WO2022211454A1 - 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents
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- A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
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- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Definitions
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease comprising two or more isoforms of hepatocyte growth factor, or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
- Charcot-Marie-Tooth disease one of rare genetic diseases, is a disease in which motor and sensory nerves are damaged due to a specific gene mutation.
- Charcot-Marie-Tooth disease is a typical inherited peripheral neuropathy and has the highest incidence among rare diseases that occur in about 1 in 2,500 people. is a symptom Charcot-Marie-Tooth disease is also called hereditary motor sensory neuropathy, abbreviated as CMT.
- hereditary peripheral neuropathy includes hereditary neuropathy with liability to pressure palsy, hereditary motor neuropathy, and hereditary sensory and autonomic neuropathy.
- CMT1 related genes include PMP22, MPZ, EGR2, LITAE, NEFL, etc.
- CMT2 related genes include MFN2, RAB7, etc.
- CMT4 related genes include GDAP1, MTMR2, SBF2, etc.
- the present inventors made intensive research efforts to develop a therapeutic agent for Charcot-Marie-Tooth disease.
- Charcot-Marie-Tooth disease disease model animals were administered a plasmid vector and a viral vector containing a polynucleotide encoding a heterozygous hepatocyte growth factor.
- the present invention was completed.
- an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising two or more hepatocyte growth factor isoforms, or polynucleotide sequences encoding the variants as an active ingredient. .
- Another object of the present invention is to provide a method for treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising two or more hepatocyte growth factor variants, or a polynucleotide sequence encoding the variants, as an active ingredient provides
- HGF hepatocyte growth factor
- the hepatocyte growth factor isoform is at least 80%, preferably 90%, 95%, or refers to HGF polypeptides having at least 99% identical amino acid sequence.
- the HGF isoform has a meaning encompassing both the normal form or wild type of HGF, and various variants of HGF (eg, splicing mutant and deletion mutant).
- the two or more hepatocyte growth factor isoforms of the present invention include full-length HGF (flHGF) and deleted variant HGF (dHGF).
- flHGF full-length HGF
- dHGF deleted variant HGF
- flHGF refers to the amino acid sequence 1-728 of an animal, preferably a mammal, more preferably a human HGF.
- the term "dHGF” refers to a defective variant of the HGF protein produced by selective splicing of the HGF gene in an animal, preferably a mammal, more preferably the first large size of the alpha chain from the full-length HGF sequence.
- dHGF refers to human HGF consisting of 723 amino acids in which 5 amino acids (F, L, P, S and S) are deleted in the ringle domain.
- the flHGF consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
- the dHGF consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
- the isoforms of HGF of the present invention are encoded by a separate nucleotide sequence or encoded by a single polynucleotide.
- the pharmaceutical composition of the present invention includes two or more polynucleotides when different types of isoforms of HGF are encoded by separate polynucleotides, and different types of isoforms of HGF are encoded by a single polynucleotide When present, it includes one or more polynucleotides comprising the single polynucleotide.
- the polynucleotides of the invention may be operably linked to one or more regulatory sequences (eg, promoters or enhancers) that control the expression of HGF isoforms.
- an expression cassette can be constructed in two ways.
- an expression cassette is constructed by linking an expression control sequence to a CDS (coding sequence) for each of the isoforms.
- an expression cassette is constructed using an internal ribosomal entry site (IRES) or 2A peptide in the same manner as “expression control sequence-first isoform CDS-IRES-second variant CDS-transcriptional termination sequence”. do.
- IRES allows two or more genes of interest to be expressed in the same construct by allowing translation of the gene to begin at the IRES sequence.
- the polynucleotides encoding all of the two or more types of isoforms are operably linked to a single expression control sequence.
- HGF isoforms may be encoded by a hybrid HGF gene that simultaneously expresses two or more different types of isoforms, for example, flHGF and dHGF.
- the hybrid HGF gene comprises a cDNA corresponding to exons 1 to 18 of human HGF, and a fragment of intron 4 or intron 4 of the human HGF gene inserted between exons 4 and 5 of the cDNA.
- a fragment of intron 4 or intron 4 of the human HGF gene inserted between exons 4 and 5 of the cDNA.
- the '-' is only an expression for distinguishing each exon and intron fragment, and does not indicate a specific structure.
- the polynucleotide encoding the two or more isoforms of HGF comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2 to SEQ ID NO: 7.
- the polynucleotide encoding the at least two isoforms of HGF is SEQ ID NO: 1 (pCK-HGF-X7), SEQ ID NO: 5 (HGF-X7-d4) or SEQ ID NO: 6 (HGF) -X7).
- HGF isoform and "hybrid HGF gene (eg, HGF-X7)" of the present invention have been reported in WO 2003/078568, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. is inserted
- the amino acid or nucleotide sequence of the HGF isoform usable in the present invention also includes an amino acid or nucleotide sequence that shows substantial identity to the sequence of the HGF isoform.
- the substantial identity is at least 80% when the amino acid or nucleotide sequence of the HGF isoform and any other sequence are aligned to maximum correspondence and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art.
- % homology used in the present invention can be calculated, for example, as follows.
- the sequence to be analyzed is aligned with the target sequence using the CLUSTAL W algorithm (Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22:4673-4680 (1994)). Comparisons are made against the window matching the shortest of the adjusted sequences.
- the shortest of the adjusted sequences may in some cases be the target sequence. In other cases, the sequence to be analyzed may constitute the shortest of the adjusted sequences.
- the bases of amino acid residues or nucleotides at each position are compared, and the ratio of the positions of the sequence to be analyzed having the same identity with the target sequence is reported as % homology.
- the gene encoding the HGF isoforms (flHGF and dHGF) of the present invention is a protein expressed from a coding region due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in an organism to express the flHGF and dHGF genes.
- the gene encoding the HGF isoform of the present invention may include a degenerate nucleotide sequence encoding the HGF isoform (flHGF and dHGF) having the same amino acid sequence while having different nucleotide sequences.
- nucleotide sequences have at least 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, or 79% homology due to codon degeneracy, more preferably is at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, or 89% homology, even more preferably at least 90%, 91%, 92% , 93%, or 94% homology, most preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homology.
- nucleotides may be made in the region other than the coding region (eg, intron region) within the range that does not affect the expression of the gene, and such modified genes are also within the scope of the present invention. included in
- the hybrid HGF gene is a nucleotide of SEQ ID NO: 5 (HGF-X7-d4), SEQ ID NO: 6 (HGF-X7), or SEQ ID NO: 10 (optimized HGF-X7-d4) contains sequence.
- the nucleotide sequences of these sequences are different from each other, the nucleotide sequence of the portion (intron region) excluding the coding region is different, and the nucleotide sequence of the coding region (exon region) is the same. It encodes flHGF and dHGF proteins with amino acid sequences.
- the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10 (optimized HGF-X7-d4) has about 82% sequence homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 (HGF-X7-d4), It encodes flHGF and dHGF proteins with identical amino acid sequences.
- the hybrid HGF gene of the present invention also includes a polynucleotide having substantially the same nucleotide sequence as the hybrid HGF gene of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10 and a fragment of the gene.
- Substantially identical polynucleotides mean at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, or 89% homology, more preferably at least 90%, 91 %, 92%, 93%, or 94% homology, most preferably at least 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homology, or 100% homology. do.
- nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is limited due to the large nucleotide size in insertion into the AAV vector.
- the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 or 10 of the present invention corresponds to a sequence showing a significantly increased gene transfer efficiency among sequences downsized by removing some of the sequences corresponding to the intron 4 fragment of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 described above do.
- the gene is significantly elevated compared to the case where HGF-X8 of SEQ ID NO: 7 is introduced and used in the AAV vector. It shows delivery efficiency and expression efficiency.
- a modified nucleotide sequence having a reduced size derived from the sequence of SEQ ID NO: 6, including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 (HGF-X7-d4) of the present invention has been reported in WO 2019/132624, and the disclosure of the patent document The contents are incorporated herein by reference.
- the polynucleotide sequence encoding the variant is a nucleotide included in naked DNA or a gene delivery system.
- the composition of the present invention can be applied in vivo through various delivery methods commonly known in the field of gene therapy, and the gene delivery system is a plasmid vector or a viral vector, but is not limited thereto.
- a plasmid can be used as a carrier for carrying the polynucleotide of the present invention.
- the polynucleotide contained in the plasmid (vector) is preferably present in a suitable expression cassette.
- the polynucleotide in the expression cassette is operably linked to a promoter.
- operably linked refers to a functional association between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoter, signal sequence or transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the nucleic acid Expression control sequences control the transcription and/or translation of the other nucleic acid sequences.
- a nucleic acid expression control sequence eg, an array of promoter, signal sequence or transcriptional regulator binding sites
- the promoter bound to the polynucleotide sequence can operate in an animal cell according to one embodiment, a mammalian cell according to another embodiment, and a human cell according to a specific embodiment to regulate transcription of a nucleotide sequence, promoters derived from mammalian viruses and promoters derived from the genome of mammalian cells.
- the promoter is, for example, a cytomegalo virus (CMV) promoter, an adenovirus late promoter, a vaccinia virus 7.5K promoter, an SV40 promoter, a tk promoter of HSV, a RSV promoter, an EF1 alpha promoter, a metallotionine promoter, a beta-actin promoter, human IL-2 gene promoter, human IFN gene promoter, human IL-4 gene promoter, human lymphotoxin gene promoter, and human GM-CSF gene promoter, but are not limited thereto.
- CMV cytomegalo virus
- the expression cassette used in the present invention may include a polyanenylation sequence, for example, bovine growth hormone terminator (Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), derived from SV40. poly adenylation sequence (Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 poly A (Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870- 1876 (1998)), beta-globin poly A (Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK polyA (Cole, C. N. and T.
- the vector of the present invention is a plasmid vector, and according to a specific embodiment of the present invention, the vector of the present invention may use a pCK, pCP, pVAX1 or pCY vector, and a specific embodiment of the present invention According to an example, a pCK vector may be used.
- Recombinant vectors comprising a single polynucleotide expressing two or more isoforms of HGF using the pCK vector are described in detail in WO 2000/040737 and WO 2003/078568, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. The specification is incorporated by reference.
- Retroviruses are widely used as gene delivery vectors because they insert their genes into the host genome, can transport a large amount of foreign genetic material, and have a wide spectrum of cells that can infect.
