagtgga ggccagactt aggcacagca caatgcccac 1260
caccaccagt gtgccgcaca aggccgtggc ggtagggtat gtgtctgaaa atgagctcgg 1320
agattgggct cgcaccgctg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag aagaagatgc 1380
aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg cggtgctgtt 1440
aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg ccaccagaca 1500
taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca gtcaccgtcc 1560
ttgacacgaa gcttgctagc accatgtggg tgaccaaact cctgccagcc ctgctgctgc 1620
agcatgtcct cctgcatctc ctcctgctcc ccatcgccat cccctatgca gagggacaaa 1680
ggaaaagaag aaatacaatt catgaattca aaaaatcagc aaagactacc ctaatcaaaa 1740
tagatccagc actgaagata aaaaccaaaa aagtgaatac tgcagaccaa tgtgctaata 1800
gatgtactag gaataaagga cttccattca cttgcaaggc ttttgttttt gataaagcaa 1860
gaaaacaatg cctctggttc cccttcaata gcatgtcaag tggagtgaaa aaagaatttg 1920
gccatgaatt tgacctctat gaaaacaaag actacattag aaactgcatc attggtaaag 1980
gacgcagcta caagggaaca gtatctatca ctaagagtgg catcaaatgt cagccctgga 2040
gttccatgat accacacgaa cacaggtaag aacagtatga agaaaagaga tgaagcctct 2100
gtctttttta catgttaaca gtctcatatt agtccttcag aataattcta caatcctaaa 2160
ataacttagc caacttgctg aattgtatta cggcaaggtt tatatgaatt catgactgat 2220
atttagcaaa tgattaatta atatgttaat aaaatgtagc caaaacaata tcttacctta 2280
atgcctcaat ttgtagatct cggtatttgt ggatcctggg taggaaacac atttgaatgg 2340
tatttactaa gatactaaaa tccttggact tcactctaat tttagtgcca tttagaactc 2400
aaggtctcag taaaagtaga aataaagcct gttaacaaaa cacaaactga atattaaaaa 2460
tgtaactgga ttttcaaaga aatgtttact ggtattacct gtagatgtat attctttatt 2520
atgatctttt gtgtaaagtc tggcagacaa atgcaatatc taattgttga gtccaatatc 2580
acaagcagta caaaagtata aaaaagactt ggccttttct aatgtgttaa aatactttat 2640
gctggtaata acactaagag tagggcacta gaaattttaa gtgaagataa tgtgttgcag 2700
ttactgcact caatggctta ctattataaa ccaaaactgg gatcactaag ctccagtcag 2760
tcaaaatgat caaaattatt gaagagaata agcaattctg ttctttatta ggacacagta 2820
gatacagact acaaagtgga gtgtgcttaa taagaggtag catttgttaa gtgtcaatta 2880
ctctattatc ccttggagct tctcaaaata accatataag gtgtaagatg ttaaaggtta 2940
tggttacact cagtgcacag gtaagctaat aggctgagag aagctaaatt acttactggg 3000
gtctcacagt aagaaagtga gctgaagttt cagcccagat ttaactggat tctgggctct 3060
ttattcatgt tacttcatga atctgtttct caattgtgca gaaaaaaggg ggctatttat 3120
aagaaaagca ataaacaaac aagtaatgat ctcaaataag taatgcaaga aatagtgaga 3180
tttcaaaatc agtggcagcg atttctcagt tctgtcctaa gtggccttgc tcaatcacct 3240
gctatctttt agtggagctt tgaaattatg tttcagacaa cttcgattca gttctagaat 3300
gtttgactca gcaaattcac aggctcatct ttctaacttg atggtgaata tggaaattca 3360
gctaaatgga tgttaataaa attcaaacgt tttaaggaca gatggaaatg acagaatttt 3420
aaggtaaaat atatgaagga atataagata aaggattttt ctaccttcag caaaaacata 3480
cccactaatt agtaaaatta ataggcgaaa aaaagttgca tgctcttata ctgtaatgat 3540
tatcatttta aaactagctt tttgccttcg agctatcggg gtaaagacct acaggaaaac 3600
tactgtcgaa atcctcgagg ggaagaaggg ggaccctggt gtttcacaag caatccagag 3660
gtacgctacg aagtctgtga cattcctcag tgttcagaag ttgaatgcat gacctgcaat 3720
ggggagagtt atcgaggtct catggatcat acagaatcag gcaagatttg tcagcgctgg 3780
gatcatcaga caccacaccg gcacaaattc ttgcctgaaa gatatcccga caagggcttt 3840
gatgataatt attgccgcaa tcccgatggc cagccgaggc catggtgcta tactcttgac 3900
cctcacaccc gctgggagta ctgtgcaatt aaaacatgcg ctgacaatac tatgaatgac 3960
actgatgttc ctttggaaac aactgaatgc atccaaggtc aaggagaagg ctacaggggc 4020
actgtcaata ccatttggaa tggaattcca tgtcagcgtt gggattctca gtatcctcac 4080
gagcatgaca tgactcctga aaatttcaag tgcaaggacc tacgagaaaa ttactgccga 4140
aatccagatg ggtctgaatc accctggtgt tttaccactg atccaaacat ccgagttggc 4200
tactgctccc aaattccaaa ctgtgatatg tcacatggac aagattgtta tcgtgggaat 4260
ggcaaaaatt atatgggcaa cttatcccaa acaagatctg gactaacatg ttcaatgtgg 4320
gacaagaaca tggaagactt acatcgtcat atcttctggg aaccagatgc aagtaagctg 4380
aatgagaatt actgccgaaa tccagatgat gatgctcatg gaccctggtg ctacacggga 4440
aatccactca ttccttggga ttattgccct atttctcgtt gtgaaggtga taccacacct 4500
acaatagtca atttagacca tcccgtaata tcttgtgcca aaacgaaaca attgcgagtt 4560
gtaaatggga ttccaacacg aacaaacata ggatggatgg ttagtttgag atacagaaat 4620
aaacatatct gcggaggatc attgataaag gagagttggg ttcttactgc acgacagtgt 4680
ttcccttctc gagacttgaa agattatgaa gcttggcttg gaattcatga tgtccacgga 4740
agaggagatg agaaatgcaa acaggttctc aatgtttccc agctggtata tggccctgaa 4800
ggatcagatc tggttttaat gaagcttgcc aggcctgctg tcctggatga ttttgttagt 4860
acgattgatt tacctaatta tggatgcaca attcctgaaa agaccagttg cagtgtttat 4920
ggctggggct acactggatt gatcaactat gatggcctat tacgagtggc acatctctat 4980
ataatgggaa atgagaaatg cagccagcat catcgaggga aggtgactct gaatgagtct 5040
gaaatatgtg ctggggctga aaagattgga tcaggaccat gtgaggggga ttatggtggc 5100
ccacttgttt gtgagcaaca taaaatgaga atggttcttg gtgtcattgt tcctggtcgt 5160
ggatgtgcca ttccaaatcg tcctggtatt tttgtccgag tagcatatta tgcaaaatgg 5220
atacacaaaa ttattttaac atataaggta ccacagtcat agcggccgct ctagagggcc 5280
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 5340
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 5400
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 5460
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggagtcgaa 5520
attcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg 5580
ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 5640
cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 5700
aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 5760
acgacgagat cctcgccgtc gggcatgctc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 5820
gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 5880
gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 5940
agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 6000
tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 6060
tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 6120
cgcgctgcct cgtcttgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 6180
accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 6240
tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 6300
ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc 6360
ctgcgccatc agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca 6420
accttaccag agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc 6480
cagtctagct atcgccatgt aagcccactg caagctacct gctttctctt tgcgcttgcg 6540
ttttcccttg tccagatagc ccagtagctg acattcatcc ggggtcagca ccgtttctgc 6600
ggactggctt tctacgtgaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 6660
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 6720
ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 6780
ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 6840
actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 6900
caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 6960
gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 7020
ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 7080
cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 7140
cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 7200
acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 7260
ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 7320
gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatg 7377
<210> 2
<211> 3479
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HGF-X7-d1
<400> 2
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctattatg atcttttgtg taaagtctgg cagacaaatg caatatctaa 780
ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa aagacttggc cttttctaat 840
gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag ggcactagaa attttaagtg 900
aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta ttataaacca aaactgggat 960
cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc 1020
tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat 1080
ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg 1140
taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag 1200
ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta 1260
actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa 1320
aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 1380
tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 1440
gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 1500
cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 1560
gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 1620
ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 1680
ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc 1740
tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 1800
aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt 1860
tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg 1920
aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca 1980
agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat 2040
atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat 2100
ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg 2160
acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag 2220
gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg 2280
attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac 2340
gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc 2400
caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag 2460
attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac 2520
taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac 2580
cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac 2640
cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg 2700
aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa 2760
cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta 2820
gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc 2880
ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa 2940
ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc 3000
tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc 3060
tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga 3120
ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac 3180
gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg 3240
tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg 3300
agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg 3360
tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag 3420
catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 3479
<210> 3
<211> 3279
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HGF-X7-d2
