CN1329509A - 用于由靶细胞表达因子viii的腺伴随病毒载体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了适于在人细胞中高水平地表达基因的改善的病毒载体。尤其是,本发明提供适于基因治疗的腺伴随病毒载体(AAV)。这些载体具有递送含核酸构建体的能力,导致在受体个体体内产生治疗水平的有生物学活性的全长因子Ⅷ。本发明还提供包含这种AAV载体的药物组合物以及制造和使用这些构建体的方法。

Description

用于由靶细胞表达因子VIII的腺伴随病毒载体

本专利申请要求美国临时申请60/125974(于1999年3月24日提交)和60/104994(于1998年10月20日提交)(此处对二者全部引用作为参考)的优先权。

发明领域

本发明涉及适于血友病基因治疗的腺伴随病毒载体(AAV)载体。特别是，这些AAV载体适于将编码因子VIII的核酸递送到患血友病A的受治疗者受体中，这样受治疗者的血液能够形成凝块。

背景

血友病是一种特征为血液凝固缺陷的遗传病。在血友病A(经典的血友病，因子VIII缺陷)中，X-染色体连锁的遗传缺陷破坏了编码因子VIII(一种血浆糖蛋白质，是血液凝固级联中的一种关键组分)的基因。人因子VIII以单链多肽合成，推定的分子量为265kDa。因子VIII基因编码2351个氨基酸，该蛋白质有6个结构域(从氨基端到羧基端指定为A1-A2-B-A3-C1-C2)(Wood等人.自然(Nature)，312；330，1984；Vehar等人.自然，312；337，1984；Toole等人。自然，312；342，1984)。人因子VIII于细胞内经加工产生主要由含结构域A1、A2和B的200KDA的重链和含结构域A3、C1和C2的80kDa的轻链组成的杂二聚体(Kaufman等人.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，263；6352-6362，1988)。单链多肽和杂二聚体均作为无活性前体循环于血浆中(Ganz等人.欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)，170；521-528，1988)。血浆中的因子VIII的活化始于凝血酶在结构域A2和B之间的切割，从而释放结构域B并产生包含结构域A1和A2的重链。在该蛋白质的激活的前凝血剂形式中，980个氨基酸的结构域B被删除。另外，在天然蛋白质中，位于结构域B两侧的两个多肽链(“a”和“b”)与二价钙阳离子结合。血友病可能产生于点突变、缺失或导致终止密码的突变(见，Antonarakis等人.分子生物医学(Mol.Biol.Med.)，4；81，1987)。

本病相当罕见，每10000个男性中大约有一个受此折磨。尽管在患病父亲和携带者母亲所生的女孩以及X-染色体异常(例如Turner综合症、X镶嵌现象，等等)的女性中可能会发生此病，但在女性中血友病极为罕见。根据患者症状的严重程度及循环的因子VIII水平，可以将每个患者的疾病程度概括性地划分为轻度、中度、重度三类。因子VIII的正常水平在50-200ng/ml血浆之间变动，而轻度患者为此值的6-60％，中度患者为此值的1-5％。重度血友病患者的因子VIII水平低于正常值的1％。

虽然血友病患者在外科手术或严重创伤后显然需要凝固因子，但是每日都可能出现的自发性内出血更值得关注。血友病患者会经历早期婴儿的自发性出血，以及经常性的自发性关节积血和其他需要凝固因子替换的出血。没有有效的治疗，慢性血友病型关节病会在成年初期发生。严重患病者易于严重的出血，可以分散地穿过组织面，最终由于危及重要器官而致死。

在中度和重度血友病患者中常常会观察到血肿。在这些患者中，血肿具有渐进性地扩大和向各个方向扩散的倾向。部分这些血肿局部性地扩大而导致相邻器官、血管和神经的局部压迫。腹部血肿的一个罕见但却常常致命的并发症是血肿穿孔和引流进入结肠，导致感染和败血症。颅内和/或颅外出血也代表非常危险的出血形势。皮下血肿会分散地进入肌肉，而咽和咽后血肿(例如并发细菌或病毒性的咽炎)会扩大并阻塞气道，有时导致危及生命的情形，需要施用足够剂量的因子VIII浓缩物，以使因子VIII水平正常。

除血肿外，在血友病患者中常常观察到关节积血，其中出血进入关节大约占血友病型出血的75％。反复性地出血进入关节最终导致关节软骨的广泛破坏、滑液增生以及其他邻近组织和骨骼中的反应性改变。反复性地关节积血的主要并发症是关节变形，还常常伴随着肌肉萎缩和软组织挛缩；伴随着关节空间渐进性地丧失，也会形成骨质疏松症和位于软骨下的骨骼中的囊肿区。

在血友病患者中常常观察到其他症状，包括血尿和粘膜出血。几乎所有的重度血友病患者在其一生的某些时候会经历血尿，并且粘膜出血在血友病患者中很常见。骨骼囊肿(假肿瘤)是血友病型出血的罕见但危险的并发症。对许多这些病例需要立即治疗。

在二十世纪80年代早期，许多重度血友病患者用因子VIII浓缩物治疗，每周大约三次。不幸的是，这些浓缩物传播病毒诸如乙型肝炎和/或丙型肝炎以及人免疫缺陷病毒(HIV)。在美国和西欧，据报道至少75％的因子VIII浓缩物接受者具有抗HIV抗体(见，Schrier和Leung.同上)。某些这些患者还逐步出现了HIV相关的免疫性血小板减少(血友病患者中非常严重的并发症)。尽管抗病毒疗法(例如，用叠氮胸苷和戊脒预防)的目的是想减缓疾病进展，但是成熟的AIDS(获得性免疫缺陷综合症)以毫不宽容的速度在感染了HIV的血友病患者中发生。确实，这使血友病患者的预期存活期(在20世纪70年代间达到顶峰时的66岁)的改善被逆转，降至49岁(见，Schrier和Leung.同上)。无病毒制品和重组因子VIII的开发对控制传染性病毒的污染起到了帮助。

然而，血友病患者获得无病毒浓缩物和重组因子VIII虽然重要，但只是解决了部分问题。为了预防自发性内出血事件，患有血友病A的患者必须经常具有大约1％，优选地5％的血清因子VIII水平。目前，无病毒制品和重组因子VIII的花费太高，无法预防性地或维持性地施用凝固因子。确实，在美国大多数血友病患者没有基于维持目的接受重组因子VIII疗法，而只在可能引起出血(如外科手术)的活动或事件前或者作为对自发性出血的治疗接受它。

而且，即使可以得到花费合理的重组的或无病毒的因子VIII制品，也无法通过每日施用而使因子VIII的水平达到稳态水平。充其量，患者接受变化很大的多种因子VIII的水平。紧随施用后的水平为超生理性的，而在施用前的水平是亚生理性的。因而仍然需要相对经济但却有效的治疗和预防血友病患者的出血(尤其是自发性出血)的方法和组合物。此外，在本领域需要能够更加接近地模拟在正常个体中所观察到的稳态生理水平的方法和组合物，以用于凝血因子(例如因子VIII)的长期递送。

发明概述

本发明提供适于基因治疗治疗血友病的改善的病毒载体。尤其是，本发明提供通过递送编码凝固蛋白质因子VIII的核酸用于治疗血友病A的AAV载体和方法。本发明还提供包含这种AAV载体的药物组合物，以及制造和使用该载体的方法。

本发明尤其适用于血友病A的基因治疗。因而，在本发明的一个实施方案中，至少将一种包含编码因子VIII核酸分子的载体与指导因子VIII在合适的受体细胞中表达的控制序列有效地连接。接着将AAV载体在导致因子VIII表达的条件下，引入到受治疗者的受体细胞中。因而，该受治疗者获得了因子VIII的连续供给，以便在出血事件期使血液凝结。

通过使用本发明的方法，实现了在体内长期表达治疗水平的因子VIII。在一个实施方案中，通过门静脉注射给予动物两种AAV载体：一种携带有编码因子VIII的重链DNA序列，另一种携带有编码因子VIII的轻链DNA序列。定期收集血液样品并测定因子VIII活性。可重复地，动物表达有生物学活性的、600-900ng/ml的因子VIII，其水平远高于大约200ng/ml的正常生理水平。而且，这些水平持续了13个月以上，因子VIII的水平或活性没有下降。在另一相关的实施方案中，将删除结构域B形式的因子VIII克隆到单AAV载体中，显示表达有生物学活性的因子VIII。

然而，并不旨在将本发明限制在特别的实施方案。通过使用多种不同的控制和调节序列，既在体内又在体外已制造并试验了许多不同形式的重组因子VIII。通过使用AAV载体和本发明中讲授的方法能够表达编码有生物学活性的因子VIII的任何DNA序列。所以，本发明涵盖含有能够在体外或体内产生有生物学活性的因子VIII蛋白质的任一AAV载体或多种载体。

例如在某些实施方案中，AAV载体含有因子VIII重链的前57个碱基对(编码10个氨基酸信号序列和人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化序列)。在某些替代实施方案中，载体也含有结构域A1和A2，以及结构域B的N端的5个氨基酸，和/或结构域B的C端的85个氨基酸，以及结构域A3，C1和C2。而在其他实施方案中，将编码因子VIII重链和轻链的核酸克隆到单一载体中，其被编码结构域B的14个氨基酸的42个核苷酸分隔开。

本发明还提供施用上述载体的方法。例如，本发明旨在涵盖适于将AAV载体递送到患者受体或试验动物的肝脏中的方法。并不旨在将本发明限制在任何特定的施用途径。然而，在优选的实施方案中，通过门或动脉血管系统成功地施用了本发明的AAV载体。

鉴于本文所公开的内容，对本领域的那些普通技术人员而言实施本发明的这些和其他实施方案是容易的。

附图简述

图1提供表示因子VIII蛋白质的简图。

图2提供表示缺失结构域B形式的因子VIII蛋白质的简图。

图3提供表示从内部末端重复(ITR到ITR)开始的、缺失结构域B形式的因子VIII构建体(AAV-F8-1)的筒图，包括控制序列。

图4提供表示从内部末端重复(ITR到ITR)开始的、缺失结构域B形式的因子VIII构建体(PVM4.1c-F8AB)的简图，包括控制序列。

图5提供pAAV-F8-1的序列(ITR到ITR)，其中质粒的骨架略去。

图6提供pVm4.1cF8ΔB的序列(ITR到ITR)，其中质粒的骨架略去。

图7提供载体rAAV-hFVIII-HC和rAAV-hFVIII-LC的图谱。

图8提供证明多种人FVIII的构建体在大鼠血浆中表达的曲线图。

图9提供使用对(A)hFVIII轻链和(B)hFVIII重链特异性的探针之肝DNA的Southern印迹分析。

图10提供使用对(A)hFVIII轻链和(B)hFVIII重链特异性的探针之来自不同组织DNA的Southern印迹分析。

图11提供使用对(A)hFVIII轻链和(B)hFVIII重链特异性的探针之肝RNA的Northern印迹分析。

本发明涉及用于在人细胞中高水平表达基因产品的改善的病毒载体。尤其是，本发明提供适用于基因治疗的AAV载体。这些载体具有递送含核酸构建体的能力，导致在宿主中产生因子VIII蛋白质。本发明还提供包含这种AAV载体的药物组合物，以及制造和使用这些构建体的方法。

可以通过本领域技术人员公知的标准方法产生本发明的AAV载体和rAAV病毒粒。这些方法一般包括步骤：(1)将AAV载体引入到宿主细胞；(2)将AAV辅助构建体引入到宿主细胞，其中辅助构建体包含能够在宿主细胞中表达以互补从AAV载体中缺失的AAV辅助功能的AAV编码区；(3)将一种或更多的辅助病毒和/或附属功能载体引入到宿主细胞，其中辅助病毒和/或附属功能载体提供能够支持重组AAV(“rAAV”)病毒体在宿主细胞中有效地产生的附加功能；(4)培养宿主细胞以产生rAAV病毒体。通过使用标准的转染技术可以将AAV载体、AAV辅助构建体和辅助病毒或一种或多种附属功能载体，同时地或者依次地引入到宿主细胞中。

