CN108368521A - Glp-1和其在用于治疗代谢疾病的组合物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于治疗受试者的II型糖尿病的组合物和方法。本文提供了一种病毒载体，所述载体包括包含编码前肽和GLP‑1活性部分的序列的核酸分子，其中，在表达时，GLP‑1的N末端氨基酸紧接在所述前肽的C末端氨基酸之后。在所需实施方案中，所述受试者是猫或狗。

Description

GLP-1和其在用于治疗代谢疾病的组合物中的用途
以电子形式提交材料的参考文献
申请人在此以引用方式并入以电子形式提交的序列表材料。此文件被标记为“15-7471_Seq_Listing_ST25”。
发明背景
美国1/400的猫和1/500的狗患有类似于人类II型糖尿病(T2DM)的病况。目前的护理标准是由主人每日两次进行的胰岛素注射以及频繁的兽医访视和一次性诊断，这些对于这些动物的主人来说既昂贵、费时又不方便。
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是在葡萄糖稳态中发挥中心作用的内源性肽激素。GLP-1类似物目前作为用于治疗糖尿病的常用人类治疗激素来使用。GLP-1能通过加强胰岛素释放、提高胰岛素敏感性、防止β细胞损失和延迟胃排空来控制高血糖。然而，由于GLP-1的循环半衰期较短，因此难以将GLP-1作为无稳定载体介导的递送的独立治疗剂来研发。被改造用于克服天然激素的短半衰期的GLP-1类似物已经成为治疗T2DM的重要治疗剂。然而，这些药物仍然需要频繁的皮下注射。实现持续治疗水平的GLP-1的替代方法是通过使用由腺相关病毒或其他病毒或非病毒载体介导的基因转移连续体内产生天然肽。GLP-1由于其短半衰期、宽治疗指数以及长期暴露的安全性而为此方法的理想候选。此方法可为受T2DM影响的人类和其他物种提供针对所述疾病的方便有效的疗法。
从基因疗法载体GLP-1不能以其天然形式表达，因为需要细胞特异性蛋白酶来从前体多肽释放活性肽。简单地表达单独肽且利用信号肽来指导分泌的尝试已经失败了，这可能归因于在生成活性GLP-1中小蛋白的翻译和分泌无效或者信号肽的裂解无效。在先前的啮齿动物关于载体介导的GLP-1表达的研究中，只有所述肽在更大的非物种特异性前肽在流感血凝素之后并且裂解位点紧接在GLP-1N末端之前的情况下表达时，才可实现有效的GLP-1循环水平。参见例如Gaddy等人，dsAAV8-mediated gene transfer and b-cellexpression ofIL-4and b-cell growth factors are capable of reversing early-onset diabetes inNOD mice,Gene Therapy,19:791-9(2012)以及Choi和Lee，Long-term,antidiabetogenic effects of GLP-1gene therapy using a double-stranded,adeno-associated viral vector,Gene Therapy,18:155-63(2011)，所述文献以引用方式并入本文中。然而，这些外源前肽有可能引起针对转导细胞的不正当破坏性免疫反应。因此，本领域需要可用于有效治疗受试者、特别是伴侣动物的II型糖尿病的组合物。
发明内容
本文提供新的改造的胰高血糖素样肽1(GLP-1)构建体。与作为独立治疗剂给出的GLP-1蛋白相比，从这些构建体表达的GLP-1蛋白适宜地以延长的循环半衰期为特征，并且被有效地加工以在体内释放GLP-1的活性部分。这些构建体可经由众多途径递送给需要其的受试者，并且特别是可通过重组载体(例如重组腺相关病毒(rAAV)载体)介导的体内表达来递送。
在一些实施方案中，提供了包含GLP-1构建体的病毒载体。在一些实施方案中，GLP-1构建体编码前肽和GLP-1的活性部分，其中当表达时，GLP-1的N末端氨基酸紧接在前肽的C末端氨基酸之后。
在一些实施方案中，前肽是内源性序列。也就是说，肽序列是衍生自最终预期施用的相同受试物种。
在一些实施方案中，前肽是衍生自凝血因子的前导序列。在一个实施方案中，前肽序列是选自以下各项的前导序列：蛋白质S、因子IX、白蛋白、白蛋白、IL2、凝血酶和甘露糖苷酶。在另一实施方案中，前肽包括弗林蛋白酶(furin)位点。
在一些实施方案中，GLP-1构建体编码对应于GLP-1的活性部分的GLP-1序列。在一个实施方案中，GLP-1序列编码GLP-1的氨基酸7至37。在另一实施方案中，GLP-1序列是SEQID NO:1。在一个实施方案中，GLP-1构建体编码以SEQ ID NO:5所述的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码GLP-1构建体的核酸序列是以SEQ ID NO:6来阐述。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:5的密码子优化序列。
在一些实施方案中，本文提供的重组载体具有包含前肽和GLP-1的表达盒。在一些实施方案中，表达盒包含特异性指导GLP-1在肝细胞中表达的启动子。
在一些实施方案中，重组载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中，rAAV具有选自AAV8、AAVrh64R1、AAV9、AAVhu.37或AAVrh10的衣壳。在具体的实施方案中，提供了具有包含前肽和GLP-1的活性部分的表达盒的rAAV载体。在特定的实施方案中，前肽包含凝血因子IX前导序列。在另一实施方案中，GLP-1序列编码GLP-1的aa 7-37。在另一实施方案中，rAAV载体包含表达盒，所述表达盒包含特异性指导GLP-1构建体在肝细胞中表达的启动子。
在一些实施方案中，提供了包含药学上可接受的载剂和如本文所述的重组载体的药物组合物。还提供了通过向有需要的受试者施用本文所述的具有表达盒的重组载体来治疗T2DM的方法，其中所述表达盒进一步包含指导GLP-1构建体在受试者中表达的调节控制序列。在一些实施方案中，所治疗的受试者是伴侣动物。在一个实施方案中，受试者是猫。在另一实施方案中，受试者是犬。如本文所用，术语“患者”和“受试者”可互换使用，并且可指人类或兽医受试者。
在又一实施方案中，用于增加受试者中GLP-1的循环半衰期的方法包括提供本文所述的重组载体，所述重组载体具有编码内源性前肽和GLP-1活性部分的表达盒，其中在表达时，GLP-1的N末端氨基酸紧接在前肽的C末端氨基酸之后。
上述重组载体可用于治疗II型糖尿病的方案中。
从以下对本发明的详细描述中，将易于明了本发明的其他方面和优点。
图式简述
图1提供了被转染的HEK293细胞中活性GLP-1表达的体外评估结果，如实施例2中所述。左边的条带对应于仅有培养基的对照。中间的条带对应于含有白细胞介素-2信号肽、接着是GLP-1(7-37)的GLP-1构建体，如实施例1中所述。右边的条带对应于含有因子IX前肽接着是GLP-1(7-37)的GLP-1构建体，如实施例1中所述。值是重复孔的平均值+/-SEM。
图2提供了显示用AAV8.CB.fFIX_GLP1转导的RAG-/-小鼠体内GLP-1表达的研究结果。顶部三条线(正方形、三角形和菱形)对应于三只用AAV8.CB.fFIX_GLP1治疗的小鼠。底部线对应于内部对照小鼠。
图3提供了其中用AAV8.CB.fFIX_GLP1(Db+AAV)治疗糖尿病小鼠(db/db)的研究的结果。使用野生型(WT)，年龄匹配的对照，以及未用载体转染的糖尿病(Db)小鼠。每周测量血清葡萄糖水平。数值是平均值+/-SEM。
图4是显示实施例2和3中所使用的GLP-1构建体的构建策略的图解。该图显示了CB7启动子、猫的因子IX前肽、GLP-1(7-37)和polyA序列。
图5提供了被转染的HuH7细胞中活性GLP-1表达的体外评估结果。如实施例1中所述，以下序列中的每一条被置于GLP-1序列的上游：蛋白质S前肽(Prot S)、白蛋白前肽(Alb)、具有弗林蛋白酶位点的IL2前导序列(IL2Fur)、具有弗林蛋白酶位点的白蛋白前肽(Alb Fur)、因子IX前肽(FIX)、没有弗林蛋白酶位点的IL2前导序列(IL2)和未转染的HuH7细胞。所有使用的序列都是猫的序列。
图6提供了被转染细胞中活性GLP-1表达的体外评估结果。如实施例1中所述，以下序列中的每一条被置于GLP-1序列的上游：具有弗林蛋白酶位点的IL2前导序列(IL2Fur)、具有弗林蛋白酶位点的白蛋白前肽(AlbFur)、因子IX前肽(FIX)、凝血酶前导序列、具有弗林蛋白酶位点的甘露糖苷酶前导序列(ManFur)和未被转染的细胞(tc+)。所有使用的序列都是猫的序列。
图7提供了如实施例5所述在野生型小鼠中施用三种不同GLP-1构建体的结果。用5×1010个相应载体注射各4只小鼠的群组，并且评估活性GLP-1的表达。
图8提供了如实施例7中所述在健康猫中施用三种不同GLP-1构建体的结果。在所示时间点评估血液中的活性GLP-1表达。
本发明的详细描述
GLP-1表达构建体已经被开发用于包括伴侣动物和人类在内的受试者，其中前导序列前肽是衍生自兽医或人类患者物种的内源性蛋白质。合意地，在裂解和分泌之后，从构建体产生的所有产物(即游离前肽和活性GLP-1)都是非免疫原性的自身肽。
本文所述的GLP-1构建体的特征在于与作为独立治疗剂施用GLP-1肽相比，它们提供延长的循环GLP-1半衰期。这归因于载体内所含表达盒的持续表达，以及GLP-1活性肽N末端的正确加工。
本文描述了经由多种途径、并且特别是通过重组载体(例如rAAV载体)介导的体内表达将这些构建体递送至有需要的受试者。本文还提供了在用于治疗有需要的受试者的T2DM或代谢综合症并且延长受试者中GLP-1的半衰期的方案中使用这些构建体的方法。另外，本文提供了增强受试者中GLP-1活性的方法。本文还提供了用于在有需要的受试者中诱导体重减轻的方法。
胰高血糖素样肽1或GLP-1是衍生自胰高血糖素原基因的转录产物的肠促胰岛素。在体内，胰高血糖素基因表达180个氨基酸的前多肽原(prepropolypeptide)，所述前多肽原被蛋白水解加工以形成胰高血糖素(两种形式GLP-1和GLP-2)。原始测序研究指示GLP-1具有37个氨基酸残基。然而，后续信息显示此肽是前肽，并且被另外加工以从氨基末端去除6个氨基酸，以形成GLP-1的活性形式GLP-1(7-37)。在37位的甘氨酸在体内也转变为酰胺以形成GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺是等效的促胰岛素激素。因此，如本文所用，可用于本文的GLP-1的生物学“活性”形式是：GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7-36)NH2。