- the polynucleotide sequence of the present invention is inserted into the retrovirus genome instead of the retrovirus sequence to produce a replication-incompetent virus.
- a packaging cell line containing the gag, pol and env genes but lacking the long terminal repeat (LTR) and ⁇ sequences was constructed (Mann et al., Cell, 33:153-159 (1983)).
- a recombinant plasmid comprising the polynucleotide sequence of the present invention, LTR and ⁇ sequence is introduced into the cell line, the ⁇ sequence enables production of an RNA transcript of the recombinant plasmid, which is packaged into a virus, and the virus is excreted into the medium (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)).
- the medium containing the recombinant retrovirus is collected, concentrated and used as a gene delivery system.
- Adenovirus has been widely used as a gene delivery vector because of its medium genome size, ease of manipulation, high titer, wide range of target cells, and excellent infectivity. Both ends of the genome contain 100-200 bp inverted terminal repeat (ITR), which is an essential cis-element for DNA replication and packaging.
- ITR inverted terminal repeat
- the E1 regions of the genome (E1A and E1B) encode proteins that regulate transcription and transcription of host cell genes.
- the E2 region (E2A and E2B) encodes proteins involved in viral DNA replication.
- the polynucleotide sequence of the present invention is preferably inserted into the deleted E1 region (E1A region and/or E1B region) or the E3 region.
- the nucleotide sequence may be inserted into the deleted E4 region.
- the term "deletion" in relation to a viral genome sequence has a meaning including a partial deletion as well as a complete deletion of the corresponding sequence.
- adenovirus can pack up to about 105% of the wild-type genome, it can additionally package about 2 kb (Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739 (1987)). Accordingly, the above-described foreign sequence inserted into the adenovirus may additionally bind to the genome of the adenovirus.
- Adenoviruses have 42 different serotypes and subgroups of A-F. Among them, adenovirus type 5 belonging to subgroup C is the most preferred starting material for obtaining the adenoviral vector of the present invention. Biochemical and genetic information for adenovirus type 5 is well known. Foreign genes carried by adenoviruses are replicated in the same manner as episomes, and thus have very low genetic toxicity to host cells. Therefore, gene therapy using the adenoviral gene delivery system is considered to be safe.
- Adeno-associated virus (AAV) vectors are suitable as the gene delivery system of the present invention because they can infect non-dividing cells and have the ability to infect various types of cells. Detailed descriptions of the preparation and use of AAV vectors are disclosed in detail in US Pat. Nos. 5,139,941 and 4,797,368.
- a study of AAV as a gene delivery system is described in LaFace et al, Viology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994) and Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37 (1995).
- AAV viruses are plasmids containing a target gene sequence flanked by two AAV terminal repeats (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988); and Samulski et al., J. Virol., 63:3822- 3828 (1989)) and an expression plasmid containing the wild-type AAV coding sequence without terminal repeats (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945 (1991)) were co-administered. It is prepared by transfection.
- the vector of the present invention is a viral vector, and according to a specific embodiment of the present invention, the viral vector of the present invention is an adeno-associated virus (AAV).
- AAV adeno-associated virus
- the AAV vector of the present invention can be used to deliver a foreign gene sequence into a cell according to various viral infection methods known in the art, and the method is not particularly limited.
- the AAV vector of the present invention has an AAV serotype selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 and AAV16.
- the AAV may be selected from the group consisting of serotypes AAV1, AAV2, AAV5, and AAV6.
- a recombinant vector comprising a single polynucleotide expressing two or more isoforms of HGF using the AAV is described in detail in WO 2019/132624A1.
- viral vectors can also be used to deliver the polynucleotide sequences of the invention in vivo.
- Vaccinia virus Panhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer.
- Liposomes are automatically formed by phospholipids dispersed in an aqueous phase. Examples of the successful delivery of foreign DNA molecules into cells using liposomes are described by Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982) and Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987).
- the liposome containing the polynucleotide sequence of the present invention interacts with the cell through mechanisms such as endocytosis, adsorption to the cell surface, or fusion with the plasma cell membrane to deliver the polynucleotide sequence into the cell.
- the polynucleotide sequence of the present invention when mounted on a naked recombinant DNA molecule or plasmid (vector), the microinjection method (Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980); and Harland and Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), calcium phosphate precipitation (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456 (1973); and Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745 -2752 (1987)), electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982); and Tur-Kaspa et al., Mol.
- the microinjection method Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980); and Harland and Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)
- calcium phosphate precipitation Graham, F.L. e
- the foreign gene sequence can be transferred into a cell according to various viral infection methods known in the art, and the method is not particularly limited.
- the polynucleotide sequence of the present invention can be transformed into an appropriate host cell, for example, a mammalian cell such as 293T or an insect cell, using the AAV vector described above, and the transformed host Using cells, DNA of the gene of the present invention can be cloned in large quantities or proteins can be mass-produced.
- an appropriate host cell for example, a mammalian cell such as 293T or an insect cell
- prevention refers to any act of inhibiting Charcot-Marie-Tooth disease by administering the composition of the present invention.
- treatment refers to delaying or inhibiting the progression/development of Charcot-Marie-Tooth disease; (b) alleviation of Charcot-Marie-Tooth disease; and (c) removal of Charcot-Marie-Tooth disease.
- composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
- compositions of the present invention are commonly used in formulation, and include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate. , microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like. not.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like, in addition to the above components.
- a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, a talct, a talct, a talct, a stevia, glycerin, glycerin, glycerin,
- the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered parenterally, for example, intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intrathecal administration, intraventricular administration (intracerebroventricular injection), brain administration (intracerebral injection) or local It can be administered using administration.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated and administered by injection.
- a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on factors such as formulation method, administration mode, age, weight, sex, degree of disease symptoms, administration time, administration route, excretion rate, and response sensitivity of the patient, An ordinarily skilled physician can readily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
- the pharmaceutical composition is administered to the subject in a dosage of 0.001 to 100 mg/individual/day based on the amount of polynucleotide at intervals of 3 weeks or less.
- the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention when the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is an HGF variant or a polynucleotide encoding the same, it is administered in a dosage of 0.001 to 100 mg.
- the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is an AAV vector
- the administration interval is, for example, 3 days, 5 days, 6 days, 7 days, 9 days, 10 days, 12 days, 14 days, 15 days, 18 days, 20 days, or 21 days. work, but is not limited thereto.
- the dosage is 0.001 to 100 mg/individual/day, 0.001 to 90 mg/individual/day, 0.001 to 80 mg/individual/day, based on the amount of polynucleotide 1 day, 0.001 to 70 mg/individual/day, 0.001 to 60 mg/individual/day, 0.001 to 50 mg/individual/day, 0.001 to 40 mg/individual/day, 0.001 to 30 mg/individual/day, 0.001 to 20 mg/individual/day, 0.001 to 15 mg/individual/day, 0.001 to 14 mg/individual/day, or 0.001 to 10 mg/individual/day It is administered in a daily dose, but is not limited thereto. According to an embodiment of the present invention, the dosage is 14 mg/individual/day.
- the pharmaceutical composition is intramuscularly administered to the subject at a dosage of 0.0005 to 50 mg per leg per day based on the amount of polynucleotide at intervals of 3 weeks or less.
- the dosage per leg is 0.0005 to 50 mg, 0.0005 to 45 mg, 0.0005 to 40 mg, 0.0005 to 35 mg, 0.0005 to 30 mg, 0.0005 to 25 mg, 0.0005 to 20 mg, 0.0005 to 18 mg, 0.0005 to 16 mg , 0.0005 to 15 mg, 0.0005 to 14 mg, 0.0005 to 13 mg, 0.0005 to 12 mg, 0.0005 to 11 mg, 0.0005 to 10 mg, 0.0005 to 9 mg, 0.0005 to 8 mg, 0.0005 to 7 mg, 0.0005 to 6 mg , or 0.0005 to 5 mg, but is not limited thereto.
- the dosage is 7 mg per leg per day.
- each dose when the pharmaceutical composition of the present invention is administered more than once, each dose may be the same or different each time.
- the subject is a mammal, and more specifically, a human, a mouse, a rat, a guinea pig, a dog, a cat, a horse, a cow, a pig, a monkey, a chimpanzee, a baboon, or a rhesus monkey (Macaca mulatta), but is not limited thereto.
- the pharmaceutical composition is administered for one cycle or more.
- the one cycle may include one or more administration times.
- the interval between the cycles is 1 month to 6 months. More specifically, the interval between the cycles is, for example, 30 days to 40 days, 30 days to 50 days, 30 days to 60 days, 30 days to 70 days, 30 days to 80 days, 30 days to 90 days, 30 days. to 100 days, 30 days to 120 days, 30 days to 150 days, 30 days to 180 days, 60 days to 70 days, 60 days to 80 days, 60 days to 90 days, 60 days to 100 days, 60 days to 120 days days days, 30 days, 40 days, 50 days, 60 days, 70 days, 80 days, 90 days, 100 days, 120 days, 150 days, or 180 days, but is not limited thereto.
- one cycle is a total dose of 0.002 to 200 mg/individual administered based on the amount of polynucleotide, and is administered at intervals of 60 to 120 days between cycles.
- one cycle is based on administration of a total dose of 0.2 to 200 mg/individual based on the amount of polynucleotide, it may include one or more administration times. For example, if the administered dose is 10 mg/individual/day, a total dose of 30 mg/individual is administered for 3 days at 2-week intervals as one cycle.
- the first cycle was administered at a dose of 14 mg/individual/day at intervals of 2 weeks for 2 days. That is, a dose of 28 mg / 1 individual is administered as one cycle, and has been administered with an interval of 90 days between cycles, but is not limited thereto.
- the pharmaceutical composition of the present invention improves CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2), which is an efficacy index related to changes in the severity of the disease in patients with Charcot-Marie-Tooth disease. has the effect of making CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2), which is an efficacy index related to changes in the severity of the disease in patients with Charcot-Marie-Tooth disease. has the effect of making CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2), which is an efficacy index related to changes in the severity of the disease in patients with Charcot-Marie-Tooth disease. has the effect of making CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2), which is an efficacy index related to changes in the severity of the disease in patients with Charcot-Marie-Tooth disease. has the effect of making CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2), which is an efficacy index related to changes in the severity
- the CMTNS-v2 includes paresthesia, pain sensitivity, vibration sensation, upper extremity muscle strength, lower extremity muscle strength, motor nerve action potential of the median nerve, sensory nerve action potential of the ulnar nerve, upper extremity motor symptoms, and lower extremity motor symptoms.