除非特别指出，本发明的实施采用了本领域技术人员知晓的病毒学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，包括那些在诸如Sambrook等人编著.分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：ALaboratory Mannual)，Glover编著.DNA克隆：实用方法(DNACloning：A Practical Approach)第I和II卷，Gait编著。寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)，Hames和Higgins编著。核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)，Hames和Higgins编著。转录和翻译(Transcription and Translation)，Tijessen编著。CRC细小病毒手册(CRC Handbook of Parvoviruses)第I和II卷，Fields和Knipe编著。基础病毒学(Fundamental Virology)第二版第I和II卷中的参考文献中描述的方法。定义

在描述本发明中将使用下列术语，并将其定义如下。

如本文所用，术语“基因转移”和“基因递送”指将特定的核苷酸序列(例如DNA)可靠地插入到靶细胞中的方法或系统。在特别优选的实施方案中，该核苷酸序列包含至少一部分因子VIII。

如本文所用，术语“载体”和“基因转移载体”指任何遗传元件，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒体等，当其与恰当的控制序列相联系时具有复制能力和/或在细胞之间可以转移核酸序列。因而，该术语包括克隆和表达载体以及病毒载体。

基因转移载体可以包含转录序列，诸如多聚腺苷酸化位点、选择性标记或报告基因、增强子序列和其他能诱导转录的控制序列。在下面对这些控制序列予以更加全面的描述。

术语“表达载体”如本文所用指重组的DNA分子，其含有在特定的宿主生物体中为表达有效地连接的编码序列所必需的希望的编码序列和适当的核酸序列。为了在原核生物中表达而必需的核酸序列常常包含有启动子、操纵子(任选)和核糖体结合位点以及其他序列。通常所知，真核细胞使用启动子(组成型的、诱导型的或组织特异型的)、增强子、终止信号和多聚腺苷酸化信号，尽管可以删除某些元件和添加其他元件而不牺牲必需的表达。

如本文所用，术语“宿主”和“表达宿主”指包含外源DNA序列(例如通过转染)、表达载体或媒介物的生物体和/或细胞，以及适用于表达重组的基因或蛋白质的生物体和/或细胞。并不旨在将本发明限制在任何特殊类型的细胞或生物体。确实，期望将任何合适的生物体和/或细胞作为宿主用于本发明。

如本文所用，术语“病毒复制子”和“病毒的复制起点”指病毒DNA序列，其允许位于表达适当的复制因子的宿主细胞中的载体以染色体外方式复制。在某些实施方案中，含有SV40或者多瘤病毒复制起点的载体复制至高拷贝数，而含有来自牛乳头瘤病毒或EB病毒的复制子的载体，以染色体外方式复制至低拷贝数，其可使用于其他实施方案中。

如本文所用，术语“AAV载体”指具有功能性的或部分功能性的ITR序列。ITR序列可以来自腺伴随病毒血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7等。然而，ITR并不需要是野生型的核苷酸序列，其可被改变(例如通过核苷酸插入、删除或替换)，只要序列保留提供有功能的抢救、复制和包装的功能。可以将AAV载体上的一个或多个AAV野生型基因(优选地rep和/或cap基因)全部或部分删除，但保留有功能的侧翼ITR序列。具有功能的ITR序列对AAV病毒体的抢救、复制和包装是必需的。因而，在此将“AAV载体”定义为至少包含在病毒的复制和包装中以顺式方式必需的那些序列(例如具有功能的ITR)。

如本文所用，术语“ITR”指反向末端重复。术语“腺伴随病毒反向末端重复”或“AAV ITR”指本领域周知的回文区，见于AAV基因组的每个末端，作为DNA复制起点和病毒的包装信号以顺式方式共同起作用。为用于本发明中的某些实施方案，将AAV侧翼ITR置于所选的一个或多个异源核苷酸序列的5’和3’位。任选地，ITR与rep的编码区或者Rep表达产物一起用于所选的序列整个进入靶细胞的基因组中。

如本文所用，术语“AAV rep编码区”指AAV基因组的本领域周知的区域，其编码复制蛋白质Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。这些Rep表达产物已证明具有许多功能，包括对AAV的DNA复制起点的识别、结合和产生缺刻，DNA螺旋酶活性和AAV(或其他异源)启动子转录调制。为复制AAV基因组，共同地需要Rep表达产物。Muzyczka(Muzyczka.Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158；97-129，1992)和Kotin(Kotin和Hum.基因治疗(Gene Ther.)，5；793-801，1994)提供了对AAV的rep编码区以及cap编码区的另外描述(如下)。AAV的rep编码区的适合的同源物包括人疱疹病毒6(HHV-6)的rep基因，据知其也介导AAV-2DNA复制(Thompson等人。病毒学(Viroi.)，204；304-311，1994)。

如本文所用，术语“AAV cap编码区”指AAV基因组的本领域周知的区域，其编码衣壳蛋白质VP1、VP2和VP3或其功能性同源物。这些cap表达产物提供包装功能，共同地需要这样的表达产物以包装病毒基因组。

如本文所用，术语“AAV辅助功能”指AAV这样的编码区，其能够在宿主细胞中表达以互补AAV载体中缺失的AAV病毒功能。一般地，AAV辅助功能包括AAV rep编码区和AAV cap编码区。“AAV辅助构建体”为含有这样的AAV编码区的载体，所述编码区为互补从AAV载体中缺失的AAV病毒功能所需要的(例如AAV的rep编码区和AAV的cap编码区)。

如本文所用，术语“附属功能”和“附属因子”指AAV复制需要但并不是由AAV病毒体(或rAAV病毒体)本身提供的功能和因子。因而，这些附属功能和因子必须由宿主细胞、病毒(例如腺病毒或单纯疱疹病毒)或处于相同细胞中的另一个被共表达的表达载体提供。通常情况下，将腺病毒的E1、E2A、E4和VA的编码区用于提供为AAV复制和包装所需要的必需的附属功能(Matsushita等人.基因治疗，5；938，1998)。

如本文所用，术语“野生型”(“wt”)指基因或基因产物，其具有将其从天然存在的来源中分离出来的时候该基因或基因产物所具有的特性。野生型基因就是在群体中最常观察到的基因，因而主观地将其指定为基因的“正常”或“野生型”形式。与此形成对照，术语被修饰的”或“突变体”指这样的基因或基因产物，其在与野生型的基因或基因产物比较时在序列和/或功能性质上显示出修饰(即，改变了的性质)。要指出的是，可以分离到天然发生的突变体；这些突变体通过这样的事实而得以鉴定即：当它们与野生型基因或基因产物相比较时具有改变了的性质。

如本文所用，术语“AAV病毒体”指完整的病毒颗粒，诸如野生型”(wt)AAV病毒颗粒(包含与AAV衣壳蛋白质外壳相结合的线性、单链AAV核酸基因组)。在这一点上，可以将任一互补的有义(“正义”或“反义”链)的单链AAV核酸分子包装入任一AAV病毒体，并且所有两条链具有相等的感染性。

如本文所用，术语“重组AAV病毒体”和“rAAV病毒体”指含有异源目的DNA分子(例如因子VIII序列)的感染性病毒颗粒，而目的DNA分子的两侧均为AAV ITR。在本发明的某些实施方案中，在其中含有AAV载体、AAV辅助功能及附属功能的适合的宿主细胞中产生rAAV病毒体。这样就赋予宿主细胞编码AAV多肽的能力，在将含有重组目的核苷酸序列的AAV载体(诸如至少一部分因子VIII或因子VIII结构域的部分)包装入重组的病毒颗粒中用于随后的基因递送时需要这些多肽。

如本文所用，术语“转染”指细胞吸收外来的DNA，当将外源的DNA引入到细胞膜内时，细胞就被“转染”了。在本领域中有许多普遍公知的转染技术(见例如，Graham等人。病毒学，52；456，1973；Sambrook等人编著。分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：ALaboratory Mannual)，冷泉港实验室，纽约，1989；Davis等人。分子生物学基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)，Elsevier，1986；Chun等人。基因(Gene)，13；197，1981)。可以采用这些技术将一种或多种外源的DNA成分，诸如基因转移载体和其他核酸分子，引入到适合的受体细胞中。

如本文所用，术语“稳定的转染”和“稳定地转染的”指将外来的DNA引入和整合到被转染细胞的基因组中。术语“稳定的转染子”指具有稳定地整合入基因组DNA中的外来DNA的细胞。

如本文所用，术语“瞬时转染”或“瞬时地转染的”指将外来的DNA引入到细胞中，其中外来的DNA不能整合入被转染细胞的基因组中。外来的DNA在被转染细胞的细胞核中存在数天。在这一段时间里，外来的DNA受到指导位于染色体上的内源基因表达的调节控制。术语“瞬时转染子”指已吸收了外来的DNA但是不能将该DNA整合的细胞。

如本文所用，术语“转导”表示通过复制缺陷型病毒载体(诸如通过重组的AAV病毒体)将DNA分子体内或体外递送到受体细胞中。

如本文所用，术语“受体细胞”指已被核酸构建体或含有所选目的核苷酸序列(即因子VIII)的载体转染或转导的细胞，或者具有被核酸构建体或含有所选目的核苷酸序列(即因子VIII)的载体所转染或转导的能力的细胞。本术语包括亲代细胞的后代，不管后代在形态或遗传组成上是否与原始的亲代完全一致，只要存在所选的序列。

术语“异源”当其指核酸序列(诸如编码序列和控制序列)时，表示在正常情况下没有连接在一起和/或在正常情况下不与特定的细胞相联系的序列。因而，核酸构建体或载体的“异源”区即为一核酸片段，其在另一个核酸分子内或附加于该核酸分子上，而在自然界中没有发现其与上述的另一个核酸分子相联系。例如，核酸构建体的异源区可以包含这样的编码序列，在自然界中没有发现该编码序列两侧的序列与其有联系。异源编码序列的另一个例子是这样的构建体，其中的编码序列本身在自然界中没有发现(例如具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。相似地，为了本发明的意图，被正常情况下在细胞中不存在的构建体所转染的细胞将被认为是异源的。如本文所用，等位基因的变异或天然发生的突变事件并不产生异源的DNA。

如本文所用，“编码序列”或“编码”特定抗原的序列是当将其置于适当的调节序列的控制之下时，在体内或体外被转录(DNA情况下)和翻译(mRNA情况下)为多肽的核酸序列。编码序列的边界由位于5’(氨基)端的起始密码子和位于3’(羧基)端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于来自原核生物或真核生物的mRNA的cDNA、来自原核生物或真核生物DNA的基因组DNA序列，甚至合成的DNA序列。通常转录终止序列位于编码序列的3’位。

如本文所用，术语“核酸序列”指DNA或RNA序列。该术语将含有DNA和RNA的任何已知的碱基类似物均包括在内，诸如但不限于：4-乙酰胞嘧啶核苷、8-羟基-N6-甲基腺嘌呤核苷、氮杂环丙烯基胞嘧啶核苷、假异胞嘧啶核苷、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲尿嘧啶、5-甲氧氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5’-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶核苷、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶核苷和2，6-二氨基嘌呤。

如本文所用，术语“重组DNA分子”如本文所用，指含有通过分子生物学的技术手段连接到一起的DNA区段的DNA分子。

如本文所用，术语“调节元件”指控制核酸序列表达的某些方面的遗传元件。例如启动子是促进有效地连接的编码区的转录起始的调节元件。其他调节元件为剪接信号、多聚腺苷酸化信号、终止信号等等(定义见下)。

术语DNA“控制序列”共同地指调节元件，诸如启动子序列、多聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等等，它们共同地为受体细胞中的编码序列提供复制、转录和翻译。只要所选编码序列能够在适当的受体细胞中被复制、转录和翻译就并不需要所有这些控制序列永远存在。