为了方便起见，“野生型”GLP-1(7-37)的序列(即人类GLP-1的天然序列)以SEQ IDNO:1：HAEGTFTSDV SSYLEGQAAKEFIAWL VKGR G显示。此野生型氨基酸序列用于以下实施例中并且在各种物种(包括人类、猫和狗)中是保守的。然而，如本文所用，术语GLP-1是指GLP-1的任何活性形式，例如GLP-1(7-37)或GLP-1(7-36)酰胺。另外，在一个实施方案中，术语GLP-1是指GLP-1肽的功能变体。功能变体包括衍生自不同物种的同系物。GLP-1的N末端(活性部分)和其家族肽共有高度的序列一致性。然而，在各物种之间观察到GLP-1蛋白质中的一些变异，尤其是在下面的粗体残基中：
在一个实施方案中，GLP-1的功能变体包括与本文所述或本领域已知的GLP-1核酸或氨基酸序列相比可包括最高约10％变化的变体，所述变体保留野生型序列的功能。如本文所用，“保留功能”是指核酸或氨基酸以与野生型序列相同的方式起作用，尽管表达或活性的水平不一定相同。例如，在一个实施方案中，与野生型序列相比，功能变体的表达或活性增加。在另一实施方案中，与野生型序列相比，功能变体的表达或活性降低。在一个实施方案中，与野生型序列相比，功能变体具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的表达或活性增加或降低。
在另一实施方案中，GLP-1的功能变体包括与本文所述或本领域已知的GLP-1核酸或氨基酸序列相比可包括最高约20％变化的变体，该等变体保留野生型序列的功能。
在一个实施方案中，GLP-1的功能变体包括与本文所述或本领域已知的GLP-1核酸或氨基酸序列相比可包括最高约30％变化的变体，该等变体保留野生型序列的功能。
在一个实施方案中，术语GLP-1是指其中与上文产生的序列(SEQ ID NO:1)相比，已进行一个或多个氨基酸取代的活性GLP-1。在一个实施方案中，在其中在物种间显示变异的残基(即，上文的粗体残基)中进行一个或多个氨基酸取代。在另一实施方案中，在其中在物种间显示保守的残基中进行一个或多个氨基酸取代。尽管GLP-1在物种间共有高度一致性，但可能需要基于载体最终预期施用的受试者的物种来选择GLP-1序列。在一个实施例中，受试者是哺乳动物。例如，在一个实施方案中，如果受试者是猫，则GLP-1序列是衍生自猫蛋白质。在另一实施方案中，GLP-1序列是衍生自犬蛋白质。在又一实施方案中，GLP-1序列是衍生自人类蛋白质。在另一实施方案中，GLP-1序列是衍生自非人类灵长类动物蛋白质。在另一实施方案中，GLP-1是衍生自牛、羊或猪蛋白质。在又一实施方案中，GLP-1是衍生自啮齿动物。在一个实施方案中，GLP-1序列编码GLP-1(7-37)。在另一实施方案中，GLP-1序列是SEQ ID NO:1。在另一实施方案中，GLP-1序列是SEQ ID NO:1的aa 1-29(其对应于野生型GLP-1的aa 7-36)。
如本文所用，术语“衍生”或“衍生自”是指序列或蛋白质源自特定的受试者物种或与源自特定受试者物种的蛋白质或序列共有相同的序列。例如，“源自”犬的前肽序列与如在犬中表达的同一前肽序列共有相同的序列(或其变体，如本文所定义)。然而，指定的核酸或氨基酸实际上不需要源自犬。能够产生所需序列的各种技术已为本领域知晓，包括诱变类似蛋白质(例如同系物)或人工产生核酸或氨基酸序列。无论衍生的序列的实际来源如何，“衍生的”核酸或氨基酸都保留“衍生”其的物种中相同核酸或氨基酸的功能。
如本文所用，术语“GLP-1构建体”、“GLP-1表达构建体”和同义词包括与前肽序列组合的如本文所述的GLP-1序列。术语“GLP-1构建体”、“GLP-1表达构建体”和同义词可用于指编码前肽和GLP-1的核酸序列或其表达产物。
本文所述的GLP-1构建体还包括前肽序列。如本文所用，术语前导序列、前肽、信号序列、前导肽和类似同义词是指在体内从最终活性GLP-1肽裂解的序列。所述“前肽”序列可包括一条以上所述序列，例如信号序列和前肽序列。虽然内源性GLP-1是以激素原(胰高血糖素原，其被裂解成GLP-1的活性形式)来表达，但合意地，本文所述构建体中使用的前肽是衍生自与GLP-1异源的蛋白质的前导序列。
在一个实施方案中，前肽衍生自最终预期施用的相同物种。例如，在一个实施方案中，期望的受试者是猫，并且前肽序列是衍生自猫蛋白质。在另一实施方案中，前肽序列是衍生自犬蛋白质。在又一实施方案中，前肽序列是衍生自人类蛋白质。在另一实施方案中，前肽序列是衍生自非人类灵长类动物蛋白质。在另一实施方案中，前肽是衍生自牛、羊或猪蛋白质。在又一实施方案中，前肽是衍生自啮齿类动物蛋白质。
可改变和/或选择前肽的长度以便增强体内GLP-1构建体的表达。因此，可针对合意长度来选择内源性前肽，或者可对所需的前肽进行改造以产生保留野生型前肽的功能但具有更合意的序列长度的前肽。
合意地，前肽添加至少约19个氨基酸至GLP1的长度，使得最终前肽-GLP-1表达产物的长度为至少约45-50个氨基酸。在一个实施方案中，前肽的长度为至少约35个氨基酸，使得最终前肽-GLP-1表达产物的长度为至少约65个氨基酸。由于这些尺寸要求，白蛋白和凝血因子是前肽的合意来源。如本文所述的这些前肽的突变体和变体也可用于本文所述的组合物和方法中。具体来说，本文所述前肽的N末端截短片段(即保留C-末端部分)是有用的，前提是它们保留将表达产物适当加工成活性GLP-1所需的裂解信号。
在一个实施方案中，所需前肽的功能变体包括与本文所述或本领域已知的前肽核酸或氨基酸序列相比可包括最高约10％变化的变体，所述变体保留野生型序列的功能。如本文所用，“保留功能”是指核酸或氨基酸以与野生型序列相同的方式起作用，尽管表达或活性的水平不一定相同。例如，在一个实施方案中，与野生型序列相比，功能变体的表达或活性增加。在另一实施方案中，与野生型序列相比，功能变体的表达或活性降低。在一个实施方案中，与野生型序列相比，功能变体具有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的表达或活性增加或降低。
在另一实施方案中，所需前肽的功能变体包括与本文所述或本领域已知的前肽核酸或氨基酸序列相比可包括最高约20％变化的变体，所述变体保留野生型序列的功能。
在另一实施方案中，所需前肽的功能变体包括与本文所述或本领域已知的前肽核酸或氨基酸序列相比可包括最高约30％变化的变体，所述变体保留野生型序列的功能。
在一个实施方案中，前肽序列与另一序列组合以提高N末端加工的效率。在一个实施方案中，前肽序列与弗林蛋白酶裂解位点组合。在一个实施方案中，弗林蛋白酶序列包含RX[R/K]R共有序列。在另一实施方案中，弗林蛋白酶序列包含序列RKRR。本领域技术人员可修饰弗林蛋白酶位点。对于含有实验证实的弗林蛋白酶裂解位点、底物、物种、实验方法、实验的原始出版物和靶向弗林蛋白酶底物的相关药物的数据库FurinDB的论述，参见Tian等人，Int.J.Mol.Sci,2011,12:1010-5，该文件以引用方式并入本文中。
在一个实施方案中，前肽是因子IX前肽。在另一实施方案中，前肽是因子II前肽。在另一实施方案中，前肽是因子VII前肽。在另一实施方案中，前肽是因子X前肽。在另一实施方案中，前肽是蛋白质C前肽。在另一实施方案中，前肽是蛋白质S前肽。在另一实施方案中，前肽是白蛋白前肽。在另一实施方案中，前肽是甘露糖苷酶前肽。在另一实施方案中，前肽是衍生自骨“gla”蛋白质。在一个实施方案中，前肽的长度为至少约19至100(包括两个端点)个氨基酸，包括其间的任一整数。在另一实施方案中，前肽的长度为约25个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约35个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约40个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约40个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约45个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约50个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约55个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约60个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约65个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约70个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约75个氨基酸。在另一实施方案中，前肽的长度为约80、85、90、95或100个氨基酸。在一个实施方案中，前肽的长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个氨基酸。
术语“氨基酸取代”和其同义词旨在涵盖通过用另一取代性氨基酸置换氨基酸进行的氨基酸序列的修饰。取代可能是保守取代。其也可能是非保守取代。就两个氨基酸来说，术语保守旨在意味着所述氨基酸共有本领域技术人员公认的共同性质。例如，氨基酸具有疏水性非酸性侧链，氨基酸具有疏水性酸性侧链，氨基酸具有亲水性非酸性侧链，氨基酸具有亲水性酸性侧链，和氨基酸具有亲水性碱性侧链。常见的性质还可以是氨基酸具有疏水性侧链，氨基酸具有脂肪族疏水性侧链，氨基酸具有芳香族疏水性侧链，氨基酸具有极性中性侧链，氨基酸具有带电的侧链，氨基酸具有带电的酸性侧链和氨基酸具有带电的碱性侧链。天然存在的和非天然存在的氨基酸都是本领域已知的，并且可在实施方案中用作取代性氨基酸。用于置换氨基酸的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括(但不限于)编码氨基酸序列的核苷酸序列的突变。本文所提及的“一个或多个”旨在涵盖(例如)1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个的个别实施方案。