- the items of the improved CMTNS-v2 include, but are not limited to, paresthesia, pain sensitivity, and vibration sensation.
- the pharmaceutical composition of the present invention has an effect of improving the functional disability scale (FDS), which is an efficacy index related to changes in the severity of the disease in patients with Charcot-Marie-Tooth disease.
- FDS functional disability scale
- the FDS includes the following 9 levels of scale:
- the pharmaceutical composition of the present invention has an effect of improving the overall neuropathy limitation score (ONLS) leg scale, which is an effective index indicating changes in lower extremity function in patients with Charcot-Marie-Tooth disease.
- ONLS overall neuropathy limitation score
- the pharmaceutical composition of the present invention has an effect of improving 10MWT (10 meter walk test), which is an effective index indicating a change in lower extremity function in patients with Charcot-Marie-Tooth disease.
- the 10MWT is an index used to determine the degree of performance of mobility, gait, and vestibular system functions, and measures steps per second (m/sec).
- the pharmaceutical composition of the present invention is effective in preventing loss of lower extremity muscles and reducing fat infiltration in patients with Charcot-Marie-Tooth disease.
- the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in a unit dosage form by being formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person of ordinary skill in the art to which the present invention pertains. or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
- the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in oil or an aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.
- the present invention provides a method for treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
- the treatment method according to another aspect of the present invention is a method including the step of administering the above-described pharmaceutical composition, overlapping content is omitted in order to avoid excessive complexity of the description of the present specification.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease, comprising two or more hepatocyte growth factor variants, or a polynucleotide sequence encoding the variant, as an active ingredient.
- a pharmaceutical composition for preventing or treating Charcot-Marie-Tooth disease comprising two or more hepatocyte growth factor variants, or a polynucleotide sequence encoding the variant, as an active ingredient.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for preparing downsizing variants of HGF-X7 from pCK-HGF-X7.
- FIG. 2 is a schematic diagram showing a method for cloning downsizing variants of HGF-X7 into a pCA vector.
- Example 3 is a graph showing the measurement of body weight after administration of the composition of the present invention according to Example 2.
- Example 4 is a view showing the results of the rotarod experiment after administration of the composition of the present invention according to Example 2.
- Figure 5 is a diagram showing the measurement results of Distal CMAP in the motor nerve conduction test after administration of the composition of the present invention.
- Figure 6 is a diagram showing the results of proximal CMAP measurement in the motor nerve conduction test after administration of the composition of the present invention.
- FIG. 7 is a diagram showing the MNCV measurement results in the motor nerve conduction test after administration of the composition of the present invention.
- FIG. 8 is a diagram showing the SNCV measurement results in a sensory nerve conduction test after administration of the composition of the present invention.
- FIG. 9 is a view showing the histological findings of the mouse femoral nerve fibers to confirm the degree of myelination of the nerve fibers of the mouse femoral nerve tissue after administration of the drug of the present invention.
- Figure 10a is a diagram showing a semi-thin optical micrograph of the femoral nerve tissue of a C22 mouse treated with pCK-HGF-X7 of the present invention (x400).
- % used to indicate the concentration of a specific substance is (weight/weight) % for solid/solid, (weight/volume) % for solid/liquid, and Liquid/liquid is (vol/vol) %.
- the HGF-X7-d4 fragment of SEQ ID NO: 5 was obtained by treatment with ClaI and SalI restriction enzymes in the pCK-HGF-X7-d4.
- the pCA vector AAV Helper-Free System, Agilent, USA
- ClaI and SalI restriction enzymes were also treated with ClaI and SalI restriction enzymes and ligated with the HGF-X7-d4 fragment to construct pCA-HGF-X7-d4.
- AAV 293T cells
- ATCC 293T cells
- the plasmid DNA pCA-HGF-X7-d4 and the DNA required for AAV production, pHelper and pAAV-RC were transferred to the 293T cells (transfection), and AAV was collected 3 days later. did.
- the collected AAV was titer measured using a titration kit (AAVpro Titration Kit, Takara, JP).
- the AAV was constructed using serotype AAV1.
- pCK-HGF-X7 as "VM202”
- AAV1-pCA-HGF-X7-d4 as "AAV1-HGF”
- pCA-HGF-X7-d4 as AAV1- constructed using a pCA vector without cloning.
- pCA-MCS was named "AAV1-MCS” and used in the following examples.
- the C22 model a transgenic mouse animal model showing the same phenotype as a CMT type 1A patient, was used.
- the experimental group was classified as follows, and the experimental results were summed up.
- AAV1-MCS AAV1-MCS of WO2019/132624A1
- AAV1-HGF AAV1-pCA-HGF-X7-d4 of WO2019/132624A1
- Rotarod test method Behavioral evaluation according to drug administration was performed using the Rotarod test method. Before drug administration, adaptive training and testing of the experimental animals were conducted for this experimental method, and the drug efficacy was evaluated by conducting a test at intervals of 2 weeks after drug administration.
- the Rotarod test method is to place a mouse on a rotating long cylinder and measure how long it lasts without falling on it. set in seconds.
- the overall exercise ability is improved in the group (C22 Ex1) administered with the composition (AAV-HGF) of the present invention 1*10 9 (vg/head) compared to the C22 Con group.
- it showed significantly improved exercise capacity at 2 weeks of administration.
- the group administered with 1*10 10 (vg/head) or 1*10 11 (vg/head) it was confirmed that the exercise ability was improved compared to the C22 Con group until the early stage after administration, and 1*10 11 (vg/head) head) showed significantly improved exercise capacity at the 8th week of administration.
- mice After drug administration, electrophysiological examination was performed on the hind legs of mice. In order to perform an accurate electrophysiological examination, all hairs from the back to the feet of the mice were removed before measurement. Mice were under respiratory anesthesia by supplying 1.5% isoflurane using an anesthetic cone. For measurement, compound muscle action potential (CMAP) and nerve conduction velocity (NCV) were measured using a Nicolet VikingQuest device (Natus Medical, San Carlos, CA, USA). The experiment was conducted twice, and the mice used for the experiment are as follows.
- CMAP compound muscle action potential
- NCV nerve conduction velocity
- mice model Experimental group number dosing substance Volume (vg/head) number of individuals gender wild type G2 (C22 Con) AAV1-MCS 1 * 10 ⁇ 11 4 Female C22 G3 (C22 Ex1) AAV1-HGF 1 * 10 ⁇ 9 3 Female G4 (C22 Ex2) AAV1-HGF 1 * 10 ⁇ 10 4 Male G5 (C22 Ex3) AAV1-HGF 1 * 10 ⁇ 11 4 Male1/Female3
- mice model Experimental group number dosing substance Volume (vg/head) number of individuals gender wild type G1 (WT) - - 5 Male2/Female3 C22 G2 (C22 Con) AAV1-MCS 1 * 10 ⁇ 11 5 Male G3 (C22 Ex1) AAV1-HGF 1 * 10 ⁇ 9 4 Male G4 (C22 Ex2) AAV1-HGF 1 * 10 ⁇ 10 5 Female G5 (C22 Ex3) AAV1-HGF 1 * 10 ⁇ 11 5 Male3/Female2
- Phase 1 clinical trials for safety and efficacy were conducted using pCK-HGF-X7 in 12 patients clinically diagnosed with Charcot-Marie-Tooth disease.
- the polynucleotide encoding the HGF isoforms of the present invention (pCK-HGF-X7) was administered at an interval of 2 weeks, at a dose of 7 mg per leg. At this time, a dose of 7 mg was administered to 28 sites of one leg muscle in an amount of 0.25 mg/0.5 ml/site. A total of 28 mg administered at 2-week intervals was defined as one cycle (1 cycle). The cycle may be repeated, preferably at an interval of 90 days.
- a screening process was conducted to examine the patient's potential to participate in this clinical trial.
- the screening process will be conducted within 30 days prior to the first administration day (Day 0), and the possibility of participating in this clinical trial was determined by examining patients for the following items.
- pCK-HGF-X7 was administered to both lower extremities at 2-week intervals (Day 0 and Day 14), and after 90 days, it was repeatedly administered at 2-week intervals (Day 90 and Day 104). That is, on each visit day, 7 mg of pCK-HGF-X7 per leg was administered to 28 sites in an amount of 0.25 mg/0.5 ml/site, and 14 mg each on Days 0, 14, 90 and 104. A total of 56 mg of pCK-HGF-X7 was administered during the clinical period.
- the primary endpoint of this clinical trial is to confirm the safety of pCK-HGF-X7 repeatedly administered to weakened lower extremity muscles in patients with Charcot-Marie-Tooth disease, and the secondary endpoint is The purpose of this study was to confirm the effectiveness of repeated treatment of pCK-HGF-X7.
- Subjects who receive the test drug in this clinical trial and can evaluate safety are subject to safety analysis.
- Adverse reactions including severe adverse reactions and adverse reactions that cause discontinuation of test drug administration
- follow-up for 270 days after administration were recorded according to their degree and relationship with test drug. If possible, safety analysis was performed through all statistical analyses.
- Efficacy according to repeated administration of pCK-HGF-X7 in all subjects is collected for 270 days after administration, and compared with the value before administration.
- Adverse reactions according to the administration of pCK-HGF-X7 of the present invention occurred in 3 to 4 cases out of 12 subjects. Of these, two adverse drug reactions were reported from the subject, one was ankle swelling and the other was itching at the injection site, all of which were mild and recovered soon. On the other hand, no Serious Adverse Events were reported.
- Table 4 shows the results of CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2), an efficacy index related to changes in disease severity.
- CMTNS-v2 an efficacy index related to the change in disease severity, decreased by 2.17 points to 13.42 points at 270 days from the baseline value of 15.58 points, showing a 14% improvement and a very significant decrease ( p ⁇ 0.0001).
- FDS functional disability scale
- the overall neuropathy limitation score (ONLS) leg scale which is an effective index indicating changes in lower extremity function, showed a decrease in 4 out of 12 subjects, and was improved, and there was no change in 8 subjects. Compared to the baseline in 12 patients, the total mean change decreased by 0.33 ⁇ 0.49 at 270 days, showing clinical improvement.