真核生物中的转录控制信号一般包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由与参与转录的细胞蛋白质特异性地相作用的短列DNA序列组成(Maniatis等人。科学(Science)，236；1237，1987)。已从多种真核生物来源包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞和病毒的基因中分离出启动子和增强子元件(类似的控制序列即启动子也在原核生物中发现)。对特定的启动子和增强子的选择依赖于将使用什么类型的细胞来表达目的蛋白质(即因子VIII)。某些真核生物的启动子和增强子具有宽宿主范围，而其他则在有限的细胞类型的亚类中具有功能(见例如，Voss等人。Trends.Biochem.Sci.，11；287，1986；和Maniatis等人。同上，综述)。例如，SV40早期基因的增强子在来自许多哺乳动物种类的广泛的多种细胞类型中活性非常高，并且广泛地用于在哺乳动物细胞中表达蛋白质(Dijkema等人。EMBO J.，4；761，1985)。在宽范围的哺乳动物细胞类型中具有活性的另外两个启动子和增强子元件的例子是人延伸因子1α基因(Uetsuki等人.生物化学杂志，264；5791，1989；Kim等人.基因，91；217，1990；和Mizushima和Nagata.核酸研究(Nucl.Acids.Res.)，18；5322，1990)和劳氏肉瘤病毒的长末端重复(Gorman等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79；6777，1982)和人巨细胞病毒(Boshart等人.细胞(Cell)，41；521，1985)的启动子和增强子。发现启动子和增强子在天然状态下可以单独或一起存在。例如逆转录病毒的长末端重复既含有启动子功能又含有增强子功能。而且，通常地启动子和增强子独立地作用于被转录或翻译的基因。因而，增强子和启动子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。“内源的”增强子/启动子为基因组中与给定的基因天然地连接的增强子/启动子。“外源的”或“异源的”启动子和增强子为通过遗传操作手段(即分子生物学技术)将其置于基因的并列位以使该基因的转录受所连接的增强子/启动子指导。

如本文所用，术语“组织特异的”指诸如启动子、增强子等这样的调节序列或控制序列，其中核酸序列在特异的一种或多种细胞类型或组织中的表达要明显地更高。在特别优选的实施方案中，白蛋白启动子和运甲状腺素蛋白启动子在肝细胞中比在其他细胞类型中显示因子VIII的表达增加。然而并不旨在将本发明限制在白蛋白或运甲状腺素蛋白启动子或者限制在肝特异性表达，因为也构思了其他的组织特异性调节元件或显示改变了的基因表达模式的调节元件。

在表达载体上，“剪接信号”的存在常常导致重组转录本的较高水平表达。剪接信号介导从原始RNA转录本上切除内含子，它包括剪接供体和受体位点(Sambrook等人编著。分子克隆：实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，纽约，1989，16.7-16.8)。常使用的剪接供体和受体位点是来自SV40的16SRNA的剪接接点。

在真核生物的细胞中高效地表达重组的DNA序列需要指导所得转录本高效地终止和多聚腺苷酸化的信号表达。转录终止信号一般见于多聚腺苷酸化信号的下游并且长度为几百个核苷酸。术语“poly A位点”或“poly A序列”，如本文所用，表示指导新生的RNA转录本终止及多聚腺苷酸化的DNA序列。重组的转录本高效地多聚腺苷酸化是期望的，因为缺少了poly A尾巴的转录本不稳定，并且很快地被降解了。在表达载体中使用的poly A信号可以是“异源的”或“内源的”。内源的poly A信号为天然地见于基因组中给定基因的编码区3’末端的poly A信号。异源的poly A信号为分离自一个基因并置于另一个基因的3’位的poly A信号。常用的异源poly A信号为SV40的poly A信号。SV40的poly A信号包含在237bp的BamHI/Bcl I限制性片段上，指导终止和多聚腺苷酸化(Sambrook等人。同上，在16.6-16.7)。

“有效地连接”指元件的排列，其中将所述组分构型为能使它们发挥通常的功能。因而，与编码序列有效地连接的控制序列具有实现编码序列表达的能力。控制序列并不需要与编码序列相邻，只要它们有指导其表达的功能。因而，举例来讲，不翻译但转录的间隔序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，而仍可以认为启动子序列与编码序列有效地连接”。

术语“经分离的”当用于核酸方面时，如在“经分离的寡核苷酸”或“经分离的多核苷酸”中指这样的核酸序列，其被鉴定并从至少一种在其天然的来源物中通常与其相联系之污染物核酸中分离出来。经分离的核酸所存在的形式或背景与其在自然界中被发现时的不同。与此相对照，未经分离的核酸为诸如DNA和RNA的核酸，呈它们在自然界中存在的状态。例如，给定的DNA序列(例如，一种基因)见于宿主细胞的染色体上，与相邻的基因接近；RNA序列(诸如编码特定蛋白质的特定mRNA序列)以与许多其他编码各种蛋白质的多个mRNA的混合物形式见于细胞中。经分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双链的形式存在。当将经分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸用于表达蛋白质时，寡核苷酸或多核苷酸将最少含有有义链或编码链(即寡核苷酸或多核苷酸可以是单链)，但是可以同时含有有义链和反义链(即寡核苷酸或多核苷酸可以是双链)。

如本文所用，术语“纯化的”或“纯化”指从样品中去除污染物。例如，可以通过去除污染性的非免疫球蛋白蛋白质将抗体纯化；也可以通过去除不与目的抗原(例如，至少一部分因子VIII)相结合的免疫球蛋白将其纯化。去除非免疫球蛋白蛋白质和/或去除不与目的抗原(例如，至少一部分因子VIII)相结合的免疫球蛋白将使样品中所需要的抗原反应性的免疫球蛋白之百分比提高。在另一个例子中，将重组因子VIII多肽在细菌宿主细胞中表达，并且通过去除宿主细胞的蛋白质将该多肽纯化；由此提高了样品中重组的多肽的百分比。

如本文所用，术语“嵌合蛋白质”指从不同的基因中获得的两个或多个编码序列，已将其克隆在一起，而且在翻译后其以单一多肽序列起作用。嵌合蛋白质也称为“杂合蛋白质”。如本文所用，术语“嵌合蛋白质”指从不同的生物体种类中获得的编码序列，以及从相同的生物体种类中获得的编码序列。

“包含给定的多核苷酸序列的组合物”，如本文所用，广泛地指含有给定的多核苷酸序列的任何组合物。该组合物可以包含水性溶液。

如本文所用，术语“风险”用于指经历出血事件风险的个体。在特别优选的实施方案中，这些个体为有轻度、中度或重度血友病的血友病患者。

如本文所用，术语“受治疗者”指任何动物(即脊椎动物类和无脊椎动物类)；而术语“脊椎动物受治疗者”指脊索动物亚门中的任一员。本术语旨在涵盖该亚门中的任一成员，包括但不限于人类和其他灵长类、啮齿类(例如小鼠、大鼠和豚鼠)、兔形类(例如兔)、牛类(例如家畜牛)、绵羊类(例如绵羊)、公山羊类(例如山羊)、猪类(例如猪)、马类(例如马)、犬类(例如狗)、猫类(例如猫)、驯养家禽(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、其他鹑鸡类鸟等)，以及野生的或野生动物类，包括但不限于诸如有蹄动物类(例如鹿)、熊、鱼、兔形类、啮齿类、鸟类等动物。并不旨在将本术语限制在特定的年龄或性别。所以，成年及新生的受治疗者以及胎儿，不管是雄性还是雌性，均涵盖于本术语中。

如本文所用，术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”为AAV载体或病毒体的量或剂量，该量或剂量的AAV载体或病毒体能产生足够量的因子VIII，以减小受治疗者的血液凝集所需的时间。一般地，具有不到因子VIII正常水平的1％的重度血友病患者的血液凝集时间大于60分钟，与此相比，非血友病患者为大约10分钟。发明详述

本发明涉及适于血友病A的基因治疗的AAV载体。尤其是，这些AAV载体适于将编码因子VIII的核酸递送到怀疑患有血液凝固障碍的受体宿主中。通过使用核酸作为模板，使宿主产生因子VIII，这样受治疗者的血液能够凝集。本发明也提供包含这种AAV载体的药物组合物以及制造和使用这些构建体的方法。I AAV载体

腺伴随病毒(AAV)是非致病性的、复制缺陷的、辅助依赖的细小病毒(或“依赖病毒”或“腺卫星病毒”)。至少有6个已识别的血清型，指定为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV-X7等。培养和血清学的证据显示AAV2和AAV3使人发生感染。尽管人群的85％为AAV2血清阳性，却从未将该病毒与人类的疾病相联系。由于其广泛的宿主范围、出色的安全性和在感染宿主中转基因表达的持续性，有意将重组的AAV(rAAV)病毒体作为基因治疗的载体。重组的AAV(rAAV)病毒体的一个显著的特性是体内施用后获得延长的表达。

通过使用已知的技术可以构建本发明的AAV载体，以在转录方向上有效地连接的成分提供(a)：控制序列，包括转录起始和终止区，和(b)：编码至少一部分因子VIII的核苷酸序列。所选控制序列在靶受体细胞中具有功能。所得的含有有效地连接的组分之构建体与功能性的AAV ITR序列结合(5’和3’位)。

AAV ITR区的核苷酸序列已知(见例如，Kotin和Hum.基因治疗，5；793-801，1994；在Fields和Knipe编著病毒学基础(Fundamental Virology)第二版中，Berns.“细小病毒属及其复制(Parvoviridae and Their replication)”有AAV-2的序列)。用于本发明载体中的AAV ITR并不需要为野生型的核苷酸序列，并且可以将其改变(例如，通过核苷酸插入、缺失或替换)。另外，AAV ITR可以从几个AAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV-X7等中的任何一个衍生而来。而且，在AAV载体中，位于所选核苷酸序列侧翼的5’和3’位的ITR只要它们发挥预想的功能，并不一定需要与相同的AAV血清型或分离物完全相同或由其衍生。A控制序列

在本发明的某些实施方案中，在载体中使用了异源控制序列。一般地，使用的异源控制序列包括那些来自编码哺乳动物或病毒基因的控制序列。例如，包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳癌病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV立即早期启动子区(CMVIE))、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、合成的启动子、杂合启动子等等。另外，来自非病毒基因(诸如鼠金属硫蛋白基因)的序列也在此使用。这些启动子序列已有商业供应(例如从Stratagene)。

在某些实施方案中，期望可以获得组织特异性的表达(例如由肝细胞表达有生物学活性的因子VIII)。并不旨在将本发明限制在由任一特定的细胞或细胞类型表达有生物学活性的因子VIII。然而由于肝细胞(即肝脏细胞)是正常情况下合成因子VIII的细胞(见，Kaufman.Ann.Rev.Med.，43；325，1992)，所以在某些特别优选的实施方案中，期望将本发明的组合物施用于肝脏。

在优选的实施方案中，通过将因子VIII的编码序列与异源控制序列(来自在所选的组织类型中专一性地被转录的基因)偶联获得表达。前面已经对许多组织特异性的启动子予以描述，它们能够在所选组织类型中实现指导性表达。然而用于本AAV载体的控制序列也可以包括正常情况下与所选核酸序列相联系的控制序列。B AAV因子VIII载体的构建

通过将所选序列直接插入到已切除主要的AAV开放阅读框架(“ORF”)的AAV基因组中，可以构建结合AAV ITR的含有控制序列和目的核苷酸序列(即至少一部分编码因子VIII的序列)的AAV载体(即AAV载体)。只要保留了足够的ITR部分以发挥复制和包装功能，也可以删除AAV基因组的其他部分。通过使用本领域公知的技术(见例如，美国专利5173414和5139941(所有这些于此处引用作为参考)；国际专利出版物WO92/01070和WO93/03769；Lebkowski等人.分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，8；3988-3996，1988；Vincent等人。疫苗90(Vaccines 90)，冷泉港实验室出版社，1990；Carter.Curr.Opin.Biotechnol.，3；533-539，1992；Muzyczka.Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158；97-129，1992；Kotin和Hum.基因治疗，5；793-801，1994；Shelling和Smith.基因治疗，1；165-169，1994；和Zhou等人。实验医学杂志(J.Exp.Med.)，179；1867-1875，1994)可以设计这些构建体。

或者，可将AAV ITR从病毒基因组中或者从含有AAV ITR的AAV载体中切割下来，通过使用标准的连接技术(诸如那些在Sambrook等人。同上，中所描述)将其融合于位于另一个载体上的所选核酸构建体的5’和3’。例如可在20mM Tris-HCl pH7.5，10mMMgCl₂，10mM DTT，33μg/ml BSA，10mM-50mM NaCl和40μM ATP，0.01-0.02(Weiss)单位的T4 DNA连接酶中于0℃(对于“粘性末端”连接)或1mM ATP，0.3-0.6(Weiss)单位的T4 DNA连接酶中于14℃(对于“平端”连接)连接，可得以完成连接。分子间的“粘性末端”连接通常在总DNA浓度为30-100μg/ml(总末端浓度5-100nM)下进行。含有ITR的几种AAV载体已在例如美国专利5139941(此处引用作为参考)中描述过。尤其是其中描述了几个可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)(收藏号为53222、53223、53224、53225和53226)得到的AAV载体。