在另一实施方案中，GLP-1肽或前肽包括与GLP-1序列或前肽序列相比可包括最高约10％变化的变体，如本文所描述的那些术语。即，GLP-1肽或前肽与本文所提供和/或本领域已知的的GLP-1或前肽序列共有约90％一致性至约99.9％一致性，约95％一致性至约99％一致性或约97％至约98％一致性。
除了本文提供的GLP-1肽和前肽之外，还提供了编码这些肽的核酸序列。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的GLP-1肽的核酸序列。在另一实施方案中，这包括编码SEQID NO:1的GLP-1序列的任何核酸序列。GLP-1(7-37)的野生型核酸序列是以SEQ ID NO:56来提供。猫胰高血糖素的序列是已知的并且可参加(例如)NCBI参考序列：XM_006935320.1。犬胰高血糖素的序列是已知的并且可参见(例如)NCBI参考序列：NM_001003044.1。在一个实施方案中，编码GLP-1的核酸序列是编码本文所述的GLP-1肽中的任一种的密码子优化的序列。在一个实施方案中，密码子优化的序列与本领域已知或本文所述的GLP-1核酸序列共有至少约60％的一致性。在一个实施方案中，密码子优化的序列与本领域已知或本文描述的GLP-1核酸序列共有至少约70％的一致性。在一个实施方案中，密码子优化的序列与本领域已知或本文所述的GLP-1核酸序列共有至少约80％的一致性。在一个实施方案中，密码子优化的序列与本领域已知或本文所述的GLP-1核酸序列共有至少约90％的一致性。在一个实施方案中，GLP-1序列被优化用于在猫中表达。在一个实施方案中，GLP-1(7-37)的核酸序列是以SEQ ID NO:2来提供。在另一实施方案中，提供了编码本文所述前肽序列中的任一种的核酸序列。在一个实施方案中，核酸序列编码因子IX前肽序列。在另一实施方案中，编码猫因子IX前肽序列的核酸序列是SEQ ID NO:4。
在一个实施方案中，前肽和GLP-1肽被排列成使得当表达产物时，GLP-1肽的N末端氨基酸残基紧接在前肽的C-末端氨基酸残基之后，且中间没有任何其他残基。因此，合意地，前肽和GLP-1肽的编码区被并入至单一核酸序列中，且在所述前肽和GLP-1的编码序列之间没有连接体。
当需要GLP-1肽和/或前肽的变体或片段时，可使用野生型核酸序列的定点诱变来生成这些肽的编码序列。或者或另外，基于网络或商业可用的计算机程序以及基于服务的公司可用于将氨基酸序列反向翻译成核酸编码序列(包括RNA和/或cDNA)。参见例如EMBOSS的backtranseq，http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/；Gene Infinity(http://www.geneinfinity.org/sms-/sms_backtranslation.html)；ExPasy(http://www.expasy.org/tools/)。在一个实施方案中，RNA和/或cDNA编码序列被设计为在最终预期施用的受试者物种中最佳表达，如本文所论述。因此，在一个实施方案中，编码序列被设计为在猫中最佳表达。因此，在另一实施方案中，编码序列被设计为在犬中最佳表达。因此，在一个实施方案中，编码序列被设计为在人类中最佳表达。因此，在一个实施方案中，编码序列被设计为在灵长类动物中最佳表达。在另一实施方案中，编码序列被设计为在羊、牛或猪中最佳表达。在另一实施方案中，编码序列被设计为在啮齿类动物中最佳表达。
可使用密码子优化来设计编码序列以进行最佳表达。密码子优化的编码区域可通过各种不同的方法来设计。此优化可使用在线提供的方法、所公布的方法或提供密码子优化服务的公司进行。在(例如)国际专利申请公布号WO 2015/012924中描述了一种密码子优化方法，所述案件以引用方式并入本文。简言之，用同义密码子序列修饰编码产物的核酸序列。可适当地修改产物的开放阅读框(ORF)的整个长度。然而，在一些实施方案中，ORF的仅一个片段可被改变。通过使用这些方法中的一种，可将频率应用于任何给定的多肽序列，并且产生编码多肽的密码子优化的编码区的核酸片段。
在核酸序列的背景中，术语“一致性百分比(％)”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”或“一致百分比”是指两条序列中的碱基在对应比对时是相同的。序列一致性比较的长度可遍及基因组的全长、基因编码序列的全长或至少约100至150个核苷酸的片段，或者根据需要来定。然而，也可能需要较小片段之间的一致性，所述较小片段例如至少约9个核苷酸，通常至少约20至24个核苷酸，至少约28至32个核苷酸，至少约36个或更多个核苷酸。多序列比对程序也可用于核酸序列。所述程序的实例包括可经由因特网上的Web服务器访问的“Clustal W”、“CAP Sequence Assembly”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”。所述程序的其他来源是本领域技术人员已知的。或者，也可使用VectorNTI实用程序。本领域已知的许多算法也可用于测量核苷酸序列的一致性，包括上述程序中所含的那些算法。作为另一实例，可使用GCG 6.1版本中的程序FastaTM来比较多核苷酸序列。FastaTM提供询问序列与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比。例如，核酸序列之间的序列一致性百分比可使用FastaTM以如GCG 6.1版本(以引用方式并入本文中)中提供的默认参数(字长为6，用于评分矩阵的NOPAM因子)来测定。
在氨基酸序列的背景中，术语“一致性百分比(％)”、“序列一致性”、“序列一致性百分比”或“一致百分比”是指两条序列中的残基在对应比对时是相同的。氨基酸序列的一致性百分比可遍及蛋白质全长、多肽、约70个氨基酸至约100个氨基酸或其肽片段或相应的核酸序列编码序列容易地测定。适合的氨基酸片段的长度可以是至少约8个氨基酸，并且可长达约150个氨基酸。通常，当提及两条不同序列之间的“一致性”、“同源性”或“相似性”时，参考“比对”序列来确定“一致性”、“同源性”或“相似性”。“比对”序列或“比对”是指通常含有与参考序列相比缺失或附加碱基或氨基酸的校正的多条核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。比对可使用各种公开或商业可用的多序列比对程序中的任一种来进行。对于氨基酸序列可利用序列比对程序，例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，这些程序中的任一种都以默认设置使用，但本领域的技术人员可根据需要改变这些设置。或者，本领域技术人员可利用提供至少与所参考算法和程序所提供的一样的一致性或比对水平的另一算法或计算机程序。参见例如JDThomson等人，Nucl.Acids.Res.,“A comprehensive comparison of multiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)。
根据本文的教导可制备前肽和GLP-1序列的各种组合以产生期望的GLP-1表达构建体。此包括本领域已知的前肽序列与如本文所述的GLP-1活性肽序列的组合。
在一些实施方案中，凝血因子前肽的使用是合意的。维生素k依赖性血浆蛋白的前肽部分高度保守。参见Hemostasis andThrombosis:Basic Principles and ClinicalPractice,Colman编辑，第1827页，有图解.Philadelphia,LippincottWilliams&Wilkins,2006。
在一个实施方案中，前肽序列是因子IX序列。在另一实施方案中，前肽序列包括与弗林蛋白酶位点组合的因子IX序列。如下文实施例所展示，并且在一个实施方案中，前肽序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的猫(家猫)因子IX前导序列。在一个实施方案中，因子IX前导序列包括信号和活化序列(前序列)并且长约46个氨基酸。在一个实施方案中，GLP-1构建体编码以SEQ ID NO:5所述的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码GLP-1构建体的核酸序列是以SEQ ID NO:6来陈述。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:5的密码子优化序列。猫因子IX的氨基酸序列是已知的，并且可参见：GenBank登录号AAR26346.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:11中再现。在另一实施方案中，前肽序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的犬(家犬)因子IX前导序列。犬因子IX的氨基酸序列是已知的，并且可参见：NCBI参考序列：NP_001003323.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:12中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:12的氨基酸1-39。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:13所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:13的密码子优化序列。在另一实施方案中，前肽序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的人类因子IX前导序列。人类因子IX的氨基酸序列是已知的，并且可参见例如：NCBI参考序列：AAA98726.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:14中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQID NO:14的氨基酸1-46。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:15所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:15的密码子优化序列。使用本领域已知的因子IX的其他同种型可制备类似的构建体。