<400> 3
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctttacta ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca 780
aaatgatcaa aattattgaa gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat 840
acagactaca aagtggagtg tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc 900
tattatccct tggagcttct caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg 960
ttacactcag tgcacaggta agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc 1020
tcacagtaag aaagtgagct gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta 1080
ttcatgttac ttcatgaatc tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag 1140
aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt 1200
caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct 1260
atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt 1320
tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct 1380
aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag 1440
gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc 1500
actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat 1560
cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac 1620
tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta 1680
cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg 1740
gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat 1800
catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat 1860
gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct 1920
cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact 1980
gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact 2040
gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag 2100
catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat 2160
ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac 2220
tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc 2280
aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac 2340
aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat 2400
gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat 2460
ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca 2520
atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta 2580
aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa 2640
catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc 2700
ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga 2760
ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga 2820
tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg 2880
attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc 2940
tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata 3000
atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa 3060
atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca 3120
cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga 3180
tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata 3240
cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 3279
<210> 4
<211> 3079
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HGF-X7-d3
<400> 4
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctaaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 780
agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 840
gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 900
tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 960
taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1020
tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1080
aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1140
ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1200
caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1260
taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1320
ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1380
gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 1440
agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 1500
tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 1560
ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 1620
caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 1680
cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 1740
tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 1800
tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 1860
aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 1920
tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 1980
ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2040
tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2100
atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2160
tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2220
agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2280
ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2340
cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 2400
aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 2460
gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 2520
ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 2580
ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 2640
gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 2700
atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 2760
caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 2820
ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 2880
gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 2940
aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3000
tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3060
taaggtacca cagtcatag 3079
<210> 5
<211> 2879
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HGF-X7-d4
<400> 5
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tccttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 780
tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 840
gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 900
cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 960
gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 1020
ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 1080
ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc 1140
tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 1200
aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga agaaggggga ccctggtgtt 1260
tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat tcctcagtgt tcagaagttg 1320
aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat ggatcataca gaatcaggca 1380
agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca caaattcttg cctgaaagat 1440
atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc cgatggccag ccgaggccat 1500
ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg tgcaattaaa acatgcgctg 1560
acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac tgaatgcatc caaggtcaag 1620
gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg aattccatgt cagcgttggg 1680
attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa tttcaagtgc aaggacctac 1740
gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc ctggtgtttt accactgatc 1800
caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg tgatatgtca catggacaag 1860
attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt atcccaaaca agatctggac 1920
taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca tcgtcatatc ttctgggaac 1980
cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc agatgatgat gctcatggac 2040
cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta ttgccctatt tctcgttgtg 2100
aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc cgtaatatct tgtgccaaaa 2160
cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac aaacatagga tggatggtta 2220
gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt gataaaggag agttgggttc 2280
ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga ttatgaagct tggcttggaa 2340
ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca ggttctcaat gtttcccagc 2400
tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa gcttgccagg cctgctgtcc 2460
tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg atgcacaatt cctgaaaaga 2520
ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat caactatgat ggcctattac 2580
gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag ccagcatcat cgagggaagg 2640
tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa gattggatca ggaccatgtg 2700
agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa aatgagaatg gttcttggtg 2760
tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc tggtattttt gtccgagtag 2820
catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata taaggtacca cagtcatag 2879
<210> 6
<211> 3679
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HGF-X7
<400> 6
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tcctgggtag gaaacacatt tgaatggtat ttactaagat actaaaatcc 780
ttggacttca ctctaatttt agtgccattt agaactcaag gtctcagtaa aagtagaaat 840
aaagcctgtt aacaaaacac aaactgaata ttaaaaatgt aactggattt tcaaagaaat 900
gtttactggt attacctgta gatgtatatt ctttattatg atcttttgtg taaagtctgg 960
cagacaaatg caatatctaa ttgttgagtc caatatcaca agcagtacaa aagtataaaa 1020
aagacttggc cttttctaat gtgttaaaat actttatgct ggtaataaca ctaagagtag 1080
ggcactagaa attttaagtg aagataatgt gttgcagtta ctgcactcaa tggcttacta 1140
ttataaacca aaactgggat cactaagctc cagtcagtca aaatgatcaa aattattgaa 1200
gagaataagc aattctgttc tttattagga cacagtagat acagactaca aagtggagtg 1260
tgcttaataa gaggtagcat ttgttaagtg tcaattactc tattatccct tggagcttct 1320
caaaataacc atataaggtg taagatgtta aaggttatgg ttacactcag tgcacaggta 1380
agctaatagg ctgagagaag ctaaattact tactggggtc tcacagtaag aaagtgagct 1440
gaagtttcag cccagattta actggattct gggctcttta ttcatgttac ttcatgaatc 1500
tgtttctcaa ttgtgcagaa aaaagggggc tatttataag aaaagcaata aacaaacaag 1560
taatgatctc aaataagtaa tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt 1620
tctcagttct gtcctaagtg gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga 1680
aattatgttt cagacaactt cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg 1740
ctcatctttc taacttgatg gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt 1800
caaacgtttt aaggacagat ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata 1860
taagataaag gatttttcta ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata 1920
ggcgaaaaaa agttgcatgc tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt 1980
gccttcgagc tatcggggta aagacctaca ggaaaactac tgtcgaaatc ctcgagggga 2040
agaaggggga ccctggtgtt tcacaagcaa tccagaggta cgctacgaag tctgtgacat 2100