另外，可以通过合成方式产生包含AAV ITR序列(置于所选核酸序列的5’和3’位)的嵌合基因。从按标准方法(见例如，Edge.自然，292；756，1981；Nambair等人。科学，223；1299，1984；Jay等人。生物化学杂志，259；6311，1984)制备的重叠寡核苷酸装配完整的嵌合序列。

而且，并不旨在将本发明限制在任何特定因子VIII序列。通过使用多种不同的调节元件和控制元件，在体外和体内已分离和测定了许多天然的和重组形式的因子VIII。因而，通过使用AAV载体和本发明中讲授的方法可以表达任何已知的或以后发现的编码有生物学活性的因子VIII的DNA序列(单独地或与至少一种另外的载体联合)。天然发生的或重组形式的因子VIII的例子可见于专利和科学文献，包括美国专利5563045、美国专利5451521、美国专利5422260、美国专利5004803、美国专利4757006、美国专利5661008、美国专利5789203、美国专利5681746、美国专利5595886、美国专利5045455、美国专利5668108、美国专利5633150、美国专利5693499、美国专利5587310、美国专利5171844、美国专利5149637、美国专利5112950、美国专利4886876、国际专利94/11503、国际专利87/07144、国际专利92/16557、国际专利91/09122、国际专利97/03195、国际专利96/21035、国际专利91/07490、欧洲专利0672138、欧洲专利0270618、欧洲专利0182448、欧洲专利0162067、欧洲专利0786474、欧洲专利0533862、欧洲专利0506757、欧洲专利0874057、欧洲专利0795021、欧洲专利0670332、欧洲专利0500734、欧洲专利0232112、欧洲专利0160457、Sanberg等人.第二十届血友病世界联盟国际大会(1992年)(XXth Int.Congress of the World Fed.Of Hemophilia(1992))、Lind等人。欧洲生物化学杂志，232；19，1995。

使用重组方法，诸如通过筛选表达因子VIII的细胞之cDNA和基因组文库或通过从已知包含因子VIII的序列之载体得到序列，能够获得编码上述因子VIII的核酸序列。此外，使用标准技术，诸如苯酚抽提和cDNA或基因组DNA的PCR(见Sambrook等人.，同上，对获取和分离DNA技术的描述)，能够从含有因子VIII序列的细胞或组织中直接分离出所需序列。也可以通过合成而不是克隆产生编码目的抗原(即因子VIII序列)的核苷酸序列。能够从按标准方法制备的重叠的寡核苷酸装配完整的序列，并装配成为完整的编码序列(见，例如Edge.自然，292；756，1981；Nambair等人。科学，223；1299，1984；Jay等人。生物化学杂志，259；6311，1984)。

尽管并不旨在将本发明限制于评价生产生物学活性的因子VIII的任何特定的方法，但是构思了诸如免疫测定(例如ELISA)和生物学活性测定方法(例如凝固活性测定)。

此外，在特别优选的实施方案中，人因子VIII涵盖于本发明，并不旨在将本发明限制于人因子VIII。确实，本发明旨在涵盖来自除人类以外的动物，包括但不限于陪伴动物类(例如犬类、猫类和马类)、家畜(例如牛类、公山羊类和绵羊类)、实验室动物类(例如啮齿类诸如鼠类以及兔形类)和“奇异的”动物(例如海洋哺乳动物、巨型的猫等)的因子VIII。II病毒体的产生

产生本发明的AAV因子VIII载体和rAAV因子VIII病毒体一般涉及步骤：(1)将含有因子VIII基因的AAV载体引入到宿主细胞；(2)将AAV辅助构建体引入到宿主细胞，其中辅助构建体含有能够在细胞中表达以互补从AAV载体中失去的AAV辅助功能的AAV编码区；(3)将一个或多个辅助病毒和/或附属功能载体引入到宿主细胞中，其中辅助病毒和/或附属功能载体提供能够支持重组的AAV(“rAAV”)病毒体在宿主细胞中高效产生的附属功能；(4)培养宿主细胞以产生rAAV病毒体。

使用本领域技术人员公知的标准方法(例如转染)可以将上述的载体和构建体引入到宿主细胞中。在本领域中已公知许多转染技术(见例如，Graham等人。病毒学，52；456，1973；Sambrook等人。同上，Davis等人。同上，Chu等人。基因，13；197，1981)。特别适合的转染方法包括磷酸钙共沉淀(Graham等人。病毒学，52；456-467，1973)、直接显微注射进入培养细胞(Capecchi.细胞，22；479-488，1980)、电穿孔(Shigekawa等人。生物技术(BioTechn)，6；742-751，1988)、脂质体介导的基因转移(Mannino等人。生物技术(BioTechn)，6；682-690，1988)、脂肪介导的转导(Felgner等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84；7413-7417，1987)和使用高压微粒轰击的核酸递送(Klein等人。自然，327；70-73，1987)。

为了本发明的目的，产生rAAV病毒体的适合的宿主细胞包括可以用作或已经用作异源DNA分子受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。术语包括已经被转染的原始细胞的后代。因而，如上所示，缩主细胞”如本文所用，一般地指已被外源的DNA序列转染的细胞。在实施本发明中，优选来自人的稳定的细胞系293(ATCC收藏号CRL1573)。尤其是，人细胞系293是已被腺病毒-5的DNA片段转化的人胚胎肾细胞系(Graham等人.普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)，36；59，1977)，并且表达腺病毒的E1a和E1b基因(Aiello等人。病毒学，94；460，1979)。该293细胞系很容易被转染，并为在其中产生rAAV病毒体提供特别方便的平台。

为了产生rAAV病毒体，含有上述AAV载体的宿主细胞必需具有能够提供AAV辅助功能以复制和加衣壳于两侧为AAV ITR的核苷酸序列的能力。AAV辅助功能一般为来自AAV的可以被表达以提供AAV基因产物的编码序列，反过来，其为大量复制AAV以反式方式起作用。如本文所用，AAV辅助功能为互补从AAV载体中失去的必需的AAV功能。因而AAV辅助功能包括一个或所有两个主要的AAV ORF，即rep和cap编码区，或其功能性同源物。

通过用AAV辅助构建体转染宿主细胞(在用AAV载体转染之前或与AAV载体同时转染)将AAV辅助功能引入到宿主细胞中。如此使用的AAV辅助构建体至少提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达，以互补大量AAV感染所必需的失去的AAV功能。AAV辅助构建体缺少AAV ITR并且既不能复制又不能包装它们本身。

在优选的实施方案中，这些构建体以载体形式存在，载体包括但不限于质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。已描述过许多AAV辅助构建体，诸如常用的既编码Rep又编码Cap表达产物的质粒pAAV/Ad和pIM2929+45(见例如，Samulski等人。病毒学杂志(J.Virol.)，63；3822-3828，1989；和McCarty等人。病毒学杂志，65；2936-2945，1991)。已描述过许多编码Rep和/或Cap表达产物的其他载体(见例如，美国专利5139941，此处引用作为参考)。

可以将AAV载体和AAV辅助构建体均构建为含有一个或多个任选的选择性标记。适合的标记包括赋予那些转染有含有选择性标记的构建体的细胞(当转染细胞生长于适当的选择培养基时)以抗生素抗性或敏感性、产生颜色、或改变抗原特性的基因。用于实施本发明的几个可选择的标记基因包括编码氨基糖苷磷酸转移酶(APH)的基因，其通过赋予对G418的抗性允许在哺乳动物细胞中选择。其他适合的标记已为本领域技术人员公知。

为了产生rAAV病毒体，必须使宿主细胞(或包装细胞)具有提供来自非AAV功能或“附属功能”的能力。附属功能为来自非AAV病毒的和/或细胞的功能(AAV依赖此功能复制其本身)。因而，附属功能至少包括在AAV复制中需要的那些非AAV蛋白质和RNA，包括那些参与了AAV基因转录的激活、阶段特异性的AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、rep和cap表达产物的合成和AAV衣壳装配的物质。以病毒为基础的附属功能可以来自任何已知的辅助病毒。

尤其是，通过使用本领域技术人员公知的方法，将附属功能引入到宿主细胞中，然后在其中表达。通常，附属功能由感染了无关辅助病毒的宿主细胞提供。已知许多适合的辅助病毒，包括腺病毒、诸如单纯疱疹病毒1型和2型的疱疹病毒和痘病毒。非病毒的附属功能也将在本文中使用，诸如那些通过使用任何已知的多种试剂进行细胞同步化提供的物质(见例如，Buller等人。病毒学杂志，40；241-247，1981；McPherson等人。病毒学，147；217-222，1985；Schlehofer等人.病毒学，152；110-117，1986)。

或者，可以通过使用附属功能载体提供附属功能。附属功能载体包含提供一种或多种附属功能的核苷酸序列。附属功能载体能够被引入到适合的宿主细胞中以支持AAV病毒体在宿主细胞中高效产生。附属功能载体可以质粒、噬菌体、病毒、转座子或粘粒的形式存在。附属功能载体也可以一个或多个线性化的DNA或RNA片段存在，当其与适当的控制序列和酶相联系时，可以在宿主细胞中被转录和翻译以提供附属功能。

提供附属功能的核酸序列可以从天然来源物诸如从腺病毒基因组中获得，或者采用本领域已知的重组或合成的方法构建。在这一点上，对来自腺病毒的附属功能进行了广泛的研究，已对涉及附属功能的许多腺病毒基因进行了鉴定和部分表征(见例如，Carter.“腺伴随病毒辅助功能”，CRC细小病毒手册(CRC Handbook of Parvoviruses)，第I卷(P.Tijssen编辑)，1990；和Muzyczka.Curr.Top.Microbiol.Immun.，158；97-129，1992)。特别是，据认为腺病毒的早期基因区E1a、E2a、E4、VAI RNA和(很可能的)E1b参与辅助过程(Janik等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78；1925-1929，1981)。对来自疱疹病毒的附属功能已予以描述(Young等人.Prog.Med.Virol.，25；113，1979)。对来自痘病毒的附属功能也予以了描述(见例如，Carter.同上，和Schlehofer等人。病毒学，152；110-117，1986)。

作为用辅助病毒感染宿主细胞或者用附属功能载体转染宿主细胞的结果，附属功能得以表达，其反式激活AAV辅助构建体以产生AAVRep和/或Cap蛋白质。Rep表达产物指导从AAV载体中切除重组的DNA(包括编码至少一部分因子VIII的目的DNA)。Rep蛋白质也为复制AAV基因组服务。所表达的Cap蛋白质装配入衣壳，并且将重组的AAV基因组包装入衣壳中。这样，大量的AAV复制接着是DNA被包装入rAAV病毒体。

在重组的AAV复制之后，通过使用多种常规的纯化方法(诸如CsCl梯度)可以从宿主细胞中纯化rAAV病毒体。此外，如果采用辅助病毒感染来表达附属功能，可以使用已知方法将残留的辅助病毒灭活。例如通过加热至约60℃的温度保持约20分钟或更长(如果适当的话)，可以将腺病毒灭活。该处理选择性地灭活不耐热的辅助腺病毒，而保存耐热的rAAV。III药物组合物

此时，所得到的rAAV病毒体就可用于药物组合物了，该药物组合物可递送至受治疗者以产生有生物学活性的因子VIII。药物组合物包含足够的遗传物质以使受体产生治疗有效量的因子VIII，以减少、停止和/或预防出血。可以将组合物单独地或与至少一种其他试剂(诸如稳定化合物)联合施用，所施用的组合物可处于任一无菌的生物相容的药学载体中，包括但不限于盐水、缓冲的盐水、右旋糖和水。可以将组合物单独地或者与其他试剂、凝固因子或因子前体、药物或激素联合地向患者施用。在优选的实施方案中，药物组合物中也含有药学可接受的赋形剂。这些赋形剂包括其本身不会诱导接受组合物的个体产生有害的免疫反应并且施用也没有不适当的毒性之任一药学试剂。药学可接受的赋形剂包括但不限于液体，诸如水、盐水、甘油、糖类和乙醇。药学可接受的盐类可以包括在其中，例如无机酸盐类，诸如盐酸盐类、氢溴酸盐类、磷酸盐类、硫酸盐类等等；和有机酸盐类，诸如乙酸盐类、丙酸盐类、丙二酸盐类、苯甲酸盐类等等；另外，辅助性的物质诸如保湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等等，也可以存在于该载体中。在Remington’s药物科学(Mack出版公司，新泽西州，1991)中提供了药学可接受的赋形剂的详尽讨论。