在另一实施方案中，前肽序列是因子VII序列。在另一实施方案中，前肽序列包括与弗林蛋白酶位点组合的因子VII序列。在一个实施方案中，因子VII前导序列包括信号和活化序列(前序列)并且长约37-40个氨基酸。在另一实施方案中，前肽序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的猫(家猫)因子VII前导序列。猫因子VII的氨基酸序列是已知的，并且可参见：GenBank登录号XP_003980582.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:16中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:16的氨基酸1-40。在一个实施方案中，GLP-1构建体编码以SEQ ID NO:17所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:17的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP1(7-37)野生型序列组合的犬因子VII前导序列。犬因子VII的氨基酸序列是已知的，并且可参见：NCBI参考序列：ABB02531.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:18中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQID NO:18的氨基酸1-40。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:19所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:19的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的人类因子VII前导序列。人类因子VII的氨基酸序列是已知的，并且可参见例如：NCBI参考序列：ACB87203.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:20中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:20的氨基酸1-60。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:21所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:21的密码子优化序列。具有38个aa的前导序列的人类因子VII的替代形式有时被称为变体2。与变体1相比，此变体2在5'编码区中缺少外显子，但保留了阅读框。所编码的同种型(b)短于同种型(a)。人类因子VII变体2的氨基酸序列是已知的并且可参见例如：NCBI参考序列：NP_062562.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:22中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:22的氨基酸1-38。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:23所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ IDNO:23的密码子优化序列。使用本领域已知的因子VII的其他同种型可制备类似的构建体。
抗凝血因子II也被称为凝血酶原。如本文所用，因子II可与凝血酶原和凝血酶互换使用。在一个实施方案中，前肽序列是因子II前导序列。在另一实施方案中，前肽序列包括与弗林蛋白酶位点组合的因子II(凝血酶)序列。在一个实施方案中，前肽长约41-43个氨基酸。在另一实施方案中，前肽序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的猫因子II前导序列。猫因子II的氨基酸序列是已知的，并且可参见：GenBank登录号XP_003993267.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:24中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:24的氨基酸1-43。在一个实施方案中，GLP-1构建体编码以SEQ ID NO:25所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:25的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的犬因子II前导序列。犬因子II的氨基酸序列是已知的并且可参见：NCBI参考序列：XP_003639742.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:26中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:26的氨基酸1-41。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:27所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:27的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的人类因子II前导序列。人类因子II的氨基酸序列是已知的并且可参见例如：NCBI参考序列：NP_000497.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:28中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:28的氨基酸1-43。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:29所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ IDNO:29的密码子优化序列。使用本领域已知的因子II的其他同种型可制备类似的构建体。
在另一实施方案中，前肽序列是因子IX前导序列。在另一实施方案中，前肽序列包括与弗林蛋白酶位点组合的因子IX序列。在一个实施方案中，前肽长约39-46个氨基酸。在另一实施方案中，前肽序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的猫因子IX前导序列。猫因子IX的氨基酸序列是已知的并且可参见：GenBank登录号NP_001009377.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:30中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:30的氨基酸1-46。在一个实施方案中，GLP-1构建体编码以SEQ ID NO:31所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:31的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP1(7-37)野生型序列组合的犬因子IX前导序列。犬因子IX的氨基酸序列是已知的并且可参见：NCBI参考序列：NP_001003323.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:32中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:32的氨基酸1-39。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:33所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:33的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的人类因子IX前导序列。人类因子IX的氨基酸序列是已知的并且可参见例如：NCBI参考序列：NP_000124.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:34中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:34的氨基酸1-46。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:35所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:35的密码子优化序列。使用本领域已知的因子IX的其他同种型可制备类似的构建体。