tcctcagtgt tcagaagttg aatgcatgac ctgcaatggg gagagttatc gaggtctcat 2160
ggatcataca gaatcaggca agatttgtca gcgctgggat catcagacac cacaccggca 2220
caaattcttg cctgaaagat atcccgacaa gggctttgat gataattatt gccgcaatcc 2280
cgatggccag ccgaggccat ggtgctatac tcttgaccct cacacccgct gggagtactg 2340
tgcaattaaa acatgcgctg acaatactat gaatgacact gatgttcctt tggaaacaac 2400
tgaatgcatc caaggtcaag gagaaggcta caggggcact gtcaatacca tttggaatgg 2460
aattccatgt cagcgttggg attctcagta tcctcacgag catgacatga ctcctgaaaa 2520
tttcaagtgc aaggacctac gagaaaatta ctgccgaaat ccagatgggt ctgaatcacc 2580
ctggtgtttt accactgatc caaacatccg agttggctac tgctcccaaa ttccaaactg 2640
tgatatgtca catggacaag attgttatcg tgggaatggc aaaaattata tgggcaactt 2700
atcccaaaca agatctggac taacatgttc aatgtgggac aagaacatgg aagacttaca 2760
tcgtcatatc ttctgggaac cagatgcaag taagctgaat gagaattact gccgaaatcc 2820
agatgatgat gctcatggac cctggtgcta cacgggaaat ccactcattc cttgggatta 2880
ttgccctatt tctcgttgtg aaggtgatac cacacctaca atagtcaatt tagaccatcc 2940
cgtaatatct tgtgccaaaa cgaaacaatt gcgagttgta aatgggattc caacacgaac 3000
aaacatagga tggatggtta gtttgagata cagaaataaa catatctgcg gaggatcatt 3060
gataaaggag agttgggttc ttactgcacg acagtgtttc ccttctcgag acttgaaaga 3120
ttatgaagct tggcttggaa ttcatgatgt ccacggaaga ggagatgaga aatgcaaaca 3180
ggttctcaat gtttcccagc tggtatatgg ccctgaagga tcagatctgg ttttaatgaa 3240
gcttgccagg cctgctgtcc tggatgattt tgttagtacg attgatttac ctaattatgg 3300
atgcacaatt cctgaaaaga ccagttgcag tgtttatggc tggggctaca ctggattgat 3360
caactatgat ggcctattac gagtggcaca tctctatata atgggaaatg agaaatgcag 3420
ccagcatcat cgagggaagg tgactctgaa tgagtctgaa atatgtgctg gggctgaaaa 3480
gattggatca ggaccatgtg agggggatta tggtggccca cttgtttgtg agcaacataa 3540
aatgagaatg gttcttggtg tcattgttcc tggtcgtgga tgtgccattc caaatcgtcc 3600
tggtattttt gtccgagtag catattatgc aaaatggata cacaaaatta ttttaacata 3660
taaggtacca cagtcatag 3679
<210> 7
<211> 2730
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of HGF-X8
<400> 7
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60
ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120
gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180
accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240
ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300
ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360
aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420
tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tccttatgtt tcagacaact tcgattcagt tctagaatgt ttgactcagc 780
aaattcacag gctcatcttt ctaacttgat ggtgaatatg gaaattcagc taaatggatg 840
ttaataaaat tcaaacgttt taaggacaga tggaaatgac agaattttaa ggtaaaatat 900
atgaaggaat ataagataaa ggatttttct accttcagca aaaacatacc cactaattag 960
taaaattaat aggcgaaaaa aagttgcatg ctcttatact gtaatgatta tcattttaaa 1020
actagctttt tgccttcgag ctatcggggt aaagacctac aggaaaacta ctgtcgaaat 1080
cctcgagggg aagaaggggg accctggtgt ttcacaagca atccagaggt acgctacgaa 1140
gtctgtgaca ttcctcagtg ttcagaagtt gaatgcatga cctgcaatgg ggagagttat 1200
cgaggtctca tggatcatac agaatcaggc aagatttgtc agcgctggga tcatcagaca 1260
ccacaccggc acaaattctt gcctgaaaga tatcccgaca agggctttga tgataattat 1320
tgccgcaatc ccgatggcca gccgaggcca tggtgctata ctcttgaccc tcacacccgc 1380
tgggagtact gtgcaattaa aacatgcgct gacaatacta tgaatgacac tgatgttcct 1440
ttggaaacaa ctgaatgcat ccaaggtcaa ggagaaggct acaggggcac tgtcaatacc 1500
atttggaatg gaattccatg tcagcgttgg gattctcagt atcctcacga gcatgacatg 1560
actcctgaaa atttcaagtg caaggaccta cgagaaaatt actgccgaaa tccagatggg 1620
tctgaatcac cctggtgttt taccactgat ccaaacatcc gagttggcta ctgctcccaa 1680
attccaaact gtgatatgtc acatggacaa gattgttatc gtgggaatgg caaaaattat 1740
atgggcaact tatcccaaac aagatctgga ctaacatgtt caatgtggga caagaacatg 1800
gaagacttac atcgtcatat cttctgggaa ccagatgcaa gtaagctgaa tgagaattac 1860
tgccgaaatc cagatgatga tgctcatgga ccctggtgct acacgggaaa tccactcatt 1920
ccttgggatt attgccctat ttctcgttgt gaaggtgata ccacacctac aatagtcaat 1980
ttagaccatc ccgtaatatc ttgtgccaaa acgaaacaat tgcgagttgt aaatgggatt 2040
ccaacacgaa caaacatagg atggatggtt agtttgagat acagaaataa acatatctgc 2100
ggaggatcat tgataaagga gagttgggtt cttactgcac gacagtgttt cccttctcga 2160
gacttgaaag attatgaagc ttggcttgga attcatgatg tccacggaag aggagatgag 2220
aaatgcaaac aggttctcaa tgtttcccag ctggtatatg gccctgaagg atcagatctg 2280
gttttaatga agcttgccag gcctgctgtc ctggatgatt ttgttagtac gattgattta 2340
cctaattatg gatgcacaat tcctgaaaag accagttgca gtgtttatgg ctggggctac 2400
actggattga tcaactatga tggcctatta cgagtggcac atctctatat aatgggaaat 2460
gagaaatgca gccagcatca tcgagggaag gtgactctga atgagtctga aatatgtgct 2520
ggggctgaaa agattggatc aggaccatgt gagggggatt atggtggccc acttgtttgt 2580
gagcaacata aaatgagaat ggttcttggt gtcattgttc ctggtcgtgg atgtgccatt 2640
ccaaatcgtc ctggtatttt tgtccgagta gcatattatg caaaatggat acacaaaatt 2700
attttaacat ataaggtacc acagtcatag 2730
<210> 8
<211> 728
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of flHGF
<400> 8
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr
165 170 175
Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser
180 185 190
Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu
195 200 205
Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp
210 215 220
His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro
225 230 235 240
His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp
245 250 255
Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr
260 265 270
Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys
275 280 285
Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu
290 295 300
Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile
305 310 315 320
Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu
325 330 335
His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn
340 345 350
Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr
355 360 365
Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp
370 375 380
Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met
385 390 395 400
Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp
405 410 415
Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala
420 425 430
Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His
435 440 445
Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys
450 455 460
Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val
485 490 495
Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg
500 505 510
Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp
515 520 525
Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr
530 535 540
Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys
545 550 555 560
Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly
565 570 575
Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp
580 585 590
Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu
595 600 605
Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn
610 615 620
Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu
625 630 635 640
Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu
645 650 655
Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp
660 665 670
Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu
675 680 685
Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly
690 695 700
Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile
705 710 715 720
Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
725
<210> 9
<211> 723
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of dHGF
<400> 9
Met Trp Val Thr Lys Leu Leu Pro Ala Leu Leu Leu Gln His Val Leu
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Pro Ile Ala Ile Pro Tyr Ala Glu Gly Gln
20 25 30
Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys Thr
35 40 45
Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys Val
50 55 60
Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly Leu
65 70 75 80
Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln Cys
85 90 95
Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu Phe
100 105 110
Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn Cys
115 120 125
Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr Lys
130 135 140
Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu His
145 150 155 160
Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Arg
165 170 175
Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr Ser Asn Pro Glu Val Arg
180 185 190
Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser Glu Val Glu Cys Met Thr
195 200 205
Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met Asp His Thr Glu Ser Gly
210 215 220
Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr Pro His Arg His Lys Phe
225 230 235 240
Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe Asp Asp Asn Tyr Cys Arg
245 250 255
Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys Tyr Thr Leu Asp Pro His
260 265 270
Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr Cys Ala Asp Asn Thr Met
275 280 285
Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr Glu Cys Ile Gln Gly Gln
290 295 300
Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr Ile Trp Asn Gly Ile Pro
305 310 315 320
Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His Glu His Asp Met Thr Pro
325 330 335
Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro
340 345 350
Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Ile Arg
355 360 365
Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys Asp Met Ser His Gly Gln
370 375 380
Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Met Gly Asn Leu Ser Gln
385 390 395 400
Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp Asp Lys Asn Met Glu Asp
405 410 415
Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp Ala Ser Lys Leu Asn Glu
420 425 430
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala His Gly Pro Trp Cys Tyr
435 440 445
Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr Cys Pro Ile Ser Arg Cys
450 455 460
Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn Leu Asp His Pro Val Ile
465 470 475 480
Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val Val Asn Gly Ile Pro Thr
485 490 495
Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu Arg Tyr Arg Asn Lys His
500 505 510
Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser Trp Val Leu Thr Ala Arg
515 520 525
Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Ala Trp Leu Gly
530 535 540
Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu Lys Cys Lys Gln Val Leu
545 550 555 560
Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu Gly Ser Asp Leu Val Leu
565 570 575
Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp Asp Phe Val Ser Thr Ile
580 585 590
Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro Glu Lys Thr Ser Cys Ser
595 600 605
Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile Asn Tyr Asp Gly Leu Leu
610 615 620
Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn Glu Lys Cys Ser Gln His
625 630 635 640
His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser Glu Ile Cys Ala Gly Ala
645 650 655
Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly Asp Tyr Gly Gly Pro Leu
660 665 670
Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val Leu Gly Val Ile Val Pro
675 680 685
Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro Gly Ile Phe Val Arg Val
690 695 700
Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile Ile Leu Thr Tyr Lys Val
705 710 715 720
Pro Gln Ser
<210> 10
<211> 2879
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> optimized HGF-X7-d4
<400> 10
atgtgggtca ccaagctgct tcctgctctg ctgctccagc acgtgctgct gcacctgctg 60
ctgctgccta tcgccatccc ctacgccgag ggccagagaa agcggagaaa cacaatccac 120
gagttcaaga aaagcgccaa gacgaccctg atcaagatcg accccgccct gaagatcaag 180
accaagaagg tgaacaccgc cgaccagtgc gccaaccggt gcaccagaaa caagggcctg 240
cctttcacct gtaaagcctt cgtgttcgac aaggccagaa agcagtgtct gtggttcccc 300
ttcaacagca tgagcagcgg cgtgaagaag gaattcggcc acgagtttga tctgtacgag 360
aacaaggact acatcagaaa ttgcatcatc ggcaagggca gaagctacaa gggtacagtg 420
tccatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480
aggtaagaac agtatgaaga aaagagatga agcctctgtc ttttttacat gttaacagtc 540
tcatattagt ccttcagaat aattctacaa tcctaaaata acttagccaa cttgctgaat 600
tgtattacgg caaggtttat atgaattcat gactgatatt tagcaaatga ttaattaata 660
tgttaataaa atgtagccaa aacaatatct taccttaatg cctcaatttg tagatctcgg 720
tatttgtgga tccttataag aaaagcaata aacaaacaag taatgatctc aaataagtaa 780
tgcaagaaat agtgagattt caaaatcagt ggcagcgatt tctcagttct gtcctaagtg 840
gccttgctca atcacctgct atcttttagt ggagctttga aattatgttt cagacaactt 900
cgattcagtt ctagaatgtt tgactcagca aattcacagg ctcatctttc taacttgatg 960
gtgaatatgg aaattcagct aaatggatgt taataaaatt caaacgtttt aaggacagat 1020
ggaaatgaca gaattttaag gtaaaatata tgaaggaata taagataaag gatttttcta 1080
ccttcagcaa aaacataccc actaattagt aaaattaata ggcgaaaaaa agttgcatgc 1140
tcttatactg taatgattat cattttaaaa ctagcttttt gccttcgagc tatcggggta 1200
aagacttgca ggagaactat tgccggaacc ccagaggcga ggaaggcggc ccctggtgct 1260
tcaccagcaa ccccgaggtg agatacgagg tgtgcgacat cccccagtgc agcgaggtcg 1320
agtgcatgac gtgcaacggc gagagctacc ggggcctgat ggaccatacc gagtctggga 1380
agatctgcca gagatgggac caccagacac ctcaccggca caagttcctg ccagaaagat 1440
atcctgacaa gggcttcgac gataactact gcagaaaccc tgacggccaa cctagacctt 1500
ggtgttacac gctggacccc cacaccagat gggaatactg tgctattaag acatgtgccg 1560
acaataccat gaacgacaca gacgtgcctc tcgagacaac agaatgcatc cagggccagg 1620
gagaaggata tagaggtaca gtgaacacca tctggaacgg aattccatgt cagcggtggg 1680
acagccaata cccccacgag cacgatatga cccctgagaa cttcaagtgt aaagacctgc 1740
gggaaaacta ttgcagaaac ccagatggct ctgaatctcc ttggtgcttc acaaccgacc 1800
ctaatatcag agtgggctac tgcagccaga tccccaattg cgacatgagc cacggacagg 1860
actgctacag gggcaatggc aagaactaca tgggaaacct gagccagacc agaagcggcc 1920
tgacctgcag catgtgggat aagaacatgg aagatctgca cagacacatc ttctgggagc 1980
ctgatgcttc taagctgaat gagaactact gccggaaccc tgatgatgat gcccacggcc 2040
cctggtgcta cactggcaac cccctgatcc catgggacta ctgtcctatc agcagatgtg 2100
aaggcgacac cacacctacc atagttaacc tggaccaccc cgtgatcagt tgcgccaaga 2160
ccaagcagct gagagtggtg aacggcatcc ctacaagaac caacatcgga tggatggtgt 2220
ccctgagata cagaaacaag cacatctgcg gcggcagcct gatcaaggaa agctgggtcc 2280
tcaccgccag acagtgtttt cctagccggg acctgaagga ctacgaggcc tggctgggca 2340
tccacgacgt gcacggcaga ggcgacgaga agtgcaagca ggtgcttaac gtgtcccaac 2400
tggtgtacgg ccccgagggc agtgatctgg tgctgatgaa actggccaga cccgccgtgc 2460
tcgacgactt cgtgtctaca atcgacctgc ctaactacgg ctgtaccatc cccgagaaga 2520
ccagctgcag cgtgtacggc tggggctata caggcctcat taactacgac ggactgctga 2580
gagtggctca cctgtacatc atgggcaacg agaaatgctc ccagcaccac agaggcaagg 2640
tgaccctgaa cgagagcgag atctgtgcag gcgccgagaa gatcggcagc ggcccttgcg 2700
agggcgatta cggaggacct ctggtctgcg agcagcacaa gatgcggatg gtcctgggag 2760
tgatcgttcc tggcagagga tgtgccatcc ctaacagacc aggaatcttt gtgcgggtgg 2820
cctactacgc caagtggatc cacaaaatca tcctgaccta caaggtgcca cagtcttga 2879
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> d1 forward
<400> 11
tctcggtatt tgtggatcct attatgatct tttgtgtaaa 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> d1 reverse
<400> 12
tttacacaaa agatcataat aggatccaca aataccgaga 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> d2 forward
<400> 13
tctcggtatt tgtggatcct ttactattat aaaccaaaac 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> d2 reverse
<400> 14
gttttggttt ataatagtaa aggatccaca aataccgaga 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> d3 forward