适用于非肠道施用的药物配方可以在水性溶液中配制，优选地在生理相容的缓冲液诸如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理缓冲盐水中。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘性的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。另外，可以将活性化合物的悬浮液配制为适当的油性注射悬浮液。适合的亲脂性溶剂或赋形剂包括脂肪油(诸如芝麻油)或合成的脂肪酸酯类(诸如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。任选地，悬浮液也可以含有提高化合物溶解度以便配制高浓缩溶液的适合的稳定剂或试剂。

对于局部或鼻部施用，在配方中使用针对待渗透的特定障碍层的渗透剂。这样的渗透剂为本领域公知。

可以采用本领域公知的方式(例如通过常规的混合、溶解、颗粒化、糖衣化、研磨、乳化、胶囊化、包封或冻干法)制造本发明的药物组合物。

可以盐的形式提供药物组合物，并可通过与许多酸类形式，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。与其相应的游离碱形式相比，盐类在水性或其他质子溶剂中更加易溶。在其他情况下，优选的制备物可以为冻干粉末，其中可以含有下列的任一种或者全部：1-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖和2％-7％甘露醇，pH范围4.5-5.5，在使用前将其与缓冲液混合。

在制备好药物组合物后，将其置于适当的容器内。并贴上治疗用标签。在施用含因子VIII的载体时，该标签应包括施用的量、频次和方法。

适用于本发明的药物组合物包括组合物，其中包含有效量的活性成分以达到预期目的。通过使用本发明中所讲授的技术，诸如ELISA和Chrom Z FVIII凝固活性测定法和其他本领域公知的技术，确定治疗有效剂量对本领域技术人员而言根本不是难事。除其他因素外，治疗剂量还将依赖于受治疗者的年龄和一般情况、血友病的程度以及控制序列的强度。因而，在人类中的治疗有效剂量将落在一个相对宽的范围内，通过临床试验可将其确定。

旨在用于本发明的剂量治疗和方案将根据受治疗者和待用的制剂的变化而变化。因而，剂量治疗可以是单剂方案或多剂方案。而且，可以向受治疗者施用适当的多剂以达到或维持所需的血液凝集时间。

尽管对其他递送方法诸如增强的常规递送进行了展望(见，例如美国专利5720720，此处引用作为参考)，但是一般地通过使用常规注射器注射可完成体内药物组合物的直接递送。在这一点上，组合物可以皮下地、表皮地、皮内地、鞘内地、眼框内地、粘膜内地(例如，鼻地、直肠地、阴道地)、腹膜内地、静脉内地、动脉内地、口服地或肌肉地递送，其他施用模式包括口和肺施用、栓剂和透皮敷用，在特别优选的实施方案中，药物组合物通过静脉内施用于门血管系统或肺动脉。

本领域技术人员将认识到上述方法和组合物也适用于其他本领域公知的治疗方案。例如，本发明的方法和组合物与离体疗法(例如，将细胞从身体移出，与AAV载体温育并将处理后的细胞返回身体)相容。IV施用

可以将AAV载体施用于任何适于表达因子VIII的组织。在优选的实施方案中，通过门血管系统或肝动脉成功地施用本发明的AAV载体，不受理论的束缚，据认为在那里载体转导肝细胞。将基因靶向肝脏的流行方法聚焦在离体基因治疗上。肝脏导向的离体基因治疗涉及肝脏细胞的手术移出、体外肝脏细胞转导(例如用重组的逆转录病毒载体感染移出的细胞)，接着是将遗传性地修饰的肝脏细胞注射入患者的肝脏或脾脏。肝脏离体基因治疗的严重缺点是这样的事实，即在培养基中无法维持和扩增肝细胞。因而，肝脏导向的离体基因治疗的成功依赖于能够将遗传修饰的(即转导了的)肝细胞及其后代高效稳定地移植。据报道，即使在最适条件下，注射入肝脏或脾脏(移植的)的修饰的自体肝脏细胞仅占肝脏中总细胞数的小百分比(少于10％)。为了解决肝脏中的移植问题，已尝试将转导的原发肝细胞异位嫁接于腹膜腔。

由于肝脏导向的离体基因治疗存在问题，所以为将基因转入肝脏细胞而研究了体内方法，包括使用重组的逆转录病毒、重组的腺病毒、脂质体和分子偶联物。尽管这些体内方法不再有与肝脏导向的离体基因治疗相伴的缺点，但是它们并不提供特异性地靶向肝细胞的方法。另外，为了实现体内转基因的表达延长，这些方法中的几个需要进行部分肝切除术。腺病毒和以分子偶联物为基础的递送方法也导致肝毒性和炎症，这是因子VIII基因治疗的不期望的特性。本发明提供用于长期表达有生物学活性的因子VIII的组合物和方法。期望本发明会克服部分肝切除术，而同时允许因子VIII在体内以治疗浓度水平表达。本发明进一步提供使接受治疗的个体产生因子VIII靶向肝细胞的基因治疗组合物和方法。

然而，即使在正常情况下并不合成蛋白质的其他组织也可能适于因子VIII的表达。例如，已经证明肌细胞表达有生物学活性的血液凝固因子IX，尽管在正常情况下其在肝脏中合成。

最后，AAV载体可以含有任何编码有生物学活性的因子VIII的核酸序列。另外，AAV载体可以含有编码因子VIII的片段的核酸，所述片段本身没有生物学活性，但是当向受治疗者施用时改善或恢复血液凝固时间。例如，正如上面所讨论，因子VIII蛋白质包含两个多肽链：重链和轻链，由在加工过程中被切割的结构域B将其分隔。如本发明所证明，用因子VIII重链和轻链共转导受体细胞导致有生物学活性的因子VIII的表达。然而，由于大部分血友病患者仅在其中一条链(例如轻链或重链)上含有突变或缺失，所以有可能仅仅施用患者缺陷的那条链，而让患者提供另一条链。在这种情况下，AAV载体将落入本发明的范围，即使单链(即重链或轻链)并没有生物学活性，但是向能够提供第二条链的受治疗者施用单链后，就形成了具有生物学活性的因子VIII。V因子VIII测定

正如下面的实验所述，测定因子VIII的表达和活性的方法有多种。尽管本发明并不限于免疫测定方法，但是本发明也提供了检测因子VIII表达的方法，包括步骤：a)提供怀疑含有因子VIII的样品和含有已知量的已知因子VIII的对照品；和b)将测试样品与已知对照品比较以确定样品中因子VIII的相对浓度。因而这些方法可以鉴定样品(例如患者样品)中是否含有足够量的因子VIII。另外，通过使用任何适合的手段实施这些方法，可以确定测试及对照样品中因子VIII的相对浓度，所述手段包括但不限于Western印迹分析、Northern印迹分析、Southern印迹分析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(例如SDS-PAGE)、逆转录酶偶联的聚合酶链反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)和荧光免疫分析(IFA)。因而实施这些方法可以确定动物来源的测试样品的基因组中存在正常的因子VIII序列，或者因子VIII(mRNA或蛋白质)的表达，以及探测测试样品中存在异常或突变的因子VIII。

在一个优选的实施方案中，通过免疫化学分析检测因子VIII的存在。例如免疫化学分析可以包含检测对因子VIII抗原决定簇特异的抗体的结合。在另一个优选的实施方案的方法中，抗体包括多克隆抗体，而在另一个优选的实施方案中抗体包括单克隆抗体。

进一步地期望将针对至少一部分因子VIII的抗体用于与因子VIII的定域与结构、测定其在适当的生物样品中的水平等有关的本领域公知的方法(如，Western印迹)。可将抗体用于检测来自个体(例如，用本发明的方法和/或组合物治疗的个体)的生物样品中的因子VIII。生物样品可以是生物液体，包括但不限于血液、血清、血浆、间隙液、尿、脑脊液、滑液等等。尤其是，可以从包括但不限于肝细胞的细胞来源中检测抗原。例如可以从个体获得细胞并将其裂解(例如，通过冻融循环或用温和的细胞裂解剂包括但不限于TRITON-X100、毛地黄皂甙、NONIDET P(NP)-40、皂甙等或其组合，见例如，国际专利出版物WO92/08981)。

接着，通过使用适当的策略(例如ELISA或RIA)和形式(例如微孔板、浸渍片(例如，正如国际专利出版物WO93/03367)等)，能够直接测试生物样品中因子VIII的存在。或者可以将样品中的蛋白质按大小分离(例如通过加或不加十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，通过免疫印迹(例如Western印迹)检测因子VIII的存在)。一般地，使用所生成的针对相当于蛋白质抗原决定簇的多肽之抗体的免疫印迹法更有效，并且因此而特别地适于本发明。在另一个优选的实施方案中，采用本领域公知的技术(Herzog等人。Nature Medicine，5；56，1999)，利用受治疗者的全血凝固时间和受试者血液之活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)，测定因子VIII的水平。

在本文中，前面对特定的测定系统给出解释只是为了阐明，以满足对发明内容充分公开的要求。应当明白本发明构思了多种免疫化学测定方法处于其精神和范围之内。确实，其他方法诸如确定因子VIII存在与活性的生物测定法也涵盖于本发明。

因而，除了上述的免疫测定系统外，其他测定系统诸如那些设计目的为测量和/或检测因子VIII和/或受治疗者血液的凝固能力的方法也涵盖于本发明(例如，ChromZ FVIII凝固活性(FVIII-c)测定法(Helena Labs))。

实验部分

以下是为了实现本发明的具体实施方案的实施例。提供实施例只是为了说明的目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。

在所使用的数字(例如数量、温度等)方面，为了确保准确已经作了努力，但是某些实验性的错误和偏差当然应该是允许的。

在随后的实验内容公开部分，应用以下缩写：N(正常的)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；mU(毫单位)；⁵¹Cr(铬51)；μCi(微居)；EC(摄氏温度)；hFVIII(人因子VIII)；FVIII(因子VIII)；pH(氢离子浓度)；JRH级；NaCl(氯化钠)；HCl(盐酸)；OD(光密度)；bp(碱基对)；ATP(腺苷5’-三磷酸)；PCR(聚合酶链反应)；DNA(脱氧核糖核酸)；cDNA(互补DNA)；AAV(腺伴随病毒)；rAAV(重组的腺伴随病毒)；ITR(反向末端重复)；FCS或FBS(胎小牛血清；胎牛血清)；CFA(完全福氏佐剂)；BSA(牛血清白蛋白)；ATCC(美国典型培养物保藏中心)；Sigma(SigmaAldrich，St.Louis，MO)；Biodesign International(BiodesignInternational，Kennebunk，MI)；Baxter Hyland(Baxter HealthcareCorp.，Biotech Group—Hyland Division)；Helena Labs(Helena Labs，Beaumont，TX)；American Diagnostica(American Diagnostica，Greenwich，CT)；Accurate Chemical(Accurate Chemical andScientific公司)；Molecular Probes(Molecular Probes，Eugene，OR)；Vysis(Vysis，Downer Grove，IL)；Tel-Test(Tel-Test公司，Friendswood，TX)；Molecualr Dynamics(Molecualr Dynamics，Sunnyvale，CA)；NUNC(Naperville，IL)；和Stratagene(Stratagene克隆系统，La Jolla，CA)；和Biodesign(Biodesign International，Kennebunkport，ME)。

实施例1双载体质粒构建

根据Yonemura等人(Yonemura等人.蛋白质工程(Pro.Engineer.)，6；669-674，1993)的报道，装配人因子VIII(hFVIII)的重链和轻链，并以表达盒的形式克隆到AAV载体中。两个载体都含有启动子和来自人延伸因子1α(EF1α)基因(Uetsuki等人。生物化学杂志，264；5791-5798；Kim等人。基因，9；217-223，1990)的第一个非编码内含子(从-573到+985)。每个载体还包含因子VIII重链的编码19个氨基酸信号序列的前57个碱基对。重链构建体编码结构域A1和A2以及结构域B N端的5个氨基酸。轻链载体除结构域A3、C1和C2外还编码结构域B的羧基端的85个氨基酸。两个载体均利用人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号。将表达盒插入到AAVITR之间。开始的克隆步骤涉及删除pVm4.1e-hFIX(Nakai等人。血液(Blood)，91；1-9，1998)的SphI和XcmI位点之间的EF1α序列的854bp，并再连接以得到pVm4.1eδD-hFIX。