在另一实施方案中，前肽序列是蛋白质S(也称为维生素K依赖性蛋白质S)前导序列。在另一实施方案中，前肽序列包括与弗林蛋白酶位点组合的蛋白质S序列。在一个实施方案中，前肽长约36-57个氨基酸。在另一实施方案中，前肽序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的猫蛋白质S前导序列。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:7的氨基酸1-57。在一个实施方案中，GLP-1构建体编码以SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:7的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体由SEQ ID NO:8或其密码子优化序列编码。猫蛋白质S的氨基酸序列是已知的并且可参见：GenBank登录号XP_011284289，为了方便起见其在SEQ ID NO:36中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:36的氨基酸1-36。在一个实施方案中，GLP-1构建体编码以SEQID NO:37所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:37的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的犬蛋白质S前导序列。犬蛋白质S的氨基酸序列是已知的并且可参见：NCBI参考序列：XP_005639500.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:38中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQID NO:38的氨基酸1-41。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:39所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:39的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的人类蛋白质S前导序列。人类蛋白质S的氨基酸序列是已知的并且可参见例如：UniProtKB/Swiss-Prot：P07225.1，为了方便起见其在SEQ IDNO:40中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ IDNO:40的氨基酸1-41。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:41所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:41的密码子优化序列。使用本领域已知的蛋白质S的其他同种型可制备类似的构建体。
在另一实施方案中，前肽序列是蛋白质Z(也称为维生素K依赖性蛋白质Z)前导序列。在另一实施方案中，前肽序列包括与弗林蛋白酶位点组合的蛋白质Z序列。在一个实施方案中，前肽长约62个氨基酸。在另一实施方案中，前肽序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的猫蛋白质Z前导序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与SEQ ID NO:1所示的GLP-1(7-37)序列组合的犬蛋白质Z前导序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的人类蛋白质Z前导序列。人类蛋白质Z的氨基酸序列是已知的并且可参见例如：GenBank：AAA36501.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:42中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:42的氨基酸1-62。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:43所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ IDNO:43的密码子优化序列。使用本领域已知的蛋白质Z的其他同种型可制备类似的构建体。
在另一实施方案中，前肽序列是蛋白质C(也称为维生素K依赖性蛋白质C)前导序列。在另一实施方案中，前肽序列包括与弗林蛋白酶位点组合的蛋白质C序列。在一个实施方案中，前肽长约42个氨基酸。在另一实施方案中，前肽序列是与SEQ ID NO:1所示的GLP-1(7-37)序列组合的猫蛋白质C前导序列。猫蛋白质C的氨基酸序列是已知的并且可参见：NCBI参考序列：XP_011283508.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:44中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:44的氨基酸1-42。在一个实施方案中，GLP-1构建体编码以SEQID NO:45所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:45的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP1(7-37)野生型序列组合的犬蛋白质C前导序列。犬蛋白质C的氨基酸序列是已知的并且可参见：NCBI参考序列：GenBank：CAA05126.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:46中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQID NO:46的氨基酸1-42。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:47所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:47的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与SEQ ID NO:1所示的GLP-1(7-37)序列组合的人类蛋白质C前导序列。人类蛋白质C的氨基酸序列是已知的并且可参见例如：GenBank：AAA60166.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:48中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQID NO:48的氨基酸1-42。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:49所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:49的密码子优化序列。使用本领域已知的蛋白质C的其他同种型可制备类似的构建体。
在另一实施方案中，前肽序列是白蛋白前导序列。在另一实施方案中，前肽序列包括与弗林蛋白酶位点组合的白蛋白前导序列。在一个实施方案中，前肽长约24个氨基酸。在另一实施方案中，前肽序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的猫白蛋白前导序列。猫白蛋白的氨基酸序列是已知的并且可参见：GenBank登录号CAA59279.1，为了方便起见其在SEQID NO:50中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:50的氨基酸1-24。在一个实施方案中，GLP-1构建体编码以SEQ ID NO:9所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:9的密码子优化序列。在一个实施方案中，编码猫白蛋白前肽-GLP-1构建体的核酸序列是SEQ ID NO:10。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的犬白蛋白前导序列。犬白蛋白的氨基酸序列是已知的并且可参见：NCBI参考序列：CAB64867.1，为了方便起见其在SEQ IDNO:51中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQ ID NO:51的氨基酸1-24。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ IDNO:52所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:52的密码子优化序列。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列是与GLP-1(7-37)野生型序列组合的人类白蛋白前导序列。人类白蛋白的氨基酸序列是已知的并且可参见例如：NCBI参考序列：AAA98797.1，为了方便起见其在SEQ ID NO:53中再现。在一个实施方案中，前肽序列是SEQID NO:53的氨基酸1-24。在另一实施方案中，GLP-1构建体序列编码以SEQ ID NO:54所述的氨基酸序列。在又一实施方案中，GLP-1构建体是编码SEQ ID NO:54的密码子优化序列。使用本领域已知的白蛋白的其他同种型可制备类似的构建体。
在一个实施方案中，编码本文所述的GLP-1构建体的核酸序列被改造至任一适合的遗传元件中，例如，裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、RNA分子(例如，mRNA)、附加体等等，其将其上携带的hLDLR序列转移至宿主细胞，例如用于生成携带DNA或RNA的纳米颗粒、包装宿主细胞中的病毒载体和/或用于递送至受试者中的宿主细胞。在一个实施方案中，遗传元件是质粒。所选择的遗传元件可通过任一适合的方法来递送，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包衣团粒、病毒感染和原生质体融合。用于制备所述构建体的方法为熟习核酸操作技术的人员已知，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见例如Green和Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor，NY(2012)。
如本文所用，“表达盒”是指包含GLP-1构建体编码序列(例如，前肽和GLP-1活性肽的编码序列)、启动子并且可包括其他调节序列的核酸分子，所述盒可被改造至遗传元件中和/或包装至病毒载体(例如病毒颗粒)的衣壳中。典型地，用于生成病毒载体的此一表达盒含有侧接有病毒基因组的包装信号和其他表达控制序列(例如本文所述的那些)的本文所述的GLP-1构建体序列。可使用本领域已知的技术(包括例如本文所述的密码子优化)针对特定物种来优化任何表达控制序列。