- the degree of fat increase in the calf and shin muscles of the patients receiving the pCK-HGF-X7 of the present invention was (according to the site) -0.6% to 1.3%.
- the degree of fat gain in patients with a baseline fat value of 10% or more is known to be 3% per year, this result suggests that the pCK-HGF-X7 of the present invention can prevent muscle loss.
- Table 8 shows the walking speed of 10 meters.
- NCV nerve conduction velocity
- Table 9 shows the results of measuring nerve conduction velocity.
- nerve conduction velocity increased in the subject's right peroneal nerve and left tibial nerve, and decreased in other nerves.
- the pCK-HGF-X7 of the present invention has high safety and excellent effect in improving Charcot-Marie-Tooth disease.
- mice were divided into a naive group (wild type, 7 mice), a control group (C22, 9 mice), and a pCK-HGF-X7 treated group (C22, 8 mice).
- the naive group did not receive any treatment, and the control group and the pCK-HGF-X7 treated group were intramuscularly administered with pCK and pCK-HGF-X7 at a dose of 600 ⁇ g/head, respectively, as follows.
- the present inventors performed a neurohistopathological analysis in order to confirm the effectiveness after 16 weeks of single administration at the same dose as above.
- FIGS. 10A and 10B A semi-thin section was performed to investigate the condition of the sciatic nerve in the femoral nerve tissue of the mouse, and the state of axon myelination was observed under a microscope. Experimental results are shown in FIGS. 10A and 10B.
- the pCK-HGF-X7 of the present invention increases the recovery of myelin sheath in a transgenic mouse animal model C22 mouse that exhibits the same phenotype as a CMT type 1A patient, so it is useful as a therapeutic agent for Charcot-Marie-Tooth disease. It was confirmed that it can be used.
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Abstract
본 발명은 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 샤르코-마리-투스병의 질환동물 모델에 투여시, 운동능력, 전기생리학적 검사 결과 및 신경병리조직학적 소견을 개선시키는 효과가 우수한 바, 샤르코-마리-투스병의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 특허출원은 대한민국 특허출원 제10-2021-0040695호(2021년 3월 29일 출원) 및 대한민국 특허출원 제10-2021-0152171호(2021년 11월 8일 출원)에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 간세포 성장인자의 둘 이상의 이형체, 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 유효성분으로 포함하는 샤르코-마리-투스병 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
희귀 유전성 질환의 하나인, 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth disease, CMT)은 특정 유전자 돌연변이로 인해 운동신경과 감각신경이 손상되는 질환이다. 샤르코-마리-투스병은 대표적인 유전성 말초신경변증(Inherited peripheral neuropathy)으로 인구 2500명 중 1명 정도로 발생하는 희귀 질환 중에서 가장 높은 발병 빈도를 가지며, 근력약화, 근육위축, 감각 소실 및 이상 감각이 주된 증상이다. 샤르코-마리-투스병은 유전운동감각신경병이라고도 하며, 약자로 CMT라 한다. 유전성 말초신경병증에는 샤르코-마리-투스병 외에도 압박마비 유전신경병(hereditary neuropathy with liability to pressure palsy), 유전운동신경병(hereditary motor neuropathy) 및 유전성 감각 자율신경병증(hereditary sensory and autonomic neuropathy)이 있다.
샤르코-마리-투스 질환의 발병 원인으로 80개 이상의 다양한 원인 유전자가 있다고 알려졌다. 유전 양상에 따라 (1) 상염색체 우성 유전의 양상을 보이면서 신경전도속도의 감소가 있는 경우는 CMT1(관련 유전자로 PMP22, MPZ, EGR2, LITAE, NEFL 등이 있음), (2) 우성 유전의 양상을 보이면서 신경전도속도는 정상에 가까우면서 운동신경 또는 감각신경의 활동전위가 저하된 경우는 CMT2(관련 유전자로 MFN2, RAB7 등이 있음), (3) X염색체 관련 유전 양상을 보이는 경우는 CMTX, 및 (4) 상염색체 열성 유전의 양상을 보이는 경우는 CMT4(관련 유전자로 GDAP1, MTMR2, SBF2 등이 있음)로 분류된다(J Korean Society for Clinical Neurophysiology 7(2):65-74, 2005). 샤르코-마리-투스 질환의 치료제로는 오나프리스톤(onapristone, 프로게스테론 길항제), 아스코르빈산(ascorbic acid), 및 NT-3(neurotrophin-3) 등이 연구되고 있다.
본 발명자들은 샤르코-마리-투스병의 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 샤르코-마리-투스병의 질환모델 동물에 간세포 성장인자의 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미스 벡터 및 바이러스 벡터를 투여한 결과, 운동능력, 전기생리학적 검사 결과 및 신경병리조직학적 소견이 개선됨을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스병의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF)"는 간엽 세포에 의해 생성되는 다기능성 이종이량체 폴리펩타이드이다. HGF는 다양한 세포 형태의 성장 및 분산(scattering) 뿐만 아니라 혈관신생(angiogenesis), 형태형성(morphogenesis), 및 모토제네시스(motogenesis)를 자극하는 것으로 알려져 있다(Bussolino et al., J. Cell. Biol. 119: 629, 1992; Zarnegar and Michalopoulos, J. Cell. Biol. 129:1177, 1995; Matsumoto et al., Ciba. Found. Symp. 212:198, 1997; Birchmeier and Gherardi, Trends Cell. Biol. 8:404, 1998; Xin et al. Am. J. Pathol. 158:1111, 2001). HGF의 다면발현성 특성은 이의 수용체, 원발암유전자(proto-oncogene) c-Met에 의해 인코딩되는 막투과성 티로신 키나아제를 통해 매개된다.
본 발명에서 상기 간세포 성장인자 이형체는 모든 대립 유전자 변형체들(variants)을 포함하는, 동물에서 자연적으로 생성되는(naturally occurring) HGF 아미노산 서열과 적어도 80％, 바람직하게는 90%, 95%, 또는 99% 이상의 동일한 아미노산 서열을 갖는 HGF 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 HGF 이형체는 HGF의 정상형(normal form) 또는 야생형(wild type), 및 HGF의 다양한 변이체(예컨대, 스플라이싱 변이체 및 결손 변이체)를 모두 포괄하는 의미를 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체들은 전장 HGF(full length HGF; flHGF)와 결손된 변이형 HGF(deleted variant HGF; dHGF)를 포함한다. 전장 HGF 및 결손된 변이형 HGF, 또는 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 모두 포함하는 조성물을 이용하는 경우, 샤르코-마리-투스병을 더욱 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "flHGF"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간 HGF의 아미노산 1-728 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "dHGF"는 동물, 바람직하게는 포유동물에서 HGF 유전자의 선택적 스플라이싱에 의해 생성되는 HGF 단백질의 결손된 변형체, 보다 바람직하게는 전장 HGF 서열로부터 알파 사슬의 첫 번째 크링글 도메인에서 5 개의 아미노산(F, L, P, S 및 S)이 결손된 723 개의 아미노산으로 이루어지는 인간 HGF를 지칭한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 flHGF는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 dHGF는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 HGF의 이형체들은 별도의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되거나, 또는 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화된다.
본 발명인 약제학적 조성물은, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에 둘 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, HGF의 서로 다른 종류의 이형체들이 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우에는 상기 단일의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 HGF 이형체들의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열(예컨대, 프로모터 또는 인핸서)에 작동가능하게 연결될 수 있다.
HGF의 두 종류 이상의 이형체들이 별도의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우, 두 가지 방식으로 발현 카세트를 구축할 수 있다. 첫 번째 방식에 따르면, 이형체 각각에 대한 CDS(coding sequence)에 발현 조절 서열을 연결하여 발현 카세트를 구축한다. 두 번째 방식에 따르면, "발현조절서열-제1 이형체 CDS-IRES-제2 이형체 CDS-전사종결 서열"과 같은 방식으로 IRES(internal ribosomal entry site) 또는 2A 펩타이드를 이용하여 발현 카세트를 구축한다. IRES는 유전자의 번역이 IRES 서열에서 시작되도록 함으로써 2 개 이상의 관심 유전자가 동일한 구조물에서 발현되도록 한다.
HGF의 두 종류 이상의 이형체들이 단일의 폴리뉴클레오타이드에 의하여 암호화되는 경우, 상기 두 종류 이상의 이형체들을 모두 암호화하고 있는 폴리뉴클레오타이드는 단일의 발현조절서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명에 있어서, HGF의 이형체들은 둘 이상의 서로 다른 종류의 이형체들, 예컨대 flHGF 및 dHGF를 동시에 발현하는 하이브리드(hybrid) HGF 유전자에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 인간 HGF 의 엑손 1 내지 18 에 해당하는 cDNA, 및 상기 cDNA 의 엑손 4 와 5 사이에 삽입된 인간 HGF 유전자의 인트론 4 또는 인트론 4의 단편을 포함한다. 즉 아래와 같은 구조로 이루어진 핵산 분자를 포함한다.
'HGF의 엑손 1 내지 4-HGF의 인트론 4 또는 그의 단편-HGF의 엑손 5 내지 18'
상기 '-'는 각 엑손과 인트론 단편을 구별하기 위한 표현일 뿐, 특정한 구조를 의미하는 표현은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 둘 이상의 HGF의 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2 내지 서열번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 둘 이상의 HGF의 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1(pCK-HGF-X7), 서열번호 5(HGF-X7-d4) 또는 서열번호 6(HGF-X7)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 "HGF 이형체", 및 "하이브리드 HGF 유전자(예컨대, HGF-X7)"에 관하여서는 WO 2003/078568에 보고된 바 있으며, 상기 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에서 이용 가능한 HGF 이형체의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 HGF 이형체의 서열과 실질적인 동일성을 나타내는 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 실질적인 동일성은, HGF 이형체의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 적어도 80％, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 91%, 92%, 93%, 또는 94%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 95％, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성, 또는 100%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "% 상동성"은 예를 들어 다음과 같이 계산될 수 있다. CLUSTAL W 알고리즘 (Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22:4673-4680 (1994))을 이용하여, 분석하고자 하는 서열을 타겟 서열에 맞추어 조정한다(align). 조정된 서열들 중 가장 짧은 것에 일치하는 윈도우에 대해 비교가 이루어진다. 조정된 서열들 중 가장 짧은 것이 어떤 경우에는 타겟 서열일 수도 있다. 다른 경우에는, 분석하고자 하는 서열이 조정된 서열들 중 가장 짧은 서열을 구성할 수도 있다. 각 위치에서의 아미노산 잔기, 또는 뉴클레오타이드의 염기를 비교하고, 타겟 서열에서와 동일성을 가지는 분석하고자 하는 서열의 위치의 비율을 % 상동성으로 보고한다.