接着用EcoRI消化该构建体释放出hFIX cDNA，并与一个含有MfeI末端(EcoRI相容的)和一个内部ClaI限制性位点的寡核苷酸连接，得到pVm4.1eδD-接头。分别从pVm4.1cFVIII-HC和pVm4.1cFVIII-LC中以ClaI-BstEII片段的形式分离出包括hGH多聚腺苷酸化序列的重链和轻链片段。将这些片段克隆到pVm4.1eδD-接头中相应的位点之间，得到质粒pVm4.1eδD-FVIII-HC(也叫rAAV-hFVIII-HC)和pVm4.1eδD-FVIII-LC(也叫rAAV-hFVIII-LC)。

图7提供了构建体的图谱。在该图中，每幅图的上部线条代表载体的基因结构，下部线条代表由载体编码的hFVIII蛋白质结构域的结构(ITR，反向末端重复；EF1α/内含子1，人多肽延伸因子1α基因启动子和第一个内含子；hFVIII-HC，人FVIII cDNA；hFVIII-LC，人FVIII cDNA；hGH PA，人生长激素多聚腺苷酸化信号；SS，人FVIII信号序列；A1、A2、“B”、A3、C1、C2，完整的和不完整的(“”)hFVIII蛋白质的蛋白质结构域)。

实施例2 单载体质粒的构建

含有因子VIII轻和重两链的质粒pAAV-F8-1构建体之构建如下。使用寡核苷酸Z8 S和Z8A生成含有克隆位点、基于EF1α和免疫球蛋白G(IgG)内含子序列的合成内含子的5’-剪接供体位点、Kozak序列和人血液凝固因子VIII(FVIII)编码序列的前16个核苷酸的PCR片段Z8。核酸序列如下所示：寡核苷酸Z8S：5′cccaagcttgcggccgcccgggtgccgcccctaggcaggtaagtgccgtgtgtggttcc 3′(SEQ ID NO：1)寡核苷酸Z8A：5′ccgctcgagcagagctctatttgcatggtggaatcgatgccgcgggaaccacacacggc 3′(SEQ ID NO：2)PCR片段Z85′cccaagcttgcggccgcccgggtgccgcccctaggcaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcggcatcgattccaccatgcaaatagagctctgctcgagcgg 3′(SEQ ID NO：3)

将核酸Z8插入到pZREO-2(Invitrogen)中HindIII和XhoI位点之间，产生pZ8。使用寡核苷酸INT3S和INT3A(其序列如下)生成含有分支点、多聚嘧啶区和合成内含子的3剪接受体位点的PCR片段INT3。寡核苷酸INT3S：5′ttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattactga 3′(SEQ ID NO：4)寡核苷酸INT3A：5′gaatcgatacctgtggagaaaaagaaaaagtggatgtcagtgtcagtaattcaaggc 3′(SEQ ID NO：5)PCR片段INT35′ttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattactgacactgacatccactttttctttttctccacaggtatcgattc 3′(SEQ ID NO：6)

将INT3插入到pZ8的SacII和ClaI位点之间，产生pZ8.I。所以，Z8.I在AvrII和ClaI位点之间含有完整的合成内含子。将带有SacI和XhoI限制性位点的hFVIII cDNA片段插入到pZ8.I的SacI和XhoI位点之间，产生pZ8.I.dB。所以，pZ8.I.dB含有合成的内含子和完整的hFVIII编码序列。

使用经过修饰以消除接头序列的寡核苷酸EG3S和EG3A，产生含有三个HNF-3结合位点和小鼠白蛋白基因的-54到+8序列的PCR片段EG3。EG3S和EG3A的序列如下：寡核苷酸EG3S：5′agggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatctacagttattggttaaa 3′(SEQ ID NO：7)寡核苷酸EG3A：5′ggaaaggtgatctgtgtgcagaaagactcgctctaatatacttctttaaccaataactg 3′(SEQ ID NO：8)PCR片段EG35′agggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatccagggaatgtttgttcttaaataccatctacagttattggttaaagaagtatattagagcgagtctttctgcacacagatcacctttcc 3′(SEQ ID NO：9)

接着使用T4多核苷酸激酶将EG3磷酸化并将其插入到pZ8.I.dB的SmaI位点，产生pZ8.I.dB.egg。通过将两个寡核苷酸SPA.S和SPA.A杂交，生成含有基于兔β-珠蛋白序列(基因和发育(Genes andDevelop.)，3；1091)的高效合成多聚腺苷酸化信号的DNA片段SPA。寡核苷酸SPA.S：5′tcgagaataaaagatcagagctctagagatctgtgtgttggttttttgtgtgcggccgc 3′(SEQ ID NO：10)寡核苷酸SPA.A：  5′tcgagcggccgcacacaaaaaaccaacacacagatctctagagctctgatcttttattc 3′(SEQ ID NO：11)PCR片段SPA5′tcgagaataaaagatcagagctctagagatetgtgtgttggttttttgtgtgcggccgctcga 3′(SEQ ID NO：12)

将SPA插入到pZero-2的XhoI位点，产生pZero-2.SPA。将SPA从pZero-2.SPA克隆中切除并插入到pZ8.I.dB.egg的XhoI位点，产生pZ8.I.dB.egg.A。将pAAV-CMV-FIX9用ClaI消化，用T4聚合酶补平和再连接以产生pAAV(Cla^-)-CMV-FIX9。

使用NotI将含有HNF-3白蛋白启动子-合成的内含子-hFVIII-合成的poly A信号的完整表达盒从pZ8.I.dB.egg.A中切除，并连接到质粒主链和来自pAAV(Cla^-)-CMV-FIX9的AAV ITR上以造出pAAV-F8-1。从ITR到ITR的载体核苷酸序列(即排除质粒主链在外)列于SEQ ID NO3。

实施例3 病毒体产生

正如在美国专利5858351、美国专利5846528、美国专利5622865及Matsushita等人。基因治疗，5；938，1998(所有这些在此处引用作为参考)中所描述，通过使用无Ad系统，从这些质粒中产生AAV载体。简言之，将293细胞(ATCC目录号CRL-1573)以3.6×10⁶个细胞/平皿的密度接种在10cm的平皿(每平皿含10ml培养基)中，并在CO₂和湿润的条件下于37℃温育。温育过夜后，大约70％-80％的细胞汇合。

接着通过磷酸钙法(正如本领域所公知)用DNA转染细胞。简言之，用无菌移液吸头将含有因子VIII编码区的AAV载体7μg、提供辅助功能的Pladeno5 7μg和1909AAV辅助病毒7μg加入到带扣盖的3ml聚苯乙烯无菌管中。接着每管加入300mM的CaCl₂(JRH级)1.0ml并通过吸液器上下吹吸混合。用2ml的移液管加入等体积的2×HBS(274mM NaCl、10mM KCl、42mM HEPES、1.4mMNa₂PO₄、12mM葡萄糖、pH7.05，JRH级)，将溶液上下吹吸三次。将该DNA混合液立即逐滴地加入到细胞中，均匀地分布在10cm平皿中。接着将细胞在CO₂和湿润条件下于37℃温育6小时。在转染的细胞培养物中可见颗粒状沉淀。6小时后从细胞中移出DNA混合物，提供新鲜的培养基并温育72小时。

72小时后，收集、沉淀、再悬浮细胞于1ml TBS/1％BSA中，通过重复地(三次)在干冰上冷冻悬浮液和在37℃融化以制备冻/融提取物。将病毒制备物于-80℃保存并在第一轮感染前通过斑点印迹测定法测定滴度。

实施例4 体外细胞转导

将来自稳定的人细胞系293(ATCC号CRL1573)的细胞接种在6孔板(即有6个供细胞生长的孔的板)，密度为5×10⁵个细胞/孔。当单层达到80％-90％汇合时，将其用rAAV病毒体AAV-eδD-FVIII-HC、AAV-eδD-FVIII-LC(AAV-eδD-FVIII-HC与AAV-eδD-FVIII-LC的比例相同)或者AAV-eδD-FIX以MOI为3×10³和3×10⁴感染。在感染后18小时用DMEM/10％加热灭活的FBS置换培养基。后来收集培养基以通过ELISA(描述如下)分析其FVIII轻链抗体水平，以及通过ChromZ FVIII作为凝固活性(FVIIIc)测定法(Helena Labs)分析其生物活性，使用了制造商的说明书及如实施例6中所描述。

实施例5单链因子VIII感染性测定

在本实施例中，研究探讨了单链因子VIII的感染性。为了测定rAAV-hF8-1的感染性，用rAAV-hF8-1和对照载体rAAV-hF8L以MOI为1×10⁴个病毒颗粒/细胞感染HepG2、293和H2.35细胞。通过Hirt提取法从感染细胞中分离重组的AAV DNA，并在碱性琼脂糖凝胶上进行电泳。用人F8作探针的Southern印迹分析表明，从感染细胞未包被的病毒中分离到相似量的rAAV-hF8-1和rAAV-hF8L。为了进一步阐明rAAV-hF8-1的感染性，使用了本领域公知的感染中心测定法(ICA)(见例如，Snyder.Current Protocols in Genetics，第十二章，John Wiley & Sons，1997)。在该测定中，确定了感染性颗粒与rAAV-F8-1总颗粒的比例，以及感染性颗粒与对照rAAV载体(基因组大小为4645个核苷酸)的总颗粒的比例。结果显示，在感染性颗粒与总颗粒的比例上rAAV-hF8-1与对照载体具有可比性，为大约1∶1000。总起来，这些结果显示rAAV-hF8-1具有的感染性与具有野生型基因组大小的rAAV载体相似。

实施例6因子VIII蛋白质表达测定

使用特异于FVIII轻链的ELISA确定293细胞中以及注射动物中FVIII轻链抗原水平(描述如下)。用50μl按1∶500在包被缓冲液中稀释的轻链特异性抗体N77110(Biodesign International)4℃过夜包被NUNC Maxisorb 96孔板。用冲洗缓冲液(PBS，0.05％Tween20)冲洗板三次，再用200μl封闭缓冲液(PBS，10％马血清，0.05％Tween)在室温下封闭1小时。洗板三次后加入标准品和样品。用Bioclate重组的人FVIII(Baxter Hyland)作标准品并在封闭缓冲液中稀释至浓度为320ng/ml-10ng/ml范围内。

为分析转导培养物上清液，标准品中含有50％培养基，为分析小鼠血浆，将标准品在合并的正常小鼠血浆(Sigma)中稀释至10％。在测定中还包含标准品测定参考血浆(SARP，Helena Labs)。随标准品和样品(96μl/孔)上样后，将板在室温下温育2小时并用冲洗缓冲液(200μl/孔)冲洗五次。加入1∶200稀释的偶联有辣根过氧化物酶的轻链特异性抗体ESH 8-HRP(American diagnostica)(100μl/孔)，接着将板在室温下温育1小时。板子用冲洗缓冲液冲洗四次，然后依制造商的说明书使用ABTS过氧化物酶底物试剂盒(BioRad)探测抗原。结果见下面的实施例7中的表1。

实施例7 因子VIII生物活性测定

用Chrom Z FVIII凝固活性(FVIII-c)测定法(Helena Labs，Beaumount，TX)探测按实施例4中所描述的被感染的293细胞中有生物学活性的FVIII。使用Bioclate重组的人因子VIII(Baxter Hyland)作为标准品分析转染的培养物上清液。将标准品在血浆稀释缓冲液(由试剂盒提供)中稀释为10ng/ml-0.313ng/ml范围，并使其在培养基中的含量为2.5％。由于该测定法既可以探测人的又可以探测鼠的FVIII活性，所以将其修改以耗尽小鼠血浆中的有生物学活性的人因子VIII。在进行测定之前，将小鼠血浆用人因子VIII特异性的抗体预温育。在未处理过的血浆样品和抗体处理过的样品中因子VIII活性的差别代表了血浆中有生物学活性的人因子VIII的量。本测定法所使用的标准品为合并的正常人血浆(FACT；获得自George King Biomedical)。将FACT在FVIII缺乏的血浆中进行系列稀释，从未稀释的200ng/ml到稀释后的6.25ng/ml。在加或不加2μl抗体N77110下，将标准品(10μl)在37℃温育15分钟。类似地，将小鼠血浆样品在FVIII缺乏的血浆中稀释，然后在加或不加2μl抗体N77110下，将10μl这些稀释的样品在37℃温育15分钟，之后马上置于冰上。这样，所有加抗体的温育是在100％的血浆背景下进行的。将吸附的抗体和没有吸附的FACT标准品以及小鼠血浆样品在由Chrom Z试剂盒提供的血浆探测缓冲液中按1∶20稀释。因而，用于测定的FACT标准品的最终浓度范围为10ng/ml-0.313ng/ml。