表达盒通常含有启动子序列作为表达控制序列的一部分。在一个实施方案中，使用肝脏特异性启动子甲状腺素结合球蛋白(TBG)。在本文所述的质粒和载体中，使用CB7启动子。CB7是具有巨细胞病毒增强子元件的鸡β肌动蛋白启动子。或者，可使用其他肝特异性启动子[参见，例如The Liver Specific Gene Promoter Database,Cold Spring Harbor,http://rulai.schl.edu/LSPD，α1抗胰蛋白酶(A1AT)；人类白蛋白，Miyatake等人，J.Virol.,71:512432(1997),humAlb；和B型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人，GeneTher.,3:10029(1996)]。TTR最小增强子/启动子、α抗胰蛋白酶启动子、LSP(845nt)25(需要无内含子的scAAV)。尽管不太合意，但本文所述的载体可使用其他启动子(例如病毒启动子、组成型启动子、调节型启动子[参见，例如，WO2011/126808和WO 2013/04943]或响应于生理诱因的启动子)。
除启动子之外，表达盒和/或载体可含有其他适当的转录起始、终止、增强子序列、有效的RNA加工信号(例如剪接和多聚腺苷酸化(polyA)信号)；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增加编码产物分泌的序列。适合的polyA序列的实例包括例如SV40、牛生长激素(bGH)和TK polyA。适合的增强子的实例尤其包括(例如)甲型胎儿蛋白增强子、TTR最小启动子/增强子、LSP(TH结合球蛋白启动子/α1微球蛋白/双库尼(bikunin)增强子)。
这些控制序列与GLP-1构建体序列“可操作地连接”。如本文所用，术语“可操作地连接”是指与感兴趣基因邻接的表达控制序列以及以反式方式或以一定距离作用以控制感兴趣基因的表达控制序列。
可将表达盒改造至用于产生病毒载体的质粒上。将表达盒包装至AAV病毒颗粒中所需的最小序列是AAV 5'和3'ITR，其可能与衣壳具有相同的AAV来源，或具有不同的AAV来源(以产生AAV假型)。在一个实施方案中，使用来自AAV2的ITR序列或其缺失型式(ΔITR)是为了方便且可加速监管批准。然而，可选择来自其他AAV来源的ITR。当ITR的来源来自AAV2并且AAV衣壳来自另一AAV来源时，所得到的载体可被称为假型化。典型地，用于AAV载体的表达盒包含AAV 5'ITR、前肽-GLP-1活性肽编码序列和任何调节序列以及AAV 3'ITR。然而，这些元件的其他配置可能是适合的。已经描述了称为ΔITR的5'ITR的缩短型式，在所述缩短型式中缺失了D序列和末端断裂位点(trs)。在其他实施方案中，使用全长AAV 5'和3'ITR。
例示性质粒在序列表中有提供。SEQ ID NO:57提供了编码猫蛋白质S前肽-GLP1构建体的质粒的序列，所述构建体的名称为pn1044.CB7.GLP1feprotS。在一个实施方案中，表达盒被改造至SEQ ID NO:57的质粒中。SEQ ID NO:58提供了编码猫IL2前肽(包括弗林蛋白酶位点)-GLP1构建体的质粒的序列，所述构建体的名称为pn1044.CB7.GLP1feIL2fur。在一个实施方案中，表达盒被改造至SEQ ID NO:58的质粒中。SEQ ID NO:59提供了编码猫凝血酶前肽-GLP1构建体的质粒的序列，所述构建体的名称为p1044.CB7.GLP1feThrombin。在一个实施方案中，表达盒被改造至SEQ ID NO:59的质粒中。SEQ ID NO:60提供了编码猫甘露糖苷酶(具有弗林蛋白酶位点)前肽-GLP1构建体的质粒的序列，所述构建体的名称为p1044.CB7.GLP1feManFur。在一个实施方案中，表达盒被改造至SEQ ID NO:60的质粒中。SEQ ID NO:61提供了编码猫白蛋白前肽-GLP1构建体的质粒的序列，所述构建体的名称为p1044GLP1fealb。在一个实施方案中，表达盒被改造至SEQ ID NO:61的质粒中。SEQ ID NO:62提供了编码猫白蛋白(具有弗林蛋白酶位点)前肽-GLP1构建体的质粒的序列，所述构建体的名称为p1044GLP1fealbfur。在一个实施方案中，表达盒被改造至SEQ ID NO:62的质粒中。SEQ ID NO:63提供了编码猫凝血酶(具有弗林蛋白酶位点)前肽GLP1构建体的质粒的序列，所述构建体的名称为p1044GLP1fealbfur。在一个实施方案中，表达盒被改造至SEQ IDNO:62的质粒中。
缩写“sc”是指自互补。“自互补AAV”是指具有其中已经设计了由重组AAV核酸序列携带的编码区以形成分子内双链DNA模板的表达盒的质粒或载体。在感染后，不是等待细胞介导的第二链合成，而是scAAV的两个互补半部将缔合以形成一个双链DNA(dsDNA)单元，所述单元准备立即复制和转录。参见例如D M McCarty等人，“Self-complementaryrecombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficienttransduction independently ofDNA synthesis”,Gene Therapy,(2001年8月)，第8卷，第16期，第1248-1254页。自互补的AAV在(例如)美国专利号6,596,535、7,125,717和7,456,683中有描述，所述专利中的每一个的全部内容以引用方式并入本文。
腺相关病毒(AAV)病毒载体是具有AAV蛋白衣壳的AAV DNase抗性颗粒，在所述衣壳中包装有核酸序列用于递送至靶细胞。AAV衣壳由60个衣壳(cap)蛋白质亚单元VP1、VP2和VP3组成，它们视所选AAV以约1:1:10至1:1:20的二十面体对称排列。可选择AAV血清型作为AAV病毒载体(DNase抗性病毒颗粒)的衣壳的来源，所述衣壳包括(例如)AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、rh8、rh.10、任何已知或提及的AAV的变体或尚未发现的AAV。参见例如美国公布专利申请号2007-0036760-A1；美国公布专利申请号2009-0197338-A1；EP 1310571。还参见WO 2003/042397(AAV7和其他猴AAV)、美国专利7790449和美国专利7282199(AAV8)、WO2005/033321和US 7,906,111(AAV9)和WO 2006/110689和WO2003/042397(rh.10)。或者，可使用基于任何所述AAV的重组AAV作为AAV衣壳的来源。这些文件还描述了可选择用于生成AAV的其他AAV并且以引用方式并入。在一些实施方案中，用于病毒载体中的AAVcap可通过上述AAV Cap或其编码核酸中的一种的诱变(即通过插入、缺失或取代)来生成。在一些实施方案中，AAV衣壳是嵌合的，其包含来自前述AAV衣壳蛋白中的两种或三种或四种或更多种的结构域。在一些实施方案中，AAV衣壳是来自两种或三种不同AAV或重组AAV的Vp1、Vp2和Vp3单体的镶嵌体。在一些实施方案中，rAAV组合物包含一种以上上述Cap。
为了将表达盒包装至病毒体中，ITR是在与基因相同的构建体中顺式需要的仅有的AAV组分。在一个实施方案中，从AAV基因组中去除复制(rep)和/或衣壳(cap)的编码序列并以反式方式或通过包装细胞系来提供以便生成AAV载体。例如，如上所述，假型化AAV可能含有来自与AAV衣壳来源不同的来源的ITR。另外或或者，可使用嵌合AAV衣壳。还可选择其他的AAV组分。所述AAV序列的来源在本文中有描述并且也可从学院、商业或公共来源(例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，马纳萨斯，弗吉尼亚州(Manassas,VA))分离或获得。或者，AAV序列可通过参考公布的序列(例如在文献或数据库中获得的公布序列，例如 等)通过合成或其他适合的手段获得。
用于生成和分离适于递送至受试者的AAV病毒载体的方法是本领域已知的。参见例如美国专利7790449；美国专利7282199；WO2003/042397；WO 2005/033321；WO 2006/110689；和US 7588772B2]。在一个系统中，生产细胞系是用编码侧接有ITR的转基因的构建体和编码rep和cap的构建体瞬时转染。在第二系统中，稳定提供rep和cap的包装细胞系是用编码侧接有ITR的转基因的构建体瞬时转染。在这些系统中的每一个系统中，AAV病毒体都是响应于辅助腺病毒或疱疹病毒的感染而产生的，从而需要分离rAAV与污染性病毒。最近，已研发了不需要辅助病毒感染即可使AAV恢复的系统-所需的辅助功能(即，腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29以及疱疹病毒聚合酶)也可由所述系统以反式方式提供。在这些较新的系统中，可通过瞬时转染具有编码所需辅助功能的构建体的细胞来提供辅助功能，或者可改造所述细胞以稳定地含有编码辅助功能的基因，所述基因的表达可在转录或转录后水平上进行控制。在又一系统中，侧接有ITR和rep/cap基因的转基因是通过基于杆状病毒的载体的感染被引入昆虫细胞中。关于这些产生系统的综述，一般参见例如Zhang等人，2009，“Adenovirus adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production,”Human Gene Therapy 20:922-929，所述文献中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文。制备和使用这些和其他AAV产生系统的方法在以下美国专利中也有描述：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065，所述专利中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文。一般参见例如Grieger和Samulski，2005，“Adeno-associated virus as a gene therapyvector:Vector development,production and clinical applications,”Adv.Biochem.Engin/Biotechnol.99:119-145；Buning等人，2008,“Recent developmentsin adeno-associatedvirus vector technology,”J.Gene Med.10:717-733；以及下文所引用的参考文献，所述参考文献中的每一个的全部内容都以引用方式并入本文。用于构建本发明的任一实施方案的方法为熟习核酸操作技术的人员已知，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见例如Green和Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor，NY(2012)。类似地，产生rAAV病毒体的方法是众所周知的，选择适合的方法不是对本发明的限制。参见例如K.Fisher等人，(1993)J.Virol.,70:520-532和美国专利号5,478,745。