본 발명의 HGF 이형체(flHGF 및 dHGF)를 인코딩하는 유전자는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 flHGF 및 dHGF 유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 HGF 이형체를 인코딩하는 유전자는 서로 다른 뉴클레오타이드 서열을 가지면서, 서로 동일한 아미노산 서열을 가진 HGF 이형체(flHGF 및 dHGF)를 인코딩하는 축퇴성 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오타이드 서열은 상동성은 코돈의 축퇴성으로 인하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 80％, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 적어도 90％, 91%, 92%, 93%, 또는 94%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 95％, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 나타낼 수 있다.
또한, 코딩 영역을 제외한 부분(예컨대 인트론 영역)에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 뉴클레오타이드의 다양한 변형(삽입, 치환, 제거) 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
예컨대, 본 발명의 구체적인 구현예에 따른, 상기 하이브리드 HGF 유전자는 서열번호 5(HGF-X7-d4), 서열번호 6(HGF-X7), 또는 서열번호 10(optimized HGF-X7-d4)의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이들 서열의 뉴클레오타이드 서열은 서로 상이하지만 코딩 영역을 제외한 부분(인트론 영역)의 뉴클레오타이드 서열이 상이하고, 코딩 영역(엑손 영역)의 뉴클레오타이드 서열은 동일하므로, 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의하여 서로 동일한 아미노산 서열을 가진 flHGF 및 dHGF 단백질을 인코딩한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 서열번호 10(optimized HGF-X7-d4)의 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열번호 5(HGF-X7-d4)의 뉴클레오타이드 서열과 약 82%의 서열 상동성을 가지나, 동일한 아미노산 서열을 가진 flHGF 및 dHGF 단백질을 인코딩한다.
본 발명의 하이브리드 HGF 유전자는 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 10의 하이브리드 HGF 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드란 적어도 80％, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 90％, 91%, 92%, 93%, 또는 94%의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 95％, 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다.
다만, 상술한 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열은 AAV 벡터에 삽입하는데 있어서, 큰 뉴클레오타이드 사이즈로 인하여 제한이 있다. 본 발명의 서열번호 5 또는 10의 뉴클레오타이드 서열은 상술한 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열의 인트론 4 단편에 해당하는 서열 중 일부를 제거하여 다운사이징한 서열 중 유의하게 상승된 유전자 전달 효율을 보이는 서열에 해당한다. 구체적으로, 서열번호 5 또는 10의 뉴클레오타이드 서열을 AAV 벡터에 도입하여 대상(subject)에 전달하는 경우, 종래 알려진 서열번호 7의 HGF-X8을 AAV 벡터에 도입하여 이용하는 경우에 비하여 유의하게 상승된 유전자 전달 효율 및 발현 효율을 보인다.
본 발명의 서열번호 5의 뉴클레오타이드 서열(HGF-X7-d4)를 포함하는, 서열번호 6의 서열로부터 유래한 사이즈가 감소된 변형 뉴클레오타이드 서열은 WO 2019/132624에 보고된 바 있으며 상기 특허문헌의 개시 내용은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 naked DNA 또는 유전자 전달 시스템에 포함되어 있는 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 조성물은 유전자 치료 분야에서 통상적으로 공지된 다양한 운반 방법을 통하여 생체 내에 적용될 수 있으며, 상기 유전자 전달 시스템은 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
(i) 플라스미드(벡터)
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 운반체로서 플라스미드(벡터)가 이용될 수 있다. 플라스미드(벡터)에 포함되는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 발현 카세트 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 카세트에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 핵산 발현조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
본 발명에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는 일 구현예에 따르면 동물세포, 다른 구현예에 따르면 포유동물 세포, 특정 구현예에 따르면 인간 세포에서 작동하여 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 상기 프로모터는 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다
본 발명에서 이용되는 발현 카세트는 폴리아네닐화 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998 (1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393 (1992)), HIV-1 poly A(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876 (1998)), beta-글로빈 poly A(Gil, A., et al, Cell 49:399-406 (1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113 (1985)) 또는 폴리오마바이러스 poly A(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790 (1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터는 pCK, pCP, pVAX1 또는 pCY 벡터를 이용할 수 있으며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 pCK 벡터를 이용할 수 있다. 상기 pCK 벡터를 이용하여 HGF의 둘 이상의 이형체를 발현하는 단일 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터들은 WO 2000/040737 및 WO 2003/078568에 자세히 기재되어 있으며, 상기 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
(ii) 레트로바이러스
레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.
레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제 불능의 바이러스를 생산한다. 비리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR (long terminal repeat)와 ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다 (Mann et al., Cell, 33:153-159 (1983)). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, LTR 및 ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다(Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513 (1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.
2 세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasahara 등(Science, 266:1373-1376 (1994))은 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO (erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열도 이와 같은 2 세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 레트로바이러스에 탑재될 수 있다.
(iii) 아데노바이러스
아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 역가(titer), 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스-엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B) 은 전사 및 숙주세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 암호화한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 암호화한다.
현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서는, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551 (1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073 (1989)). 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 영역 및/또는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, "결실" 은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. 또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105％까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb 를 추가적으로 패키징 할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739 (1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.
아데노바이러스는 42개의 상이한 혈청형 및 A-F의 서브그룹을 갖는다. 이 중에서, 서브그룹 C에 속하는 아데노바이러스 타입 5가 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 얻기 위한 가장 바람직한 출발물질이다. 아데노바이러스 타입 5에 대한 생화학적 및 유전적 정보는 잘 알려져 있다. 아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적 독성이 매우 낮다. 따라서, 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료는 안전할 것으로 판단된다.
(iv) 아데노-연관 바이러스 벡터
아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus, AAV) 벡터는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제5,139,941 호 및 제4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다.
유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993), Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448 (1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37 (1995)에 개시되어 있다.
전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 타겟 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973 (1988); 및 Samulski et al., J. Virol., 63:3822- 3828 (1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드 (McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945 (1991))를 동시 전달(transfection)하여 제조된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 벡터는 바이러스 벡터이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV)이다.
본 발명의 AAV 벡터는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 외래 유전자 서열을 세포 내로 운반하는데 이용될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 및 AAV16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV serotype을 갖는다.
상기 AAV는 serotype AAV1, AAV2, AAV5, 및 AAV6로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 AAV를 이용하여 HGF의 둘 이상의 이형체를 발현하는 단일 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 WO 2019/132624A1에 자세히 기재되어 있다.
(v) 다른 바이러스 벡터
다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 생체 내로 운반하는 데 이용할 수 있다. 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657 (1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492 (1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148 (1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10 (1988)), 렌티바이러스 (Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62 (1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415 (1995)) 로부터 유래된 벡터들도 상기 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.
(vi) 리포좀
리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀을 이용하여 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)에 개시되어 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용 하여 세포 내로 폴리뉴클레오타이드 서열을 운반한다.
본 발명에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 네이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드(벡터)에 탑재된 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479 (1980); 및 Harland 와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456 (1973); 및 Chen 과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841 (1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718 (1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87 (1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190 (1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190 (1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)) 방법에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열을 세포 내로 도입시킬 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는 당업계에 공지된 다양한 바이러스 감염 방법에 따라 외래 유전자 서열을 세포 내로 운반할 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 상술한 AAV 벡터를 이용하여 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 293T와 같은 포유동물세포(mammalian cell) 또는 곤충세포(insect cell) 등에 형질 전환시킬 수 있고, 형질 전환된 숙주 세포를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 샤르코-마리-투스병을 억제시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 샤르코-마리-투스병의 진행/발전의 지연 또는 억제; (b) 샤르코-마리-투스병의 경감; 및 (c) 샤르코-마리-투스병의 제거를 의미한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 척수강내 투여, 뇌실 내 투여 (intracerebroventricular injection), 뇌 투여(intracerebral injection) 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 주사로 제제화되어 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대상체에 3주 이내의 간격으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 0.001 내지 100 mg/개체/일의 투여량으로 투여된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분이 HGF 이형체 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드인 경우 0.001 내지 100 mg의 투여량으로 투여된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물의 유효성분이 AAV 벡터인 경우, 1×108 내지 1×1012 genome copies (GC)/site 또는 1×108 내지 1×1012 genome copies (GC)/head의 투여량으로 투여된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 투여 간격은 예컨대, 3일, 5일, 6일, 7일, 9일, 10일, 12일, 14일, 15일, 18일, 20일, 또는 21일이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 투여량은 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 0.001 내지 100 mg/1개체/1일, 0.001 내지 90 mg/1개체/1일, 0.001 내지 80 mg/1개체/1일, 0.001 내지 70 mg/1개체/1일, 0.001 내지 60 mg/1개체/1일, 0.001 내지 50 mg/1개체/1일, 0.001 내지 40 mg/1개체/1일, 0.001 내지 30 mg/1개체/1일, 0.001 내지 20 mg/1개체/1일, 0.001 내지 15 mg/1개체/1일, 0.001 내지 14 mg/1개체/1일, 또는 0.001 내지 10 mg/1개체/1일의 투여량으로 투여되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 투여량은 14 mg/1개체/1일이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대상체에 3주 이내의 간격으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 1일에 다리당 0.0005 내지 50 mg의 투여량으로 근육 내 투여된다. 상기 다리당 투여량은 0.0005 내지 50 mg, 0.0005 내지 45 mg, 0.0005 내지 40 mg, 0.0005 내지 35 mg, 0.0005 내지 30 mg, 0.0005 내지 25 mg, 0.0005 내지 20 mg, 0.0005 내지 18 mg, 0.0005 내지 16 mg, 0.0005 내지 15 mg, 0.0005 내지 14 mg, 0.0005 내지 13 mg, 0.0005 내지 12 mg, 0.0005 내지 11 mg, 0.0005 내지 10 mg, 0.0005 내지 9 mg, 0.0005 내지 8 mg, 0.0005 내지 7 mg, 0.0005 내지 6 mg, 또는 0.0005 내지 5 mg 이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 투여량은 1일에 다리당 7 mg이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물이 1회 이상 투여되는 경우의 각 투여량은 매회 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 대상체는 포유류이고, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 랫트, 기니피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 바분(baboon), 또는 붉은털 원숭이(Macaca mulatta)이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 1 주기(1 cycle) 이상 투여된다. 상기 1 주기는 1회 이상의 투여 회수를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 주기 사이의 간격은 1개월 내지 6개월이다. 보다 구체적으로, 상기 주기 사이의 간격은 예컨대, 30일 내지 40일, 30일 내지 50일, 30일 내지 60일, 30일 내지 70일, 30일 내지 80일, 30일 내지 90일, 30일 내지 100일, 30일 내지 120일, 30일 내지 150일, 30일 내지 180일, 60일 내지 70일, 60일 내지 80일, 60일 내지 90일, 60일 내지 100일, 60일 내지 120일, 30일, 40일, 50일, 60일, 70일, 80일, 90일, 100일, 120일, 150일, 또는 180일 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 1 주기는 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 총 0.002 내지 200 mg/1개체의 투여량이 투여되는 것을 1 주기로 하고, 주기 간 60 내지 120일 간격을 두고 투여된다.