将25μl这些稀释液加入到预冷的96孔板中。板置于冰上，加入25μl F1Xa试剂和50μl FX，并将板于37℃温育15分钟。加入底物(50μl)并将板在37℃下再温育3分钟。通过加入25μl 50％的乙酸终止反应并测量405nm的光密度。

如下面的表1所示，用AAV-eδD-FVIII-HC感染的293细胞没有导致抗原产生，也没有有生物学活性的蛋白质。感染有AAV-eδD-FVIII-LC的细胞产生FVIII轻链，但没有有生物学活性的蛋白质。然而用所有两种载体转导的细胞以剂量依赖方式产生FVIII轻链和有生物学活性的FVIII。用阴性对照载体AAV-eδD-FIX转导细胞，既没有产生抗原也没有产生任何有生物学活性的FVIII。假设在转导细胞中产生了等量的重链和轻链。采用定义：1个单位等于1毫升正常人的混合血浆中因子VIII的量或200ng，将活性单位数转换为纳克。

表1从两种rAAV载体体外产生有生物学活性的人因子VIII

载体	MOI	ELISA(ng/ml)	ChromZ
								(mU/ml)	(ng/ml)
AAV-eδD-FVIII-HC和AAV-eδD-FVIII-LC	3×103	24	35	7.1
					AAV-eδD-FVIII-HC和AAV-eδD-FVIII-LC	3×104	121	440	87.9
AAV-eδD-FVIII-HC	3×103	0	0	0
					AAV-eδD-FVIII-HC	3×104	0	0	0
AAV-eδD-FVIII-LC	3×103	20.5	0	0
					AAV-eδD-FVIII-LC	3×104	96.9	0	0
AAV-hFIX	3×103	0	0	0
					AAV-hFIX	3×104	0	0	0
无载体		0	0	0

实施例8 FVIII重链和轻链的免疫荧光染色

在这些实验中，采用免疫荧光染色分析按如上所述转导的293细胞。将293细胞以4×10⁵个细胞/孔的密度铺于包被有大鼠尾胶原的双孔培养玻片。48小时后，将细胞以3×10⁴个颗粒/细胞的MOI用rAAV-hFVIII-HC和rAAV-hFVIII-LC转导。转导48小时后，用丙酮将细胞在原位固定，用2％BSA封闭，并用荧光标记的抗hFVIII轻链抗体和荧光标记的抗hFVIII重链抗体染色。所用的抗hFVIII轻链抗体为ESH-4单克隆抗体(American Diagnostica)，依制造商说明书用alexa-488(Molecular Probes)荧光标记。所用的抗hFVIII重链抗体为MAS530P单克隆抗体(Accurate Chemical)，依制造商说明书用alexa-594(M0lecular Probes)荧光标记。细胞用DAPI复染。用装备有独立的滤镜(用于DAPI、FITC和罗丹明信号)和CCD照相机的Zeiss Axioskop荧光显微镜收集影像。用Quips影像软件(Vysis)进行影像分析。

如上所示，用rAAV-eδD-FVIII-HC或者AAV-eδD-FVIII-LC感染细胞，接着用针对所有二条链的抗体染色，导致人FVIII的单个链的产生。共感染有所有两种载体的细胞之免疫荧光染色证实，许多细胞共表达人FVIII的所有两条链，尽管某些细胞只表达hFVIII的重链或轻链。

实施例9 采用单构建体体外表达因子VIII

表2说明含有由不同的启动子驱动的因子VIII重链和轻链的两种单载体构建体表达有生物学活性的因子VIII。将构建体pAAV-hF8-1(SEQ ID NO：13)和pVm4.1cF8ΔB(SEQ ID NO：14)转染到293细胞。转染后，让细胞表达因子VIII 48-72小时。依制造商的说明书通过Chrom Z FVIII凝固活性(FVIII-c)测定法测定培养液中的因子VIII

表2体外产生有生物学活性的FVIII

构建体	EIASA(ng/ml)	ChromZ(ng/ml)
			对照	-	0
pAAV-hF8-1	-	4.9
			pVm4.1cF8ΔB	-	46

实施例10 用组织特异性启动子表达因子VIII

在这些实验中使用了不同的启动子和增强子元件以驱动因子VIII编码序列的表达。使用不同启动子，比较了因子VIII在293细胞和HepG2细胞中的表达。pAAVeF8ΔB含有带hGH内含子的EF-1α启动子、缺失结构域B的因子VIII(F8ΔB)和poly A。如前所述，pAAV-hF8-1使用带最小的内含子的HNF-3白蛋白启动子，其后为F8ΔB和最小的poly A。构建体pAAV-c8使用CMV增强子-启动子和F8ΔB。pAAV8b1含有HNF-3白蛋白启动子，其后为带F8ΔB的CMV/B-珠蛋白内含子和最小的多聚腺苷酸位点。表3描述了相对于对照质粒pV4.1eF8ΔB而言利用白蛋白启动子的因子VIII在Hep G2和293细胞中的表达。这些数据说明在Hep G2肝细胞中带有白蛋白启动子的因子VIII的表达比在293细胞中因子VIII的表达提高了。

表3启动子的相对组织特异性

质粒构建体	HepG2细胞	293细胞
			pAAV-hF8-1	6.2	0.6
pAAV8b1	6.7	1.0
			pAAVc8	30.0	41.0
pV4.1eF8ΔB	100	100

接下来，将衍生自运甲状腺蛋白(TTR)基因启动子的几个启动子转染到Hep G2细胞。TTR是含量丰富的血清蛋白质，并且其基因的增强子-启动子含有公知的肝脏特异性转录因子结合位点(Samadani等人。基因表达(Gene Expression)，6；23，1996；Yan等人。EMBO，9；869，1990；Costa和Grayson.核酸研究(Nuc.Acids Res.)，19；4139，1991；Costa等人。分子细胞生物学(Mol.Cell.Bio.)，6；4697，1986)。通过将pAAV-hF8-1上的HNF-3白蛋白启动子置换为多种长度的TTR启动子-增强子，制造构建体。通过把弱亲和力结合位点置换为强亲和力结合位点而修饰TTR增强子-启动子，以产生pAAV-hF8-2。pAAV-hF8-TTR-E-L-P202构建体含有全长TTR启动子并在增强子和启动子之间有一个接头。其余构建体为5’端缺失的：pAAV-hF8-TTR-E-P202在启动子和增强子之间没有接头；pAAV-hF8-TTR-E-P197从启动子中删除5个碱基对；pAAV-hF8-TTR-E-P151有50个碱基对的缺失；pAAV-hF8-TTR-P202缺少TTR增强子，pAAV-hF8-TTR(X)在增强子中有65个碱基对的缺失。对照质粒pAAV-hF8-1表达大约4.6mU/ml。表4表明，使用TTR启动子系列使因子VIII活性相对于对照质粒成倍提高。

表4用来自TTR的启动子表达因子VIII

质粒构建体	相对因子VIII活性
		pAAV-hF8-STTR	3.16
pAAV-hF8-TTR-E-L-P202	8.86
		pAAV-hF8-TTR-E-P202	6.1
pAAV-hF8-TTR-EP197	7.3
		pAAV-hF8-TTR-E-P151	13.3
pAAV-hF8-TTR-P202	2.3

实施例11 体内因子VIII的表达

为了测试本发明的AAV载体方法在体内的可行性，通过门静脉对三组(每组5只)C57BL/6小鼠注射3×10¹¹个AAV-eδD-FVIII-HC颗粒，3×10¹¹个AAV-eδD-FVIII-LC颗粒，或者AAV-eδD-FVIII-HC和AAV-eδD-FVIII-LC两种均3×10¹¹个颗粒。另外，对一组(4只)动物用3×10¹¹个AAV-eδD-FIX颗粒注射。已经表明当将基因通过腺病毒载体递送到门静脉时，该品系小鼠不诱发对人FVIII的免疫应答(Connelly等人。血液，87；4671-4677，1996)。正如如下的结果所提示，在这些实验中所获得的数据证实了通过使用两种AAV载体独立地递送FVIII的重链和轻链产生有生物学活性的FVIII的可行性。

通过后眼眶血管丛收集血液样品(前两个月每两周一次，其后六个月每月一次以及在第十一个月)于柠檬酸钠中。在用AAV-eδD-FVIII-LC单独注射或两种载体均注射的动物中，FVIII轻链的表达水平很高(如图8所示)。

为了评价动物中产生的有生物学活性的人FVIII的量，使用了修改的Chrom Z测定法。由于该测定法既检测人的又检测小鼠的FVIII，所以在吸附到人特异性的FVIII抗体之前或之后对血浆中FVIII存在的量进行了确定。吸附后留在血浆中的FVIII的量代表有活性的小鼠FVIII的量，并且二者之差代表了有活性的人FVIII的量。对照实验证实当向小鼠血浆样品中加入高达32ng的人FVIII时，抗体可以从该样品中移出80％-90％的人FVIII。如表5所示，修改的Chrom Z测定法表明只有那些用两种载体均注射的动物产生有生物学活性的FVIII。尽管在注射后10周和5个月得到了相似的结果，表5显示的结果来自注射后8周时收集的血浆的结果。用重链和轻链两种载体共注射的5只动物中有一只没有表达VIII(推测是由于无效注射)，因而将其从分析中剔除。如ELISA所测量，两种载体均注射的动物产生超过2μg/ml的FVIII轻链。Chrom Z测定法表明在血浆中探测到总共600-900ng/ml有活性的hFVIII。来自小鼠因子VIII的占大约400-500ng/ml，表明在血浆中存在有大约230-430ng/ml有活性的人hFVIII。尽管发现只有一部分总蛋白质具有活性，但是动物产生了生理水平的活性蛋白质(即200ng/ml)。发现这些动物维持了超过11个月而不衰减的生理水平的活性蛋白质。对单独用轻链载体、单独用重链载体或者hFIX载体注射动物所进行的类似分析证实，在这些动物的血浆中没有有生物学活性的FVIII。

表5体内人因子VIII的生物学活性

所用构建体	ELISA(nG/ml)	总FVIII(-Ab)(单位)	鼠FVIII(+Ab)(单位)	人FVIII(ng/ml)
					AAV-eδD-FVIII-HC和AAV-eδD-FVIII-LC*	2288	3.9	2.2	342
AAV-eδD-FVIII-LC*	3329	1.4	1.6	0
					AAV-eδD-FVIII-HC	0	1.6	1.6	0
AAV-eδD-FIX	0	1.4	2.0	0

^*＝三只动物的平均值)

实施例12 基因转移和载体在组织中的表达

在这些实验中，每组实验动物中的一只在注射后8周处死(即，如在实施例11中所述)，从其中分离出DNA，接着通过Southern印迹分析获得基因转移到肝脏的证据。另外，为了确定载体在除肝脏外的其他器官中的表达程度，从其他组织中获得DNA。

20微克DNA用BglII消化，用1％琼脂糖凝胶分离，并与³²P标记的编码hFVIII的结构域A1和A2的1126 bp AlwNI片段(重链探针)或者³²P标记的编码hFVIII的结构域A3、C1和C2的1456bpNdeI-EcoRI片段(轻链探针)杂交。通过将BglII消化的重链或轻链质粒DNA(分别为pVm4.1eδD-hFVIII-HC和pVm4.1eδD-hFVIII-LC)插入到BglII消化的天然小鼠肝脏DNA(比例为每二倍体基因组10、5、1、0.1、0.01个拷贝)中，生成拷贝数对照。用Storm860 Phosphoimager(Molecular Dynamics)分析了杂交后的膜，并且用ImageQua NT软件(Molecular Dynamics)对载体拷贝数的定量进行了评估。对杂交后的膜也进行了放射自显影。使用RNA Stat提取试剂盒(Tel-Test)从肝脏中分离出总RNA。正如如下简述，通过使用本领域公知的方法，连同³²P标记的上述对因子VIII的重链和轻链特异的探针，对10μg RNA也进行了Northern印迹分析，并且在杂交后的膜上进行放射自显影。