任选地，本文所述的GLP-1构建体可经由不同于rAAV的病毒载体来递送。所述其他病毒载体可包括适于基因疗法使用的任何病毒，包括(但不限于)腺病毒；疱疹病毒；慢病毒；逆转录病毒等等。适合地，倘若生成这些其他载体中的一个，则其是作为复制缺陷型病毒载体来产生。
“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指合成的或人造的病毒颗粒，其中含有感兴趣基因的表达盒被包装在病毒衣壳或包膜中，其中也被包装在病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列都是复制缺陷的；即，它们不能生成后代病毒体，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，病毒载体的基因组不包括编码复制所需酶的基因(基因组可被改造为“无病毒基因的(gutless)”-仅含侧接有扩增和包装人造基因组所需的信号的感兴趣的转基因)，但这些基因可在产生期间提供。因此，认为在基因疗法中使用是安全的，因为除了在存在复制所需的病毒酶时，后代病毒体的复制和感染都不能发生。
本文还提供了包括本文所述的病毒载体构建体的组合物。本文所述的药物组合物被设计用于通过任何适合的途径或不同途径的组合递送至有需要的受试者。直接递送至肝脏(任选地经由静脉内，经由肝动脉，或通过移植)、经口、吸入、经鼻内、经气管内、经动脉内、经眼内、经静脉内、经肌内，经皮下、经真皮内和其他非经肠施用途径。本文所述的病毒载体可以单一组合物或多种组合物进行递送。任选地，可递送两种或更多种不同的AAV，或多种病毒[参见例如WO2011/126808和WO2013/049493]。在另一实施方案中，多种病毒可含有不同的复制缺陷型病毒(例如，AAV和腺病毒)。
可将复制缺陷型病毒与生理上可接受的载剂一起调配以用于基因转移和基因疗法应用中。在AAV病毒载体的情形中，可使用基因组拷贝(“GC”)的定量作为调配物中所含剂量的量度。可使用本领域已知的任一方法来测定本发明的复制缺陷型病毒组合物的基因组拷贝(GC)数目。进行AAV GC数目滴定的一种方法如下：首先用DNase处理纯化的AAV载体样品以消除来自产生过程的未壳体化的AAV基因组DNA或污染性质粒DNA。然后使对DNase抗性颗粒经受热处理以从衣壳中释放基因组。然后通过使用靶向病毒基因组特定区域(通常是poly A信号)的引物/探针集进行的实时PCR对所释放基因组进行定量。
此外，复制缺陷型病毒组合物可以含有在约1.0×109GC至大约1.0×1015GC范围内的量的复制缺陷型病毒的剂量单位形式来调配。在另一实施方案中，病毒基因组的此量可以分开剂量来递送。在一个实施方案中，对于约5kg的中等猫或小犬受试者来说，剂量为约1.0×1011GC至约1.0×1012GC。在一个实施方案中，对于约20kg的中等犬受试者来说，剂量为约1.0×1012GC至约1.0×1013GC。中等犬的体重在约5kg至约50kg的范围内。在一个实施方式中，对于约70kg的中等人类受试者来说，剂量为约1.0×1012GC至约1.0×1013GC。中等人类受试者的体重在约55kg至约80kg的范围内。在一个实施方案中，对于受试者来说，剂量为约1.0×1011GC至1.0×1013GC。在另一实施方案中，剂量为约3×1012GC。例如，AAV病毒的剂量可以是约1×1011GC、约5×1011GC、约1×1012GC、约5×1012GC或约1×1013GC。在另一实例中，构建体可以每mL约0.001mg至约10mg的量来递送。在一个实施方案中，对于兽医受试者来说，构建体可以1μL至约100mL的体积来递送。关于将物质施用给各种兽医动物的良好实践的论述参见例如Diehl等人，J.AppliedToxicology,21:15-23(2001)。此文件以引用方式并入本文中。如本文所用，术语“剂量”可指在治疗过程期间递送至受试者的总剂量或在单次(多次)施用中递送的量。
上述重组载体可按照公布的方法递送至宿主细胞。rAAV优选悬浮于生理学相容的载剂中，其可施用给所需的受试者，包括(但不限于)猫、狗、人类或非人类哺乳动物受试者。根据转移病毒所针对的适应症，本领域技术人员可容易地选择适合的载剂。例如，一种适合的载剂包括盐水，其可用各种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)来调配。其他例示性载剂包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。载剂的选择不是本发明的限制。
任选地，除了rAAV和/或变体和载剂之外，本发明的组合物可含有其他常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。适合的例示性防腐剂包括氯丁醇，山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚和对氯苯酚。适合的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
在一个实施方案中，提供了包括一种或多种病毒载体的组合物，所述病毒载体各自包含一种或多种如本文所述的GLP-1构建体。例如，在一个实施方案中，组合物包括编码前肽-GLP-1-(7-37)构建体的AAV载体。所述组合物还包括编码前肽和GLP-1-(7-36)NH2构建体的AAV载体。对于组合物中含有的每种构建体，AAV载体衣壳的来源可以是相同的或不同的。
本文所述的病毒载体和其他构建体可用于制备具有下列各种用途的药剂：用于将GLP-1构建体递送至有需要的受试者，向受试者提供具有延长的半衰期的GLP-1，和/或用于治疗受试者的II型糖尿病或代谢综合症。因此，另一方面提供了治疗糖尿病的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包括如本文所述的含有前肽-GLP-1表达盒的病毒载体。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一实施方案中，受试者是猫或犬。在另一实施方案中，受试者是人类。
在另一实施方案中，提供了用于治疗猫中的T2DM的方法。所述方法包括施用包括包含编码猫因子IX前肽和GLP-1活性部分的序列的核酸分子的病毒载体，其中当表达时，GLP-1的N末端氨基酸紧接在前肽的C末端氨基酸之后。
另一方面提供了治疗代谢综合症的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包括如本文所述的含有前肽-GLP-1表达盒的病毒载体。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一实施方案中，受试者是猫或犬。在另一实施方案中，受试者是人类。
另一方面提供了减轻受试者体重的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的组合物。在一个实施方案中，所述组合物包括如本文所述的含有前肽-GLP-1表达盒的病毒载体。在一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一实施方案中，受试者是猫或犬。在另一实施方案中，受试者是人类。
治疗过程可任选地涉及重复施用相同的病毒载体(例如，AAV8载体)或不同的病毒载体(例如，AAV8和AAVrh10)。还可使用本文所述的病毒载体来选择其他组合。任选地，可将本文所述的组合物组合在涉及其他糖尿病药物或基于蛋白质的疗法(包括例如GLP-1类似物、胰岛素、口服降血糖药物(磺酰脲类、双胍类、噻唑烷二酮类和α葡糖苷酶抑制剂)的方案中。任选地，可将本文所述的组合物组合在涉及包括饮食和锻炼方案的生活方式改变的方案中。
要注意的是，术语“一(a或an)”是指一个或多个。因此，术语“一(a或an)”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
词语“包含(comprise、comprises和comprising)”应理解为包含性的，而不是排他性的。词语“由......组成(consist、consisting)”和其变化形式应理解为排他性的，而不是包含性的。虽然说明书中的各个实施方案是使用“包含”语言来呈现的，但在其他情况下，相关实施方案也旨在使用“由......组成”或“基本上由...组成”语言来理解和描述。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“约”意指与给出的参考值相差10％。
如本文所用的术语“调节”或其变化形式是指组合物抑制生物学路径的一种或多种组分的能力。
“受试者”是哺乳动物，例如人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人类灵长类动物，例如猴、黑猩猩、狒狒或大猩猩。如本文所用，术语“受试者”与“患者”可互换使用。
如本文所用，“疾病”、“病症”和“病况”可互换使用，以指示受试者中的异常状态。
除非在本说明书中另外定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义，并且通过参考所公布的文本，所述文本为本领域技术人员提供了对本申请中所使用的许多术语的通用指南。
以下实施例仅是说明性的，并且不意图限制本发明。
实施例1-GLP-1载体的构建
选择几种含有具有已知裂解位点的前肽的分泌蛋白质。这些蛋白质包括凝血因子(因子II、VII、IX、X、蛋白质C、蛋白质S)和肝脏产生的其他蛋白质(白蛋白)。将前肽序列置于GLP-1(7-37)氨基酸序列的上游。还设计了仅含有白细胞介素-2信号肽接着是GLP-1(7-37)的控制序列。反向翻译所得到的蛋白质序列并且进行密码子优化，随后添加kozak共有序列、终止密码子和克隆位点。通过GeneArt产生序列，并且将其克隆至含有鸡β肌动蛋白启动子与CMV增强子的表达载体(p1044)中。表达构建体侧接有AAV2ITR。猫FIX_GLP1氨基酸序列是以SEQ ID NO:5显示。猫的ProtS_GLP1氨基酸序列是以SEQ ID NO:7显示。猫的Alb_GLP1氨基酸序列是以SEQ ID NO:9显示。猫的FVII_GLP1氨基酸序列是以SEQ ID NO:17显示。猫的FII_GLP1氨基酸序列是以SEQ ID NO:25显示。猫的ProtC_GLP1氨基酸序列是以SEQID NO:45显示。