상기 1 주기는 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 총 0.2 내지 200 mg/1개체의 투여량이 투여되는 것을 기준으로 하므로, 1회 이상의 투여 회수를 포함할 수 있다. 예를 들면, 투여 용량이 10 mg/개체/일인 경우 2주 간격으로 3일 동안 총 30 mg/개체의 투여량이 투여되는 것을 1주기로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 1주기는 14 mg/개체/일의 용량으로 2주 간격으로 2일간 투여하였다. 즉, 28 mg/1개체의 투여량이 투여되는 것을 1주기로 하여, 주기(cycle) 사이에 90일의 간격을 두고 투여된 바 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 질환의 중증도 변화와 관련된 유효성 지표인 CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2)를 개선시키는 효과가 있다.
상기 CMTNS-v2는 감각이상, 통각 예민도, 진동 감각, 상지 근력, 하지 근력, 정중 신경의 운동신경 활동 전위, 척골 신경의 감각신경 활동 전위, 상지 운동증상, 및 하지 운동증상을 포함한다.
상기 개선된 CMTNS-v2의 항목은 감각이상, 통각 예민도, 및 진동 감각을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 질환의 중증도 변화와 관련된 유효성 지표인 FDS(functional disability scale)를 개선시키는 효과가 있다.
상기 FDS는 다음과 같은 9 단계의 scale을 포함한다:
0; 정상, 1; 정상이지만 피로감이나 통증이 있는 경우(normal but with cramps and fatigability), 2; 달리기를 할 수 없는 경우(inability to run), 3; 걷기가 어렵지만 도움 없이 걷는 것이 가능한 경우 (walking difficulty but still possible unaided), 4; 지팡이를 가지고 걸을 수 있는 경우(walk with cane), 5; 목발을 가지고 걸을 수 있는 경우(walk with crutches), 6; 보조기를 착용하고 걸을 수 있는 경우(walk with a walker), 7; 휠체어를 타고 다녀 야 하는 경우(wheelchair bound), 8; 누워서 생활하는 경우(bedridden).
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 하지 기능의 변화를 나타내는 유효성 지표인 ONLS(overall neuropathy limitation score) leg scale을 개선시키는 효과가 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 하지 기능의 변화를 나타내는 유효성 지표인 10MWT (10 meter walk test)를 개선시키는 효과가 있다. 상기 10MWT는 이동성, 보행, 전정계 기능의 수행 정도를 결정하는데 사용되는 지표로, 초당 걸음 걸이(m/sec)를 측정한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 샤르코-마리-투스병의 환자에서 하지 근육의 소실을 방지하고, 지방 침윤을 감소시키는 효과가 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 샤르코-마리-투스병의 치료방법을 제공한다.
상기 본 발명의 다른 일 양태에 따른 치료방법은, 상술한 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.
본 발명은 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 샤르코-마리-투스병의 질환동물 모델에 투여시, 운동능력, 전기생리학적 검사 결과 및 신경병리조직학적 소견을 개선시키는 효과가 우수한 바, 샤르코-마리-투스병의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pCK-HGF-X7으로부터 HGF-X7의 다운사이징 변이체들을 제조하는 방법을 보여주는 모식도이다.
도 2는 HGF-X7의 다운사이징 변이체들을 pCA 벡터에 클로닝하는 방법을 보여주는 모식도이다.
도 3은 실시예 2에 따른 본 발명의 조성물 투여 후 체중을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 2에 따른 본 발명의 조성물 투여 후 rotarod 실험결과를 나타낸 도이다.
도 5은 본 발명의 조성물을 투여한 후, 운동신경전도 검사에서 Distal CMAP 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 6는 본 발명의 조성물을 투여한 후, 운동신경전도 검사에서 Proximal CMAP 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 7는 본 발명의 조성물을 투여한 후, 운동신경전도 검사에서 MNCV 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 조성물을 투여한 후, 감각신경전도 검사에서 SNCV 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 약물 투여 후, 마우스 대퇴신경 조직의 신경섬유 수초화 정도를 확인하기 위하여 마우스 대퇴조직 신경섬유의 조직학적 소견을 나타낸 도이다.
도 10a는 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 C22 마우스의 대퇴신경조직의 semi-thin 광학 현미경 사진을 나타낸 도이다(x400).
도 10b는 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 C22 마우스의 대퇴신경조직의 semi-thin 전자 현미경 사진을 나타낸 도이다(Bar = 2μm).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: AAV1-HGF (AAV1-pCA-HGF-X7-d4)의 제작
HGF의 두 가지 이형체(flHGF 및 dHGF)를 발현하는 AAV 벡터를 제작하기 위해, 서열번호 1의 pCK-HGF-X7로부터 위치지정 돌연변이 (site-directed mutagenesis) 방법을 통해 HGF 유전자의 인트론 4에 해당하는 부분의 서열 일부를 제거한 4가지 유도체(derivative), pCK-HGF-X7-d1, pCK-HGF-X7-d2, pCK-HGF-X7-d3 및 pCK-HGF-X7-d4를 제작하였다. 이 때 사용한 프라이머 서열은 서열번호 11 내지 18과 같다.
상기 pCK-HGF-X7-d4에서 ClaI 및 SalI 제한효소를 처리하여 서열번호 5의 HGF-X7-d4를 절편을 얻었다. pCA 벡터(AAV Helper-Free System, Agilent, USA)에도 ClaI 및 SalI 제한효소를 처리하고 상기 HGF-X7-d4 절편과 함께 라이게이션 하여 pCA-HGF-X7-d4를 제작하였다.
AAV를 생산하기 위해, 293T 세포 (ATCC)를 전날 준비하여 24시간 동안 안정화시켰다. 이 293T 세포에 상기 플라스미드 DNA pCA-HGF-X7-d4와 AAV 생산에 필요한 DNA인 pHelper 및 pAAV-RC(AAV Helper-Free System, Agilent, USA)를 전달(transfection)한 후 3일 후 AAV를 수거하였다. 수거한 AAV는 titration kit(AAVpro Titration Kit, Takara, JP)를 이용하여 titer를 측정하였다. 상기 AAV는 serotype AAV1을 이용하여 제작되었다.
상기 pCK-HGF-X7을 "VM202"로, 상기 AAV1-pCA-HGF-X7-d4를 "AAV1-HGF"로, pCA-HGF-X7-d4를 클로닝하지 않은 pCA 벡터를 이용하여 제작한 AAV1-pCA-MCS를 "AAV1-MCS"로 명명하고 이하의 실시예에서 사용하였다.
실시예 2: AAV-HGF를 이용한 C22 마우스에서의 치료 효능 확인
2-1. 실험동물 준비 및 투여
AAV-HGF의 샤르코-마리-투스병 치료 효능을 확인하기 위해, CMT type 1A형의 환자와 같은 표현형을 보이는 형질전환 마우스 동물모델인 C22 모델을 사용하였다. 실험군은 다음과 같이 분류하였고, 실험 결과는 합산하여 정리하였다.
| 마우스모델 | 실험군 번호 | 투여물질 | 용량 (vg/head) |
개체수 |
| Wild type | G1 (WT) | - | - | 5 |
| C22 | G2 (C22 Con) | AAV1-MCS | 1 * 1011 | 10 |
| G3 (C22 Ex1) | AAV1-HGF | 1 * 109 | 10 | |
| G4 (C22 Ex2) | AAV1-HGF | 1 * 1010 | 10 | |
| G5 (C22 Ex3) | AAV1-HGF | 1 * 1011 | 10 |
상기 표 1과 같이, C22에 마우스에 AAV1-MCS(WO2019/132624A1의 AAV1-MCS) 및 AAV1-HGF(WO2019/132624A1의 AAV1-pCA-HGF-X7-d4)를 용량별로 척수강내 투여하였고, 투여 후 2주 간격으로 체중 변화 및 행동평가분석을 하였고, 16주째 전기생리학적 검사 및 신경조직 병리학적 검사를 진행하였다.
2-2. 체중 분석
체중 분석 결과, 모든 그룹 간 유의미한 차이는 없이 체중이 유지되고 있는 것을 확인할 수 있었다.
2-3. 행동평가분석
약물 투여에 따른 행동평가는 Rotarod 실험법을 이용하였다. 약물 투여 전, 이 실험방법에 대해 실험동물의 적응 훈련 및 테스트를 실시하였고 약물 투여 후 2주 간격으로 테스트를 실시하여 약효를 평가하였다. Rotarod 실험법은 회전하는 긴 원통 위에 마우스를 올려두고 그 위에서 떨어지지 않고 얼마나 버티는지에 대한 시간을 측정하는 것으로, 원통의 회전이 시작되는 순간부터 마우스가 바닥에 떨어지는 순간까지의 시간이 측정되며, 만점은 180초로 설정하였다.
실험 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물(AAV-HGF)을 1*109 (vg/head)를 투여한 군(C22 Ex1)에서 전반적으로 C22 Con군에 비해 운동능력이 호전되는 것을 확인할 수 있었는데, 특히 투여 2주째 유의미하게 개선된 운동능력을 나타내었다. 1*1010 (vg/head) 또는 1*1011 (vg/head)로 투여한 군에서도 투여 후 초반까지는 C22 Con군에 비해 운동능력이 호전되는 것을 확인할 수 있었는데, 1*1011 (vg/head)로 투여한 군은 투여 8주째 유의미하게 개선된 운동능력을 나타내었다.