使用本领域公知的方法将肝脏DNA用BglII消化并与下述的FVIII轻链探针杂交之后，在用rAAV-hFVIII-LC或重链和轻链两种载体均注射的动物中探测到所预计的3015bp的条带。在单独用重链载体或者用hFIX载体注射的动物中没有观察到该条带，如图9A所示(rAAV-hFVIII-LC，道1；rAAV-hFIX，道2；rAAV-hFVIII-HC，道3；rAAV-hFVIII-LC和rAAV-hFVIII-HC两种，道4；通过将相应的质粒以每二倍体基因组10、5、1、0.1、0.01个拷贝数的比例插入到BglII消化的天然小鼠肝脏DNA中产生拷贝数对照，道5-9)。Phosphoimage分析发现轻链载体以每二倍体基因组大约2.4和1.5个拷贝数分别存在于单独用轻链载体或用两种载体注射的动物中。如图9B所示，当用hFVIII重链探针与BglII消化的DNA杂交时，在单独用重链载体或者用两种载体均注射的动物中观察到预期的2318bp的条带，但在单独用轻链载体或者用hFIX载体注射的动物中没有观察到。在单独用重链载体和用两种载体均注射的动物中载体的拷贝数分别为每二倍体基因组1.1和1.7个。

正如图10A和10B所示，从脾、肾和心脏组织中提取的DNA与hFVIII的轻链探针或者重链探针的杂交结果提示，这些组织每10个二倍体基因组中含有少于1个拷贝数的载体序列，证实了在门静脉内注射后载体主要分布到肝脏。

通过对来自注射后8周处死的动物的RNA的Northern印迹分析(如上所述)还评价了人FVIII基因在小鼠肝脏中的表达。正如图11A所示，在单独用轻链载体或者用两种载体均注射的动物中观察到预计大小(2.7kb)的hFVIII轻链转录本。类似地，正如图11 B所示，在单独用重链载体或者用两种载体均注射的动物中探测到预期的hFVIII重链转录本(2.7kb)。由于Southern印迹分析证明在用两种载体均注射的动物中，重链和轻链的DNA序列以大约相同的拷贝数存在(每二倍体基因组分别为1.7和1.5个拷贝数)，所以这些结果证实hFVIII的重链和轻链均以大约相等的量在肝脏中表达。

                       序列表<110>Couto.Linda B.

 Colosi.peter C.<120>用于由靶细胞表达因子VIII的腺伴随病毒<130>AVIGEN-03743<140>待分配<141>1999-07-30<150>60/125，974<151>1999-03-24<150>60/104，994<151>1998-10-20<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>1cccaagcttg cggccgcccg ggtgccgccc ctaggcaggt aagtgccgtg tgtggttcc    59<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>2ccgctcgagc agagctctat ttgcatggtg gaatcgatgc cgcgggaacc acacacggc 59<210>3<211>103<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>3cccaagcttg cggccgcccg ggtgccgccc ctaggcaggt aagtgccgtg tgtggttccc 60gcggcatcga ttccaccatg caaatagagc tctgctcgag cgg                   103<210>4<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>4ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttactga    57<210>5<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>5gaatcgatac ctgtggagaa aaagaaaaag tggatgtcag tgtcagtaat tcaaggc    57<210>6<211>99<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>6ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttactgacac 60tgacatccac tttttctttt tctccacagg tatcgattc                        99<210>7<211>100<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>7agggaatgtt tgttcttaaa taccatccag ggaatgtttg ttcttaaata ccatccaggg 60aatgtttgtt cttaaatacc atctacagtt attggttaaa                       100<210>8<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>8ggaaaggtga tctgtgtgca gaaagactcg ctctaatata cttctttaac caataactg 59<210>9<211>144<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>9agggaatgtt tgttcttaaa taccatccag ggaatgtttg ttcttaaata ccatccaggg 60aatgtttgtt cttaaatacc atctacagtt attggttaaa gaagtatatt agagcgagtc 120tttctgcaca cagatcacct ttcc                                        144<210>10<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>10tcgagaataa aagatcagag ctctagagat ctgtgtgttg gttttttgtg tgcggccgc  59<210>11<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>11tcgagcggcc gcacacaaaa aaccaacaca cagatctcta gagctctgat cttttattc 59<210>12<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>12tcgagaataa aagatcagag ctctagagat ctgtgtgttg gttttttgtg tgcggccgct 60cga                                                               63<210>13<211>11933<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：合成的<400>13cagctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc 60tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120actaggggtt cctgcggccg cccagggaat gtttgttctt aaataccatc cagggaatgt 180ttgttcttaa ataccatcca gggaatgttt gttcttaaat accatctaca gttattggtt 240aaagaagtat attagagcga gtctttctgc acacagatca cctttccggg tgccgcccct 300aggcaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg ttatggccct 360tgcgtgcctt gaattactga cactgacatc cactttttct ttttctccac aggtatcgat 420tccaccatgc aaatagagct ctccacctgc ttctttctgt gccttttgcg attctgcttt 480agtgccacca gaagatacta cctgggtgca gtggaactgt catgggacta tatgcaaagt 540gatctcggtg agctgcctgt ggacgcaaga tttcctccta gagtgccaaa atcttttcca 600ttcaacacct cagtcgtgta caaaaagact ctgtttgtag aattcacgga tcaccttttc 660aacatcgcta agccaaggcc accctggatg ggtctgctag gtcctaccat ccaggctgag 720gtttatgata cagtggtcat tacacttaag aacatggctt cccatcctgt cagtcttcat 780gctgttggtg tatcctactg gaaagcttct gagggagctg aatatgatga tcagaccagt 840caaagggaga aagaagatga taaagtcttc cctggtggaa gccatacata tgtctggcag 900gtcctgaaag agaatggtcc aatggcctct gacccactgt gccttaccta ctcatatctt 960tctcatgtgg acctggtaaa agacttgaat tcaggcctca ttggagccct actagtatgt 1020agagaaggga gtctggccaa ggaaaagaca cagaccttgc acaaatttat actacttttt 1080gctgtatttg atgaagggaa aagttggcac tcagaaacaa agaactcctt gatgcaggat 1140agggatgctg catctgctcg ggcctggcct aaaatgcaca cagtcaatgg ttatgtaaac 1200aggtctctgc caggtctgat tggatgccac aggaaatcag tctattggca tgtgattgga 1260atgggcacca ctcctgaagt gcactcaata ttcctcgaag gtcacacatt tcttgtgagg 1320aaccatcgcc aggcgtcctt ggaaatctcg ccaataactt tccttactgc tcaaacactc 1380ttgatggacc ttggacagtt tctactgttt tgtcatatct cttcccacca acatgatggc 1440atggaagctt atgtcaaagt agacagctgt ccagaggaac cccaactacg aatgaaaaat 1500aatgaagaag cggaagacta tgatgatgat cttactgatt ctgaaatgga tgtggtcagg 1560tttgatgatg acaactctcc ttcctttatc caaattcgct cagttgccaa gaagcatcct 1620aaaacttggg tacattacat tgctgctgaa gaggaggact gggactatgc tcccttagtc 1680ctcgcccccg atgacagaag ttataaaagt caatatttga acaatggccc tcagcggatt 1740ggtaggaagt acaaaaaagt ccgatttatg gcatacacag atgaaacctt taagactcgt 1800gaagctattc agcatgaatc aggaatcttg ggacctttac tttatgggga agttggagac 1860acactgttga ttatatttaa gaatcaagca agcagaccat ataacatcta ccctcacgga 1920atcactgatg tccgtccttt gtattcaagg agattaccaa aaggtgtaaa acatttgaag 1980gattttccaa ttctgccagg agaaatattc aaatataaat ggacagtgac tgtagaagat 2040gggccaacta aatcagatcc tcggtgcctg acccgctatt actctagttt cgttaatatg 2100gagagagatc tagcttcagg actcattggc cctctcctca tctgctacaa agaatctgta 2160gatcaaagag gaaaccagat aatgtcagac aagaggaatg tcatcctgtt ttctgtattt 2220gatgagaacc gaagctggta cctcacagag aatatacaac gctttctccc caatccagct 2280ggagtgcagc ttgaggatcc agagttccaa gcctccaaca tcatgcacag catcaatggc 2340tatgtttttg atagtttgca gttgtcagtt tgtttgcatg aggtggcata ctggtacatt 2400ctaagcattg gagcacagac tgacttcctt tctgtcttct tctctggata taccttcaaa 2460cacaaaatg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Claims (30)

1.一种治疗人血友病的方法，包括

a)提供至少一种包含编码因子VIII的核苷酸序列的重组腺伴随病毒载体；和

b)在使所述因子VIII核苷酸序列在所述受治疗者中以提供有效治疗量的水平表达的条件下，将所述至少一种重组腺伴随病毒载体施用于所述受治疗者。

2.权利要求1的方法，其中所述因子VIII核苷酸序列在所述受治疗者的肝脏中表达。

3.权利要求1的方法，其中所述血液凝固障碍得到改善。

4.权利要求1的方法，其中所述血液凝固障碍是血友病A。

5.权利要求1的方法，其中所述受治疗者是人。

6.权利要求1的方法，其中所述重组腺伴随病毒载体编码所述因子VIII的轻链。

7.权利要求1的方法，其中所述重组腺伴随病毒载体编码所述因子VIII的重链。

8.权利要求1的方法，其中所述因子VIII核苷酸序列编码选自A1、A2、A3、B、C1和C2中的至少一个因子VIII结构域。

9.权利要求1的方法，其中将所述重组腺伴随病毒载体静脉内施用。

10.权利要求8的方法，其中所述静脉内施用是通过门静脉。

11.权利要求1的方法，其中所述重组腺伴随病毒载体进一步地包含编码人生长激素多聚腺苷酸化序列的核苷酸。

12.一种治疗受治疗者的方法，包括a)提供：

i)患有血液凝固障碍的受治疗者，

ii)第一种包含编码因子VIII轻链之核苷酸序列的重组腺伴随病毒载体；和

iii)第二种包含编码因子VIII重链之核苷酸序列的重组腺伴随病毒载体；和b)在使所述因子VIII重链和轻链核苷酸序列在所述受治疗者中以提供治疗有效量的水平表达的条件下，将所述第一种和第二种重组腺伴随病毒载体施用于所述受治疗者。

13.权利要求12的方法，其中所述因子VIII重链和轻链核苷酸序列在所述受治疗者的肝脏中表达。

14.权利要求12的方法，其中所述因子VIII核苷酸序列编码选自A1、A2、A3、B、C1和C2中的至少一个因子VIII结构域。

15.权利要求12的方法，其中所述血液凝固障碍得到改善。

16.权利要求12的方法，其中所述血液凝固障碍是血友病A。

17.权利要求12的方法，其中所述受治疗者是人。

18.权利要求12的方法，其中所述将重组腺伴随病毒载体静脉内施用。

19.权利要求18的方法，其中所述静脉内施用是通过门静脉。

20.权利要求12的方法，其中所述重组腺伴随病毒载体进一步地包含编码人生长激素多聚腺苷酸化序列的核苷酸。

21.一种重组腺伴随病毒载体以及药学可接受的赋形剂，其中所述载体包含与控制序列有效地连接的编码至少一部分因子VIII的核酸，其中所述控制序列指导所述因子VIII部分的翻译的转录。

22.权利要求21的载体，其中所述编码因子VIII的核酸包含编码因子VIII重链的核苷酸。

23.权利要求21的载体，其中所述编码因子VIII的核酸包含编码因子VIII轻链的核苷酸。

24.权利要求21的载体，其中所述编码至少一部分因子VIII的核酸编码选自A1、A2、A3、B、C1和C2中的至少一个因子VIII结构域。

25.权利要求21的载体，其中所述载体进一步包含编码人生长激素多聚腺苷酸化序列的核苷酸。

26.一种含有至少一种重组腺伴随病毒载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞能表达因子VIII。

27.权利要求26的宿主细胞，其中所述细胞是肝脏细胞。

28.权利要求26的宿主细胞，其中所述因子VIII以处于或者高于生理水平表达。

29.权利要求26的宿主细胞，其中所述宿主细胞以大于约200ng/ml的水平表达所述因子VIII。

30.权利要求29的宿主细胞，其中所述宿主细胞存在于动物中。

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