<400> 15
tctcggtatt tgtggatcct aaggtgtaag atgttaaagg 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> d3 reverse
<400> 16
cctttaacat cttacacctt aggatccaca aataccgaga 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> d4 forward
<400> 17
tctcggtatt tgtggatcct tataagaaaa gcaataaaca 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> d4 reverse
<400> 18
tgtttattgc ttttcttata aggatccaca aataccgaga 40
Claims (14)
- 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 naked DNA 또는 유전자 전달 시스템에 포함된 것인, 약제학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 유전자 전달 시스템은 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pCK인, 약제학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus, AAV) 벡터인, 약제학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 serotype AAV1, AAV2, AAV5, 및 AAV6로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체와 동일한 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는, 축퇴성 뉴클레오타이드 서열인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 전장 간세포 성장인자(full-length Hepatocyte Growth Factor, flHGF) 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 결실 변이 간세포 성장인자(deleted variant Hepatocyte Growth Factor, dHGF)인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1(pCK-HGF-X7), 서열번호 5(HGF-X7-d4), 서열번호 6(HGF-X7), 또는 서열번호 10 (optimized HGF-X7-d4)의 염기서열을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대상체에 3주 이내의 간격으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 0.001 내지 100 mg/1개체/1일의 투여량으로 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대상체에 3주 이내의 간격으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 다리당 0.0005 내지 50 mg의 투여량으로 근육 내 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 1 주기(1 cycle) 이상 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 주기 사이의 간격은 2개월 내지 6개월인, 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 1 주기는 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 총 0.2 내지 200 mg/1개체의 투여량이 투여되는 것을 1 주기로 하고, 주기 간 60 내지 120일 간격을 두고 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020210040695 | 2021-03-29 | ||
KR20210040695 | 2021-03-29 | ||
KR20210152171 | 2021-11-08 | ||
KR1020210152171 | 2021-11-08 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220135215A true KR20220135215A (ko) | 2022-10-06 |
Family
ID=83459335
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020220039189A KR20220135215A (ko) | 2021-03-29 | 2022-03-29 | 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR20220135215A (ko) |
WO (1) | WO2022211454A1 (ko) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100562824B1 (ko) * | 2002-03-20 | 2006-03-23 | 주식회사 바이로메드 | 유전자 발현효율이 높으며 간세포 성장인자의 두 가지이형체를 동시에 발현하는 하이브리드 간세포 성장인자유전자 |
MX2014005318A (es) * | 2011-11-03 | 2015-01-14 | Viromed Co Ltd | Terapia genica para la neuropatia diabetica usando una isoforma hgf. |
KR101872105B1 (ko) * | 2016-09-05 | 2018-06-27 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 샤르코 마리 투스병 치료용 약학 조성물 |
EP3733855A4 (en) * | 2017-12-29 | 2021-03-03 | Helixmith Co., Ltd | ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) VECTOR INCLUDING A HYBRID HGF GENE INTRODUCED INTO ITS BREAST |
-
2022
- 2022-03-29 WO PCT/KR2022/004416 patent/WO2022211454A1/ko active Application Filing
- 2022-03-29 KR KR1020220039189A patent/KR20220135215A/ko unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Kim et al., J Korean Society for Clinical Neurophysiology 7(2):65-74, 2005 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2022211454A1 (ko) | 2022-10-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2743398C2 (ru) | Генная терапия нейродегенеративных нарушений | |
JP4279141B2 (ja) | 神経変性疾患治療のための組成物及び方法 | |
US10017553B2 (en) | Splice variants of GDNF and uses thereof | |
AU2002326163A1 (en) | Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases | |
JP2005516949A (ja) | Gdnfの骨格筋へのアデノ随伴ウイルス媒介性のデリバリー | |
KR101817665B1 (ko) | Hgf 이형체를 이용한 당뇨병성 신경병증의 유전자 치료 | |
CN108368521A (zh) | Glp-1和其在用于治疗代谢疾病的组合物中的用途 | |
KR20190020745A (ko) | Abc4a를 발현시키기 위한 이중 중첩 아데노-관련 바이러스 벡터 시스템 | |
KR101860452B1 (ko) | 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체를 이용한 근위축성 측삭 경화증 예방 또는 치료용 조성물 | |
CN116113702A (zh) | 一种融合蛋白及其用途 | |
KR20170036085A (ko) | 포유동물 rpe65의 높은 아소머로하이드롤라아제 활성 돌연변이 | |
EP3419673B1 (en) | Gene therapy for the treatment of a disease of retinal cone cells | |
KR20200074167A (ko) | 가바펜티노이드로부터의 간섭이 감소되고 hgf 이형체들을 발현하는 dna 컨스트럭트를 이용하는 신경병증의 치료 | |
RU2762367C1 (ru) | Вектор на основе аденоассоциированного вируса (aav), имеющий гибридный ген hgf, введенный в него | |
KR20210158859A (ko) | Ube3a 유전자 및 발현 카세트 및 이들의 용도 | |
KR20220135215A (ko) | 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 | |
KR20220003566A (ko) | 신규한 유형의 효소 조성물 | |
CA2561593A1 (en) | Antiobesity drug | |
WO2007122976A1 (ja) | ポリグルタミン病の治療剤又は発病抑制剤 | |
CA2464887A1 (en) | Methods and compositions for treating parkinson's disease | |
CN110191954B (zh) | 用于治疗涉及rdh12的病症和疾病的方法和组合物 | |
KR20230029624A (ko) | 유전자 치료를 위한 글루코스-6-포스파타제(G6Pase-a)를 코딩하는 벡터 | |
CA3227584A1 (en) | Aqp1 gene therapy to prevent radiation induced salivary hypofunction |