2-4. 전기생리학적 검사
약물 투여 후, 마우스의 뒷다리에서 전기생리학적 검사를 실시하였다. 정확한 전기생리학적 검사를 수행하기 위해, 측정 전 마우스의 등부터 발까지의 털을 모두 제거하였다. 마우스는 마취 콘(cone)을 사용하여 1.5% 이소플루란(isoflurane)을 공급하여 호흡마취 하였다. 측정은 Nicolet VikingQuest 장치(Natus Medical, San Carlos, CA, USA)를 이용하여 복합근육활동전위(compound muscle action potential, CMAP) 및 신경전도속도(nerve conduction velocity, NCV)를 측정하였다. 실험은 2회에 걸쳐 진행하였고, 실험에 사용한 마우스는 아래와 같다.
| 실험1 | |||||
| 마우스모델 | 실험군 번호 | 투여물질 | 용량 (vg/head) |
개체수 | 성별 |
| Wild type | G2 (C22 Con) | AAV1-MCS | 1 * 10^11 | 4 | Female |
| C22 | G3 (C22 Ex1) | AAV1-HGF | 1 * 10^9 | 3 | Female |
| G4 (C22 Ex2) | AAV1-HGF | 1 * 10^10 | 4 | Male | |
| G5 (C22 Ex3) | AAV1-HGF | 1 * 10^11 | 4 | Male1/Female3 | |
| 실험2 | |||||
| 마우스모델 | 실험군 번호 | 투여물질 | 용량 (vg/head) |
개체수 | 성별 |
| Wild type | G1 (WT) | - | - | 5 | Male2/Female3 |
| C22 | G2 (C22 Con) | AAV1-MCS | 1 * 10^11 | 5 | Male |
| G3 (C22 Ex1) | AAV1-HGF | 1 * 10^9 | 4 | Male | |
| G4 (C22 Ex2) | AAV1-HGF | 1 * 10^10 | 5 | Female | |
| G5 (C22 Ex3) | AAV1-HGF | 1 * 10^11 | 5 | Male3/Female2 | |
결과는 도 5 내지 도 8에 나타내었다. AAV-HGF를 투여한 모든 용량군에서 전반적으로 C22 Con군에 비해 Distal CMAP가 증가되는 양상이 나타났다. 그리고 1*109 (vg/head) 또는 1*1010 (vg/head)를 투여한 군에서 proximal CMAP 및 SNCV(sensory nerve conduction velocity)가 증가하는 양상을 보였는데, 특히 SNCV의 경우 C22 Con군에 비해 AAV-HGF 1*109 (vg/head)를 투여한 군에서 유의한 차이를 확인할 수 있었다.
2-5. 신경조직 병리학적 검사
본 발명의 약물 투여 후, 신경조직 병리학적 검사를 수행하기 위해 마우스 대퇴신경에 대해 semithin section을 진행하였다. 본 발명의 약물의 신경섬유 수초화(myelination)에 대한 유효성을 확인하기 위해, 수초화된 액손(myelinated axon) 및 탈수초화된 액손(unmyelinated axon)의 수를 측정하였다. 결과는 도 9에 나타내었다. 그 결과, AAV-HGF 1*109 (vg/head)를 투여한 군(C22 Ex1)에서 수초화된 액손(myelinated axon)의 증가 및 탈수초화된 액손(unmyelinated axon)의 감소가 관찰되어 신경섬유 수초화 정도의 면에서 개선되는 양상을 확인할 수 있었다.
실시예 3. pCK-HGF-X7(VM202)를 이용한 임상 1상 시험에서의 샤르코-마리-투스병의 치료 효능 확인
3.1 대상환자 및 투여방법
임상적으로 샤르코-마리-투스병으로 진단받은 12명의 환자를 대상으로, pCK-HGF-X7을 이용하여 안전성 및 유효성에 대한 임상 1상을 수행하였다. 본 발명의 HGF 이형체들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(pCK-HGF-X7)는 2주 간격으로, 다리당 7 mg의 투여량으로 투여되었다. 이 때 7 mg의 투여량은 0.25 mg/0.5 ml/site의 양으로 한 다리 근육의 28곳에 투여되었다. 2주 간격으로 총 28 mg이 투여되는 것을 한 주기(1 cycle)로 정의하였다. 상기 주기는 반복될 수 있으며, 바람직하게는 90일 간격으로 반복될 수 있다.
| Cohort | Total dose | Dose Level per injection | Dose VM202 per Visit | |||
| Day 0 | Day 14 | Day 90 | Day 104 | |||
| n=12 | 56 mg | 0.25 mg/0.5 ml | 14 mg (0.5 ml * 56) |
14 mg (0.5 ml * 56) |
14 mg (0.5 ml * 56) |
14 mg (0.5 ml * 56) |
3.2 시험방법
(1) 동의서 확보 및 스크리닝 과정
환자로부터 동의서를 받은 후, 환자의 본 임상시험 참여 가능성을 검사하는 스크리닝 과정을 진행하였다. 스크리닝 과정은 1차 투여일(Day 0)을 기준으로 이전 30일 이내에 진행하게 되며, 다음과 같은 항목에 대해 환자를 검사하여 본 임상시험 참여 가능성을 결정하였다.
a. 병력 조사 (complete medical history)
b. 일반 검사 (complete physical exam)
c. 암 검사 (cancer screening tests)
d. 흉부 X선 검사 (Chest X-ray)
e. 바이러스 검사 (viral screening tests)
f. 혈액 및 혈청 화학 검사 (hematology and serum chemistry)
g. 뇨 검사 (Urinalysis)
h. 뇨 임신 검사 (여성만 시행)
i. 신경학적 검사
j. ECG
k. CMTNS-v2
l. 보조기구 사용여부
(2) 시험약 투여 과정
스크리닝이 완료된 시험대상자는 양측 하지에 pCK-HGF-X7을 2주 간격 (Day 0 및 Day 14)으로 투여되고, 90일 후 2주 간격 (Day 90 및 Day 104)으로 반복 투여되었다. 즉, 시험대상자는 각 방문일에 한 다리당 7 mg의 pCK-HGF-X7을 0.25 mg/0.5 ml/site의 양으로 28곳을 투여되는데, Day 0, 14, 90 및 104일에 각각 14 mg을 투여 받아 임상기간 동안 총 56 mg의 pCK-HGF-X7을 투여 받았다.
3.3. 임상평가지표
본 임상시험의 일차평가항목 (primary endpoint)는 샤르코-마리-투스병 환자를 대상으로 약화된 하지근육에 반복투여된 pCK-HGF-X7의 안전성을 확인하는 것이며, 이차평가항목 (secondary endpoint)는 pCK-HGF-X7의 반복치료에 따른 유효성을 확인하는 것이었다.
(1) 안전성 평가
본 임상시험에서의 시험약을 투여 받고 안전성에 대한 평가가 가능한 시험대상자는 안전성 분석의 대상이 된다. 투여 후 270일 동안의 추적 관찰을 통한 이상반응 (중증 이상반응 및 시험약 투여를 중단케 하는 이상반응도 포함)이 그 정도와 시험약과의 관계에 따라 모두 기록이 되었다. 가능한 경우 모든 통계적 분석을 통하여 안전성 분석을 하였다.
1) 이상반응
2) 실험실적 검사 및 활력징후
(2) 유효성 분석
모든 시험대상자의 pCK-HGF-X7 반복투여에 따른 유효성을 투여 후 270일 동안 수집하고, 투여 전 값과 비교 분석한다.
1) 질환의 중증도 변화
- CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2)
- FDS (functional disability scale)
2) 하지 기능의 변화:
- ONLS(overall neuropathy limitation score) leg scale
- 10MWT(10-meter walk test)
3) 하지 근육의 지방 침윤 정도 변화:
- MRI legs
4) 신경 재생 가능성:
- NCV(nerve conduction velocity)
3.4 시험결과
(1) 안전성 시험결과 (이상반응 보고)
본 발명의 pCK-HGF-X7의 투여에 따른 이상반응은 12명의 시험대상자 중 3명에서 4건이 발생하였다. 이 중 약과 관련된 이상반응 (Adverse Drug Reaction)은 시험대상자로부터 보고된 2건으로, 하나는 발목 부종, 다른 하나는 주사 부위 가려움증으로서 모두 경증이었으며 곧 회복되었다. 반면에 중증이상반응 (Serious Adverse Events)은 한 건도 보고되지 않았다.
(2) 유효성 시험결과
1) CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2)
질환의 중증도 변화와 관련된 유효성 지표인 CMTNS-v2 (Charcot-Marie-Tooth Neuropathy Score version 2) 결과는 표 4에 나타내었다.
| - | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
| Sensory symptoms | 2.67±0.89 | 1.75±0.62 | -0.92±0.79 (p = 0.0078) |
| Motor symptoms(legs) | 1.25±0.45 | 1.17±0.58 | -0.08±0.29 |
| Motor symptoms(arms) | 0.92±0.51 | 0.92±0.51 | 0.00±0.00 |
| Pinprick sensibility | 1.92±0.67 | 1.08±0.67 | -0.83±0.39 (p = 0.0020) |
| Vibration | 3.08±1.00 | 2.42±0.90 | -0.67±0.49 (p = 0.0078) |
| Strength(legs) | 1.17±0.39 | 1.17±0.39 | 0.00±0.00 |
| Strength(arms) | 1.08±0.29 | 1.08±0.29 | 0.00±0.00 |
| Ulnar CMAP | 0.08±0.29 | 0.17±0.39 | 0.08±0.29 |
| Radial SAP amplitude, antidromic testing | 3.42±0.79 | 3.67±0.49 | 0.25±0.45 |
| CMTNS-v2 Total Score | 15.58±3.37 | 13.42±2.75 | -2.17±1.11 (p < 0.0001) |
표 4에 나타낸 바와 같이, 질환의 중증도 변화와 관련된 유효성 지표인 CMTNS-v2는, 기저치 15.58점 대비 270일 시점에서 13.42점으로 2.17점이 감소되어 14%의 호전을 보였으며 매우 유의한 감소를 보였다(p < 0.0001). 세부항목을 살펴보면, CMTNS-v2의 9개 항목 중 3개 항목 (감각이상, 통각 예민도, 진동 감각)에서 기저치 대비 유의미한 개선이 관찰되었다. 즉, 감각이상(sensory symptoms)에서 기저치 대비 -0.92±0.79 (p = 0.0078), 통각 예민도(pinprick sensibility)에서 기저치 대비 -0.83±0.39 (p = 0.0020), 진동감각(vibration)에서 기저치 대비 -0.67±0.49 (p = 0.0078)로서 유의한 개선을 보였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 pCK-HGF-X7 DNA는 샤르코-마리-투스 질환을 개선하거나 질병의 진전을 막을 수 있음을 알 수 있었다.