实施例2-体外分析
根据制造商的说明书，使用lipofectamine 2000将在GLP-1序列上游仅含有IL-2信号肽或猫因子IX前肽的构建体的纯化质粒转染至90％铺满的HEK 293细胞的6孔板的一式三份的孔中。转染后48小时收获上清液，并且使用高灵敏度N末端GLP-1ELISA(Millipore)测量活性GLP-1。两个构建体的表达显示于图1中。图1显示IL-2对照中GLP-1的表达基本为零，而因子IX构建体的表达为约60pM。
实施例3-体内GLP-1表达
如前所述，通过三重转染和碘克沙醇(iodixanol)梯度纯化将含有猫因子IX前肽的构建体包装在AAV血清型8载体中。用载体(1012GC/kg)于50微升PBS中的静脉注射液治疗RAG-/-小鼠(n＝4)小鼠。用作内部对照的一只动物(小鼠D)不能实现静脉内途径。通过在含有5微升DPP-IV抑制剂的血清分离管(Millipore)中分离全血来连续收集血清，并如上所述对活性GLP-1进行分析。血清活性GLP-1浓度显示于图2中。图2显示对照小鼠中的活性GLP-1的水平低至2pM。相反，在注射AAV8.CB.fFIX_GLP1的三只小鼠中，GLP-1浓度适于1pM，在第14天突然升高(在小鼠C中升高至约10pM)，在第21天减少，然后在第42天时反弹。尽管在人造构建体中递送GLP-1，但在裂解前肽之后，该肽具有活性，如图2所示。除了肝脏(图2)之外，已表征肌肉中前肽的加工(未显示数据)。即使过度表达，加工也是有效的。
实施例4-用GLP-1构建体体内治疗糖尿病
用因子IX前肽载体(3×1012GC/kg，n＝5)于50微升PBS中的静脉注射液治疗6至7周龄的糖尿病(db/db)小鼠。未治疗的年龄匹配的db/db小鼠(n＝5)和未治疗的db+/-小鼠(n＝5)(WT)用作对照。每周使用基于板的葡萄糖分析(Caymen Chemical)来测量血清葡萄糖。血清葡萄糖数据显示于图3中。图3显示在治疗之后，用AAV8.CB.fFIX_GLP1治疗的糖尿病小鼠的血清葡萄糖水平始终低于未治疗的年龄匹配的糖尿病(Db)小鼠。
实施例5-各种构建体的体内GLP-1表达
本研究旨在分析用于AAV介导的GLP-1表达的可能的临床候选。我们以前观察到因子IX弗林蛋白酶前肽能够在小鼠中表达n末端裂解的glp1(活性glp-1)。然后，我们在黑6野生型小鼠中尝试了各种其他的构建体来评估可能更好的构建体。用总共5×1010个相应载体IV施用各4只小鼠的群组。凝血酶弗林蛋白酶肽(另一凝血因子)在黑6中产生的活性GLP-1比因子IX和甘露糖苷酶弗林蛋白酶构建体更多。图7。
实施例6-猫的体内GLP-1治疗
将在6只客户拥有的动物中进行单一剂量、开放标记试点研究。纳入标准包括：
1.至少连续2次测量时血糖>200mg/dL
2.果糖胺高于实验室参考范围
3.受试者不是胰岛素疗法的候选(归因于主人无法提供治疗或其他禁忌症)
4.主人愿意坚持研究方案
排除准则包括：
1.高血糖被认为是继发于药物、肢端肥大症等
2.目前正使用胰岛素或口服降糖药物
3.不适合约束和静脉穿刺
4.研究员认为可能会给受试者带来额外风险或干扰研究药物的评估的任何情况。
在第0天，受试者动物将接受1013GCAAV8.CB7.thrGLP1。在筛选时和第0天、第14天、第28天、第42天、第60天、第90天、第120天、第150天、第180天，将进行CBC/化学、果糖胺、葡萄糖曲线和血清GLP-1。
实施例7-健康猫中的衣壳和剂量比较
给予健康猫如下所述的表达GLP1的载体，并且以每周为基础经由MilliporeActive GLP1分析来评估直到第90天为止。在GLP1保存DPPIV抑制剂血浆管(BDBiosciences，P700血浆管)中收集用于化验分析的血液。在第0天、第14天、第28天、第42天、第60天和第90天时拍摄CBC和化学组。在第90天后，将动物处死。
给予第一群组猫7×1012gc/kg的AAV8.CB7.CI.GLP1thrombin.r BG，如通过数字微滴PCR(ddpcr)来测定。给予一只猫7×1012gc/kg(ddpcr)的AAV3b.CB7.CI.GLPlthrombin.rBG。给予两只猫2×1012gc/kg(ddpcr)的AAV8.CB7.CI.GLP1thrombin.rBG。glp1活性的差异示于图8中。
本说明书中引用的所有出版物以及美国临时申请62/201,803和62/356,289以引用方式并入本文。类似地，被本文参考并且出现在所附序列表中的SEQ ID NO是以引用方式并入本文。虽然已经参考具体实施方案描述了本发明，但应当了解，可在不背离本发明的精神的情况下进行修改。所述修改旨在属于所附权利要求书的范围。

Claims (41)

1.一种可用于治疗所选物种的糖尿病的病毒载体，所述载体包含含有编码前肽和GLP-1的序列的核酸分子，其中在表达时，GLP-1的N末端氨基酸紧接在所述前肽的C末端氨基酸之后。
2.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述前肽是至少约40个氨基酸。
3.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述前肽是源于所述载体最终预期施用的相同物种。
4.如权利要求3所述的病毒载体，其中所述前肽是猫的序列。
5.如权利要求3所述的病毒载体，其中所述前肽是犬、人类、非人类灵长类动物等等的序列。
6.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述病毒载体被设计用于靶向选自猫、犬或人类的哺乳动物。
7.如权利要求1所述的病毒载体，其中GLP-1序列编码GLP-1的活性部分。
8.如权利要求7所述的病毒载体，其中所述GLP-1序列编码氨基酸7至37。
9.如权利要求8所述的病毒载体，其中所述GLP-1序列是SEQ ID NO:1或与其至少75％一致的序列。
10.如权利要求1所述的病毒载体，其中编码GLP-1的所述核酸序列包含SEQ ID NO:2或与其至少60％一致的序列。
11.如权利要求10所述的病毒载体，其中所述序列是针对猫或犬或人类的表达进行优化的密码子。
12.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述核酸序列编码信号肽(前导肽)和前肽。
13.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述前肽是因子IX前肽或其变体。
14.如权利要求13所述的病毒载体，其中所述前肽是猫因子IX前肽或与其至少80％一致的序列。
15.如权利要求13所述的病毒载体，其中所述前肽序列编码因子IX序列的氨基酸1至46。
16.如权利要求15所述的病毒载体，其中所述前肽序列是SEQ ID NO:3。
17.如权利要求15所述的病毒载体，其中编码所述前肽的所述核酸序列包含SEQ IDNO:4。
18.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述前肽是白蛋白前肽。
19.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述前肽是选自以下各项的凝血因子的前肽部分：凝血因子II、VII、IX、X、蛋白质C和蛋白质S蛋白质。
20.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述前肽序列是针对所述选择的患者物种进行优化的密码子。
21.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述病毒载体进一步包含指导所述前肽和GLP-1在宿主细胞中表达的表达控制序列。
22.如权利要求21所述的病毒载体，其中所述表达控制序列包含启动子。
23.如权利要求22所述的病毒载体，其中所述启动子是CB7启动子。
24.如权利要求21所述的病毒载体，其中所述表达控制序列包含组织特异性启动子。
25.如权利要求24所述的病毒载体，其中所述组织特异性启动子是肝特异性启动子。
26.如权利要求24所述的病毒载体，其中所述组织特异性启动子是选自甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子或淋巴细胞特异性蛋白1(LSP1)启动子。
27.如权利要求1所述的病毒载体，其进一步包含内含子、Kozak序列、polyA和转录后调控元件中的一种或多种。
28.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述载体是重组腺相关病毒(AAV)载体。
29.如权利要求26所述的重组载体，其中所述载体是具有选自AAV8、rh64R1、AAV9、AAVhu.37或rh10的衣壳和其变体的rAAV。
30.如权利要求1所述的病毒载体，其中所述载体是选自慢病毒载体、整合型载体、DNA和RNA纳米颗粒。
31.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和如权利要求1至30中任一项所述的病毒载体。
32.一种治疗糖尿病的方法，所述方法包括将如权利要求31所述的组合物施用到有需要的受试者。
33.如权利要求32所述的方法，其中静脉内施用所述组合物。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述受试者是猫或犬。
36.如权利要求32所述的方法，其中所述受试者是猫，并且所述前肽是猫的序列。
37.如权利要求32所述的方法，其中与另一种疗法组合施用所述组合物。
38.如权利要求37所述的方法，其中与胰岛素疗法一起施用所述组合物。
39.如权利要求32所述的方法，其中以约1×1012GC/kg的剂量施用所述组合物。
40.如权利要求32所述的方法，其中超过一次施用所述组合物。
41.一种用于延长受试者中GLP-1的循环半衰期的方法，所述方法包括提供内源性前肽和GLP-1的活性部分，其中，在表达时，GLP-1的N末端氨基酸紧接在所述前肽的C末端氨基酸之后。
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