2) FDS (functional disability scale)
| - | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
| FDS Score | 2.67±0.65 | 2.08±0.79 | -0.58±0.51(p = 0.0156) |
또 다른 유효성 지표인 FDS(functional disability scale)의 경우, 시험대상자 12명 중 7명에서 감소를 보여 증상 개선을 보였으며, 12명의 기저치 대비 270일 시점에서 총 평균 변화량이 0.58±0.51 (p = 0.0156) 감소하여 유의한 개선을 보였다.
3) ONLS (overall neuropathy limitation score) leg scale
| - | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
| ONLS leg scale Score | 2.08±0.29 | 1.75±0.45 | -0.33±0.49 |
하지 기능의 변화를 나타내는 유효성 지표인 ONLS(overall neuropathy limitation score) leg scale의 경우, 시험대상자 12명 중 4명에서 감소를 보여 개선되었으며, 8명에서는 변화가 없었다. 12명의 기저치 대비 270일 시점에서 총 평균 변화량이 0.33±0.49 감소하여 임상적 개선을 보였다.
4) MRI legs (fat contents in muscle %)
MRI를 통하여 샤르코-마리-투스 질환에 의한 하지 근육의 소실 및 지방 침윤 정도의 변화를 측정하였다. 근육의 소실은 지방의 증가로 이어지기 때문에, 해당 부위의 영상 이미지에서 지방의 퍼센티지를 계산하여 근육 소실의 정도를 측정하였다. 결과는 표 7에 나타내었다.
| - | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
| Rt. Gastrocnemius(%) | 24.27±22.51 | 24.48±22.30 | 0.22±1.66 |
| Rt. Tibialis anterior(%) | 12.70±13.76 | 14.61±13.23 | 1.91±2.34(p = 0.0164) |
표 7에 나타낸 바와 같이, MRI를 통해 측정된 근육 소실의 정도(=지방 증가의 정도)는, 장딴지근육(Gastrocnemius)에서 0.22, 앞정강이근(tibialis anterior)에서는 1.91로서, 이는 이미 알려진 연간 1.8 변화와 유사하였다. 그러나 임상시작 시에 지방의 기저값이 10% 이상으로 측정되었던 환자를 별도로 분석하면, 본 발명의 pCK-HGF-X7을 투여받은 환자들의 장딴지 및 정강이 근육에서 지방의 증가 정도가 (부위에 따라) -0.6% 부터 1.3%로 나타났다. 지방 기저치가 10% 이상 되는 환자에서의 지방증가의 정도가 연간 3%로 알려져 있음을 감안할 때, 이 결과는 본 발명의 pCK-HGF-X7가 근육의 소실을 방지할 수 있음을 시사하는 것임을 알 수 있었다.
5) 10MWT (10 meter walk test)
10 미터를 걷는 속도를 표 8에 나타내었다.
| - | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
| 10MWT: Average Speed (m/sec) | 1.16±0.24 | 1.22±0.18 | 0.06±0.20 |
시험대상자 12명 중 8명에서 속도의 증가를 보여 개선되었으며, 12명의 베이스라인 시점 대비 270일 시점에서 총 평균 변화량이 0.06±0.20 증가하였다.
6) NCV (nerve conduction velocity)
신경전도속도(nerve conduct velocity)를 측정한 결과를 표 9에 나타내었다.
| - | Baseline | Day 270 | Change from baseline |
| Right, Median nerve | 19.58±4.44 | 19.67±3.68 | 0.08±1.73 |
| Right, Ulnar nerve | 19.58±4.21 | 19.58±3.26 | 0.00±2.04 |
| Right, Radial nerve | 20.58±4.50 | 19.33±4.10 | -1.25±2.90 |
| Right, Tibial nerve | 9.75±10.80 | 9.50±10.23 | -0.25±1.86 |
| Right, Peroneal nerve | 1.58±5.48 | 2.92±6.89 | 1.33±4.31 |
| Right, Sural nerve | 3.58±8.39 | 3.42±8.01 | -0.17±0.39 |
| Left, Median nerve | 19.58±3.65 | 19.83±3.46 | 0.25±1.36 |
| Left, Ulnar nerve | 19.50±3.66 | 19.42±3.85 | -0.08±1.83 |
| Left, Radial nerve | 21.92±6.40 | 20.08±5.00 | -1.83±5.54 |
| Left, Tibial nerve | 9.92±11.10 | 11.25±10.44 | 1.33±6.21 |
| Left, Peroneal nerve | 5.33±8.12 | 4.00±7.39 | -1.33±4.44 |
| Left, Sural nerve | 3.58±8.39 | 3.25±7.62 | -0.33±0.78 |
표 9에 나타낸 바와 같이, 신경전도속도는 시험대상자의 우측 비골(peroneal nerve), 좌측 경골 신경(Tibial nerve)에서 증가를 보였으며, 그 외 신경에서는 감소를 보였다.
7) 소결
이번 임상에서는 pCK-HGF-X7의 뛰어난 안전성 및 CMTNS-v2, FDS, ONLS leg scale 등 임상적 지표에서 유의한 결과를 확인하였다. 또한 MRI legs 결과에서 근육손실방지를 시사하였고, 10MWT에서 개선되는 결과를 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명의 pCK-HGF-X7은 안전성이 높으면서도 샤르코-마리-투스 질환을 개선하는 효과가 우수함을 확인하였다.
실시예 4. pCK-HGF-X7를 이용한 C22 마우스에서의 치료 효능 확인
4.1 실험동물 준비 및 투여
본 발명의 pCK-HGF-X7의 샤르코-마리-투스병 치료 효능을 확인하기 위해, CMT type 1A형의 환자와 같은 표현형을 보이는 형질전환 마우스 동물모델인 C22 모델(5주령)을 사용하였다. 마우스는 Naive 군(wild type, 7마리), Control 군(C22, 9마리), pCK-HGF-X7 처리군(C22, 8마리)로 나누어 실험을 진행하였다. Naive 군은 아무 처리를 하지 않았으며, Control 군 및 pCK-HGF-X7 처리군은 각각 pCK와 pCK-HGF-X7을 600 μg/head의 용량으로 다음과 같이 근육 내 투여하였다.
| 근육 | 좌/우 | 농도(μg/μl) | volume (μl) | 최종 용량 (μg) |
| Bicep femoris | 좌 | 2 | 50 | 100 |
| tibialis anterior | 좌 | 2 | 50 | 100 |
| gastrocnemius | 좌 | 2 | 50 | 100 |
| Bicep femoris | 우 | 2 | 50 | 100 |
| tibialis anterior | 우 | 2 | 50 | 100 |
| gastrocnemius | 우 | 2 | 50 | 100 |
본 발명자들은 상기와 같은 용량으로 단회 투여를 하고 16주 후 유효성을 확인하기 위해, 신경조직병리학적 분석을 수행하였다.
4.2 신경조직병리학적 분석
마우스의 대퇴신경조직에 대해서 좌골신경 상태를 조사하기 위해 semi-thin section을 진행하였고, axon myelination 상태를 현미경으로 관찰하였다. 실험 결과는 도 10a 및 도 10b에 나타내었다.
분석 결과, Control 군의 경우 Naive 군에 비해 신경 내 demyelination된 병소가 많이 관찰되었다. 반면 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 군의 경우 myelinated axon fiber들이 다수 관찰되었고, large myelinated fiber 수는 증가하고 small unmyelinated fiber 수는 감소하여 전반적으로 수초화(myelination)가 회복되는 양상을 확인할 수 있었다(도 10a).
또한 전자현미경 분석을 통해 sciatic nerve의 수초화(myelination) 정도 및 수초(myelin)의 기형 여부를 관찰하였다. 그 결과, Control 군의 경우 Naive 군에 비해 탈수초화(demyelination)가 확연히 진행되었다. 반면, 본 발명의 pCK-HGF-X7을 처리한 군의 경우, Naive 군에 근접한 수준의 수초화(myelination) 회복 소견이 관찰되었다(도 10b).
따라서, 본 발명의 pCK-HGF-X7는 CMT type 1A형의 환자와 같은 표현형을 보이는 형질전환 마우스 동물모델 C22 마우스의 신경수초의 회복을 증가시키는 바, 샤르코-마리-투스병의 치료제로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
Claims (14)
- 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체, 또는 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는, 샤르코-마리-투스병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 이형체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 naked DNA 또는 유전자 전달 시스템에 포함된 것인, 약제학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 유전자 전달 시스템은 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인, 약제학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 플라스미드 벡터는 pCK인, 약제학적 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스(Adeno-associated virus, AAV) 벡터인, 약제학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 serotype AAV1, AAV2, AAV5, 및 AAV6로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체와 동일한 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 인코딩하는, 축퇴성 뉴클레오타이드 서열인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 둘 이상의 간세포 성장인자 이형체는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 전장 간세포 성장인자(full-length Hepatocyte Growth Factor, flHGF) 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 결실 변이 간세포 성장인자(deleted variant Hepatocyte Growth Factor, dHGF)인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1(pCK-HGF-X7), 서열번호 5(HGF-X7-d4), 서열번호 6(HGF-X7), 또는 서열번호 10 (optimized HGF-X7-d4)의 염기서열을 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대상체에 3주 이내의 간격으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 0.001 내지 100 mg/1개체/1일의 투여량으로 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 대상체에 3주 이내의 간격으로 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 다리당 0.0005 내지 50 mg의 투여량으로 근육 내 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 1 주기(1 cycle) 이상 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 주기 사이의 간격은 2개월 내지 6개월인, 약제학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 1 주기는 폴리뉴클레오타이드의 양을 기준으로 총 0.2 내지 200 mg/1개체의 투여량이 투여되는 것을 1 주기로 하고, 주기 간 60 내지 120일 간격을 두고 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
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